抗腫瘤試劑的製作方法

2023-12-09 01:54:06 1

專利名稱：抗腫瘤試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含來源於蛇毒的解整聯蛋白(disintegrin)的抗腫瘤藥物，更具體說涉及含有活性成分Salmosin的抗腫瘤藥物，這種Salmosin是一種新的含Arg-Gly-Asp(RGD)序列的解整聯蛋白，其來源於韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液。
背景技術：
腫瘤侵染和轉移是一種癌症細胞致命性地全身擴散的生物學現象。首先，脫離初發位置(例如上皮組織)的癌症細胞破壞將它們與其他組織隔離的基底膜。部分侵染細胞能夠穿透圍繞血管的基膜以及排列其上的內皮細胞層，從而隨血流而自由循環。最後，癌症細胞到達毛細血管，吸附並且再次穿透毛細血管壁，形成二級腫瘤。也許，只有少於10000分之1的脫離初發位置的癌症細胞能夠存活並在另一個組織形成克隆(參見Erkki Ruoslahti，科學美國人，72-77，1996年9月)。
因此，腫瘤轉移和侵染需要細胞和胞外基質(ECM)間的粘性相互作用。在腫瘤轉移期間，腫瘤細胞能夠引起內皮細胞收縮，暴露出內皮細胞下基底膜，使腫瘤細胞有效地粘附到周圍基質的ECM蛋白質上(參見Hynes，R.O.細胞48549，1987)。這些基質蛋白質通過結合特異的細胞表面受體(包括整聯蛋白家族的成員)促進細胞粘著。
就結構而言，每個整聯蛋白是由非共價相連的α和β亞基組成的異二聚體。人們認為β1亞家族是胞外基質粘著的主要媒介。已有報導說β1整聯蛋白可能有其它功能，例如介導細胞-細胞的直接粘著(參見Larjava，H.等，細胞生物學雜誌，110803-815，1990)。在白細胞上發現的β2亞家族包含介導細胞-細胞相互作用的受體。β3亞家族包括血小板糖蛋白IIb/IIIa複合體和玻連蛋白受體，它可能在腫瘤侵染和轉移的發展過程中起重要作用(參見Albelda，S.M.等，癌症研究，506757-6764，1990)。
跨越細胞膜的整聯蛋白受體複合體將一個細胞的完整細胞骨架與胞外環境連接起來。人們認為細胞粘附分子(如纖維蛋白原、玻連蛋白和層粘連蛋白)的通用序列或特有核心序列導致了細胞粘連，以及細胞的擴散或整合。
另一方面，腫瘤發生和轉移與整聯蛋白的生物作用密切關聯(參見Giancotti F.G.和Rouslahti E.，細胞60849-859，1990；Hynes R.O.細胞6911-25，1992；Nip J.等，臨床研究雜誌962096-2103，1995)。
纖維蛋白原受體α5β1的過量表達抑制了中國倉鼠卵巢細胞的轉化表現型。在ras-轉化的齧齒動物細胞中，整聯蛋白α5β1減少(參見Plantefaben L.C.和Hynes R.O.細胞56281-290，1989)，超纖維蛋白原(多聚體纖維狀形式的纖維蛋白原)阻止了腫瘤的轉移和形成(參見Pasqualini R.，等，天然藥物21197-1203，1996)。
整聯蛋白αvβ3是多數惡性細胞的特有標記，暗示這種粘連受體在人黑素瘤的惡性生長中起關鍵作用(參見Albelda S.M.等，癌症研究506757-6764，1990)。整聯蛋白αvβ3基因的表達和產生的粘連表型直接參與人黑素瘤的體外增殖(參見Felding-Hamermann，臨床研究雜誌892018-2022，1992).
