豬肉質性狀相關基因btg3及製備方法和應用的製作方法

2023-05-02 09:23:31

專利名稱：豬肉質性狀相關基因btg3及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及一種豬肉質性狀相關基因BTG3， 還涉及一種豬肉質性狀相關基因BTG3的製備方法，同時還涉及一種豬肉質性狀相關基因 BTG3的用途。
背景技術：
我國的養豬歷史長達5000餘年，豬肉是我國人民的主要肉食品。多年以來，我國 的養豬生產以自給自足為主，育種方面進展很少。近現代歐美國家利用現代育種手段，以 提高生長速度、減少飼料消耗、增加瘦肉率為主要目標，使豬的生長速度和瘦肉率大幅度提 高。但伴隨著生產水平的提高，豬肉品質卻大大降低了。隨著我國社會經濟的發展，人們飲 食觀念發生從「吃飽」到「吃好」的變化，消費者對豬肉品質的要求越來越高。因此，在提高 豬的瘦肉率時如何兼顧肌肉品質成為當今豬育種工作的重點。20世紀80年代以來，隨著分子生物學及遺傳學的發展，豬的定向育種工作效率 大為提高。目前，標記輔助選擇(MAS)、影響豬重要數量性狀的基因組區域定位(QTL)、用 基因組掃描(genome scanning)法和候選基因法(Candidate gene approach)研究影響 豬重要經濟性狀的主效基因(Economic traits loci, ETLs)已經成功地應用到國內外 的豬育種實踐當中。其中，通過對氟烷(Hal)基因的基因型進行直接選擇以降低豬只的 應激敏感性、提高豬肉品質，有商業價值的氟烷基因基因型的簡化DNA檢測法已成為專利 並得到廣泛應用(彭中鎮等，豬數量性狀基因及其標記研究進展.國外畜牧科技，1999， 26(1) :28_32) ο Le Roy 等(LeRoy 等，Evidence for a new major gene influencing meat quality in pigs. Genet Res, 1990, 55 (1) 33-40)在漢普夏豬及其雜種中發現不利 等位基因RN-可使肌肉中肌糖原含量升高，終端pH值降低，造成酸肉和烹調損失，豬肉工 藝學品質下降，影響火腿的產量。Casas-Carrillo等(Casas-Carrillo等，Relationship of growth hormone and insulin-like growth factor-1 genotypes with growth and carcass traits in swine. Anim Genet, 1997,28(2) :88_93.)在以 6 頭公豬與 18 頭無相 關的母豬雜交群體中，發現在一個公豬家系中位於豬5號染色體上的類胰島素樣生長因 子1 (Insulin like growth factor 1，IGF-1)基因型與斷奶後日增重存在連鎖(L0D = 2.3)。Milan 等(Milan 等，A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle. Science, 2000, 288 (5469) 1248-51)通過對候選區域 進行大規模的測序分析，發現單磷酸腺苷活化酶Y 3亞基基因(AMP-activated protein kinase (AMPK)，y-subunit 3，PRKAG3)編碼第200位胺基酸的密碼子的錯義突變與漢普 夏豬的酸肉表型直接相關，RN豬的該位點均為不利的等位基因Q(即穀氨醯胺)。Te Pas 等(Te Pas 等，Influences of myogenin genotypes on birth weight, growth rate， carcass weight, backfat thickness，and lean weight of pigs. J Anim Sci，1999，77 2352-2356)在兩個大白豬群中檢測了 myogemn基因的多態性，分析發現不同基因型的個體 在出生重、生長速度和瘦肉量等性狀上有顯著差異。對兩個選擇系肌肉的MyoD基因家族成員mRNA表達水平比較發現F-系(選擇生長速度)中myogenin、myf_5、MyoD的mRNA表達 水平比L-系(選擇瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚與成肌細胞的表達成負相關(Te Pas等， Messenger ribonucleic acid expression of the myoD gene family in muscle tissue at slaughter in relation toselection for porcine growth rate. J Anim Sci,2000, 7 69-77)。本研究室長期以來致力於豬重要功能基因的分離鑑定工作，曾經利用代表性差 異顯示技術、基因晶片技術、基因表達序列分析技術(SAGE)等分離了一些與經濟性狀有 關的基因，並對其中一些效應顯著的基因進行了功能分析。BTG3基因正是從長白和通城 豬胚胎發育不同時期的骨骼肌SAGE文庫中篩選出來的對骨骼肌發育具有顯著影響的基 因，它是抗增殖基因家族BTG/T0B家族成員之一，該家族成員蛋白質N端110個胺基酸具 有高度同源性，這個同源區包括兩個短的、高度保守的同源區A-box和B-box，A-box具有 抗增殖作用，B-box具有同許多靶分子結合的功能。