一種利用細胞工廠製備凍幹A型肝炎減毒活疫苗的方法

2023-12-09 03:34:26

專利名稱：一種利用細胞工廠製備凍幹A型肝炎減毒活疫苗的方法
一種利用細胞工廠製備凍千A型肝炎減毒活疫苗的方法 技術領域-
本發明涉及一種凍幹A型肝炎減毒活疫苗製備方法，尤其是公開了一種利用細胞 工廠製備凍幹A型肝炎減毒活疫苗的方法，屬於生物製藥技術領域。
背景技術：
傳統的病毒性疫苗製備，關鍵是為病毒提供適宜其增殖的細胞基質，通常採用貼 壁培養的生長方式。貼壁培養系統主要有轉瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統等。 轉瓶培養一般用於小量培養到大規模培養的過度方式，或作為生物反應器接種細胞的 準備途徑。其特點是結構簡單、投資少、技術成熟、重複性好、容易擴大等等，同時 也存在著細胞生長密度低、單瓶細胞有生長差異、勞動強度大，佔地空間大的等缺點。 是目前國內疫苗生產廠家普遍採用的細胞培養方式。反應器貼壁培養通常採用片狀載 體和籃式攪拌系統，可以提供較高的細胞密度， 一般適於多次收穫培養產物，國內一 些科研人員曾嘗試釆用反應器培養細胞來製備A肝疫苗，效果均不理想。其原因在於 肝炎病毒在細胞內增殖周期較長，且只能收穫一次。
本發明涉及的"細胞工廠"是丹麥NUNC公司出品的CELL FACTORIES和美國 CORNING公司出品的Cell STACK,英文直譯分別為細胞工廠或細胞培養室，其培養 原理基本相同，外觀尺寸略有差異。使用過程中的關鍵問題是l.解決了 2BS細胞在 細胞工廠中的生長適應性；2.確定了使用細胞工廠培養L-A-1減毒株的增值高峰期；3. 確定了科學的洗換方法，提高了細胞收穫率和細胞工廠連續使用率。

發明內容
本發明公開一種利用細胞工廠製備凍幹A型肝炎減毒活疫苗的方法，適用於工業 化生產。
本發明的技術解決方案如下
在無菌條件下，採用單層感染法或同時感染法在細胞工廠中將A型肝炎減毒株
(L-A-l)感染2BS細胞後，分別進行35天或28天左右的連續培養，期間需進行2-3 次更換維持液，最終得到A型肝炎病毒收穫液；再經離心收集細胞沉澱、氯仿抽提、 稀釋合併後，成為A型肝炎疫苗原液；原液檢定合格後配製成為A型肝炎疫苗半成品，經分裝、凍幹、檢定合格後，成為凍幹A型肝炎減毒活疫苗。
本發明的細胞工廠製備的凍幹A型肝炎減毒活疫苗，每支成品(復溶後體積lml) 含以下組分及含量-
A型肝炎減毒活疫苗 0.755毫升
明膠-蔗糖保護劑 0.245毫升
復溶後A型肝炎病毒滴度不低於6.50 lg CCIDWml。
本發明所述疫苗的具體製備工藝步驟
(1) 2BS細胞製備
取出凍存的工作細胞庫中的細胞管，復甦後混合培養，成單層後，用0.25%胰蛋白 酶消化，於37°C ±0. 5'C靜止或旋轉培養；
(2) 感染2BS細胞。
在製備好的細胞中加入毒種稀釋液(0.01 0.05MOD，感染細胞，有兩種感染方 法單層感染法和懸浮感染法。
(3) 更換維持液
棄去細胞工廠內液體，加維持液200 250ml/層，置35t:士0.5'C繼續培養，7 10 天換液一次，待病毒增殖高峰時收穫；
(4) 洗換、收穫
逐層認真檢査細胞工廠，確認無汙染，根據螢光情況，確定疫苗液加量，用Hank's 液清洗細胞表面，200 300ml/層，充分振搖後排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消 化液，50ml/層，待細胞面呈疏鬆狀，加入199綜合培養液，150 200ml/層，振搖至細 胞脫落，無菌收集，分至離心杯中；使用滅菌注射用水(含100單位/ml卡那黴素)衝 洗細胞工廠，備下次使用。
(5) 離心、抽提
於2 8'C、 3000rpm離心30分鐘；離心後棄上清液，收集離心沉澱進行無菌檢查， 無菌檢査合格後的沉澱液合併，進行細胞破碎處理；細胞破碎條件勻漿，28000rpm/ 分鐘，l分鐘；
細胞勻漿液加入1/3體積的三氯甲烷混合後提純病毒，3000rpm離心30分鐘，連 續抽提病毒液三次；
(6) 原液合併、保存、檢定
同一細胞批生產病毒收穫液，經提純後在無菌條件下合併為一批原液，取樣做原液檢定。原液放置於-6(TC以下保存3個月； (7)半成品配製及分裝