血管發生是已有血管派生出新血管的生物過程(參見Folkman J.和D』Amore P.A.細胞871153-1155，1996)。這一過程在實體瘤發展以及正常發育、傷口癒合和發炎過程中都發揮關鍵作用，平滑肌和內皮細胞中的血管細胞粘連分子致力於該過程的調節(參見Nguyen M.等，自然365267，1993)。
腫瘤的血管發生表型轉變可能是由於參與血管發生的正負調節因子失衡導致的。近來，有報導說存在兩種細胞因子依賴性血管發生途徑，這兩種途徑由不同的血管細胞整聯蛋白αvβ3和αvβ5確定，αvβ3和αvβ5在血管發生的血管細胞中表達，並在鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)和人腫瘤碎片誘導的血管發生中起重要作用(參見Friedlander M.等，科學2701500-1502，1995)。αvβ3整聯蛋白的激活刺激了促進血管生長和分化的存活信號，這表明通過細胞因子和整聯蛋白受體進行的信號活動與新血管的生長關係密切(參見Brooks Pγ.C.等，細胞791157-1164，1994)。
另一方面，已經鑑定到如下幾種內源血管發生抑制因子幹擾素α，γ(參見Friesel R.等細胞生物學雜誌104689-696，1987；EzekowitzR.A.等，N.Engl.J.Med.3241456-1463，1992)；幹擾素誘導蛋白10(參見Angiolillo A.L等，實驗醫學雜誌182155-162，1995；Strieter R.M.等，生物化學和生物物理學研究通訊210；51-57，1995)；特異性抑制內皮細胞增殖的血管緊張素和endostatin(參見O』Reilly M.S.等細胞79315-328，1994；O』Reilly M.S.等，細胞88277-285，1997)；gro-β(參見Cao Y.等，實驗醫學雜誌1822069-2077，1995)；催乳素的16 kDaN-末端片段(參見Clapp C.等，內分泌學1331292-1299，1993)；以及血小板因子4(參見Maione T.等，科學24777-79，1990；Gupta S.K.等，美國科學院學報927799-7803，1995)。
眾所周知，解整聯蛋白是一類主要來源於蛇毒的小蛋白質(參見Niewiarowski S.等，Semin.Hematol.3l289-300，1994)。多數解整聯蛋白含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)序列，這些序列是血小板纖維蛋白原蛋白受體α2bβ3識別的結構區，同時它們也是包括αvβ3和αvβ5在內的幾種整聯蛋白的有效拮抗物。有幾篇報導論述，含有RGD序列的解整聯蛋白通過阻斷腫瘤細胞與ECM的粘連而抑制腫瘤轉移(參見Trikna M.等，癌症研究54(8)4993-4998，1994)。
經鑑定，整聯蛋白αvβ3是雞胚胎和人體新生血管的標記(參見Brooks，P.C.等，科學264569-571，1994)。抗αvβ3單克隆抗體能夠誘導新生血管內皮細胞衰亡，幹擾新血管發生。應用含有阻斷配體與整聯蛋白αvβ3結合的RGD序列的合成肽抑制了雞尿囊絨毛膜(CAM)上腫瘤誘導的血管發生(參見Brooks，P.C.等，細胞991157-1164，1994)，同時還抑制了協助內皮細胞粘連和分散的血管生成素的功能。最近，報導了一種來源於蛇毒的解整聯蛋白—trifavin，它能夠抑制TNF-α誘導的血管發生。這些發現意味著解整聯蛋白、合成RGD肽和抗αvβ3單抗可以開發成為有效的抗腫瘤試劑。
與先前的報導一致，本發明人從韓國蛇Agkistrodon halysbrevicaudus的毒液中分離到Salmosin，經鑑定它是一種新的具有血小板凝集強抑制活性的7.5kDa蛋白質(參見韓國專利NO142606，SEQID NO1)；並且它含有已知的抑制配體與整聯蛋白αvβ3結合的RGD序列。
在目前情況下，我們有充分的理由開發研製含有從韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus毒液得到的活性成分Salmosin的抗腫瘤藥。