越來越多的研究表明，該基因家族成 員抑制多種細胞的增殖並刺激它們的分化(Matsuda等，In search of a function for theTIS21/PC3/BTG2/T0B family. FEBS Lett，2001，497 :67_72 ；Winkler GS.Themammalian anti-pro1iferative BTG/Tob protein family. J Cell Physiol. 2010. 222(1) :66_7)。 BTGl基因已被國外多個研究證明對成肌細胞的分化具有強烈的剌激作用(Matsuda等， In search of a function for the TIS21/PC3/BTG1/T0B family. FEBS Lett，2001，497 : 67-72 ；Busson 等，Coactivation of nuclear receptors and myogenic factorsinduces the major BTGl influence on muscle differentiation.Oncogene，2005，24 (10) 1698-710)，BTG3基因主要依賴p53發揮抗細胞增殖的作用，被認為對血管形成、神經形 成和骨形成過程有重要影響(Yoshida 等，ANA, a novel member ofTob/BTGl family, is expressed in the ventricular zone of the developing central nervous system. Oncogene,1998. 16 2687-2693 ；Rahamani, APR04 negatively regulates Src tyrosine kinase activity in PC12 cells. J Cell Sci,2006. 119(4) :646_658 ;0u 等，The candidate tumor suppressor BTG3 is a transcriptional target of p53 thatinhibits E2F1. EMBO J, 2007. 26(17) =3968-3980) 申請人的研究表明，BTG3基因與BTGl基因對成肌 細胞早期發育的影響相似但效應比BTGl基因更大，它可能在豬胚胎期先促進骨骼肌細胞 的增殖即肌纖維數目的增多，然後促進肌細胞的分化，這兩方面對於肌肉的產量和質量均 具有顯著影口向(Feng 等，Molecular characterization of the BTG2 and BTG3 Genes in fetal muscle development of lean and fatty pig breeds. Gene,2007. 403 :170-177)。 Rehfeld認為肌纖維的數量和體積的遺傳變異與遺傳力很高(Rehfeld等，Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection. Livestock Production Science, 2000,66 :177-188)，因而利用影響肌纖維早期發育的基因進行育種 選擇能定向改造豬的肉質和生長性狀。到目前為止，除申請人之外，仍沒見到研究豬BTG3基因功能的報導。研究突變位 點在群體中的多態性，並進行性狀關聯分析是研究基因功能的有力手段。申請人研究了豬 BTG3基因多態性以及基因型與性狀關聯分析，發現了顯著影響豬肉質性狀的分子標記。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種豬肉質性狀相關基因BTG3，該基因是一種抗增殖 基因，能夠抑制成肌細胞的增長，促其分化成肌纖維，該基因的低表達能使動物獲得更快的 肌肉生長速度。本發明的另一個目的是在於提供了一種豬肉質性狀相關基因BTG3的製備方法， 方法易行，操作簡便，利用該方法能夠簡單快速高效的獲得目的基因。本發明的再一個目的是在於提供了一種豬肉質性狀相關基因BTG3在豬標記輔助 選擇中的應用，在檢測位點為CT基因型的個體具有較好的肌肉嫩度。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施一種豬肉質性狀相關基因BTG3，它的cDNA序列為SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。PCR擴增的BTG3基因的目的片段全長為135bp，其序列如附圖2所示。所獲得的BTG3基因目的片段的DNA序列中有如附圖2所示的C47-T47的鹼基突 -^iji Mvu I-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ■生。