將檢定合格的A肝疫苗原液與明膠-蔗糖保護劑按比例(3.08: 1)混合均勻後，按 要求進行分裝，分裝量1.0mL/瓶，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
(8) 凍幹
將步驟(7)中的分裝品冷凍乾燥，步驟為-35°。預凍2小時，製品-4(TC冷凍3 4 小時，逐漸升溫真空乾燥10~12小時，30 35i:恆溫真空乾燥5 6小時，全過程累計 20 24小時，製備出凍幹A肝減毒活疫苗成品。
(9) 成品檢定
根據現行版《中華人民共和國藥典》相關要求進行全面檢定。 本發明通過細胞工廠製備出凍幹A肝減毒活疫苗，在有限的空間內利用了最大限 度的培養表面，從而節省了大量的廠房空間,並可節省貴重的培養液。更重要的是，它 可有效地保證操作的無菌性，從而避免因汙染而帶來的原料、勞務和時間損失；特別 適合於貼壁細胞，也可用於懸浮培養，在從實驗室規模進行放大時不會改變細胞生長 的動力學條件，規格放大變得簡單易行，培養表面經測試保證最有利於細胞貼附和生 長。
本發明優點在於工藝可控性好，不易汙染，適於工業化、規模化生產；培養空間利用率提高3倍以上，使細胞生長密度達到4.0 5.0XlS個/m1,保證了病毒的增殖 空間，同時還通過無菌衝洗、離心處理等方法有效解決了細胞工廠消化後的細胞殘留 問題，從而可以連續使用細胞工廠進行細胞培養，提高了細胞工廠的重複使用率。
具體實施例方式
下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背 離本發明的精神和原則的前提下，對本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變 都將落入本發明的待批權利要求範圍之內。
實施例1 :
選用丹麥NUNC公司出品的CELL FACTORIES 10層，36塊，採用單層感染法制 備凍幹A肝減毒活疫苗的製備工藝。 1.2BS細胞製備
將選好的細胞中用Hank's液清洗細胞表面，再用0.25%胰酶消化細胞，將消化後 的細胞與含10。/。小牛血清的MEM培養液混合，製成細胞懸液，按適宜比例分種(1:5)，無菌加入細胞工廠中，200ml/層，放置37。C士0. 5。C培養7天。
2. 單層感染
認真檢査細胞，確認細胞單層且無汙染，棄舊液，用Hank's液輕輕洗細胞面後控 淨，加入毒種稀釋液(0.03MOI)，置於35。C土0.5。C培養3.5小時，補加維持液(含2% 小牛血清的MEM培養液)至200ml/層，置35。C士0.5。C培養7天後換液。
3. 更換維持液
棄去細胞工廠內液體，加維持液200ml/層，置35t:士0.5t:繼續培養，間隔7天換液 一次，共換液兩次，待病毒增殖高峰時收穫。
4. 洗換、收穫
逐層認真檢査細胞工廠，確認無汙染，根據螢光情況，確定疫苗液加量，用Hank's 液清洗細胞表面，250ml/層，充分振搖後排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/層，待細胞面呈疏鬆狀，加入199綜合培養液，150ml/層，振搖至細胞脫落，無 菌收集，分至離心杯中；使用滅菌注射用水(含100單位/ml卡那黴素)衝洗細胞工廠， 備下次使用。
5. 離心、抽提
於2 『C、 3000rpm離心30分鐘；離心後棄上清液，收集離心沉澱進行無菌檢査， 無菌檢査合格後的沉澱液合併，進行細胞破碎處理；細胞破碎條件勻漿，28000rpm/ 分鐘，l分鐘；
細胞勻漿液加入l/3體積的三氯甲垸混合後提純病毒，3000rpm離心30分鐘，連 續抽提病毒液三次；
6. 原液合併、保存
經提純後在無菌條件下合併為一批原液，計7.2L，於-6(TC以下保存
7. 半成品配製及分裝、凍幹
將檢定合格的A肝疫苗原液與明膠-蔗糖保護劑按比例(3.08: 1)混合均勻後，按 要求進行分裝，分裝量1.0mL/瓶，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
8.成品檢定根據現行版《中華人民共和國藥典》相關要求進行全面檢定。
實施例2:
