PGC‑1α基因過表達慢病毒載體、PGC‑1α慢病毒及構建方法和應用與流程

2024-04-01 12:39:05 3

本發明屬於分子生物學的技術領域，更具體地，涉及一種pgc-1α基因過表達慢病毒載體、pgc-1α慢病毒及構建方法和應用。

背景技術：

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γcoactivator-1alpha,pgc-1α)是一種多功能的輔激活因子，能夠協同激活一些核受體和轉錄因子，在線粒體的生物合成、能量代謝、糖脂代謝等多條代謝通路中起作用。在小鼠模型，通過增益功能和功能缺失使pgc-1α在骨骼肌結構和功能上的生物學作用被逐步揭示，骨骼肌超表達pgc-1α的轉基因小鼠中，快酵解型股肌和蹠肌中ⅰ型肌纖維的含量增加；同時利用快慢肌纖維特異的啟動子，發現pgc-1α作為鈣調磷酸酶(calcineruin，can)信號通路的靶基因與肌細胞增強因子(myocyteenhancerfactor-2，mef2)蛋白協同激活慢肌纖維相關基因的轉錄。這些發現暗示，pgc-1α可能是調控肌纖維類型轉換的關鍵因子並可以組合肌纖維轉化過程的多條信號通路，但其調控肌纖維類型轉化的具體機制仍有待進一步揭示。

通過分子技術，實現目的基因在宿主細胞中的過表達是研究該基因功能的一種重要手段。將外源基因導入真核細胞的方式有兩種：瞬時轉染與穩定轉染。瞬時轉染是將重組dna導入細胞以獲得目的基因的暫時的表達，轉染的dna不必整合進宿主的染色體；穩定或持久的轉染能夠將目的基因整合到基因組dna並指導適量蛋白合成，整合效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達，具有更好的穩定性。相對於細胞系，原代細胞體外培養和轉染難度均增加。目前尚無外源基因在雞原代成肌細胞中可長效穩定表達的研究報導。

技術實現要素：

為解決現有技術存在的不足，本發明提供了一種可用於轉染雞原代成肌細胞的pgc-1α基因過表達慢病毒載體、pgc-1α慢病毒及構建方法和應用。

本發明的技術技術方案如下：

本發明提供了一種pgc-1α基因過表達慢病毒載體，所述載體以慢病毒載體lv5為基礎進行構建，並整合有雞pgc-1α基因的cds序列，雞pgc-1α基因的cds序列如seqidno.1所示。

本發明還提供了一種pgc-1α基因過表達慢病毒載體的構建方法，該方法包括以下步驟：

(1)pcr擴增雞pgc-1α基因的cds序列，得到pgc-1α基因片段；

(2)使用限制性內切酶酶切pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5，然後用連接酶連接酶切後的pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5，得到重組連接產物；

(3)將重組連接產物轉化感受態細胞，並進行鑑定，鑑定為陽性結果且序列正確的為構建成功的pgc-1α基因過表達慢病毒載體。

進一步地，步驟(1)中，pcr擴增所用引物對序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

進一步地，步驟(2)中，使用notⅰ和nsiⅰ限制性內切酶對pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5進行雙酶切。

進一步地，步驟(2)中，使用t4dna連接酶連接酶切後的pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5。

進一步地，步驟(3)中的感受態細胞為大腸桿菌dh5α。

本發明還提供了一種pgc-1α慢病毒的構建方法，使用包裝質粒對所述pgc-1α基因過表達慢病毒載體進行包裝，通過共轉染293t細胞，得到pgc-1α慢病毒。

進一步地，所述包裝質粒為pgag/pol、prev和pvsv-g。

本發明還提供了一種應用所述pgc-1α慢病毒的構建方法構建得到的pgc-1α慢病毒。

本發明還提供了一種所述pgc-1α基因過表達慢病毒載體或所述的pgc-1α慢病毒在雞成肌細胞中過表達pgc-1α基因研究中的應用。

本發明的有益效果：本發明提供了一種pgc-1α基因過表達慢病毒載體及pgc-1α慢病毒，其構建方法簡單，陽性率高；pgc-1α慢病毒能夠轉染雞成肌細胞，轉染效率高，且可長效穩定在雞原代成肌細胞中過表達pgc-1α基因。本發明的pgc-1α慢病毒轉染入雞成肌細胞中後，能顯著促進雞成肌細胞中慢肌肌球蛋白重鏈sm基因、生肌調節因子myod、myog基因以及骨骼肌特異性轉錄因子pax7基因的表達，同時顯著抑制了快白肌肌球蛋白重鏈fwm基因的表達。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中的慢病毒載體lv5的圖譜；

