用於體內遞送多核苷酸的多綴合物的製作方法
2023-11-04 21:15:02 1
專利名稱：用於體內遞送多核苷酸的多綴合物的製作方法
用於體內遞送多核苷酸的多綴合物本申請是申請日為2007年8月17日、發明名稱為「用於體內遞送多核苷酸的多綴合物」的中國專利申請200780029802. 3 (國際申請號PCT/US2007/076202)的分案申請。相關申請的交叉參考本申請要求2006年8月18日提交的美國臨時申請號60/822，833和2007年5月3日提及的美國臨時申請號60/915，868的優先權。
背景技術：
多核苷酸和其他膜不透性化合物向活細胞的遞送受到細胞的複雜的膜系統的高度限制。用於反義和基因治療的藥物是相對較大的親水聚合物並且通常也是帶大量負電荷的。這兩種物理特徵阻礙了它們經細胞膜的直接擴散。為此原因，多核苷酸遞送的主要障 礙是多核苷酸向細胞內部的遞送。已經開發了多種轉染試劑在體外將多核苷酸遞送到細胞。然而，在體外有效的轉染試劑的毒性、血清相互作用和弱的尋靶作用使得多核苷酸的體內遞送複雜化。在體外良好運行的轉染試劑、陽離子聚合物和脂類通常去穩定化細胞膜並形成大的顆粒。轉染試劑的陽離子電荷促進了核酸結合以及細胞結合。膜的去穩定化促進了膜不透性多核苷酸經細胞膜的遞送。這些性質使得轉染試劑在體內無效或有毒性。陽離子電荷導致與血清組分的相互作用，其引起多核苷酸-轉染試劑相互作用的去穩定化和弱的生物利用度和尋靶作用。陽離子電荷也可以導致體內毒性。在體外有效的轉染試劑的膜活性通常導致體內毒性。對於體內遞送，轉染複合體(與待遞送的核酸結合的轉染試劑)應該是小的，直徑小於IOOnm,並且優選小於50nm。甚至小於20nm或小於IOnm的更小的複合體將是更有效的。大於IOOnm的轉染複合體在體內基本上不能接近除了血管細胞之外的細胞。體外複合體也是帶正電荷的。該正電荷對於複合體與細胞的附著和膜融合、去穩定化或破壞是必須的。體內轉染複合體上的陽離子電荷導致不利的血清相互作用並且因此導致弱的生物利用度。接近中性或負電荷的複合體將具有更好的體內分布和尋靶能力。然而，體外轉染複合體通過電荷-電荷(靜電)相互作用與核酸結合。帶負電荷的聚合物和脂類不與帶負電荷的核酸相互作用。此外，這些靜電複合體當暴露於生理鹽濃度或血清組分時傾向於聚集或瓦解。最後，在體外有效的轉染複合體通常在體內是有毒的。用於轉染的聚合物和脂類破壞或去穩定化細胞膜。用核酸遞送平衡該活性在體外比在體內更容易達到。儘管一些研究小組已經在改善體內基因向細胞的遞送方面取得了不斷的進步，但是仍然需要將多核苷酸與遞送劑一起有效遞送到靶細胞而沒有與體內施用轉染試劑相關的毒性的製劑。本發明使用生物學不穩定的綴合物遞送系統提供了將多核苷酸遞送到細胞並釋放的組合物和方法。發明概述在優選的實施方案中，本發明描述了用於在體內將多核苷酸遞送到細胞的組合物，其包含與多核苷酸可逆地綴合的可逆掩蔽的膜活性聚合物。聚合物通過一個或多個第一種可逆共價連接連接到一種或多種掩蔽劑並且通過一個或多個第二種可逆共價連接進一步連接到一種或多種多核苷酸。第一種和第二種可逆共價連接可以包含在相同或相似的條件下被切割的可逆鍵或者它們可以在不同的條件下被切割，即它們可以包含正交(orthogonal)可逆鍵。對哺乳動物施用可藥用載體或稀釋劑中的多核苷酸-聚合物綴合物。 