選用美國CORNING公司出品的Cell STACK, 10層，36塊，採用單層感染法製備 凍幹A肝減毒活疫苗的製備工藝。 1.2BS細胞製備將選好的細胞中用Hank's液清洗細胞表面，再用0.25%胰酶消化細胞，將消化後 的細胞與含10%小牛血清的MEM培養液混合，製成細胞懸液，按適宜比例分種(1: 5)，無菌加入細胞工廠中，200ml/層，放置37。C士0. 5。C培養7天。
2. 單層感染
確認細胞單層且無汙染，棄舊液，用Hank's液輕輕洗細胞面後控淨，加入毒種稀 釋液(0.04MOI)，置於35'C士0.5。C培養3.5小時，補加維持液(含2。/。小牛血清的MEM 培養液)至200ml/層，置35'Ci0.5。C培養7天後換液。
3. 更換維持液
棄去細胞工廠內液體，加維持液200ml/層，置35"Ci0.5'C繼續培養，間隔7天換液 一次，共換液兩次，待病毒增殖高峰時收穫。
4. 洗換、收穫
逐層認真檢査細胞工廠，確認無汙染，根據螢光情況，確定疫苗液加量，用Hank's 液清洗細胞表面，250ml/層，充分振搖後排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/層，待細胞面呈疏鬆狀，加入199綜合培養液，150ml/層，振搖至細胞脫落，無 菌收集，分至離心杯中；使用滅菌注射用水(含100單位/ml卡那黴素)衝洗細胞工廠， 備下次使用。
5. 離心、抽提
於2 8'C、 3000rpm離心30分鐘；離心後棄上清液，收集離心沉澱進行無菌檢查， 無菌檢查合格後的沉澱液合併，進行細胞破碎處理；細胞破碎條件勻漿，28000rpm/ 分鐘，l分鐘；
細胞勻漿液加入l/3體積的三氯甲垸混合後提純病毒，3000rpm離心30分鐘，連 續抽提病毒液三次。
6. 原液合併、保存
經提純後在無菌條件下合併為一批原液，計7.0L，於-6(TC以下保存
7. 半成品配製及分裝、凍幹
將檢定合格的A肝疫苗原液與明膠-蔗糖保護劑按比例(3.08: 1)混合均勻後，按 要求進行分裝，分裝量1.0mL/瓶，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
8.成品檢定根據現行版《中華人民共和國藥典》相關要求進行全面檢定。
實施例3:
選用NUNC公司出品的CELLFACTORIES, 10層12塊，美國CORNING公司出品的Cell STACK, 40層6塊，採用懸浮感染法製備凍幹A肝減毒活疫苗的製備工藝。
1. 懸浮感染
挑選好細胞種，棄去細胞工廠中的培養液，用Hank，s液輕輕洗細胞面後控淨，加 消化液消化，待細胞面呈疏鬆狀，加入細胞、毒種混合懸液(0.0 5MOI)，按適宜比 例分種(1: 5)，置35。C土0.5'C吸附2.5小時補加生長液(含15。/。小牛血清的MEM培養 液)至220ml/層，置35。Ci0.5。C培養，7天後換液。
2. 更換維持液
棄去細胞工廠內液體，加維持液220ml/層，置35'Ci0.5'C繼續培養，間隔7天換液 一次，共換液兩次。待病毒增殖高峰時收穫。
3. 洗換、收穫
逐層認真檢査細胞工廠，確認無汙染，根據螢光情況，確定疫苗液加量，用Hank's 液清洗細胞表面，250ml/層，充分振搖後排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/層，待細胞面呈疏鬆狀，加入199綜合培養液，150ml/層，振搖至細胞脫落，無 菌收集，分至離心杯中；使用滅菌注射用水(含100單位/ml卡那黴素)衝洗細胞工廠， 備下次使用。
4. 離心、抽提
於2 8°C、 3000rpm離心30分鐘；離心後棄上清液，收集離心沉澱進行無菌檢查， 無菌檢查合格後的沉澱液合併，進行細胞破碎處理；細胞破碎條件勻槳，28000rpm/ 分鐘，l分鐘；
細胞勻漿液加入l/3體積的三氯甲烷混合後提純病毒，3000rpm離心30分鐘，連 續抽提病毒液三次；
5. 原液合併、保存
經提純後在無菌條件下合併為一批原液，計6.5L，於-60'C以下保存
6. 半成品配製及分裝、凍幹
將檢定合格的A肝疫苗原液與明膠-蔗糖保護劑按比例(3.08: 1)混合均勻後，按 要求進行分裝，分裝量1.0mL/瓶，分裝後迅速進行冷凍真空乾燥。
7.成品檢定根據現行版《中華人民共和國藥典》相關要求進行全面檢定。
權利要求
