在凝膠過濾介質上連接進行重複固相析出的分離純化方法

2023-12-09 04:42:46 1

專利名稱：在凝膠過濾介質上連接進行重複固相析出的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種全新的分離純化方法，適用於多種物質的分離純化，可以把一大類基本的分離純化方法——液體溶液中的固相析出法提高到一個新水平。
固相析出法，包括沉澱法和結晶法，是一種非常基本的分離純化方法。它是根據不同物質在同一溶液中溶解度不同，在固液兩相分配的量不同進行分離的。操作上，使不同的物質在處於一定條件的溶液中發生固相析出，形成沉澱或結晶，然後用自然沉降、過濾或離心技術分離固液兩相。
固相析出法具有簡單、經濟、處理量大、適應面廣、濃縮倍數高的優點，廣泛應用於各種物質的分離純化過程中，在化學、化工、生物工程、生化、醫學、製藥、食品等眾多學科與產業的分離純化工作中，起非常重要的作用。
固相析出法一般一次就可除去大量雜質，但為提高產品純度，常需進行重複操作，如有機小分子物質和無機物常用重結晶方法，蛋白質分離常可用重複鹽析等。
重複固相析出法會明顯改善分離效果，但因為單元操作體積和裝置的接觸面積不可能太小，造成損失大、收率低；又因重複析出一般是斷續操作，步驟多而操作麻煩，實際應用中，重複析出的次數不可能過多，一般只重複兩到三次；所以重複固相析出法在應用上受到嚴重的限制。
迄今為止，人們已設計出幾種連續重複固相析出裝置，但應用面都很窄，效率也不高。
如工業上應用的連續多級結晶器，用溫度梯度實現重複結晶，固液分離靠螺旋刮刀等分離不徹底，效率較低。
在聚合物的淋洗分級裝置中，也有一種連續重複沉澱的設計，通過溫度梯度，使溶解了的沉澱又重新沉澱，沉澱物與溶液分離靠的是玻璃砂、鋁箔等物質，固液分離也不徹底，效率不高。
Schwimmer在1953年(S.Schwimmer，Nature，1953，171，442)曾用過如下方法把CaSO4·1/2H2O介質填裝在玻璃柱中，將含蛋白質的硫酸銨溶液流經柱體，介質的水合作用增加了鹽的濃度，造成蛋白質的鹽析，因溶液向前流動，鹽濃度逐漸增高，可能造成反覆沉澱。但此法條件很難控制，效率也不高。
已知的重複固相析出裝置，都有應用面窄、裝置較複雜、固液分離不徹底、效率低、操作條件較難控制的缺點，至今還沒有一種較好的連續重複固相析出法廣泛應用。
本發明的目的發明一種全新的，在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的方法，它解析度高、回收率大、上樣量大、設備簡單、裝置可以反覆使用並適用於多種析出方法。
本發明的基本要點是本發明應用以下兩點原理首先，在凝膠過濾層析中，小分子遷移慢，大分子遷移快，其次，一定範圍大小的固體顆粒介質(一般大於5μm、小於50μm)可以充當助濾劑，攔阻固相析出物，起到過濾的作用，並提供高的流率。而一定細度的凝膠過濾介質可以起助濾劑作用。本發明利用第一點實現重複固相析出，利用第二點實現徹底的固液分離。
實施本發明的條件固相析出劑的分子量比被析出物的分子量要小，使得二者在凝膠過濾介質上，遷移時，有較明顯的速率差異。
操作上，選擇適當排阻範圍和工作範圍的，一定細度的凝膠過濾介質，填裝在層析柱內，或鋪成板準備層析，先將能使被分離物發生固相析出的溶液(稱做析出劑或析出)流入柱或板內，達到一定體積，再將被分離物質以固相或溶解相上樣，然後通入能使被分離物溶解的溶液或溶劑(稱為溶解液或溶解劑)進行洗脫，以上裝柱或鋪板及上樣洗脫的操作同於一般的層析操作。