在優選實施方案中，公開了膜活性聚合物，其包含聚乙烯醚隨機共聚物。可以從兩種、三種或多種不同的單體合成聚乙烯醚共聚物。單體可以選自受保護的氨基乙烯醚，如含有苯二甲醯亞氨基的乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚。優選的聚乙烯醚隨機共聚物包含三種單體含有胺的單體、丁基乙烯醚和十八烷基乙烯醚。在優選實施方案中，膜活性聚合物的一種或多種生物物理學特徵通過掩蔽劑可逆地屏蔽或修飾。掩蔽劑可以選自位阻穩定劑、尋祀基團(targeting groups)和電荷修飾齊U。掩蔽劑可以通過抑制聚合物與血清組分或非靶細胞的非特異性相互作用而改善聚合物-多核苷酸的生物分布或尋靶作用。掩蔽劑也可以減少聚合物或聚合物-多核苷酸綴合物的聚集。含有尋靶基團的掩蔽劑可以通過將綴合物系統靶向細胞表面受體而增強細胞特異性尋靶作用或細胞內化。在聚合物綴合到多核苷酸之前或之後，可以將掩蔽劑綴合到膜活性聚合物。在優選實施方案中，使用所述的綴合物系統可以被遞送到細胞的多核苷酸可以選自DNA、RNA、封閉性多核苷酸、反義寡核苷酸、質粒、表達載體、寡核苷酸、siRNA、微RNA、mRNA、shRNA 和核酶。在優選實施方案中，掩蔽劑和多核苷酸通過可逆連接共價連接到膜活性聚合物。儘管聚合物的掩蔽和多核苷酸與聚合物的連接是重要的，但是這些連接可以幹擾聚合物的轉染活性或多核苷酸的活性。通過經由可逆連接將掩蔽劑和多核苷酸連接到聚合物，所述可逆連接在合適的時間被切割，聚合物恢復活性並且多核苷酸被釋放。可逆的共價連接含有可逆的或不穩定的鍵，其可以選自生理學不穩定的鍵、細胞生理學不穩定的鍵、pH不穩定鍵、非常pH不穩定鍵、極端pH不穩定鍵、酶可切割的鍵和二硫鍵。將聚合物連接到多核苷酸和掩蔽劑的兩種可逆連接的存在提供了多核苷酸與遞送聚合物的共同遞送和掩蔽劑對遞送聚合物的選擇性尋靶作用和失活。連接的可逆性提供了多核苷酸從膜活性聚合物的釋放和膜活性聚合物的選擇性活化。在優選實施方案中，我們描述了一種組合物，其包含遞送聚合物，其a)通過一種或多種可逆連接共價連接到一種或多種尋靶基團、位阻穩定劑或電荷修飾劑；和b)通過一種或多種可逆連接共價連接到一種或多種多核苷酸。在一個實施方案中，尋靶作用劑、位阻穩定劑或電荷修飾劑的可逆共價連接與多核苷酸可逆共價連接是正交的。在優選實施方案中，我們描述了聚合物綴合系統，其用於將多核苷酸遞送到細胞並將該多核苷酸釋放到細胞中，所述聚合物綴合系統包含可逆地綴合到膜活性聚合物的多核苷酸，所述膜活性聚合物自身可逆地綴合到掩蔽劑。綴合鍵可以是相同的或者它們可以是不同的。此外，綴合鍵可以在相同或不同條件下被切割。在優選實施方案中，我們描述了聚合物綴合系統，其用於將膜不透性分子遞送到細胞並在細胞中釋放分子。聚合物綴合系統包含可逆地連接到膜活性聚合物的膜不透性分子，其中多種掩蔽劑通過可逆的共價鍵連接到膜活性聚合物。膜活性聚合物當在體內應用時可以是無毒的或者可以不是被靶定的。掩蔽劑的可逆連接可逆地抑制或改變了聚合物的膜相互作用、血清相互作用、細胞相互作用、毒性或電荷。優選的可逆共價鍵包含不穩定鍵、生理學不穩定鍵或在哺乳動物細胞內條件下可被切割的鍵。優選的不穩定鍵包含pH不穩定鍵。優選的PH不穩定鍵包含馬來醯胺酸鍵。