具有提高的脅迫耐受性和產量的轉基因植物的製作方法

2023-12-03 01:58:51

專利名稱:具有提高的脅迫耐受性和產量的轉基因植物的製作方法
具有提高的脅迫耐受性和產量的轉基因植物發明領域[oooii本發明總體上涉及過量表達編碼多肽的核酸序列的轉基因植 物，其中所述的多肽能夠賦予正常的或非生物脅迫條件下提高的脅迫耐受 性並且因而賦予增加的植物生長和作物產量。此外，本發明涉及編碼多肽 的新的經分離核^列，其中所述的多肽賦予植物在非生物脅迫條件下提 高的耐受性，和/或在正常的或非生物脅迫條件下增加的植物生長和/或產發明背景[00021非生物的環境脅迫如乾旱、鹽度、熱和寒冷是植物生長和作物 產量的主要限制性因素。作物產量在本文中定義為每英畝收穫的相關農產 品(如穀粒、飼草或種子)的蒲式耳數。由這些脅迫引起的主要作物如大豆、 稻、玉米、棉屬植物、和小麥的作物損失和作物產量損失代表了重要的經 濟和政治因素並且在眾多不發達國家造成食物短缺。[0003]水分有效性(water availability)是諸多非生物脅迫和它們對植物 生長影響的一個重要方面。連續暴露於乾旱條件造成植物代謝方面的重大 改變，所述重大改變最終導致細胞死亡並且因此導致產量損失。因為在一 些土壤中的高鹽含量導致有效用於細胞攝取的水更少，所以高鹽濃度對植 物的影響與乾旱對植物的影響相似。此外，在水凍溫度的情形下，植物細 胞因植物內部形成冰而失水。因此，因乾旱、熱、鹽度和寒冷脅迫所致的 作物損傷主要歸咎於脫水。[0004
因為植物在其生活周期期間 一般暴露於水分有效性降低的條 件。大多數植物已經演化了針對由這些非生物脅迫所致乾燥的保護機制。。[00051常規植物育種策略進展相對緩慢並且需要對非生物脅迫耐受的 建立者品系(founder line)與其他種質雜交以開發新的非生物脅迫抗性品 系。相對於此類建立者品系有限的種質資源以及遠緣相關植物種之間雜交 的不相容性代表了常規育種中遭遇的重大問題。針對耐受性的育種基本上 不成功。
0006
許多農業生物技術公司在致力於開發轉基因的耐受非生物脅迫 的作物植物中，嘗試了鑑定能賦予對非生物脅迫應答耐受的基因。雖然已 經表徵了參與植物中脅迫應答或用水效率的一些基因，然而，對賦予脅迫 耐受性和/或用水效率的植物基因的表徵和克隆仍大多是不完整的和零散 的。迄今，在開發轉基因的耐受非生物脅迫的作物植物方面取得的成功是 有限的，並且此類植物沒有被商業化。[0007
為了開發轉基因的耐受非生物脅迫的作物植物，需要在作物植 物的才莫型植物系統、溫室研究和田間試驗中測試眾多參數。例如，用水效 率(WUE)是經常與乾旱耐受相關的一個參數。對植物應答脫水、滲透壓休 克和極端溫度的研究也用來確定該植物針對非生物脅迫的耐受性或抗性。 當測試轉基因的存在對植物脅迫耐受性的影響時，與田間相比較，溫室或 植物生長室環境的固有優勢是能夠將土壤屬性、溫度、水和養分有效性和 光強度標準化。[0008j已經以多種方式定義和測量WUE。 一種方法是計算完整植物幹 重與該植物在整個生命期間所消耗水的重量的比率。另一種變例是在測量 生物量積累和水使用時使用較短的時間間隔。又一種方法是使用來自植物 限定部分的測量結果，例如僅測量地上部分和水使用。WUE又定義為C02 攝取與來自葉或葉部分的水蒸氣損失之比，這常常在極短的時間段(例如秒 /分鐘)內測量。固定在植物組織中並用同位素比質鐠儀測量的13C/UC比率 也已經用來在採用C3光合作用的植物中估計WUE。[0009IWUE的提高表明生長和水消耗的效率相對改善，但是單獨考慮 這個信息不能指出這兩個過程之一是否已經改變或兩者皆改變。在選擇性 狀旨在改良作物的過程中，在生長無變化的情況下，因水使用降低引起的 WUE增加將在水輸入成本高昂的灌溉農業系統中具有特殊優勢。在水使 用沒有相應驟增的情況下，主要受生長增加推動的WUE提高將適用於全 部農業系統。在不限制水供應的許多農業系統中，生長增加也能提高產量， 即便這種生長增加以水使用提高(即WUE無變化)為代價。因此，需要WUE 和生物量積累這兩者均增加的新方法以改善農業生產率。