發明概述本發明人從韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液分離並純化了Salmosin，克隆了其cDNA，並在大腸桿菌中大量表達重組Salmosin。然後，他們在發現Salmosin能夠強烈抑制腫瘤血管發生(癌症細胞生長和轉移的關鍵)，而不影響正常內皮細胞的增殖的基礎上，研製了包含活性成分Salmosin(含有RGD序列的解整聯蛋白)的抗腫瘤藥。
因此本發明的首要目的是提供包含來源於韓國蛇Agkistrodon halysbrevicaudus毒液的活性成分Salmosin的抗腫瘤藥。
附圖簡述以下結合附圖的詳細描述，將進一步顯示本發明的上述和其他目的及特點。其中

圖1是編碼磷酸核糖激酶的重組表達載體ΔpMA-PRK153的基因圖譜。
圖2A是編碼由PRK153、尿激酶裂解位點和Salmosin組成的融合蛋白的重組表達載體ΔpMASIN1的基因圖譜。
圖2B是重組Salmosin和分離的Salmosin的SDS-PAGE模式照片。
圖3顯示Salmosin抑制B16黑素瘤細胞轉移的鼠肺照片。
圖4A是顯示Salmosin對bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)刺激的BCE(牛毛細管內皮)細胞增殖的抑制作用曲線圖。
圖4B是顯示抗-αvβ3單抗和Salmosin對bFGF刺激的BCE細胞增殖的抑制作用曲線圖。
圖5A是顯示bFGF誘導的CAM(雞尿囊絨毛膜)血管發生的照片。
圖5B是顯示抗-αvβ3單抗對bFGF誘導的CAM血管發生抑制作用的照片。
圖5C是顯示Salmosin對bFGF誘導的CAM血管發生抑制作用的照片。
圖6A是顯示Salmosin或其它抗αvβ3整聯蛋白的拮抗劑(即抗-αvβ3抗體或GRGDSP)對玻連蛋白和BCE細胞粘連的抑制作用曲線圖。
圖6B是顯示Salmosin或其它抗αvβ3整聯蛋白的拮抗劑(即抗-αvβ3抗體或GRGDSP)對Salmosin和BCE細胞粘連的抑制作用曲線圖。
圖7顯示了鼠肺照片，表明Salmosin對轉移性Lewis肺腫瘤生長的抑制作用(上PBS處理，下Salmosin處理)。
圖8是顯示Salmosin對實體性Lewis肺腫瘤生長抑制作用的曲線圖。
發明詳述本發明人從韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液分離並純化到Salmosin，篩選出其cDNA，並在大腸桿菌中大量表達了重組Salmosin。他們研究了分離的Salmosin和重組Salmosin在體內和體外對腫瘤轉移和生長的生物學作用。結果發現Salmosin強烈抑制αvβ3整聯蛋白的功能(該功能是腫瘤血管發生的關鍵)，並且有效地抑制腫瘤的轉移和生長。下面進一步說明本發明。
用一系列柱層析從韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液中分離並純化出Salmosin，並從Agkistrodon halys brevicaudus毒腺的cDNA文庫中克隆出其cDNA。為了研究Salmosin是否能抑制腫瘤細胞的轉移，將Salmosin與黑素瘤細胞混合，注射到鼠尾側靜脈。Salmosin在體外不能阻斷腫瘤細胞自身增殖，而是以劑量依賴的方式阻斷腫瘤細胞的血管發生。這些發現有力地提示Salmosin對腫瘤轉移的抑制效果是由於它阻斷了與腫瘤轉移相關的整聯蛋白的功能，而非它的細胞毒性。基於這種思路，本發明人通過BCE細胞增殖實驗，研究Salmosin是否能阻斷與腫瘤血管發生有關的αvβ3整聯蛋白的功能。結果發現，Salmosin阻斷了腫瘤誘導的血管發生，而不影響已有血管或已有血管發生；並且發現Salmosin對BCE細胞增殖的抑制效果是由於Salmosin與BCE細胞表面的玻連蛋白受體—αvβ3整聯蛋白的直接結合所致。
另一方面，眾所周知，解整聯蛋白阻斷轉移性腫瘤形成克隆，但不清楚解整聯蛋白能否阻斷已形成的轉移性腫瘤的生長。因此，為了檢測Salmosin對轉移性腫瘤生長的影響，將轉移性Lewis肺腫瘤細胞注射給鼠，克隆形成後，注射Salmosin。結果證明轉移性腫瘤生長被有效地抑制了，而不產生任何細胞毒症狀，Salmosin還能阻斷實體瘤的生長。