另一優選的不穩定鍵包含二硫鍵。膜不透性分子包括但不限於多核苷酸、蛋白質、抗體和膜不透性藥物。在優選實施方案中，在過量聚合物存在下將多核苷酸連接到聚合物。過量聚合物可以有助於多核苷酸-聚合物綴合物的配製。過量聚合物可以在綴合物配製期間減少綴合物的聚集。可以在將綴合物施用於細胞或生物前將多核苷酸-聚合物綴合物與過量聚合物分離。備選地，多核苷酸-聚合物綴合物可以與過量聚合物共同施用於細胞或生物。過量聚合物可以與所述聚合物是相同的或者它可以是不同的。在優選實施方案中，本發明的聚合物綴合物可以用於體外遞送多核苷酸或其他膜不透性分子。對於體外遞送，聚合物的可逆掩蔽增強了一些否則無效的多胺如聚賴氨酸的轉染活性。可逆掩蔽也可以通過減小其他膜活性聚合物的毒性或將它們的膜破壞性特徵限制於內體而增強所述其他膜活性聚合物的效用。在優選實施方案中，我們描述了用於在體內將多核苷酸遞送到細胞的系統，其包含將尋靶基團共價連接到多核苷酸，將第二種尋靶基團共價連接到膜活性聚合物，並將多核苷酸和膜活性聚合物注射到生物中。當結合附圖考慮時，本發明的其他目的、特徵和優點根據下面的詳細描述將是顯而易見的。附圖簡述圖I.聚乙烯醚聚合物聚合的反應方案。圖2.闡明本發明的掩蔽劑的幾種實施方案的附圖。圖3.簡圖，圖解了多核苷酸-聚合物可逆綴合物和通過馬來醯胺酸對綴合物的可逆掩蔽。圖4.顯微照片，顯示了用A) CDM-PEG (左)或B) CDM-PEG加CDM-Pip-LBA掩蔽的PBAVE聚合物的肝臟肝細胞的定向遞送。圖5.顯微照片，顯示了在體內掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物向肝細胞的遞送。圖6.曲線圖，圖解了 ppara siRNA的多綴合物介導的遞送後體內靶基因降低(knockdown)。圖7.顯微照片，顯示了 用(A)DNA-DWl360-CDM-PEG/NAG，(B)DNA+DW1360-CDM-PEG/NAG(未綴合到聚合物的多核苷酸)，(C)DNA-DWl360-CDM-PEG/ 葡萄糖，和(D) DNA-DWl360-CDM-PEG/甘露糖在體內將ds DNA向肝臟的遞送。Cy3_標記的DNA =每個小圖中的左上象限，AIEXA -488鬼筆環肽染色的肌動蛋白=右上象限，細胞核=左下象限，複合圖=右下象限。圖8.圖和印跡，圖解了靜脈內注射siRNA多綴合物後小鼠的肝臟中靶基因表達的降低。(A)用apoB siRNA多綴合物處理後肝臟中apoBmRNA水平的降低。(B)apoB siRNA多綴合物處理的小鼠中apoB-100蛋白的血清水平。(C)靜脈內注射ppara siRNA多綴合物後肝臟中ppara mRNA水平的降低。 圖9.圖表，圖解了 apoB-lsiRNA多綴合物劑量反應。(A)注射apoB-lsiRNA多綴合物的連續稀釋液後apoB mRNA的降低。(B)注射不同量的siRNA後apoB mRNA的降低。