樣品被溶解劑洗脫後，被分離物質分子以溶解狀態遷移，遷移速率比前面的析出劑分子速率快，所以會逐漸趕上並相遇，進入析出劑裡發生固相析出，析出物即被作為助濾劑的凝膠過濾介質過濾攔阻，而溶液中不析出的物質繼續以原速率快速遷移，這樣發生第一次固相析出分離。析出物被攔阻後，停止不動，當後續的溶解劑流過時，又重新溶解，以大的遷移速率追趕析出劑，重複析出，析出物又被攔阻，發生第二次固相析出分離，如此反覆，只要層析柱或板有足夠的長度，使以上的追趕過程實現，就可以繼續重複。這樣，就可以實現連續而多次重複的固相析出分離，直至被分離物流出柱或板為止。
以上所說的一定排阻範圍，是指能使析出劑分子與被分離樣品分子的遷移速率的有明顯差別，而且差別越大越好，最好是析出劑完全滲透，樣品分子完全排阻。比如在等電點沉澱蛋白質，一定pH值的緩衝液的分子屬小分子，如NaAc-HAc緩衝液，而蛋白質分子分子量大於一萬，所以用葡聚糖凝膠G-10，G-15，G-25，都可以滿足最好的排阻範圍要求。一定的細度指的是能夠較好地攔阻析出物使固液分離徹底又有較好的流速，一般中粒或更小顆粒的凝膠過濾介質就可以較好地攔阻析出物。一定的工作範圍，指在析出劑、溶解劑和樣品溶液中介質操作性能良好。
凝膠過濾層析技術又稱分子排阻層析，凝膠滲透層析，作為一種通用性的分離技術已廣泛應用，其介質也不斷推陳出新，有多種商品可供選擇；如控孔玻璃微珠(Bio-glass)系列，葡聚糖(Sephadex)系列，瓊脂糖(Bio-GelA、Sepharose)系列，聚丙烯醯胺(Bio-GelP)系列，聚合烯丙基葡聚糖(Sephacryl)系列、聚乙烯醇(Toyopearl)系列等，其分子排阻範圍從百到數百萬道爾頓，其粒度一般都有粗、中、細、超細四個等級，除粗粒外，中、細、超細膠作為助濾劑的性能很好，可以快速地過濾一般的固相析出物。工作範圍也較寬，在水溶液操作性能良好，許多凝膠如Sephacryl，Toyopearl，可以在有機溶劑中操作，並可耐受一定強度的酸鹼，機械生能與流速也非常好，總之，現代凝膠過濾層析技術已能為本發明提供多種排阻範圍，細度和工作範圍的凝膠，為本發明的可行性提供了充分的保證。
本發明可以很方便地在現有的層析裝置上實施。同一般層析技術相似，可以採用階段洗脫、梯度洗脫方式，也可以在一個柱上實現多種方式的不同機制的固相析出方法的連續重複操作。
階段洗脫方式先在層析柱或板內流入析出液，然後上樣， 再分別用不同強度的溶解劑分別按階段進行洗脫。
梯度洗脫方式使析出液與樣品同於階段洗脫方式流入層析系統，而溶解劑則按梯度方式逐漸增強溶解生能。這種洗脫方式，會使樣品得到一個連續的，分辨力更好的分級效果，在流出液中不同的物質將會有一個較窄的分布。
如果我們在層析系統中先流入一種析出方式的析出劑達一定體積，然後再流入另一種析出方式的析出劑達一定體積，兩種析出劑的遷移速率相等或相近而不能相互混合幹擾，而其體積不能太大，要讓樣品物質的速率能從後面追上來並發生一定次數的反覆析出，那麼我們就可以在一個柱或板上，實現兩種析出方式的連續重複分離。
本發明所指的固相析出劑不一定是特定的沉澱劑，只要在某一溶液或溶劑中溶解度小，有析出就可以，甚至可以用蒸餾水等。
本發明將固相析出分離原理與凝膠過濾層析原理結合起來，創造了一種全新的連續重複固相析出技術，可簡稱「固相析出層析」，它與現有技術相比，有以下優點1.上樣量大、解析度高、回收率較好。可以將固相析出分離方法引入一個新水平。因為採用助濾劑過濾方法在介質上阻留析出物，不同與一般層析技術的保留機制，所以其上樣量可以大於任何一種已知的層析技術而沒有固定相吸附或分配等過程中所出現的飽合限制；因為是多次連續重複析出且固液分離徹底，故比一般的析出分離法分辨力高出許多；因本發明的固液分離機制特殊，其單元操作體積小、故回收率較好。