在又一個實施方案中，本發明涉及產生前述轉基因植物的方法， 其中所述方法包括用包含本發明的分離的多核苷酸的表達載體轉化植物 細胞，並從該植物細胞產生轉基因植物，其中所述的轉基因植物表達由所 述多核苷酸編碼的多肽。與該植物的野生型品種相比較時，所述多肽在植 物中的表達導致正常和/或脅迫條件下對環境脅迫增加的耐受性和/或增加 的生長和/或產量。
圖2顯示所公開的胺基酸序列PpHD-l(SEQ ID NO:36)、 BnHD畫l (SEQ ID NO:38)、 BnHD-2 (SEQ ID NO:40)、 ZmHD-1 (SEQ ID NO:42)、 LuHD-l (SEQ ID NO:44)、 OsHD曙l (SEQ ID NO:46)、 GmHD-1 (SEQ ID NO:48)、 GmHD-2 (SEQ ID NO:50)、 GmHD-3 (SEQ ID NO:52) 和TaHD-1 (SEQ ID NO:54)的比對結果。該比對結果使用Vector NTI的 Align X產生。
優選實施方案的詳述
在一個實施方案中，本發明提供過量表達表1中所鑑定的分離 的多核苷酸或其同源物(homolog)的轉基因植物。本發明的轉基因植物與該 植物的野生型品種相比較時，顯示提高的環境脅迫耐受性。與該植物的野 生型品種相比較時，此類分離的核酸在該植物中的過量表達可以任選地導 致正常或脅迫條件下植物生長增加或相關農產品的產量增加。不希望受限於任何理論，認為本發明轉基因植物的環境脅迫耐受性提高、生長增加和 /或產量增加是因該植物的用水效率提高所致。
在另一個實施方案中，本發明提供用表達盒轉化的轉基因植物，其中所述的表達盒包含編碼富含亮氨酸重複序列(LRR)蛋白的分離的多核苷酸。LRR —般作為20至29個胺基酸的重複序列存在於蛋白質中，每個重複序列含具有共有序列LXXLXLXXN/CXL的一個11胺基酸保守區域，其中X是任意胺基酸並且L是纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。本發明的LRR蛋白含有由SEQ ID NO:6的第422至441位胺基酸代表的LRR。廣泛認可的LRR的主要功能是為蛋白質-蛋白質相互作用的形成提供結構性支架。含LLR的蛋白質已知參與激素-受體相互作用、酶抑制、細胞勦附、細月包運輸、4直物抗病性和細菌毒力。
0051]該實施方案的轉基因植物可以包含編碼LRR蛋白的任意多核苷酸，其中所述的LRR蛋白具有包含SEQIDNO:6第422至441位胺基酸的序列。更優選地，該實施方案的轉基因植物包含編碼LRR蛋白的多核苷酸，其中所述LRR蛋白具有包含SEQIDNO:6第1至646位胺基酸的序列。
在另 一個實施方案中，本發明提供用表達盒轉化的轉基因植物， 其中所述的表達盒包含編碼鋅指-6(ZF-6)蛋白的分離的多核苷酸。這些蛋 白質包含由SEQ ID NO:18的第210至272位胺基酸代表的IBR結構域。 該實施方案的轉基因植物可包含編碼ZF-6蛋白的任意多核苷酸，其中所 述的ZF-6蛋白具有包含SEQ ID NO:18第210至272位胺基酸的序列。 更優選地，該實施方案的轉基因植物包含編碼ZF-6蛋白的多核苷酸，其 中所述的ZF-6蛋白具有包含SEQIDNO:18第1至594位胺基酸的序列。