以下實施例用於進一步闡述本發明，它們不應認為是對發明範圍的限定。實施例1從毒液中分離Salmosin為了從韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus的毒液中純化Salmosin，將lml毒液懸浮在20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5，緩衝液A)中至體積為10ml，裝入用緩衝液A平衡的苯胺-瓊脂糖(Sepharose)柱(Pharmacia-LKB，Sweden)，洗脫流速為30ml/小時。收集未與柱結合的組分，用緩衝液A懸浮，再裝入DEAE-Toyopearl柱(2.5×5.0cm)(Pharmacia-LKB，Sweden)，洗脫流速為60ml/小時。以25mM、50mM、100mM和1M NaCl的濃度進行分步洗脫，用超濾系統(Amicon，USA.)濃縮活性級分。濃縮物裝入TSK-G2000柱(7.5×300cm)(Toyosoda，Japan)，用PBS(磷酸鹽緩衝液)洗脫。匯合活性級分，濃縮後裝入用0.1％TFA(三氟乙酸)溶液平衡的反相Vydac C18柱(2.5×300cm)(Vydac，USA)。然後，用所述TFA溶液和20％(v/v)乙腈溶液交替洗柱子，用20-60％(v/v)線性梯度的乙腈將蛋白質洗脫到所述TFA溶液中。實施例2重組Salmosin的表達和純化為了克隆編碼Salmosin的cDNA，用Agkistrodon halys brevicaudus毒腺cDNA文庫作模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR反應中，寡聚d(T)作為3』引物，用根據Salmosin N-末端胺基酸序列(—EECDCG—)推斷的核苷酸序列(SEQ ID NO2)作為5』引物。用瓊脂糖凝膠電泳純化290bp的PCR產物，將其克隆到載體pCPII(Invitrogen，USA)上。分析克隆的DNA序列(SEQ ID NO3)，由所述DNA序列翻譯產生的胺基酸序列與分離到的Salmosin序列一致。表達重組Salmosin時，使用了大腸桿菌表達載體ΔpMA-PRK153(見圖1)。在這種載體中，在araB啟動子的調控下，目標蛋白表達為與磷酸核糖激酶(PRK)形成的融合蛋白。為了方便進行亞克隆，通過將由PCR產生的DNA片段引入BamHI和XhoI位點而將之修蝕。同時在磷酸核糖激酶和Salmosin編碼序列之間引入尿激酶裂解位點，將製備得到的表達載體命名為ΔpMASINI(見圖2A)。在圖2A中，ParaB代表araB啟動子，PRK(1-153)代表包含1到153胺基酸序列的蛋白質，UK代表尿激酶裂解位點。將該表達載體轉化大腸桿菌菌株MC1061。轉化子在1升2×YT培養基中生長，用1％阿拉伯糖(w/v)誘導，37℃培養18小時，至600nm波長吸光度為0.3。Salmosin表達成為不溶的內涵體，將內涵體重懸浮於沉澱洗滌溶液(0.5％Triton X-100，1mM EDTA，1mM DTT)，以12000rpm離心20分鐘，除去汙染的大腸桿菌蛋白質。再洗3次後，沉澱溶解於20ml 8M脲溶液(8M脲，20mM Tris-HCl，pH7.8，20uM DTT)，4℃保溫24小時。離心後，澄清的上清液在4℃對4L透析緩衝液(80mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.8，0.03％SDS)透析。隨後在室溫用尿激酶裂解重新摺疊的融合蛋白30分鐘，比率為400mg融合蛋白對1U尿激酶。將10mg裂解蛋白質裝入用20mM Tris-HCl，(pH8.0)緩衝液平衡的DEAE-Toyopearl柱子，用含有50mMNaCl的同一緩衝液洗脫。匯合活性級分，濃縮後加入TSK-G200 HPLC柱子(2.15×30cm)，用PBS洗脫。隨後，為了除去不當裂解的Salmosin，將活性級分加入半製備C18 HPLC柱(1.0×20cm)，用0.1％TFA溶液中的20-40％(v/v)線性梯度的乙腈洗脫。