2.操作簡單，實施容易方便，與現有的層析設備兼容，介質可以反覆使用，每次用後不需要再生，比其它的重複析出操作簡單得多，且速度快。裝置簡單、體積小，可以連續自動進行重複析出，節省人力，並可自動跟蹤檢測。可省去一些離心和過濾的特殊設備，降低成本。可以在現有的實驗室規模及工業規模的層析設備上直接應用。
3.應用非常廣泛。溶液中的固相析出法是一大類的基本分離方法。只要滿足析出劑的分子量比待分離物質的分子量小的條件，就可以應用本發明。而絕大多數的溶液析出法，都是用分子量較小的析出劑使分子量較大的物質發生固相析出而得以分離的。故本發明可以得到非常廣泛的應用。凝膠過濾介質排阻範圍可以從百至百萬，只要滿足重複析出的追趕條件，不論被分離物質是大分子還是小分子都可以實施本發明。
在理論上，本發明可以把固相析出法從初分離水平提高到一個較精確生產製備的水平，並為層析技術提供了一種全新的機制，還為尋找特定物質的析出條件提供一個全面而方便的方法。象聚乙二醇沉澱蛋白質等選擇生較好的析出法應用本發明，尤其是梯度洗脫方式，得到了很高的解析度，可以成為一類很有價值的方法。
在實踐上，因為固相析出法廣泛應用於初分離及工業生產，對這些生產工藝實施本發明，將會明顯改善純度，縮短工藝，節省人力和成本，將會使一系列的工藝得到改進。
下面列舉一些適合實施本發明的一些固相析出方法對蛋白質和多肽的分離，有鹽析法、有機溶劑沉澱法、等電點沉澱法、聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶生非離子聚合物沉澱法、金屬離子沉澱法、有機酸沉澱法、無機酸沉澱法、表面活生劑沉澱法、多聚電解質沉澱法等等。
對核酸、多糖、脂類等物質，有有機溶劑沉澱法、金屬鹽沉澱法、非離子聚合物沉澱法等。
對抗生素、胺基酸、維生素等有金屬鹽沉澱法，在特殊溶劑中的一些結晶法、鹽析法等。結晶法也可以廣泛實施尤其對一些有機物和分子量較大的無機物。
下面列舉些可實施本發明得到改善的工藝胰島素的鹽析與等電點沉澱工藝、胃蛋白酶的重複鹽析工藝、乙醇法及酚法處理核糖核酸的工藝、乙醇沉澱分離右旋糖酐的工藝、亞油酸的鹽析工藝、膽固醇的丙酮提純工藝、頭孢菌素的二價重金屬離子沉澱工藝，等等。
以下結合幾個實施例對本發明作進一步說明實例1用連續重複鹽析方法分離三種標準蛋白樣品稱取牛血清白蛋白12.0mg，雞卵清蛋白12.0mg，核糖核酸酶13.0mg，混合在一起，用1.60ml蒸餾水溶解(三種標準蛋白都是上海生化所東風度試劑廠，電泳純產品)。
層析介質選擇瑞典Pharmacia公司生產的葡聚糖凝膠SephadexG-25細膠(Fine)，溶脹後裝填於10mm×60cm柱中，填裝55cm，用蒸餾水裝柱。
鹽析用溶液為用蒸餾水配製的，70％飽合度的硫酸銨溶液。
操作柱裝好後，用70％硫酸銨溶液平衡兩個柱床體積，然後上樣1.60ml，再用直線梯度洗脫方式洗脫，攪拌瓶為75ml的70％硫酸銨溶液，貯存瓶為75ml蒸餾水，平衡與洗脫流速為24ml/小時。
用核酸蛋白檢測儀在280nm於柱後檢測，當梯度走完後，用蒸餾水洗脫，直至記錄儀回復基線無吸收為止，共出現三個蛋白吸收峰。
以上操作在室溫進行。
實施例2，用連續重複鹽析法分離蛇毒樣品稱東北白眉蝮蛇毒凍乾粉末100.0mg，用1.0ml蒸餾水溶解。
層析介質為瑞典Pharmacia公司生產的交聯葡聚糖SephacrylS-200HR凝膠，用蒸餾水裝填16mm×100cm的層析柱，柱中膠裝至90cm高。
鹽析溶液為55％飽合度的硫酸銨溶液，先用此溶液平衡1個柱床體積。
然後上樣1ml，用鹽濃度逐漸下降的直線梯度洗脫，貯存瓶為125ml蒸餾水，攪拌瓶為125ml的55％的硫酸銨溶液，流速32ml/小時。
用核酸蛋白檢測儀檢測並用記錄儀記錄，當梯度洗完後，再用蒸餾水繼續洗脫，直至記錄筆回復基線不再有吸收為止。
層析圖譜在後部分顯示較高的分辨力。