在本發明的一個優選實施方案中，表l中所列的多核苷酸在來 自高等植物的植物細胞(例如種子植物，如作物植物)中表達。多核苷酸可 以通過任意方法"導入"植物細胞，所述方法包括轉染法、轉化或轉導法、 電穿孔法、粒子轟擊法、農桿菌感染法等。公開了用於轉化或轉染植物細 胞的合適方法，例如使用在美國專利號4,945,050; 5,036,006; 5，100，792; 5,302,523; 5,464,765; 5,120,657; 6,084,154等中描述的粒子轟擊法。更優 選地，可以使用如美國專利號5,591,616; 5,731,179; 5,981,840; 5,990,387; 6,162,965; 6,420,630，美國專利申請公開號2002/0104132等中描述的農杆 菌轉化法，製備本發明的轉基因玉米種子。可以使用如歐洲專利號EP 0424 047、美國專利號5,322,783、歐洲專利號EP 0397 687、美國專利號5,376,543 或美國專利號5,169,770中描述的技術開展大豆的轉化。可以在PCT申請 號WO93/07256中找到小麥轉化的具體實例。可以使用在美國專利號 5，004，863; 5,159,135; 5,846,797等中公開的方法轉化棉屬植物。可以使用 在美國專利號4,666,844; 5,350,688; 6,153,813; 6,333,449; 6,288,312; 6,365,807; 6，329，571等中公開的方法轉化稻。其他植物轉化方法在例如美 國專利號5,932,782; 6，153，811; 6，140，553; 5,969,213; 6,020,539等中公開。 可以根據本發明使用適於將轉基因插入特定植物的任意植物轉化方法。
在本領域中充分建立了酶活性和動力學參數的測定法。必須針 對野生型酶的比活性調整確定任意給定變異酶的活性的實驗，這完全在本 領域技術人員的能力範圍內。關於酶的一般綜述，以及有關結構、動力學、 原理、方法、應用的具體細節和用於測定許多酶活性的實例是豐富且為本 領域技術人員熟知的。
用Tl植物在第一個實驗中獲得的數據在第二實驗中以T2植物驗證。選擇具有正確表達模式的林系進一步分析。通過監測標記表達而篩選Tl中來自陽性植物(雜合子和純合子)的種子批次。對於每個所選的事件，隨後留下雜合種子批次用於T2評價。在每個種子批次中，在溫室中培育相等數目的陽性和陰性植物用於評價。
用Ishida等，1996, Nature Biotech. 14745-50所述的方法開展小麥轉化。不成熟的胚與攜帶"超級雙元，，載體的根癌農桿菌共培養，並且通
過器官發生作用回收轉基因植物。該方法提供2.5%-20%之間的轉化效率。隨後例如使用實施例3中所述的測定法篩選轉基因植物在限水條件下的改良生長和/或產量和/或脅迫耐受性，並且在溫室和田野研究中篩選產量。實施例8-脅迫耐受的玉米植物
使用基因組DNA的Taqman分析法測試轉基因在每抹小植物中的拷貝數，並且使用從葉樣品分離的總RNA的qRT-PCR法測試轉基因表達。
為了在循環的乾旱測定法中測試，在小花缽中栽種對於轉化事件為分離的轉基因玉米種子。將這些花缽在溫室中具有均一環境條件的區域內維持，並且最佳地栽培。將這些植物全部進行唯一標記、採樣並分析轉基因拷貝數。使所述植物在這些條件下生長直至它們達到預定的生長期。隨後以固定的時間間隔給植物反覆澆水至飽和。這種7jV乾旱循環重複持續整個試驗期。在生長期間測量植物的生長和生理性狀，如高度、莖直徑、葉翻巻、葉伸展率、葉水分狀態、葉綠素含量和光合作用率。在實驗結束時，收穫植物以取得地上部分鮮重和乾重。隨後比較轉基因陽性植物與陰性植物之間的循環乾旱耐受表型。
0135
為測試無雨條件下對乾旱耐受為分離的轉基因玉米，在單個位置或多個位置處使用受控的乾旱脅迫。在一處地點通過滴灌帶或噴灌法控制作物水分有效性，其中所述的地點預期在平均5個月季節期間具有少於10cm的降雨和大於5°C的最低溫度，或具有被"自動擋雨保護罩"遮擋的預期當季降水量，其中所述的自動擋雨保護罩在不需要時縮回以提供開放的田間條件。遵循本地區的整地、種植、受精和害蟲控制的標準農學慣例。每塊試驗區用對於單個轉基因插入事件的存在為分離的種子播種。Taqman轉基因拷貝數測定法用於葉樣品以區分轉基因植物與無效分離的對照植物。還對已經以這種方式進行了基因分型的植物就一系列與乾旱耐受、生長和產量相關的表型進行評分。這些表型包括植物高度、每株植物的穀粒重量、每林植物的穀粒數、每林植物的穗數、地上部分乾重、葉的水蒸氣導度、葉C02攝取、葉的葉綠素含量、光合作用相關的葉綠素螢光參數、用水效率、葉水勢、葉的相對水含量、莖汁液流速、莖導水率、葉溫、葉反射比、葉的光吸收、葉面積、至開花的天數、雌雄穗開花間隔、穀粒灌漿持續期(duration of grain fill)、滲透勢、滲透調節、根大小、葉伸展率、葉片角度、葉翻巻和存活。用市售田間生理學儀器，使用製造商提供的標準方法取得全部測量值。使用單林植物作為每個事件的重複單元。
