用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應用的製作方法
2023-12-08 17:53:11
本發明涉及一種用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應用。
背景技術：
水稻(Oryza sativa L.)是世界主要糧食作物之一，是世界上三分之一人類的主食。水稻幹尖線蟲(Aphelenchoides besseyi Christie)引起的水稻幹尖線蟲病，使水稻在世界範圍內每年減產10％～70％，造成巨大的經濟損失。目前，對水稻幹尖線蟲的防治措施，主要是加強檢疫，以及播種前用溫湯或藥劑浸種，但浸種後水稻發芽勢常有降低趨勢。研究發現，水稻栽培過程中，施肥施藥等工作對土壤環境滲透壓造成了重要影響。大部分生物在高滲透壓下無法存活，而水稻幹尖線蟲可通過進入變滲隱生狀態，在高滲透壓環境下存活，當環境適宜時，又恢復正常代謝，使浸種防治與農藥防治效果降低，增加防治水稻幹尖線蟲的難度。對水稻幹尖線蟲應對高滲透壓脅迫時的生理機制進行研究，可為防治水稻幹尖線蟲提供新思路，避免因化學藥劑的過量使用造成環境汙染。
硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)具有抗氧化、抗旱、耐熱等能力，在生物抗逆中起著重要的作用。Trx廣泛存在於各種生物體內，有使巰基和二硫化物相互轉換的功能，為一系列生理反應提供氧化還原對，維持細胞內蛋白質的還原狀態，使其正常發揮功能，對保持生物體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。在水稻幹尖線蟲抵抗高滲透壓脅迫過程中，Trx起重要輔助作用。目前，國內外對植物寄生線蟲Trx的研究較少。鑑於Trx對生物抵抗非生物逆境脅迫的重要作用，擬克隆水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因(thioredoxin like protein，Trxl)，通過基因沉默技術，探究Trxl基因沉默後水稻幹尖線蟲在高滲透壓條件下的存活情況，為防治水稻幹尖線蟲提供新思路。
技術實現要素：
基於以上不足之處，本發明提供一種用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應用。
本發明所採用的技術如下：一種用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因，其序列如序列表SEQ No.1所示。
本發明還具有如下技術特徵：
1、一種用於構建水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因的引物組，如下：
上遊引物Ab-Trxl-F：如序列表SEQ No.2所示，
下遊引物Ab-Trxl-R：如序列表SEQ No.3所示。
2、一種用於構建水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因dsRNA的引物組，如下：
合成正義鏈RNA上遊引物Ab-Trxl-TTF：如序列表SEQ No.4所示，
合成正義鏈RNA下遊引物Ab-Trxl-iR：如序列表SEQ No.5所示，
合成反義鏈RNA上遊引物Ab-Trxl-iF：如序列表SEQ No.6所示，
合成反義鏈RNA下遊引物Ab-Trxl-T7R：如序列表SEQ No.7所示。
3、一種用於水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白酶基因Q-PCR檢測的引物組，如下：
上遊引物Ab-Trxl-qF：如序列表SEQ No.8所示，
下遊引物Ab-Trxl-qR：如序列表SEQ No.9所示。
4、如上所述的一種水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因在防治水稻幹尖線蟲中的應用。
本發明的類硫氧還蛋白基因在水稻幹尖線蟲受高滲透壓脅迫後表達上調，表明該基因在水稻幹尖線蟲抗高滲透壓脅迫過程中起作用。通過對該基因的研究，為研究水稻幹尖線蟲應對高滲透壓脅迫的生理機制建立基礎，可為防治水稻幹尖線蟲提供新思路，避免因化學藥劑的過量使用造成環境汙染。在防治水稻幹尖線蟲中具有重要的生物學意義和潛在的應用價值。
附圖說明
圖1為實施例1中Q-PCR技術檢驗高滲透壓脅迫後Ab-Trxl相對表達量變化圖；
圖2為實施例1中Q-PCR技術檢驗Ab-Trxl基因沉默效果圖；