實施例3重組Salmosin和分離的Salmosin的比較實驗為了比較上述實施例1和2中製備的Salmosin的物化性質和生物活性，分別進行了N-端測序，血小板凝集檢測和SDS-凝膠電泳。結果顯示重組Salmosin的N-端序列以EAGEEC起始，這與分離的Salmosin的一致，它們對血小板凝集的抑制活性也相同。並且，SDS-PAGE結果表明重組Salmosin的大小與分離Salmosin完全相同(見圖2B)。圖2B中，1道是重組Salmosin，M道是分子量標記，2道是分離的Salmosin。據此清楚地表明，重組Salmosin摺疊正確，並具有與分離Salmosin同樣的生物活性。實施例4Salmosin抑制腫瘤轉移為了研究體內Salmosin對腫瘤轉移的抑制效果，將Salmosin與B16黑素瘤細胞一起注射給C57BL/6鼠(Charles river，Japan)。用0.02％EDTA分離B16黑素瘤細胞，輕輕地重新懸浮在無血清RPMI-1640培養基中，至濃度為7.5×105/ml。然後將Salmosin(250,500,1250ug/kg鼠)與細胞混合製備含有指定量Salmosin或PBS的單細胞懸液，取200ul單細胞懸液注射入鼠尾側靜脈。14天後，處死鼠，利用解剖顯微鏡計數肺黑素瘤克隆。結果發現，與PBS處理的對照組相比，C57BL/6鼠肺內的轉移克隆急劇減少(見表1)。如表l所示，Salmosin對克隆形成的抑制是劑量依賴性的；低劑量Salmosin(250μg/kg鼠)能抑制肺內的克隆形成，但給予更高劑量的Salmosin時，幾乎檢測不到克隆。這些發現與組織化學分析結果相符(見圖3A，正常肺；B，PBS處理；C，250ug Salmosin/kg處理；D，1250ug Salmosin/kg處理)。
表1Salmosin處理對腫瘤轉移的抑制
另外，根據將B16黑素瘤細胞體外與Salmosin溫育，不影響它們隨後的增殖率這一實驗事實，表明Salmosin對腫瘤轉移的抑制不是由細胞毒性引起的。
基於Salmosin對B16黑素瘤細胞粘連和侵染ECM的抑制效果，這些實驗證據有力地提示，Salmosin作為腫瘤細胞表面的整聯蛋白受體拮抗劑，抑制腫瘤轉移。實施例5Salmosin抑制血管發生實施例5-1BCE(牛毛細血管內皮)細胞增殖檢測應用BCE細胞增殖檢測系統，檢查Salmosin對血管發生的抑制效果。製備來自牛腎上腺的BCE細胞初級培養物，隨後該細胞在含有3ng/ml bFGF、補充有10％胎牛血清的Dulbeco′s基本培養基(DMEM)上維持培養。將上述BCE細胞在凝膠狀24-槽培養板上鋪板，37℃、5％CO2培養24小時。培養後，培養基換成含有5％胎牛血清的DMEM，並將Salmosin加入培養基。培養20分鐘後，用溶於上述培養基的bFGF(1ng/ml)處理細胞，72小時後，用胰蛋白酶分離細胞，計量細胞數。結果發現Salmosin能夠以劑量依賴性方式抑制bFGF刺激的BCE細胞增殖。Salmosin濃度為0.1-0.2ug/ml(對應13-27nM)時觀察到半最高抑制(見圖4A)。另外，Salmosin處理使bFGF刺激的BCE細胞發生顯著的形態變化，成為球形。但是，缺乏bFGF時，用20ug/ml Salmosin處理(這是Salmosin對bFGF誘導的增殖產生最高抑制所需劑量)不能抑制細胞增殖(見圖4A框中的示意圖)。另一方面，經檢查抗αvβ3的單抗能有效抑制bFGF誘導的BCE細胞增殖(見圖4B)。
實施例5-2CAM(雞尿囊絨毛膜)檢測通過CAM(雞尿囊絨毛膜)檢測，檢查Salmosin對體內腫瘤誘導的血管發生的抑制效果。將三天齡受精雞卵小心地打出裂縫，用透明膠帶封好。37℃，60％溼度保溫10天，該受精卵發育為胚胎。之後，將6ng bFGF植入每個胚胎的CAM，誘導新血管發生。保溫24小時後，用5μg Salmosin，5μg抗αvβ3的單抗(陽性對照)或PBS(磷酸鹽緩衝液，陰性對照)處理每個胚胎的CAM。72小時後，在立體顯微鏡下觀察CAM上的血管(見圖5A、5B和5C)。觀察到PBS處理時，新血管發生無可見變化(見圖5A)，而用Salmosin或抗αvβ3的單抗處理時，新血管發生被抑制(見圖5B和5C)。