圖2是本發明實施例1中的pgc-1α基因過表達慢病毒載體的圖譜。

圖3是本發明實施例1中pgc-1α基因過表達慢病毒載體的酶切鑑定結果；

圖4是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中pgc-1α基因mrna含量；

圖5是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中sm基因mrna含量；

圖6是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中fwm基因mrna含量；

圖7是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中myod基因mrna含量；

圖8是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中myog基因mrna含量；

圖9是本發明實施例4中螢光定量pcr檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中pax7基因mrna含量；

圖10是本發明本發明實施例4中westernblot檢測雞成肌細胞感染pgc-1α慢病毒後細胞中pgc-1α基因的蛋白質表達含量。

具體實施方式

下面結合實施例和說明書附圖對本發明進行詳細地解釋說明。

本發明提供了一種可用於轉染雞原代成肌細胞的pgc-1α基因過表達慢病毒載體，所述載體以慢病毒載體lv5為基礎進行構建，並整合有雞pgc-1α基因的cds序列，雞pgc-1α基因的cds序列如seqidno.1所示。

慢病毒裁體lv5是基於hiv1構建的慢病毒基因過表達載體，採用efla啟動子啟動目的基因的表達。efla啟動子來源於人類靶向延長因子la(efia)基因，可在多種細胞中穩走表達。載體中螢光gfp基因具有獨立的啟動子cmv。既保留了gfp的作用，也避免了融合標籤蛋白對目的基因功能產生影響。慢病毒裁體lv5能夠表達綠色螢光蛋白，能夠準確追蹤載體進入細胞內的位置，並且能夠了解不同環境下pgc-1α基因的強弱表達，使pgc-1α基因基因研究更直觀。

慢病毒裁體lv5能夠連接重組連接雞pgc-1α基因的cds序列(編碼序列)，雞pgc-1α基因的cds序列(seqidno.1)如下所示：

atggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgacatcgagtgtgctgctctggttggtgaagaccagcctctttgcccagatctcccagaacttgacctctccgaactagacgtgaacgacctggatgcagacagcttcctgggggggctcaagtggtacagcgaccagtctgaggtcatctccagccagtacagcaatgagcctgccaacatctttgagaaaatagatgaagagaatgaggcaaacttgctagcagttctcactgagacactggacagcatccctgtggatgaggatggattgccttcatttgatgcactgacagatggagatgtgaccaatgaacatgacgccagcccttccccgatgcccgacggcacccctccgccccaggaggcagaagagccgtctctactcaagaagctcttgctggctccagccaacactcagctaaattacaatgaatgcagtggtctcagcacacaaaaccatgcgaacacaaatcacaggatcagaacaagccctgtggttgttaagactgagaattcgtggagcaataaagcgaagagcatttgtcaacaacaaaagccacaaagacgtccctgctctgaacttctcaaatatctgactacgaacgatgaccctcctcagaccaaaccagcagagaacaggaacagcagcaaagagaaatgcacctccaaaaggaagccccatctgcagtctcagacaaaccacctgcaagccaaaccaacaagtttatcacttccattgacacctgagtctccaaatgatcccaagggttccccatttgagaacaagactattgaacaaaccttaagtgtggaactctctggaactgcaggcctaactccacctacgacccctcctcataaagccaaccaagataatcctttcaggacttcacctaagccgaagtcatcatgcaagactgttgcaccaccttcaaaaaagccccgttatagtgagtcttccggttctcaaggaaacaaccctgtcaagaagggtccagaacagactgagctgtatgcacagcttagcaagactacagcactgtccagtggacatgaggagagaaagacaaaacggcccagtttgcggctgtttggtgaccatgactattgtcaatctgtgaattcaaagtcggaaatccacattaaaatatcccaggaacttcaggactccagacaactagaatttaaggattcttcacctgggtggcagtgtcagatttgttcttctctagaacaagaccagtatttcaagaaagagactttacagacaagtaagcagggatcccaaggtaataacagaaaacagctccaagaccaggaaattcgggctgaactgaataagcattttggtcaccccagccaagctgtttttgatgaagaagcagataagaccggtgaactaagggacagtgattacagtaatgaacaattttccaaactacctatgtttataaattcaggactagcaatggatggtctctttgatgacagtgaagatgaaagtgataaactatgctacccttgggatggcacacaatcctattcattatttgacgtatcgccttcttgctcttcttttaactctccatgcagagattcagtatctccacccaaatccttattttctcaaagatcccaaaggacacgctctagatcaaggtcctttcctcaacgcaggtcttgttcccgttctccatattcccgatcgagatcaaggtcaccctgtagtagatcctcttcaagatcttgtcactgttatgagtccagccactgtagacaccgagcacaccgaagttctccctcacgtgcaagatcgcgatccagatcaccgtacagtcgcagacccagatatgacagctatgaggaatatcagcatgaaaggctgaagagggaagaataccgcaaagagtatgaaaaacgggaatctgaaagggccaaacaaagggagagacagaggcagaaagcaattgaagagcgtcgtgtgatttacgtgggtaaaatcagacctgacacaacccgaaaagatctgagggaccggtttgaagtttttggtgaaatcgaggagtgcacagtaaatttgcgggatgatggagacagctatggtttcatcacctaccgctatacttgtgatgcctttgctgctcttgagaatggatacactttacgcaggtcaaacgagcctgactttgagctgtacttttgtggacgcaagcagttttgcaagtctaactatgcagacctagattcaaactcagatgattttgatcctgcttccactaaaagcaagtatgactccatggattttgatagtttacttaaagaggcacagcggagcctgcgcaggtaa