圖10.圖表，圖解了 apoB-lsiRNA多綴合物處理的小鼠中膽固醇水平。圖11.顯微照片，顯示了(A)ApoB siRNA或(B)GL3陰性對照siRNA，或(C)僅鹽水的多綴合物遞送後小鼠肝臟中的脂類積累。圖12.圖表，圖解了在第O天在小鼠 中施用apoB-lsiRNA綴合物後第2_15天，基因表達的抑制(A)和引起的血清膽固醇的降低(B)。圖13.顯微照片，顯示了通過施用可逆地綴合到DW1360並用CDM-PEG和CDM-NAG掩蔽的抗體，體內遞送抗體到肝細胞。左上象限顯示了經標記的抗體，右上象限顯示了肌動蛋白，左下象限顯示了細胞核，右下象限顯示了複合圖。圖14.圖表，其圖解了在用商業體外轉染試劑或用不同量的ApoBsiRNA多綴合物遞送的ApoB siRNA轉染的原代肝細胞中的基因降低。圖15.圖表，圖解了在體外siRNA-綴合物對H印a_lclc7細胞的轉染僅僅綴合物=掩蔽的 siRNA-PLL。圖16.圖表，圖解了 PBAVE存在下DPH的螢光。圖17.圖表，圖解了 A)在Shodex SB-803柱上PEG標準品的洗脫圖，B) ShodexSB-803柱的校準圖，和OPBAVE聚合物的分子量計算。圖18.圖表，圖解了 A)Cy3標記的核酸標準品和掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物的洗脫圖，B) Sephacryl S-500大小排阻層析的校準圖，和C)掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物的分子量計算。圖19.顯微照片，顯示了使用寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/NAG綴合物(A，C)或寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/葡萄糖綴合物(B，D)，體內多核苷酸遞送到小鼠半乳糖受體陽性腫瘤(A-B)或半乳糖受體陰性腫瘤(C-D)。發明詳述本發明涉及可用於將多核苷酸或其他細胞不透性分子遞送到哺乳動物細胞的化合物、組合物和方法。本文描述了用於在體內將多核苷酸或其他膜不透性分子遞送到細胞的多綴合物(polyconjugate)系統。多綴合物系統將尋靶、抗調理作用、抗聚集和轉染活性摻入到小的50納米以下的遞送載體。該系統的關鍵組分是連接組分部分的鍵的可逆性。所述的體內多核苷酸遞送綴合物的第一個組分包含該多核苷酸與膜活性聚合物的生理學上可逆的共價連接。多核苷酸與膜活性聚合物的共價連接確保了在血清存在下體內或離體(ex vivo)施用時，多核苷酸不容易與聚合物解離，從而提供了多核苷酸與膜活性聚合物向靶細胞的共同遞送。然而，多核苷酸與聚合物的共價連接可以使得多核苷酸無活性。因此，通過生理學上可逆的連接或者鍵完成多核苷酸與膜活性聚合物的連接或鍵。通過使用生理學可逆的連接，多核苷酸可以從聚合物被切除，釋放多核苷酸參與和細胞組分的功能性相互作用。通過選擇合適的可逆連接，可能形成綴合物，其僅在其被遞送到希望的位置，如細胞質後釋放所述多核苷酸。所述的體內多核苷酸遞送綴合物的第二種組分包含膜活性聚合物的可逆修飾。膜活性聚合物的可逆修飾減小了非生產性血清和非靶細胞相互作用並且減小了毒性。掩蔽劑也可以為綴合物增加希望的功能，如增強靶細胞相互作用或增強綴合物的胞吞作用。通過掩蔽劑與聚合物經由生理學可逆的共價連接進行共價連接掩蔽聚合物。掩蔽劑可以是無菌的穩定劑、尋靶基團或電荷修飾劑。掩蔽劑可以掩蔽聚合物防止非特異性相互作用，延長循環時間，增強特異性相互作用，抑制毒性，或改變聚合物的電荷。