為測試無雨條件下對於乾旱耐受為不分離的轉基因玉米，在單個位置或多個位置處使用受控的乾旱脅迫。在一處地點通過滴灌帶或噴灌法控制作物水分有效性，其中所述的地點預期在平均5個月季節期間具有少於10cm的降雨和大於5°C的最低溫度，或具有被"自動擋雨保護罩，，遮擋的預期當季降水量，其中所述的自動擋雨保護罩在不需要時縮回以提供開放的田間條件。遵循本地區的整地、種植、受精和害蟲控制的標準農學慣例。設計試驗布局以將含有非分離轉基因事件的試驗區與具有零分離對照的毗鄰試驗區配對。 一個無效分離體是因孟德爾分離而不含有轉基因的轉基因植物的子代(或衍生自該子代的林系)。對於特定事件的額外的重複配對試^^區分布在試驗田周圍。在配對試驗區中對一系列與乾旱耐受、生
長和產量相關的表型評分並在試驗區水平上估計。當測量技術僅可能應用於單個植物時，從試驗區內每次隨機選擇這些植物。這些表型包括植物高
度、每林植物的穀粒重量、每抹植物的穀粒數、每抹植物的穗數、地上部分乾重、葉的水蒸氣導度、葉C02攝取、葉的葉綠素含量、光合作用相關的葉綠素螢光參數、用水效率、葉水勢、葉的相對水含量、莖汁液流速、莖導水率、葉溫、葉反射比、葉的光吸收、葉面積、至開花的天數、雌雄穗開花間隔、穀粒灌漿持續期、滲透勢、滲透調節、根大小、葉伸展率、葉片角度、葉翻巻和存活。用市售田間生理學儀器，使用製造商提供的標準方法取得全部測量值。使用各個試驗區作為每個事件的重複單元。
[0137
為進行轉基因玉米乾旱耐受性和產量的多地點試驗，選擇5至20個地點，包括主要的玉米生長區。這些地區分布廣泛，旨在提供基於平均溫度、溼度、降水量和土壤類型的預期作物水分有效性。不超出標準農學實踐調整作物水分有效性。設計試驗布局以將含有非分離轉基因事件的試驗區與具有無效分離對照的毗鄰試驗區配對。在配對試驗區中對一系列與乾旱耐受、生長和產量相關的表型評分並在試驗區水平上估計。當測量技術僅可能應用於單個植物時，從試驗區內每次隨機選擇這些植物。這些表型包括植物高度、每林植物的穀粒重量、每抹植物的穀粒數、每林植物的穗數、地上部分千重、葉的水蒸氣導度、葉C02攝取、葉的葉綠素含量、光合作用相關的葉綠素螢光參數、用水效率、葉水勢、葉的相對水含量、莖汁液流速、莖導水率、葉溫、葉反射比、葉的光吸收、葉面積、至開花的天數、雌雄穗開花間隔、穀粒灌漿持續期、滲透勢、滲透調節、根大小、葉伸展率、葉片角度、葉翻巻和存活。用市售田間生理學儀器，使用製造商提供的標準方法取得全部測量值。使用各個試驗區作為每個事件的重複單元。
權利要求
1.用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包含編碼tRNA 2』-磷酸轉移酶的分離的多核苷酸。
2. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼CDC2蛋白激酶的分離的多核苷酸。
3. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼富含亮氨酸重複序列的蛋白的分離的多核苷酸。
4. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼Ran結合蛋白的分離的多核苷酸。
5. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼質體分裂蛋白的分離的多核苷酸。
6. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼線粒體基質載體蛋白的分離的多核苷酸。
7. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼MADS盒蛋白的分離的多核普酸。
8. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼腺苷激酶-1蛋白的分離的多核苷酸。
9. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼鋅指蛋白6的分離的多核苷酸。
10. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼細胞周期蛋白依賴性激酶調節亞基蛋白的分離的多核苷酸。
11. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼鋅指蛋白7的分離的多核苷酸。
12. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼MAR結合蛋白的分離的多核苷酸。
13. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼LRP-2蛋白的多核苷酸。
14. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼植物光敏素蛋白激酶蛋白的多核苷酸。
15. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼小突觸泡蛋白的多核苷酸。
16. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼4丐依賴磷酸酶B蛋白的多核苷酸。
17. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼油體鉤蛋白的多核苷酸。
18. 用表達盒轉化的轉基因植物細胞或轉基因植物，所述的表達盒包 含編碼組蛋白脫乙醯酶蛋白的多核苷酸。
19. 分離的多核苷酸，其具有選自以下核酸分子的序列(a) 包含表1或表2中所述多核苷酸序列的核酸分子；(b) 編碼多肽的核酸分子，其中所述多肽與由(a)的核酸分子編碼的多 肽的胺基酸序列具有至少50%同一性；和(c) 與(a)至(b)的核酸分子在嚴格雜交條件下雜交的核酸分子。
20. 分離的多肽，其具有選自以下的序列(a) 表l中所述的多肽序列；和(b) 與(a)的多肽序列具有至少50%同一性的多肽。
21. 產生轉基因植物的方法，所述的轉基因植物包含根據權利要求
19 所述的至少一個多核苷酸，其中與該植物的野生型品種相比較時，所述多產量增加和/或環境脅迫耐受性提高，所述方法包括步驟(a) 將包含才艮據權利要求
19所述的至少一個多核苷酸的表達載體導 入才直物細力包，和(b) 從該植物細胞產生表達所述多核苷酸的轉基因植物，其中與該植物的野生型品種相比較時，所述多核苷酸在該轉基因植物中的表達導致該;fei物在正常的或限水條件下的生長和/或產量增加和/或環境脅迫耐受性提高。
22.增加植物在正常的或限水條件下的生長和/或產量和/或提高植物 的環境脅迫耐受性的方法，所述方法包括增加植物中根據權利要求
19所述 的至少一個多核苷酸表達的步驟。
專利摘要
公開了能夠增強植物在限水條件下的生長、產量和/或提高環境脅迫耐受性的多核苷酸，其中所述植物經轉化以含有此類多核苷酸。還提供了使用此類多核苷酸的方法以及含有此類多核苷酸作為轉基因的轉基因植物和農產品，包括種子。
文檔編號C12N15/82GKCN101652480SQ200880009520
公開日2010年2月17日 申請日期2008年3月20日
發明者A·舍利, B·麥可西, D·艾倫 申請人:巴斯福植物科學有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan