從藍藻中快速分離純化c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法

2023-04-23 15:17:41

專利名稱：從藍藻中快速分離純化c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種從藍藻中快速分離純化c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，屬於藻藍蛋白分離純化技術領域。
技術背景為了研究蛋白質等生物大分子的細胞定位、相互作用及其動態變化，研究人員急需新技 術和新材料來實現對蛋白質等生物大分子的"標識"、"閱讀"和"查詢"。現在常用的螢光 標記，由於螢光染料分子螢光特性的限制(螢光光譜較寬、量子產率低)，遠遠不能適用於 高通量的生物大分子專一標識。藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質複合物，主要存在於藍藻、紅藻、隱藻和少數甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的螢光。在藍藻和紅藻中，由2-3 種藻膽蛋白組成超分子結構藻膽體,形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻 類光合作用的學者提出將藻膽蛋白作為螢光標記物，用於診斷試劑。由於其獨特的優點，藻膽 蛋白和藻膽蛋白標記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。同常用的螢光標記物相比，藻膽蛋白具有下列優點生產過程安全、無毒，光能吸收強， 螢光產率高，超過90%，背景光幹擾和假陽性率低，在pH4-11的範圍內穩定，可以作雙色、 三色和四色標記。所以，這類試劑的應用範圍不斷擴大。但是，由於價格昂貴，尚未應用到 普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限於用細胞流式儀進行的診斷。藻膽蛋白及其診斷試劑主要由美國生產，德國也有產品向我國推銷，英國和我國臺灣正 在研製。最早研製產品的是美國分子探針公司(Molecular Probes, Inc.)現在Sigma公司 共有6種藻膽蛋白產品，藻膽蛋白-Biotin/Avidin標記物12種，RPE-IgG或RPE-IgM12種，RPE 單抗標記物3種。藻膽蛋白生產沿用已公開的實驗室方法。藻膽蛋白蛋白的種類包括異藻藍 蛋白(APC)、藻藍蛋白(PC)、藻紅藍蛋白(PEC)和藻紅蛋白(PE)四大類，其中，藻藍蛋白和藻 紅蛋白根據其光譜特性不同又分為C-藻藍蛋白(CPC)、R-藻藍蛋白(RPC)、C-藻紅蛋白(CPE)、 b-藻紅蛋白(b-PE)、 B-藻紅蛋白(BPE)和R-藻紅蛋白(RPE)。其中存在於藍藻中的C-藻 藍蛋白(CPC)和異藻藍蛋白(APC)是目前最常用的藻膽蛋白螢光探針。我國螺旋藻等藍藻 已經開始了工業化培養，資源非常豐富，是分離純化CPC和APC的很好的材料。國際市場上 決定購、銷關係的主要是價格因素。影響普及型診斷試劑的開發和應用的主要因素也是藻膽 蛋白價格太高。因此，開發CPC和APC的快速高效分離純化技術，實現高純度CPC和APCE 的低成本大量製備，對於CPC和APC在普及型診斷試劑的應用具有重要的意義。 發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種從藍藻中快速分離純化c-藻藍蛋白和異藻藍蛋 白的方法。本發明的技術方案如下從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，步驟如下 (1) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的提取原料為藍藻，採用液氮研磨的方法，使藍藻解體溶解，離心去除細胞殘渣，收集上清液得到c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗提液。(2) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的初步純化將步驟(l)的粗提液，用硫酸銨沉澱法，使c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白從粗提液中沉澱 出來，離心收集沉澱，再用pH5.8 6.0、 20mM磷酸緩衝液溶解並透析，除去硫酸銨，即得c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液。(3) —步法製備高純度C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白將步驟(2)製得的O藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液，用離子交換層析，並用具有恆定的 離子強度、連續pH梯度的緩衝液進行洗脫，分別獲得高純度的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白。優選的，上述步驟(1)中的原料藍藻為單細胞藍藻，具體選自螺旋藻或集胞藻。可以 自行培養或購買。所述步驟(1)具體操作如下取新鮮的藍藻，按重量體積比l: 1 (g/ml或kg/1)加入液氮進行研磨磨碎，然後按鮮藻 重量體積比1: 1 (g/ml或kg/1)加入0.02mol/L磷酸緩衝液(pH5.8~6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，上清液即為C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的粗提液。所述步驟(2)具體操作如下向步驟(1)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度為55 60%(w/v)，放置5 6h，然後在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，取沉澱， 並將沉澱溶於20mM的磷酸緩衝液(pH5.8~6.0)中，將溶有沉澱的磷酸緩衝液進行透析，透 析液即為C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液。上述沉澱與磷酸緩衝液的比例沒有嚴格限定，只 要沉澱能夠完全溶解即可。