這些修飾的每一種可以改變聚合物的膜活性，使得經修飾的聚合物不能促進多核苷酸的遞送。因此，通過生理學可逆的連接完成掩蔽劑與膜活性聚合物的連接。通過使用生理學可逆的連接，掩蔽劑可以從聚合物被切除，從而暴露聚合物並恢復被暴露的聚合物的活性。通過選擇合適的可逆連接，可能形成綴合物，其在已經被遞送或靶向希望的細胞類型或細胞位置後恢復膜活性聚合物的活性。本發明包括如下一般結構的綴合物遞送系統N-L1-P- (L2-M)y,其中N是多核苷酸或其他細胞不透性分子，L1是可逆連接，P是聚合物，L2是第二 種可逆連接，M是掩蔽劑。掩蔽劑M掩蔽或修飾P的性質或相互作用。y是大於O的整數。優選的聚合物是膜活性聚合物。另一優選的聚合物是轉染聚合物。許多掩蔽劑可以連接到單個聚合物。所述許多掩蔽劑可以通過多個可逆連接連接到所述聚合物。當可逆連接L2切割時，聚合物P恢復被掩蔽的性質或相互作用。掩蔽劑M可以為聚合物P增加活性，如細胞受體結合。L1的可逆鍵可以與L2的可逆鍵是相同或不同的(正交的)。選擇可逆連接L1或L2的可逆鍵使得在希望的生理條件下，如存在於希望的組織、器官和亞細胞位置中的生理條件下或應答藥學上可接受的外源試劑的加入下發生切割。多核苷酸N和掩蔽劑M可以在沿著聚合物P的長度的任何位置處連接到聚合物P。聚合物聚合物是通過稱作單體的較小單位重複鍵合形成的分子。聚合物可以是線性的、分枝網絡狀的、星形的、雞冠狀或梯形的。聚合物的主鏈由原子組成，所述原子的鍵是聚合物長度增長所需的。例如，在聚-L-賴氨酸中，羰基碳、α-碳和α-胺基是聚合物長度所需的並且因此是主鏈原子。聚合物的側鏈由這樣的原子組成，所述原子的鍵不是聚合物長度的增長所需的。聚合物可以是均聚物，其中使用一種單體或者聚合物可以是共聚物，其中使用兩種或多種不同的單體。共聚物可以是交替的、隨機的(統計學的)、嵌段或接枝的(雞冠狀)。交替聚合物含有確定的重複順序的單體，如-[Α-Β]η_。交替聚合物的單體通常不均聚化，而是一起反應產生交替共聚物。隨機共聚物中的單體沿著任何給定鏈沒有確定順序或排列，如-AnBm_。此類聚合物的一般組成反映了輸入單體的比例。然而，一種單體與另一種單體的精確比例可以在鏈之間不同。單體的分布可以沿著單一聚合物的長度不同。而且，單體的化學性質可以影響其摻入隨機共聚物中的速率和它在聚合物內的分布。從而，儘管隨機聚合物中單體的比例取決於單體的輸入比例，但是輸入比例可以不精確地匹配摻入的單體的比例。嵌段聚合物具有一種聚合物(聚合物A)的一段或嵌段接著是第二種聚合物(聚合物B)的一段或嵌段即-聚A-聚B-。結果是不同的聚合物鏈以從頭至尾的構型連接。從而，嵌段聚合物是不同單體成分的嵌段的線性排列。通常(儘管不是必需的)，聚合物嵌段是均聚物，聚合物A由不同於聚合物B的單體組成。二嵌段共聚物是聚A-聚B，三嵌段共聚物是聚A-聚B-聚A。如果A是親水基團並且B是疏水基團，那麼所得的嵌段共聚物可以被認為是聚合的表面活性劑。接枝聚合物是一種類型的嵌段共聚物，其中一個單體的鏈被接枝到另一單體的側鏈上，如(其中n、m、X、y和ζ是整數):
權利要求