本發明還提供了一種用於轉染雞原代成肌細胞的pgc-1α基因過表達慢病毒載體的構建方法，該方法包括以下步驟：

(1)pcr擴增雞pgc-1α基因的cds序列，得到pgc-1α基因片段；

(2)使用限制性內切酶酶切pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5，然後用連接酶連接酶切後的pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5，得到重組連接產物；

(3)將重組連接產物轉化感受態細胞，並進行鑑定，鑑定為陽性結果且序列正確的為構建成功的pgc-1α基因過表達慢病毒載體。

進一步地，步驟(1)中，pcr擴增所用引物對序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

進一步地，根據權利要求2所述的pgc-1α基因過表達慢病毒載體的構建方法，其特徵在於，步驟(2)中，使用notⅰ和nsiⅰ限制性內切酶對pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5進行雙酶切。

進一步地，步驟(2)中，使用t4dna連接酶連接酶切後的pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5。

進一步地，步驟(3)中的感受態細胞為大腸桿菌dh5α。

本發明還提供了一種可用於轉染雞原代成肌細胞的pgc-1α慢病毒的構建方法，使用包裝質粒對所述pgc-1α基因過表達慢病毒載體進行包裝，通過共轉染293t細胞，得到pgc-1α慢病毒。

pgc-1α基因過表達慢病毒載體使用包裝質粒進行包裝後，能夠轉染293t細胞，且轉染效率高。

進一步地，所述包裝質粒為pgag/pol、prev和pvsv-g。

本發明還提供了一種應用所述pgc-1α慢病毒的構建方法構建得到的pgc-1α慢病毒。

本發明還提供了一種所述pgc-1α基因過表達慢病毒載體或所述pgc-1α慢病毒在雞成肌細胞中過表達pgc-1α基因研究中的應用。

pgc-1α慢病毒能夠轉染雞原代成肌細胞，轉染效率高，且可長效穩定在雞原代成肌細胞中過表達pgc-1α基因。與常用的鼠成肌細胞c2c12細胞系來說，pgc-1α慢病毒轉染雞原代成肌細胞，更能真實反映pgc-1α基因在雞骨骼肌中過表達的體內的狀態。

為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例對本發明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護範圍。在描述本下述實施例中，凡未註明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件、實驗手冊中的條件。

實施例1

pgc-1α基因過表達慢病毒載體(lv5-pgc-1α)的構建方法，包括以下步驟：

(1)根據genbank中登錄的雞pgc-1α基因序列號nm_001006457.1，人工合成雞pgc-1α基因的cds序列，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

(2)根據雞pgc-1α基因的cds序列，設計上下遊引物，引物序列如下：

pgc-1α-f：

gcggccgcgccaccatggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgac(含notⅰ酶切位點)

pgc-1α-r：

atgcatttacctgcgcaggctccgctgtgcctctttaagta(含nsiⅰ酶切位點)

(3)以人工合成的雞pgc-1α基因的cds序列為模板，使用高保真pfudna聚合酶，通過上下遊引物pgc-1α-f、pgc-1α-r進行pcr擴增，其反應體系和反應程序如下：

反應體系(50μl)：

反應程序：

(4)將上述pcr產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果並回收pgc-1α基因片段；

(5)用notⅰ和nsiⅰ限制性內切酶分別對回收的pgc-1α基因片段和慢病毒載體lv5進行雙酶切，37℃酶切2h，反應體系如下：

反應體系(50μl)：

(6)對酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果並回收pgc-1α基因片段和線性化的慢病毒載體lv5；

(7)用t4dna連接酶將pgc-1α基因片段和線性化慢病毒載體lv5，22℃水浴連接2h，連接體系如下：

連接體系(20μl)：

(8)將重組連接產物轉化感受態大腸桿菌dh5α：從-70℃中取出感受態大腸桿菌dh5α，冰上放置，待感受態大腸桿菌dh5α解凍後，加入10μl重組連接產物，輕柔混勻內容物，在冰上放置30min，42℃水浴熱激90sec，快速將離心管轉移到冰浴中，冷卻3min，加入800μl不含抗生素的lb培養基，37℃震蕩培養(150rpm)1h，取200μl塗布於含50μg/mlampicillinlb平板上，37℃培養16h。

(9)挑取數個菌落，抽提質粒並酶切鑑定挑出陽性克隆：從步驟(8)培養的平板上挑取4個單獨、飽滿的菌落，置於含有5ml(含50μg/mlampicillin)lb培養基的試管中，37℃震蕩培養(200rpm)16h，用質粒小提試劑盒(天根生化，dp104-02)抽提質粒，將抽提的質粒用notⅰ和nsiⅰ限制性內切酶進行雙酶切鑑定，酶切反應體系如下：

反應體系(10μl)：

37℃酶切1h，1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察酶切條帶，如附圖3所示，鑑定正確的克隆即為陽性克隆。

(10)將陽性克隆對應的菌液，送生物公司測序，將測序結果與雞pgc-1α基因的cds序列進行比對，比對正確的克隆即為構建成功的pgc-1α基因過表達慢病毒載體lv5-pgc-1α，pgc-1α基因過表達慢病毒載體lv5-pgc-1α的圖譜如附圖2所示。未整合的慢病毒載體的圖譜如附圖1所示。

實施例2

pgc-1α基因過表達慢病毒lv5-pgc-1α包裝，按照上海吉瑪製藥技術有限公司提供的病毒包裝說明書進行，具體包括以下步驟：

(1)用胰蛋白酶消化處於對數生長期的239t細胞，將5×106個細胞懸液接種15cm培養皿，加入18ml含10％fbs的dmem培養液，混勻後置於37℃、5％co2培養箱過夜培養；

(2)轉染混合物的製備：在5ml無菌離心管中加入1.5ml無血清dmem，將pgc-1α基因過表達慢病毒載體lv5-pgc-1α與包裝質粒pgag/pol、prev和pvsv-g，總量為25μg，按7:5:5:3比例混勻加入，取另一支無菌的5ml離心管，加入1.5ml無血清dmem，再加入300μlrna-mate混勻，室溫放置5min後將兩管混合，室溫放置20～25min；

(3)將15cm培養皿中的培養液換成8ml無血清的dmem，將轉染混合物逐滴加入，輕輕地前後搖晃培養皿以混勻複合物，置於37℃、5％co2培養箱中溫育4～6h；

(4)吸棄轉染液，加入18ml含10％fbs的dmem培養液，37℃、5％co2培養箱繼續培養72h；

(5)病毒收集：收集培養72h的轉染293t細胞上清，4℃，4000rpm離心4min後，將離心管上清液用0.45μm過濾器過濾，4℃，20000rpm離心2h，將濃縮液收集分裝至指形管中，-80℃保存；