一種豬肉質性狀相關基因BTG3的製備方法，其步驟是1、引物設計用人BTG3基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM_006806)為信息探針，利用NCBI 中的BLAST工具在GenBank豬EST資料庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90% 以上的豬ESTs (片段長度大於IOObp)序列，然後用DNAstaH網上下載地址http://WWW. dnastar. com/forms, aspx ？ forms = reg)中的 Se#an 程序構建豬 EST-重疊群，並獲得由 重疊群拼接構成的一致序列(consensus)，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。將獲得 的一致序列與人的mRNA作同源性比對以確認序列的正確性。然後用Primer Premier 5.0 軟體(網上下載地址:http://www. premierbiosoft. com/primerdesign/index, html)設計 引物擴增BTG3基因CDNA782 916位點間長度為135bp的片段。引物序列如下B3P0LF :5，-GATATTCCCACCTCTTCCA-3，(正向)，B3P0LR :5，-GGTTTATTCTTCCTTCCCT-3，(反向)；2、PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1. 5mL EpendorfT管中，然後用PCR產物純化試劑盒(Tiangen，Bei jing)純化PCR產物，按照試劑 盒說明書操作，具體步驟是每IOOmg的凝膠中300 μ L的Sl液，於65°C溫育IOmin至凝膠完 全融化，將含有DNA的Sl液轉入回收柱，9200g離心30s，使漿液通過Minicolumn擠出。將 下面管子中的廢液倒掉，再加入500 μ L的Wl液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。 再加入 500 μ L 的 Wl 液，靜置 lmin, 9200g 離心 30s，取下 Minicolumn 裝入 1. 5ml Ependoff 管中，加入25 μ L的滅菌水或者TE液，靜置Imin之後，9200g離心lmin，以洗脫DNA存於 Ependorff 管中。3、連接反應將純化的PCR產物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)連接，連接 反應總體積是5μ 1，其中包括2. 5μ 1 2Χ ligation buffer，0. 5 μ 1載體，1 μ 1純化PCR產 物，最後加入1 μ 1滅菌水置4°C水浴過夜。4、感受態細胞的製備從37°C培養了 16 20h的新鮮平板上挑取一個DH5 α單 菌落(promega,USA)接種於2ml LB中，於37°C振蕩培養3h，轉接Iml菌液於含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37°C振蕩培養約4h，待OD6tltl達到0. 3 0. 4時將鹽水瓶從搖床取出置 冰浴冷卻10 15min，然後將菌液轉入離心管中於4°C 4，OOOg離心IOmin以收集細胞，將 離心管倒置以棄淨培養液，用IOml冰預冷的0. lmol/L的CaC12重懸沉澱，冰浴30min，重 復4°C 4，OOOg離心IOmin —次，用4ml冰預冷的0. lmol/L的CaC12重懸沉澱，置4°C保存5、轉化無菌狀態下取100 120 μ 1感受態細胞於1. 5ml Ependorff管 中，將5μ 1的連接產物加入混勻，在冰上放置30min後42°C熱激90s，其間不要搖動 Ependorff管，取出後冰浴3 4min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體養基，37 V振蕩 培養45min。取100 μ 1塗布於已提前4h塗布了異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG， Isopropylthio-β -D-galactoside)和 X_gal 的含 Amp 的瓊脂平板上，37°C平放 Ih 後倒置 培養。克隆子通過PCR鑑定為陽性的用於送上海英駿生物技術有限公司測序。將大白、 杜洛克和梅山三個品種的各一個克隆子分別測序或混合測序，測序結果用Seqman 軟體 (網上下載地址:http//www. dnastar. com/forms, aspx ？ forms = reg)比對尋找 SNPs,測 序結果顯示在該片段47bp處存在C、T鹼基突變，該處C-T的改變造成胺基酸由脯氨酸變為 絲氨酸。一種分離的豬肉質性狀基因BTG3，其序列為SEQUENCE NO. 1所示的核苷酸序列。一種豬肉質性狀相關基因BTG3在豬標記輔助選擇中的應用，其應用過程是1、豬BTG3基因部分DNA序列的克隆合成弓I物 B3P0LF :5，-GATATTCCCACCTCTTCCA-3，(正向),B3P0LR 5，-GGTTTATTCTTCCTTCCCT-3，(反向)擴增 BTG3 基因 cDNA 782 916 位點間長度為 135bp的片段。PCR擴增反應體系為20 μ 1，其中DNA模板1 μ 1，IXPCR buffer (Promega, USA),0. 