圖3為實施例1中分別對水稻幹尖線蟲進行Ab-Trxl基因沉默處理與對照處理後，進行高滲透壓脅迫時水稻幹尖線蟲存活數對比圖。
具體實施方式
本發明提供的用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因來源於水稻幹尖線蟲，該類硫氧還蛋白基因命名為Ab-Trxl，長度為1,148bp，其基因序列如SEQ No.1所示，具有典型的Trxl結構域。
實施例1：
防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因的獲得及其功能驗證。
(一)RNA抽提及cDNA合成：
DEPC處理水清洗線蟲(雌蟲：雄蟲：幼蟲＝4:2:1)，離心去上清後，液氮處理下研磨。取研磨粉末，應用TRIzol法(Invitrogen，cat.No.15596-026)提取水稻幹尖線蟲總RNA，DEPC處理水溶解。應用AMV反轉錄系統(Promega，cat.No.A3500)，以Oligo(dT)18為引物進行第一鏈cDNA反轉錄，隨機引物法合成第二鏈cDNA。反應過程根據試驗手冊進行。
(二)水稻幹尖線蟲類硫氧還蛋白基因完整閱讀框克隆
根據轉錄組測序結果合成水稻幹尖線蟲類硫氧還蛋白基因引物組，
Ab-Trxl-F:5`-TTC GAC AAA CTC TAT CCA GC-3`，
Ab-Trxl-R：5`-TGA AAT TCC ATT TGA TGG CG-3`。
以水稻幹尖線蟲第二鏈cDNA為模板進行完整閱讀框序列的PCR擴增(TaKaRa r-Taq酶25μL反應體系：94℃30s，58℃1min，72℃1min，進行35個循環)，擴增產物送生物公司測序驗證，所得序列命名為Ab-Trxl。
(三)螢光定量Q-PCR驗證
選取高滲透壓(飽和MgSO4·7H2O溶液)處理4h、12h、24h、48h和96h後水稻幹尖線蟲，液氮下研磨並採用TRIzol法提取總RNA。應用GoTaq 2-Step RT-qPCR System(Promega A6010)試劑盒進行第一鏈cDNA反轉錄。
根據測序結果合成水稻幹尖線蟲類硫氧還蛋白基因Q-PCR驗證引物組，
Ab-Trxl-qF：5`-TGA CCG ATG AAG CAA ATA CCA-3`，
Ab-Trxl-qR：5`-TCG ACG AGC TCA ACA CTT AC-3`。
水稻幹尖線蟲28s RNA作為內參基因，
Ab-28s-qF：5`-TAC GAT CGG TGT TCG TTG C-3`，
Ab-28s-qR：5`-CTC ACA TCG TCG ACA TCC AA-3`。
應用Stratagene Mx3000P qPCR system(Agilent,USA)和GoTaq 2-Step RT-qPCR System試劑盒進行Q-PCR擴增。使用2步法PCR，第一步：預變性95℃3min。第二步：95℃30s，58℃1min，72℃30s共40個循環。融解曲線測定從55℃到95℃。對Q-PCR擴增採用相對定量法計算次重複試驗初始模板量比值，兩配對樣本t檢驗p<0.01，差異顯著。結果如圖1所示，Ab-Trxl在高滲透壓脅迫後4h、12h、24h、48h、72h和96h時均有顯著上調，證實Ab-Trxl在高滲透壓脅迫中起到一定作用。
(四)Ab-Trxl基因沉默
以水稻幹尖線蟲cDNA為模板，應用引物組：
Ab-Trxl-T7F：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACA AGT GCA TTT TGG AGC G-3`，
Ab-Trxl-iR：5`-ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`
進行PCR擴增生產正義鏈模板。
應用引物組：
Ab-Trxl-iF：5`-AAC AAG TGC ATT TTG GAG CG-3`，
Ab-Trxl-T7R：5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG ACA AAC GAT TTG ATG TCC GC-3`
進行PCR擴增生產反義鏈模板。應用RNAi試劑盒進行體外轉錄反應，合成正義鏈與反義鏈RNA，經退火生產dsRNA。