(6)病毒滴度檢測：用胰蛋白酶消化處於對數生長期的239t細胞，按3×104個細胞/孔的濃度接種96孔板，37℃、5％co2培養箱24h，將上述步驟的病毒原液10μl，用10％fbs的dmem培養液10倍稀釋3-5個梯度，吸去96孔板中的培養液，加入不同稀釋度的病毒液，每孔100μl，每個梯度設3個重複，37℃、5％co2培養箱繼續培養72h，螢光顯微鏡計數螢光細胞，結合稀釋倍數計算病毒滴度。確保得到的病毒滴度不低於1×108tu/ml。

實施例3

雞成肌細胞的分離提取，具體包括以下步驟：

(1)用70％乙醇消毒11胚齡的雞胚，在其鈍端用鑷柄敲開蛋殼，用無菌的鑷子移去蛋殼帽，暴露出氣室；

(2)換用乾淨的鑷子，移去蛋殼膜，再次換用乾淨的鑷子，輕夾雞胚頸部，將雞胚移入盛有無菌pbs緩衝液培養皿中；

(3)用乾淨的鑷子去除雞胚腿部皮膚，用剪刀將雞胚腿部剪至另一個盛有5ml20％fbs的dmem培養皿中；

(4)仔細分離肌肉，去除骨骼等非肌肉組織；

(5)用剪刀儘量剪碎肌肉組織，將含有剪碎肌肉組織的培養液移入50ml離心管中，加至約20ml；

(6)在渦旋振蕩器上高速震蕩1min，靜置，待較大的組織塊沉澱後，吸取上清液，用200目尼龍膜過濾；

(7)用培養液重懸離心管內組織，重複步驟(6)；

(8)將過濾的培養液移入細胞培養皿中，置於37℃、5％co2培養箱中進行差速貼壁2次：培養40min後，將細胞上清液移入新的細胞培養皿中，繼續置於37℃、5％co2培養箱培養40min；

(9)將細胞上清液移入新的細胞培養皿中，置於37℃、5％co2培養箱培養過夜；

(10)用0.25％的胰蛋白酶消化細胞，計數後接種於細胞板中。

實施例4

pgc-1α基因過表達慢病毒lv5-pgc-1α轉染雞成肌細胞的方法，具體包括：

(1)感染預實驗：待接種至96孔板的雞成肌細胞達到50％匯合時，吸棄細胞上清，加入含不同梯度pgc-1α基因過表達慢病毒lv5-pgc-1α的培養基100μl，同時將空載體慢病毒lv5-nc感染的雞成肌細胞以及未感染病毒的雞成肌細胞c設為對照，每個病毒梯度重複3個孔，置於37℃、5％co2培養箱培養24h，更換新鮮培養基，繼續培養培養48h後，觀察螢光表達情況。確定pgc-1α基因過表達慢病毒lv5-pgc-1α和慢病毒空載體lv5-nc對照感染雞成肌細胞的合適moi值；

(2)正式實驗：待接種至六孔板的雞成肌細胞達到50％匯合時，吸棄細胞上清，加入含有最適moi值的moi值培養基，同時設慢病毒空載體lv5-nc感染雞成肌細胞以及未感染病毒的成肌細胞c為對照，每組設3個重複孔。分別收集感染後1、4、9天的細胞，用於測定pgc-1α基因、pax7基因、myod基因、myog基因、sm基因、fwm基因的mrna表達水平以及pgc-1α蛋白表達水平。如附圖4-10所示，雞成肌細胞過表達pgc-1α基因第1-9天時，過表達感染組(lv5-pgc-1α組)pgc-1αmrna表達顯著高於空載體感染組(lv5-nc組)和未感染組(c組)；感染第9天時，過表達組pgc-1α蛋白表達量顯著高於空載體組和未感染組；慢肌肌球蛋白重鏈sm基因、生肌調節因子myod、myog基因以及骨骼肌特異性轉錄因子pax7基因的mrna表達顯著提高，快白肌肌球蛋白重鏈fwm基因mrna表達顯著下調。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明實質內容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