特別是發現Salmosin能使bFGF誘導的新血管破裂，表明Salmosin能抑制腫瘤誘導的新血管發生，而不影響已有血管或屬於正常生理現象的血管發生。實施例6Salmosin抑制BCE細胞粘連為了研究BCE細胞增殖是否被Salmosin與αvβ3整聯蛋白(BCE細胞表面的一種玻連蛋白受體)的直接結合所抑制，檢查了Salmosin抑制BCE細胞粘連玻連蛋白的能力用溶於PBS的Salmosin(1ug/槽)和玻連蛋白(0.5ug/槽)包被96槽微板，4℃，16小時。清洗該微板，用10mg/ml熱變性牛血清清蛋白保溫1小時以封閉存留的蛋白質結合位點，用前用PBS洗。用胰蛋白酶-EDTA分離BCE細胞，在PBS中洗三次，重懸浮於無血清DMEM。5×104個細胞與Salmosin、抗αvβ3的單抗、合成的RGD肽(GRGDSP)或合成的RGE肽(GRGETP)預保溫20分鐘，並將之均分到上述板的各個槽中，然後在37℃，5％CO2，95％空氣中繼續保溫1小時。用PBS洗去未結合的細胞，然後固定結合在板上的細胞，並用考馬斯藍染色。測量每個槽在540nm的光吸收，確定相對細胞數。結果發現Salmosin與bFGF誘導的細胞預保溫，能夠高度抑制BCE細胞與玻連蛋白粘連(見圖6A)；抗αvβ3的單抗強烈抑制細胞與Salmosin粘連(見圖6B)；合成RGD肽(GRGDSP)也能夠抑制細胞與玻連蛋白或Salmosin粘結(見圖6A和6B)。這些結果清楚地顯示，Salmosin與BCE細胞上的αvβ3整聯蛋白結合，從而阻斷了整聯蛋白介導的細胞粘著。實施例7Salmosin對轉移性腫瘤生長的抑制已有報導，解整聯蛋白通過阻斷腫瘤細胞附著到內皮，從而抑制肺腫瘤克隆的形成。但是，不清楚解整聯蛋白是否抑制肺轉移性腫瘤的生長。為了研究Salmosin對轉移性腫瘤生長的抑制效果，將來源於ATCC(Rockville，USA.)的1.5×105個Lewis肺腫瘤細胞注射入8周齡的C57BL/6雄鼠側尾靜脈，鼠體內形成轉移性克隆。4天後，對鼠靜脈注射Salmosin，每天一次，劑量為1.25mg/kg/天；4周後，處死鼠，分離肺；在解剖鏡下計數肺腫瘤克隆數目。所有測試鼠都沒有發現可辨認的毒性症狀。結果顯示，Salmosin顯著抑制轉移性腫瘤的生長(見表2)。在這方面，Salmosin對轉移性腫瘤生長的抑制效果可以解釋為Salmosin結合了腫瘤血管發生所必須的αvβ3整聯蛋白。
表2Salmosin處理對肺部轉移性Lewis肺瘤生長的抑制
另外，進行了組織化學分析來研究Salmosin對肺部轉移肺瘤的抑制效果。該肺組織在Bouin’s溶液中固定4小時，依照標準操作包埋在石蠟中。4μm厚切片在胰蛋白酶中，37℃浸泡10分鐘，然後用PBS清洗。上述切片用蘇木精和曙紅染色，隨後製片。在Salmosin處理的動物肺中幾乎沒有觀察到腫瘤克隆(見圖7)，這與PBS處理的對照鼠完全不同。圖7分別顯示了放大400倍(左)和200倍(右)的照片，暗示Salmosin對轉移性腫瘤生長的抑制效果與它對血管發生(次級腫瘤生長所必需)的抑制作用密切相關。實施例 8Salmosin抑制實體瘤的生長為了檢查Salmosin在實體瘤生長中的作用，將Lewis肺瘤細胞(1×106)皮下注射到C57BL/6鼠背部中線，使之長成至少100-200mm3的一塊。將鼠隨機分為兩組後，一組動物在遠離腫瘤的位置皮下注射Salmosin的PBS液(10mg/kg鼠)，每天一次；另一組作為對照，只注射PBS。每天同一時間測量各組動物的腫瘤體積，當對照鼠開始死亡時，終止實驗。結果觀察到，Salmosin處理強烈抑制實體瘤的生長(見圖8)。
給藥和有效劑量雖然Salmosin的有效劑量隨病人的年齡、體重和病情進展而變，優選非腸道給藥，一次劑量為0.5-10mg/kg/天，本領域技術人員可以根據經驗區別對待。
急性毒理實驗為了檢查Salmosin的急性毒性，給雄性C57BL/6鼠皮下注射7天Salmosin，統計死亡鼠個數以確定LD50。測量結果LD50大約為1000mg/kg，表明含有Salmosin的抗腫瘤藥物在有效劑量範圍內足夠安全。