蒸餾水稀釋dsRNA濃度至3mg/mL，採用dsRNA餵飼法處理線蟲12h，以蒸餾水為對照。處理後一部分線蟲用於提取RNA，反轉錄後應用引物Ab-Trxl-qF和Ab-Trxl-qR進行Q-PCR擴增，應用水稻幹尖線蟲28s rRNA基因引物Ab-28s-qF和Ab-28s-qR進行Q-PCR擴增作為對照，驗證RNAi效果。結果如圖2所示，RNAi後Ab-Trxl表達量顯著下降。另一部分線蟲用於高滲透壓處理1d～6d後線蟲存活數測定，每個處理隨機選取100條蟲進行觀察，重複三次。結果如圖3所示，水稻幹尖線蟲存活數顯著下降。說明水稻幹尖線蟲類硫氧還蛋白基因沉默，對該線蟲抗高滲透壓能力起到顯著影響，可用於該線蟲病害防治。
東北林業大學
用於防治水稻幹尖線蟲的類硫氧還蛋白基因及引物和應用
9
1
1148
DNA
Ab-Trxl
1
gtaaaagtaa cgatcagtgt gaagatgtct gaatcgcgtt caaatcacga atcagatctc 60
aaaagtttgc gttttcaaac acgttctaaa gtggttgtga aagcggccga agttccagaa 120
gatatgataa gacgagctgt gggattggca gatgaagcaa tcgcaaataa tttgaatgaa 180
gcagacatcg cccaatttct taagtccaat ttcgacaaac tctatccagc accgtggcac 240
tgtttcgttg gcaagcgatt cagctcgttt gtgactcacg aaagcggtag cttcatttac 300
ttttacatcg tcaatttggc cgtcgttttg ttccgctgca aagattgatt tctcttgttg 360
tttttgtacc caaaagattt tgattcgaat ccattggttt ttgtttttgt tggcatcgtg 420
ttcgtgcatt tcattttagc ggccgttcat cgaataaaca agtgcatttt ggagcgttta 480
aagcgaaatg atttcagttt ctcgtctctt caatttcagt cgaactttca atctacgtgg 540
atattgtagc agaatgaccg atgaagcaaa taccatctac tcgttcaaag ccaaggactc 600
cgatggcgcc gaagtctctt tggacaaata tcgcggcaag gtgttgattg tcgtcaacac 660
ggcatctcaa tgcggtaagt gttacagcaa ttacactcaa ttgaaagagc tgctcgacaa 720
gtacaaatcc cagggactag aagttgccgc ttttccgtgc aaccaattcg gaaaccaaga 780
acctggttgt gatgcggaca tcaaatcgtt tgtgtccgac aagttcaaat tcgatcccga 840
cttgtattcc aaggttaagg ttaacggaga cgacgctcat ccgttgttta aattcctcaa 900
gaaagagcaa ggtggtacgt tgttcgacgc catcaaatgg aatttcacca agttcttggt 960
gaaccgtcaa ggaaaagttg ttgctcgtta tgcgccgacc accgagccaa agtcgatggt 1020
gaaagacatc gagaaagcat tgaacggcga gttgtgagaa tcgcgatagt aacgcaaaga 1080
ctgtaatatt ttattgtacg attaagttaa atagagcaag aataaactaa acggttatta 1140
aaaaaaaa 1148
2
20
DNA
Ab-Trxl-F
2
ttcgacaaac tctatccagc 20
3
20
DNA
Ab-Trxl-R
3
tgaaattcca tttgatggcg 20
4
40
DNA
Ab-Trxl-T7F
4
taatacgact cactataggg aacaagtgca ttttggagcg 40
5
20
DNA
Ab-Trxl-iR
5
acaaacgatt tgatgtccgc 20
6
20
DNA
Ab-Trxl-iF
6
aacaagtgca ttttggagcg 20
7
40
DNA
Ab-Trxl-T7R
7
taatacgact cactataggg acaaacgatt tgatgtccgc 40
8
21
DNA
Ab-Trxl-qF
8
tgaccgatga agcaaatacc a 21
9
20
DNA
Ab-Trxl-qR
9
tcgacgagct caacacttac 20