3 μ M of each primer,1. 5mM MgC12, 75 μ M of each dNTPs,IUTaq DNA polymerase (Promega, USA)。PCR 擴增程序95 V 5min,循環 35 次，94°C 30s, 55 °C 20s, 72°C 20s，最後72°C延伸5min。PCR擴增產物經3% (質量比)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫 外燈下拍照結果顯示均為135bp特異擴增片段(詳見圖2)。2、PCR-RFLP診斷方法建立擴增的PCR產物用MvaI進行酶切，PCR產物酶切反應體積是5 μ 1，其中 IXbufferO. 5 μ 1，PCR產物3 μ 1，限制性內切酶0. 3 μ 1 (10U)，用Η20補足5 μ 1，將樣品混 勻後離心，37°C酶切4-8h。用3% (質量比)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，凝膠成像系統 成像，記錄基因型。酶切後共產生三種基因型，其中CC基因型有48bp和87bp兩條帶，雜合 子CT型有135bp，48bp和87bp三條帶，TT型只有135bp—條帶，用3% (質量比)的瓊脂 糖凝膠電泳檢測能明顯的判別帶型(圖4)。3、標記性狀關聯分析在利用PCR-RFLP方法對樣本進行基因分型後，通過PopGen 32軟體(網上下載) 計算其各SNPs位點在品種之間的X2值以及檢驗差異顯著性的P值，應用SPSS軟體中的 廣義線性模型程序來分析基因型與生產性狀的關聯。分析模型如下Yijkl = μ +G.+Bj+S,+ ε iJklYijkl表示觀測值，μ表示均值，Gi表示基因型效應，Bj表示組合效應，Sk表示性別 效應，ε iJkl表示殘差，假定服從N(0，I σ 2)分布。
應用該模型對每個性狀進行分析並獲得一個經校正的表型值，然後以經校正的表 型值作為新的性狀值，再建立如下的分析模型Yij = μ +GENOTYPEi+ εYij是新的性狀值，μ是新的性狀值的總體均值，GENOTYPEi為基因型效應，ε 為 隨機誤差，假定服從Ν(0，σ2)分布。應用該模型即可分析出基因型效應，並進行基因型效應間的多重比較。本發明為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標記。依照本發明，豬生產性狀基因 BTG3可以用於豬標記輔助選擇中。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果簡單高效，假陽性率低，檢出率高； 用於豬育種中能夠早期選種、活體選種，縮短世代間隔，節約時間和成本，大大加快豬育種 速度。


圖1為一種豬肉質性狀相關基因BTG3製備方法的流程圖；圖2為一種豬肉質性狀相關基因BTG3第五外顯子區擴增序列的電泳圖譜；片段大小為135bp (瓊脂糖膠濃度為2% )。M :DNA分子量標準(DL20001adder)；圖3為一種豬肉質性狀相關基因BTG3測序發現的47bp處存在C、T兩個等位基 因；圖4為一種豬肉質性狀相關基因BTG3第五外顯子區的MvaI-RFLP兩種基因型電 泳圖譜；M =DNA分子量標準(DL20001adder)圖5為一種豬肉質性狀相關基因BTG3核苷酸序列表。
具體實施例方式實施例1 —種豬肉質性狀相關基因BTG3的製備方法，其步驟是A、引物設計用人BTG3基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM_006806)為信息探針，利用NCBI 中的BLAST工具在GenBank豬EST資料庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以 上的豬ESTs (片段長度大於IOObp)序列，然後用DNAstar中的SeqMan程序(網上下載) 構建豬EST-重疊群，並獲得由重疊群拼接構成的一致序列(consensus)，核苷酸序列如序 列表SEQ ID N0:1所示。將獲得的一致序列與人的mRNA作同源性比對以確認序列的正確 性。然後用Primer Premier5. 0軟體(網上下載)設計引物擴增BTG3基因cDNA782 916 位點間長度為135bp的片段。引物序列如下B3P0LF :5，-GATATTCCCACCTCTTCCA-3，(正向)，B3P0LR :5，-GGTTTATTCTTCCTTCCCT-3，(反向)；B、PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放 入1.5mL Ependorff管中，然後用PCR產物純化試劑盒(Tiangen，Bei jing)純化PCR產物， 按照試劑盒說明書操作，具體步驟是每IOOmg的凝膠中300 μ L的Sl液，於65°C溫育IOmin至凝膠完全融化，將含有DNA的Sl液轉入回收柱，9200g離心30s，使漿液通過Minicolumn 擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500μ L的Wl液至管中，9200g離心15s，倒掉管中 的廢液。