本發明的含有活性成分Salmosin和可藥用載體的藥物組合物，可以以注射劑劑型給藥。注射劑還可以包含等滲水溶液或懸液，可藥用載體包括防腐劑、穩定劑、潤溼劑、乳化劑、用於改變滲透壓的鹽或緩衝液。
雖然說明和描述本發明的具體實施例使用黑素瘤細胞和Lewis肺瘤細胞作為受測腫瘤細胞，然而本發明的抗腫瘤試劑可以對多種腫瘤有效，例如皮膚癌、喉癌、子宮癌、結腸癌、肺癌和骨髓癌。
正如以上說明和顯示，本發明提供一種含有活性成分Salmosin的抗腫瘤試劑。本發明論證Salmosin是一種新的阻斷αvβ3整聯蛋白功能、強烈抑制腫瘤血管發生、腫瘤轉移以及實體瘤生長的解整聯蛋白。在抑制腫瘤生長，而對已有血管和正常血管發生沒有任何不利影響的有效劑量範圍內，Salmosin未呈現細胞毒性。據此，Salmosin可以用於研製對多種癌症有效的抗腫瘤藥物。序列表申請人 金鬥植髮明名稱含有活性成分SALMOSIN的抗腫瘤藥物在先申請號 KR98-23778在先申請日 1998-06-23在先申請號 KR 99-20579在先申請日 1999-06-04序列數 3軟體類型KOPATIN 1.0SEQ ID NO1胺基酸數 73分子類型 PRT來源 Agkistrodon halys brevicaudusSEQ ID NOl的序列描述Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys1 5 10 15Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly20 25 30Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala50 55 60Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala65 70SEQ ID NO 2核苷酸數20分子類型DNA來源合成序列220鏈型單鏈寡核苷酸SEQ ID NO2的序列描述ggngargart gygaytgygg20SEQ ID NO3核苷酸數 222分子類型DNA來源Agkistrodon halys brevicaudusSEQ ID NO3的序列描述gaggccggag aagaatgtga ctgtggctct cctggaaatc cgtgctgtga tgctgcaacc 60tgtaaactga gacaaggagc acagtgtgca gaaggactgt gctgtgacca gtgcagattt 120atgaaagaag gaacaatatg ccggagagca acgcgtgatg acctggatga ttactgcaat 180ggcatatctg ctggctgtcc cagaaatccc ttccatgcct aa 22權利要求
1.一種抗腫瘤試劑，包含來自Agkistrodon halys brevicaudus毒液的具有如SEQ ID NO1所示胺基酸序列的活性成分Salmosin，和可藥用載體。
2.權利要求1的抗腫瘤試劑，其中的Salmosin的胺基酸序列(SEQID NO1)由SEQ ID NO3所代表的cDNA序列推斷出來。
3.權利要求1的抗腫瘤試劑，其對皮膚癌、喉癌、子宮癌、結腸癌、肺癌和骨髓癌有效。
全文摘要
本發明涉及包含Salmosin的抗腫瘤藥物，其中的活性成分Salmosin是一種來自韓國蛇Agkistrodon halys brevicaudus毒液的，含有Arg－Gly－Asp(RGD)序列的新的解整聯蛋白。Salmosin是一種能夠阻斷αvβ3整聯蛋白功能、強烈抑制腫瘤血管發生、腫瘤轉移以及實體瘤生長的解整聯蛋白。在抑制腫瘤生長和對已有血管和正常血管發生沒有任何不利影響的有效劑量範圍內，Salmosin未呈現細胞毒性。據此，Salmosin可以用於研製對多種癌症有效的抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K35/56GK1239675SQ99109240
公開日1999年12月29日 申請日期1999年6月23日 優先權日1998年6月23日
發明者金鬥植, 康仁哲, 鄭光會 申請人:金鬥植