1.一種採用細胞工廠製備的凍幹A型肝炎減毒活疫苗，其特徵在於由以下組分組成每支成品(復溶後體積1ml)含以下組分及含量A型肝炎減毒活疫苗 0.755毫升明膠-蔗糖保護劑0.245毫升復溶後A型肝炎病毒滴度不低於6.50lg CCID50/ml。
2. 權利要求1所述的疫苗為凍幹劑型。
3. 權利要求1所述的疫苗製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 2BS細胞製備取出凍存的工作細胞庫中的細胞管，復甦後混合培養，成單層後，用 0. 25%胰蛋白酶消化，於37°C±0. 5。C靜止或旋轉培養；(2) 用細胞工廠製備A肝疫苗收穫液；(3) 更換維持液棄去細胞工廠內液體，加維持液200 250ml/層，置35'C士0.5t:繼續培養，7 10天換液一次，待病毒增殖高峰時收穫；(4) 洗換、收穫逐層認真檢査細胞工廠，確認無汙染，根據螢光情況，確定疫苗液加 量，用Hank's液清洗細胞表面，200 300ml/層，充分振搖後排空洗液； 加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液，50ml/層，待細胞面呈疏鬆狀，加入199 綜合培養液，150 200ml/層，振搖至細胞脫落，無菌收集，分至離心杯中；(5) 離心、抽提於2 8"C、 3000rpm離心30分鐘；離心後棄上清液，收集離心沉澱 進行無菌檢查，無菌檢査合格後的沉澱液合併，進行細胞破碎處理；細胞 破碎條件勻漿，28000rpm/分鐘，1分鐘；細胞勻漿液加入1/3體積的三氯甲烷混合後提純病毒，3000rpm離心 30分鐘，連續抽提病毒液三次；(6) 原液合併、保存同一細胞批生產病毒收穫液，經提純後在無菌條件下合併為一批原 液，於-6(TC以下保存3個月；(7) 半成品配製及分裝將檢定合格的A肝疫苗原液與明膠-蔗糖保護劑按比例(3.08: 1)混合 均勻後，按要求進行分裝，分裝量1.0mL/瓶，分裝後迅速進行冷凍真空幹 燥。(8) 凍幹將步驟(7)中的分裝品冷凍乾燥，步驟為-35°。預凍2小時，製品 -4(TC冷凍3 4小時，逐漸升溫真空乾燥10~12小時，30 35。C恆溫真空幹 燥5 6小時，全過程累計20~24小時，製備出凍幹A肝減毒活疫苗成品。
4、權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟(2)用單層感染 法製備A肝疫苗收穫液挑選好細胞種，棄去細胞工廠中的舊液，用Hank，s液輕輕洗細胞面後 控淨，加消化液消化，待細胞表面顯疏鬆狀，加入細胞懸液，按l: 5比例 分種，置37"C士0.5'C培養6 7天感染；確認細胞單層且無汙染，棄舊液，用Hank's液輕輕洗細胞面後控淨，按0.01 0.05MOI加入毒種稀釋液，置於 35T:土0.5。C培養3.5 4小時，補加維持液(含2 5。/。小牛血清的MEM培養液) 至200ml/層，置35。C士0.5。C培養7 10天後換液。
5、權利要求2所述的製備方法，其特徵在於步驟2用同時感染法製備A肝疫苗收穫液挑選好細胞種，棄去細胞工廠中的培養液，用Hank's液輕輕洗細胞面 後控淨，加消化液消化，待細胞面呈疏鬆狀，加入細胞、毒種混合懸液 (0.01 0.05MOI)，按l: 5比例分種，置35。C士0.5。C吸附2.5小時補加生 長液(含10 15。/。小牛血清的MEM培養液)至200ml/層，置35。C士0.5。C培養， 7 10天後換液。
全文摘要
本發明公開一種利用細胞工廠製備凍幹A型肝炎減毒活疫苗的方法，工藝可控性好，不易汙染，適於工業化、規模化生產；培養空間利用率提高3倍以上，使細胞生長密度達到4.0～5.0×106個/ml，保證了病毒的增殖空間，同時還通過無菌衝洗、離心處理等方法有效解決了細胞工廠消化後的細胞殘留問題，從而可以連續使用細胞工廠進行細胞培養，提高了細胞工廠的重複使用率。
文檔編號A61K39/29GK101406699SQ20081005144
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月19日 優先權日2008年11月19日
發明者劉景曄, 佔永生, 妍 周, 屈翠波, 王雲霞, 謝寶生 申請人:長春長生生物科技股份有限公司