再加入500 μ L的Wl液，靜置lmin, 9200g離心30s,取下Minicolumn裝入1. 5ml Ependorff管中，加入25 μ L的滅菌水或者TE液，靜置Imin之後，9200g離心lmin，以洗脫 DNA 存於 Ependorff 管中。C、連接反應將純化的PCR產物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)連接，連接 反應總體積是5μ 1，其中包括2. 5μ 1 2Χ ligation buffer，0. 5 μ 1載體，1 μ 1純化PCR產 物，最後加入1 μ 1滅菌水置4°C水浴過夜。D、感受態細胞的製備從37°C培養了 16 20h的新鮮平板上挑取一個DH5 α單菌 落(實驗室儲備，絕對不能寫實驗室儲備，必須寫明來源或文獻出處)接種於2ml LB中，於 37°C振蕩培養3h，轉接Iml菌液於含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續在37°C振蕩培養約4h，待 OD600達到0. 3 0. 4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10 15min，然後將菌液轉入離心 管中於4°C 4，OOOg離心IOmin以收集細胞，將離心管倒置以棄淨培養液，用IOml冰預冷的 0. lmol/L的CaCl2重懸沉澱，冰浴30min,重複4°C 4，OOOg離心IOmin 一次，用4ml冰預冷 的0. lmol/L的CaC12重懸沉澱，置4°C保存備用。E、轉化無菌狀態下取100 120 μ 1感受態細胞於1. 5ml Ependorff管 中，將5μ 1的連接產物加入混勻，在冰上放置30min後42°C熱激90s，其間不要搖動 Ependorff管，取出後冰浴3 4min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體養基，37 V振蕩 培養45min。取100 μ 1塗布於已提前4h塗布了 IPTG(前面寫明中文字，英文用括號) (Isopropylthio- β -D-galactoside，異丙基硫代 _ β -D-半乳糖苷)和 X-gal 的含 Amp 的 瓊脂平板上，37°C平放Ih後倒置培養。克隆子通過PCR鑑定為陽性的用於送上海英駿生物技術有限公司測序。將大 白、杜洛克和梅山三個品種的各一個克隆子分別測序或混合測序，測序結果用Seqman 軟 件(網上下載)比對尋找SNPs，測序結果顯示在該片段47bp處存在C、T鹼基突變，該處 C-T的改變造成胺基酸由脯氨酸變為絲氨酸。一種分離的豬肉質性狀基因BTG3，其序列為 SEQUENCE NO. 1所示的核苷酸序列。PCR-RFLP-MvaI多態性在各豬品種中的分布情況是1、豬BTG3基因部分DNA序列的克隆合成弓I物 B3P0LF :5，-GATATTCCCACCTCTTCCA-3，(正向),B3P0LR 5『-GGTTTATTCTTCCTTCCCT-3『(反向)擴增 BTG3 基因 cDNA 782 916 位點間長度為 135bp 的片段。PCR擴增反應體系為20 μ 1，其中DNA模板(被檢測豬群血液提取的DNA) 1 μ 1， IXPCR buffer (Promega, USA), 0. 3 μ M of each primer, 1. 5mMMgC12, 75 μ M of each dNTPs, IU Taq DNA polymerase (Promega, USA)。PCR 擴增程序95 °C 5min，循環 35 次， 94°C 30s, 55°C 20s, 72°C 20s，最後72°C延伸5min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，在紫外燈下拍照結果顯示均為135bp特異擴增片段(詳見圖2)。2、PCR-RFLP檢測方法建立擴增的PCR產物用MvaI酶切，PCR產物酶切反應體積是5 μ 1，其中 IXbufferO. 5 μ 1，PCR產物3 μ 1，限制性內切酶0. 3 μ 1 (10U)，用Η20補足5 μ 1，將樣品混 勻後離心，37°C酶切4-8h。用3% (質量比)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，凝膠成像系統成像，記錄基因型。酶切後共產生三種基因型，其中CC基因型有48bp和87bp兩條帶，雜合 子CT型有135bp，48bp和87bp三條帶，TT型只有135bp—條帶，用3% (質量比)的瓊脂 糖凝膠電泳檢測能明顯的判別帶型(見圖4)。3、基因型在各品種中的分布頻率分析利用PCR-MvaI-RFLP方法檢測了七個豬種其中包括大白、長白、杜洛克、通城、二 花臉、清平和江西玉山，這些豬種基本涵蓋各豬種的基因型。通過PopGen32軟體(網上下 載)計算其各SNPs位點在品種之間的x2值以及檢驗差異顯著性的P值，試驗使用的豬種 的基因頻率如表1所示，在七個豬品種中均只檢測到CC和CT基因型，並且各豬品種中都是 C等位基因佔優，其中大白豬的兩個等位基因頻率最接近，長白和杜洛克次之，四個國內品 種豬都是C等位基因佔絕對優勢。表1豬BTG3基因在七個豬品種中的基因型頻率與等位基因頻率