所述步驟(3)具體操作如下取步驟(2)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液1.5 2.5ml，上瓊脂糖凝膠FF (DEAE Sepharose Fast Flow)離子交換色譜柱，然後用含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩衝液 (pH5.6，)洗脫，再用20mmol/L醋酸緩衝液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L 醋酸緩衝液(pH4.0，含0.05mol/LNaCl)各lOOmL進行梯度洗脫，洗脫速度為1 1.2mL/min， 洗脫曲線見圖l，檢測波長280nm，根據洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純 度的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白(圖2A，圖2B)。優選的，所述步驟(3)中的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經20mmol/L 醋酸緩衝液(pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預先平衡的，規格為0.6X10cm。以上操作步驟如無特別說明，均按本領域常規操作。經吸收光譜檢測，得到的純化CPC，最大吸收峰為615nm，純度A615/A2犯達到了 5.59; 580nm光激發，最大螢光發射峰位於640nm (圖2A)。純化的APC最大吸收峰為650nm， 純度A650/A28o達到了 5.19; 580nm光激發，最大螢光發射峰位於660nm (圖2B)。 一般 認為，A620/A2so和A650/A28o達到4.5以上，就認為CPC和APC己經純化，因此，該一步 法離子交換層析得到的CPC和APC是高純化的。Native—PAGE電泳檢測，分離純化的CPC 和APC分別只有一個條帶，進一步表明分離純化的CPC和APC沒有其它蛋白的汙染(圖3)。 本發明的優良效果在於，以藍藻為材料，應用液氮研磨快速提取CPC和APC，然後經 硫酸銨沉澱進行初步純化，最後根據CPC和APC在較寬的pH範圍內保持穩定的特性和不 同的等電點特性，利用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析技術，用恆定的離子強度、連續pH梯度的緩衝液進行洗脫， 一步法可以同時得到高純度的CPC和APC。本方法省去 了傳統的應用分子篩層析結合離子強度洗脫的離子交換層析的複雜分離純化程序，克服了難 於規模化快速製備的難題，操作簡便，省時省力，對設備要求簡單，得率高，容易大量製備 並且大大降低了 CPC和APC的製備成本，從而為將CPC和APC應用於超靈敏的生物醫學檢測 奠定了基礎，具有很好的應用前景和經濟效益。


圖1是鈍頂螺旋藻CPC和APC連續剃度離子交換層析洗脫曲線(檢測波長280)，峰A 為CPC，峰B為APC。圖2A是圖1的峰A中分離純化的CPC的吸收光譜(實線)和螢光發射光譜(虛線)。 吸收峰分別為615nm， A615/A280達到了 5. 59，表明已經高度純化。用580nm激發，螢光發 射峰位於640腦，與標準螢光發射峰相同。圖2B是圖1的峰B中分離純化的APC的吸收光譜(實線)和螢光發射光譜(虛線)。 吸收峰分別為650nm， A650/A280達到了 5. 19，表明已經高度純化。用580nm激發，螢光發 射峰位於660nm，與標準螢光發射峰相同。圖3分離純化的鈍頂螺旋藻CPC和APC的聚丙烯醯氨凝膠電影(Native — PAGE)電泳 圖譜，泳道1為CPC,泳道2為APC。在Native—PAGE中，CPC和APC都分別只有一個條帶， 進一步說明分離純化的CPC和APC沒有其它蛋白的汙染。
具體實施方式
下面結合說明書附圖和實施例對本發明做進一步闡述，但本發明所保護範圍不僅限於此。實施例1從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，步驟如下(1) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的提取取新鮮的螺旋藻，按重量體積比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然後按鮮藻重量體積比l: 1加入0.02mol/L磷酸緩衝液(pH5.8)，溶解，4'C下，8000 rpm離心15min，上清液即為c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的粗提液。(2) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的初步純化向上述步驟(1)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度 為60%(w/v)，放置5h，然後在4'C下，10000rpm離心10 min，取沉澱，並將沉澱溶於 20mM的磷酸緩衝液(pH5.8)中，將溶有沉澱的磷酸緩衝液進行透析，透析液即為C-藻藍 蛋白和異藻藍蛋白溶液。(3) —步法製備高純度C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白取步驟(2)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液2.0ml，上經20mmol/L醋酸緩衝液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，規格 為0.6X10cm，然後用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩衝液(pH5.6，)洗脫，再用 20mmol/L醋酸緩衝液(pH5.8，含0.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩衝液(pH4.0，含 0.05mol/LNaCl)各100mL進行梯度洗脫，洗脫速度為lmL/min，洗脫曲線見圖l，檢測波 長280腦，根據洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純度的C-藻藍蛋白和異藻藍 蛋白(圖2A，圖2B)。實施例2從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，步驟如下(1) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的提取取新鮮的集胞藻，按重量體積比l: 1 (g/ml)加入液氮研磨磨碎，然後按重量體積比 1: 1加入0.02mol/L磷酸緩衝液(pH6.0)，溶解，4'C下，10000rpm離心10 min，上清液即為c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的粗提液。(2) C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的初步純化向上述步驟(1)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗提液中加入固體硫酸銨，至濃度 為55。