1.用於將RNA幹擾多核苷酸體內遞送到肝細胞的綴合物遞送系統，其包含 其中， P是膜活性多胺， L2是二取代的馬來醯胺酸生理學不穩定的鍵， M1是含有靶向基團的掩蔽劑， M2是含有位阻穩定劑的掩蔽劑， N是RNA幹擾多核苷酸， L1是與L2正交的生理學不穩定的共價鍵， y和ζ是大於或等於O的整數,其中y和ζ的值一起大於P的胺數目的50%, P的膜活性通過經生理學不穩定的鍵L2連接M1和M2修飾大於50%的P胺而被可逆抑制，並且L2的切割恢復P的膜活性。
2.權利要求I的綴合物，其中所述多核苷酸包含siRNA或者微RNA。
3.權利要求I的綴合物，其中所述多胺大於5kDa。
4.權利要求I的綴合物,其中所述綴合物直徑小於20nM。
5.權利要求I的綴合物，其中所述綴合物在pH9下具有O到-20mV的ζ電位。
6.權利要求I的綴合物，其中L2是馬來醯胺酸。
7.權利要求6的綴合物，其中靶向基團是半乳糖衍生物。
8.權利要求7的綴合物，其中P-L2-M1具有結構 其中η是I到500的整數。
9.權利要求6的綴合物，其中所述位阻穩定劑是聚乙二醇。
10.權利要求9的綴合物，其中P-L2-M1具有結構其中η是I到500的整數。
11.權利要求I的綴合物，其中所述膜活性聚合物含有兩種或更多種不同的單體。
12.權利要求11的綴合物，其中所述膜活性聚合物含有三種或更多種不同的單體。
13.權利要求12的綴合物，其中所述單體選自含有胺的單體、低級烷基單體、丁基單體、高級烷基單體、十二烷基單體和十八烷基單體。
14.權利要求I的綴合物，其中y+z的值大於或等於所述多胺上胺數目的70%。
15.權利要求I的綴合物遞送系統，其中所述綴合物遞送系統還包含通過生理學不穩定鍵可逆地共價連接到多種掩蔽劑的過量膜活性多胺，其中所述過量聚合物不共價連接到所述RNA幹擾多核苷酸。
16.權利要求I的綴合物遞送系統，其中所述綴合物在可藥用載體或稀釋劑中提供。
17.用於將RNA幹擾多核苷酸體內遞送到肝細胞的綴合物遞送系統，其通過包含如下步驟的方法形成 a)形成膜活性多胺； b)形成第一種掩蔽劑，其包含含有尋靶基團的二取代的馬來酐； c)形成第二種掩蔽劑，其包含含有位阻穩定劑的二取代的馬來酐； d)通過與馬來醯胺酸鍵正交的生理學不穩定的共價鍵將所述RNA幹擾多核苷酸連接到所述多胺； e)可逆地抑制膜活性多胺的膜活性，其中抑制由通過將所述多胺與所述第一種和第二種掩蔽劑反應修飾所述多胺上50%或以上的胺組成。
18.權利要求17的綴合物遞送系統，其中所述尋靶基團是半乳糖衍生物並且所述位阻穩定劑是聚乙二醇。
19.權利要求18的綴合物遞送系統，其中所述半乳糖衍生物是N-乙醯半乳糖胺。
全文摘要
本發明涉及用於向哺乳動物細胞遞送多核苷酸或其他細胞不透性分子的化合物、組合物和方法。描述了多綴合物系統，其向小的生物相容的體內遞送載體中摻入尋靶、抗調理作用、抗聚集和轉染活性。連接組分部分的多個可逆連接的使用提供了生理學應答活性調節。
文檔編號A61P35/00GK102614528SQ20121011107
公開日2012年8月1日 申請日期2007年8月17日 優先權日2006年8月18日
發明者A·布洛欣, D·B·羅森瑪, D·H·韋克菲爾德, D·L·劉易斯, H·赫維耶, J·A·沃爾夫, J·E·哈格斯特倫, J·克萊因, S·翁, V·特魯別茨科伊 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司