權利要求
一種分離的豬肉質性狀基因BTG3，其序列為SEQUENCE NO.1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的一種豬肉質性狀相關基因ST^J的製備方法，其步驟是A、引物設計用人BTG3基因的mRNA序列為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST 資料庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的豬ESTs序列，用DNAstar中 的SeqMan程序構建豬EST-重疊群，獲得由重疊群拼接構成的一致序列，然後用Primer Premier 5.0軟體設計引物擴增BTG3基因cDNA 782 916位點間長度為135 bp的片段， 引物序列如下B3P0LF :5』 - GATATTCCCACCTCTTCCA -3』，B3P0LR 5' - GGTTTATTCTTCCTTCCCT -3，；B、PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5 mL Ependorff管中，用PCR產物純化試劑盒純化PCR產物，步驟是每IOOmg的凝膠中300 μ L的 Sl液，於65°C溫育IOmin至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉入回收柱，9200g離心30s， 使漿液通過Minicolumn擠出，將下面管子中的廢液倒掉，再加入500 μ L的Wl液至管中， 9200g離心15s，倒掉管中的廢液，再加入500yL的Wl液，靜置lmin，9200g離心30s，取下 Minicolumn裝入1. 5 ml Ependorff管中，加入25 μ L的滅菌水或者TE液，靜置Imin之 後，9200g離心1 min，以洗脫DNA存於Ependorff管中；C、連接反應將純化的PCR產物與pMDIS-T載體連接，連接反應總體積是5μ ，其中 包括2.5 μ 1 2 X ligation buffer, 0. 5 μ 1載體，1 μ 1純化PCR產物，最後加入1 μ 滅 菌水置4°C水浴過夜；D、感受態細胞的製備從37°C培養了16 20 h的新鮮平板上挑取一個DH5ci單菌落接 種於2ml LB中，於37°C振蕩培養3 h，轉接1 ml菌液於含有30 ml LB的鹽水瓶中，繼續 在37°C振蕩培養4h，待0D_達到0. 3^0. 4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻l(Tl5 min, 然後將菌液轉入離心管中於4°C 4，OOOg離心10 min以收集細胞，將離心管倒置以棄淨培 養液，用10 ml冰預冷的0.1 mol/L的CaC12重懸沉澱，冰浴30 min，重複4°C 4，000g離 心10 min 一次，用4 ml冰預冷的0. 1 mol/L的CaC12重懸沉澱，置4°C保存備用；E、轉化無菌狀態下取100 120μ 1感受態細胞於1.5 ml Ependorff管中，將5 μ 1的 連接產物加入混勻，在冰上放置30 min後42°C熱激90 s，取出後冰浴；Γ4 min，加入400 μ 1無抗生素的LB液體養基，37°C振蕩培養45 min，取100 μ 1塗布於已提前4 h塗布了 IPTG和X-gal的含Amp的瓊脂平板上，37°C平放1 h後倒置培養，測序結果顯示在該片段 47bp處存在C、T鹼基突變，該處C-T的改變造成胺基酸由脯氨酸變為絲氨酸。
3.權利要求1所述的一種豬肉質性狀相關基因BTG3在豬標記輔助選擇中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬肉質性狀相關基因BTG3及製備方法和應用，步驟是A、引物設計用人BTG3基因的mRNA序列為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST資料庫中做同源序列篩選，獲得序列；B、PCR產物的純化、克隆和測序PCR產物的純化，在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入管中，用PCR產物純化；C、連接反應將純化的PCR產物與pMD18-T載體連接，滅菌；D、感受態細胞的製備；E、轉化無菌狀態下感受態細胞於管中，將連接產物加入混勻，冰上放置，加入無抗生素的液體養基，振蕩培養，存在C、T鹼基突變。簡單高效，假陽性率低，檢出率高，用於豬育種中能夠早期選種、活體選種，縮短世代間隔，節約時間和成本，大大加快豬育種速度。
文檔編號C12N15/12GK101979573SQ20101053616
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者馮政, 劉貴生, 孫華, 宋忠旭, 彭先文, 李良華, 梅書棋, 武華玉, 黃京書 申請人:湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所