/。(w/v)，放置6h，然後在4。C下，8000 rpm離心15min，取沉澱，並將沉澱溶於20mM 的磷酸緩衝液(pH6.0)中，將溶有沉澱的磷酸緩衝液進行透析，透析液即為C-藻藍蛋白 和異藻藍蛋白溶液。(3) —步法製備高純度C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白取步驟(2)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液2.5ml，上經20mmol/L醋酸緩衝液 (pH5.8，含0.05mol/LNaCl)預先平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，規格 為0.6X10cm，然後用含O.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩衝液(pH5.6，)洗脫，再用 20mmol/L醋酸緩衝液(pH5.8,含O.05mol/L NaCl)和20mmol/L醋酸緩衝液(pH4.0，含 O.05mol/L NaCl)各lOOmL進行梯度洗脫，洗脫速度為1.2mL/min，洗脫曲線見圖1，檢測 波長280nm，根據洗脫曲線分別收集蛋白峰A和蛋白峰B，得到高純度的C-藻藍蛋白和異藻 藍蛋白(圖2A，圖2B)。
權利要求
1、從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，步驟如下(1)原料為藍藻，採用液氮研磨的方法，使藍藻解體溶解，離心去除細胞殘渣，收集上清液得到C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗提液；(2)將步驟(1)的粗提液，用硫酸銨沉澱法，使C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白從粗提液中沉澱出來，離心收集沉澱，再用pH5.8～6.0、20mM磷酸緩衝液溶解並透析，除去硫酸銨，即得C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液；(3)將步驟(2)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液，用離子交換層析，並用具有恆定的離子強度、連續pH梯度的緩衝液進行洗脫，分別獲得高純度的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白。
2、 如權利要求l所述的從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，其特 徵在於，所述步驟(1)具體如下取新鮮的藍藻，按重量體積比1: 1加入液氮研磨磨碎，然後按重量體積比1: 1加入0.02mol/L磷酸緩衝液(pH5.8 6.0)，溶解，4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10min 15min,上清液即為c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的粗提液。
3、 如權利要求l所述的從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，其特 徵在於，所述藍藻為單細胞藍藻，選自螺旋藻或集胞藻。
4、 如權利要求1所述的從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，其特 徵在於，所述步驟(2)具體操作為向上述步驟(1)得到的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白粗 提液中加入固體硫酸銨，至濃度為55 60%，重量體積比，放置5 6h，然後在4。C下，8000 rpm 10000rpm離心10 min 15min，取沉澱，並將沉澱溶於pH5.8 6.0的20mM的磷酸緩衝 液中，將溶有沉澱的磷酸緩衝液進行透析，透析液即為C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液。
5、 如權利要求l所述的從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，其特 徵在於，所述步驟(3)具體操作如下取步驟(2)製得的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白溶液1.5 2.5ml，上DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱，然後用pH5.6、含0.05mol/LNaCl的20mmol/L醋酸緩衝液洗脫，再 用pH5.8、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸緩衝液和pH4.0、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸緩衝液各lOOmL進行梯度洗脫，洗脫速度為1 1.2mL/min，檢測波長280nm，根據洗脫曲線分別收集c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白，得到高純度的c-藻藍蛋白和異藻藍蛋白。
6、 如權利要求5所述的從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，其特 徵在於，所述DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱是經pH5.8、含0.05mol/L NaCl的 20mmol/L醋酸緩衝液預先平衡的，規格為0.6X lOcm。
全文摘要
一種從藍藻中快速分離純化C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白的方法，屬於藻藍蛋白分離純化技術領域。本發明應用經凍溶和低離子強度溶漲快速提取C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白，然後經硫酸銨沉澱進行初步純化，最後利用瓊脂糖凝膠FF(DEAE Sepharose Fast Flow)離子交換層析技術，用恆定的離子強度、pH梯度的緩衝液進行洗脫，一步法可以得到高純度的C-藻藍蛋白和異藻藍蛋白。本方法操作簡便，省時省力，對設備要求簡單，得率高並且大大降低了CPC和APC的製備成本，從而為將CPC和APC應用於超靈敏的生物醫學檢測奠定了基礎。
文檔編號C07K1/30GK101240010SQ20081001440
公開日2008年8月13日 申請日期2008年2月28日 優先權日2008年2月28日
發明者周百成, 張熙穎, 張玉忠, 陳秀蘭, 顏世敢 申請人:山東大學