實施例3用等電點沉澱法分離酪蛋白樣品市售500g包裝的酪蛋白，取500mg，溶於5ml的0.1mol/L的醋酸鈉溶液中。
層析介質用瑞典Pharmacia公司生產的葡聚糖凝膠SephadexG-75中粒凝膠，溶脹後，用蒸餾水裝填於26mm×30cm的層析柱中。
用4mmol/L的PH4.70的HAc-NaAc緩衝液為沉澱劑平衡2個柱床體積，再上樣5ml，然後用0.1mol/L的pH為7.9的Tris-HCl緩衝液作溶解劑洗脫。
平衡與洗脫流速皆為100ml/小時。
用核酸蛋白檢測儀在280nm連續檢測，並用記錄儀記錄。用溶解劑洗至不再有蛋白吸收。
上樣後，洗脫10ml左右，即可在微透明的凝膠中看到出現白色的沉澱帶，隨溶解劑不斷流入，白色沉澱帶逐漸前移，並漸漸加寬，直至出柱。
實施例4用連續重複有機溶劑沉澱法分離人血漿樣品1ml新鮮的人抗凝血漿層析介質用Sephacryl S-200HR，用蒸餾水裝填26m×30cm的層析柱。
用50％的乙醇-蒸餾水溶液作沉澱劑，配法向1000ml95％乙醇中加入960ml蒸餾水，混勻。
先用50％乙醇溶液平衡柱子1個柱床體積後上樣1ml，用乙醇濃度逐漸下降的直線梯度進行洗脫，貯存瓶為150ml蒸餾水，攪拌瓶為150ml50％乙醇溶液。
平衡與洗脫流速為30ml/小時，用核酸蛋白檢測儀在280mm連續檢測並記錄，梯度洗完後，用蒸餾水洗至記錄筆回到基線並穩定，不再有吸收為止。
權利要求
1.一種在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的分離純化方法，其特徵在於選擇適當排阻範圍和工作範圍的，一定細度的凝膠過濾介質，填裝在層析系統內，先將能使被分離物發生固相析出的溶液或溶劑(稱做析出液或析出劑)流入系統內，達到一定體積，再將被分離物質以固相或溶解相上樣，然後通入能使被分離物溶解的溶液或溶劑(稱為溶解液或溶解劑)進行洗脫。
2.按照權利要求1所述的在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的分離純化方法，其中析出液或析出劑分子與被分離物質的分子在分子大小或形狀上有較明顯差別，造成前者在層析系統上的遷移速率明顯慢於後者選擇適當排阻範圍指的是在這種排阻範圍的凝膠過濾介質上，遷移速率差別越大越好。
3.按照權利要求1所述的在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的分離純化方法，其中一定細度指的是該凝膠過濾介質能較好地過濾攔阻析出物，實現固液分離。
4.按照權利要求1所述的在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的分離純化方法，其中析出液或析出劑指的是在其中能使被分離物質發生析出的溶液或溶劑，甚至是蒸餾水也可以，不一定是特殊的析出溶液或溶劑。
5.按照權利要求1所述的在凝膠過濾介質上連續進行重複固相析出的分離純化方法，其中層析系統可以是柱或板等，洗脫方式可以與普通層析一致，比如可以用階段與梯度洗脫方式等。
全文摘要
本發明涉及一種全新而基本的分離純化方法，適合多種物質的沉澱與結晶分離純化過程。該方法通過將一定體積的固相析出溶液或溶劑流入適當的凝膠過濾層析系統，再上樣洗脫，實現了連續重複的固相析出分離純化過程。本方法的特點是解析度高，上樣量大，損失小，操作簡便，適用面極廣，可以使一系列的沉澱、結晶的分離純化方法和工藝得到明顯改進，具有很大的應用推廣價值，尤其適合於實驗室製備與工業化生產。
文檔編號G01N1/34GK1153298SQ9511403
公開日1997年7月2日 申請日期1995年12月26日 優先權日1995年12月26日
發明者黃潮 申請人:黃潮