sequencelisting

江蘇省家禽科學研究所

pgc-1α基因過表達慢病毒載體、pgc-1α慢病毒及構建方法和應用

3

patentinversion3.5

1

2388

dna

人工序列

1

atggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgacatcgagtgtgctgctctg60

gttggtgaagaccagcctctttgcccagatctcccagaacttgacctctccgaactagac120

gtgaacgacctggatgcagacagcttcctgggggggctcaagtggtacagcgaccagtct180

gaggtcatctccagccagtacagcaatgagcctgccaacatctttgagaaaatagatgaa240

gagaatgaggcaaacttgctagcagttctcactgagacactggacagcatccctgtggat300

gaggatggattgccttcatttgatgcactgacagatggagatgtgaccaatgaacatgac360

gccagcccttccccgatgcccgacggcacccctccgccccaggaggcagaagagccgtct420

ctactcaagaagctcttgctggctccagccaacactcagctaaattacaatgaatgcagt480

ggtctcagcacacaaaaccatgcgaacacaaatcacaggatcagaacaagccctgtggtt540

gttaagactgagaattcgtggagcaataaagcgaagagcatttgtcaacaacaaaagcca600

caaagacgtccctgctctgaacttctcaaatatctgactacgaacgatgaccctcctcag660

accaaaccagcagagaacaggaacagcagcaaagagaaatgcacctccaaaaggaagccc720

catctgcagtctcagacaaaccacctgcaagccaaaccaacaagtttatcacttccattg780

acacctgagtctccaaatgatcccaagggttccccatttgagaacaagactattgaacaa840

accttaagtgtggaactctctggaactgcaggcctaactccacctacgacccctcctcat900

aaagccaaccaagataatcctttcaggacttcacctaagccgaagtcatcatgcaagact960

gttgcaccaccttcaaaaaagccccgttatagtgagtcttccggttctcaaggaaacaac1020

cctgtcaagaagggtccagaacagactgagctgtatgcacagcttagcaagactacagca1080

ctgtccagtggacatgaggagagaaagacaaaacggcccagtttgcggctgtttggtgac1140

catgactattgtcaatctgtgaattcaaagtcggaaatccacattaaaatatcccaggaa1200

cttcaggactccagacaactagaatttaaggattcttcacctgggtggcagtgtcagatt1260

tgttcttctctagaacaagaccagtatttcaagaaagagactttacagacaagtaagcag1320

ggatcccaaggtaataacagaaaacagctccaagaccaggaaattcgggctgaactgaat1380

aagcattttggtcaccccagccaagctgtttttgatgaagaagcagataagaccggtgaa1440

ctaagggacagtgattacagtaatgaacaattttccaaactacctatgtttataaattca1500

ggactagcaatggatggtctctttgatgacagtgaagatgaaagtgataaactatgctac1560

ccttgggatggcacacaatcctattcattatttgacgtatcgccttcttgctcttctttt1620

aactctccatgcagagattcagtatctccacccaaatccttattttctcaaagatcccaa1680

aggacacgctctagatcaaggtcctttcctcaacgcaggtcttgttcccgttctccatat1740

tcccgatcgagatcaaggtcaccctgtagtagatcctcttcaagatcttgtcactgttat1800

gagtccagccactgtagacaccgagcacaccgaagttctccctcacgtgcaagatcgcga1860

tccagatcaccgtacagtcgcagacccagatatgacagctatgaggaatatcagcatgaa1920

aggctgaagagggaagaataccgcaaagagtatgaaaaacgggaatctgaaagggccaaa1980

caaagggagagacagaggcagaaagcaattgaagagcgtcgtgtgatttacgtgggtaaa2040

atcagacctgacacaacccgaaaagatctgagggaccggtttgaagtttttggtgaaatc2100

gaggagtgcacagtaaatttgcgggatgatggagacagctatggtttcatcacctaccgc2160

tatacttgtgatgcctttgctgctcttgagaatggatacactttacgcaggtcaaacgag2220

cctgactttgagctgtacttttgtggacgcaagcagttttgcaagtctaactatgcagac2280

ctagattcaaactcagatgattttgatcctgcttccactaaaagcaagtatgactccatg2340

gattttgatagtttacttaaagaggcacagcggagcctgcgcaggtaa2388

2

56

dna

人工序列

2

gcggccgcgccaccatggcgtgggacatgtgcaaccaggactctgtatggagtgac56

3

41

dna

人工序列

3

atgcatttacctgcgcaggctccgctgtgcctctttaagta41