與肥胖症和/或ⅱ型糖尿病相關的fto基因多態性的製作方法

2023-12-08 22:35:21

專利名稱：與肥胖症和/或ⅱ型糖尿病相關的fto基因多態性的製作方法
與肥胖症和/或I I型糖尿病相關的FTO基因多態性本發明涉及診斷、預測、治療和/或預防人類的肥胖症和/或Ii型糖尿病的工具。更準確地說，本發明提供人類的肥胖症和/或II型糖尿病的風險評價和/或診斷 和/或預測的工具(means)和方法(methods)，該工具或方法是以核酸生物標記的檢測為基 礎的，所述的生物標記屬於肥胖基因(FTO)的一套SNP (單核苷酸多態性)，或與肥胖基因 (FTO)的一套SNP (單核苷酸多態性)相關。本發明還提供鑑定與人類的肥胖症和/或II型糖尿病的易感性相關的SNP單倍 型(haplotype)的工具和方法，以及選擇用於預防和/或治療人類的肥胖症和/或II型糖 尿病的藥物製劑的工具和方法。肥胖症是這樣一種狀況，其中人類或其他哺乳動物的脂肪組織中貯存的天然能量 儲藏增加到一個點，該點與某些健康狀況相關或增加死亡率。肥胖症既是個體臨床狀況也日益被視為嚴重的公共的健康問題。現在普遍已知， 體重超重易罹患各種疾病，尤其是心血管疾病，睡眠呼吸暫停，骨關節炎和II型糖尿病。更 準確地說，肥胖症，尤其是向心性肥胖症(男性型肥胖症或以腰部肥胖為主的肥胖症)是集 合多種疾病的「代謝症候群」(「症候群X」)的重要的危險因子，並是非常易於罹患心血管 疾病的危險因子。這些危險因子是II型糖尿病，高血壓，高血膽固醇和甘油三酯水平(合 並高脂血症)。與上述一起出現的炎症狀態參與形成動脈硬化的高患病率，並且前血栓形成 狀態進一步惡化心血管的風險。在臨床環境中，典型地通過測定BMI (體重指數)，腰圍和評價危險因子和併發症 的出現來評價肥胖症。在流行病學研究中，BMI單獨用作肥胖症的患病率和發病率指數。通 過將受試者的體重(千克)除以他/她身高(米)的平方而計算出BMI BMI = (kg/m2)或 BMI =[體重(磅)x703/ 身高(英寸)2]一般而言，認為-BMI低於18. 5是體重過輕-BMI介於18. 5-24. 9是正常體重
-BMI 介於 25. 0-29. 9 是超重-BMI 介於 30. 0-39. 9 是肥胖-BMI為40. 0或更高是嚴重(或重度)肥胖-而且，BMI為35.0或更高，同時患有至少一種其他的明顯的並存疾病，則通常被 劃分為病理性肥胖症。已經提示有助於肥胖症的發生發展的因素不僅包括進食過多，還包括-遺傳因素和一些遺傳失調(如Prader-Willi症候群)；-基礎性疾病(如甲狀腺功能低下)；-某些藥物(如非典型的抗精神病藥物)；_久坐的生活方法；等經常認為肥胖症是遺傳和非遺傳因素聯合作用的結果。在這方面，仍需鑑定致病 基因。
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目前，肥胖症是發達國家和新興國家面對的最大的健康問題。在所有對抗肥胖症的可用的方法之中，應用外科手術治療肥胖症日益增多。這 一技術由沿胃的頂部放置矽樹脂環以幫助限制日常吃入的食物量組成。並且已經使用其 它侵入性更大的外科技術，這些侵入性更大的外科技術將消化道的任何部分切除或再造 (reroute)。然而，所有這些外科技術給患者帶來風險，並且這些技術或者不能保證成功減 肥，或者不能降低發病率(morbidity)和死亡率(mortality)。因此，本領域需要新的對於對抗肥胖症真正有效的藥物。在這方面，鑑定參與肥胖 症的發病的，並因此是有希望的獲選治療靶的基因，是科學家和醫務人員更嚴重關心的問 題之一。確切地說，本發明旨在通過公開迄今為止在遺傳因素和肥胖症之間的最顯著相關 性來滿足這種需要。實際上，本發明是基於在歐洲人群中，在肥胖基因(FTO)座位上的幾個 SNP (單核苷酸多態性)與肥胖症的早期發病和嚴重的肥胖症之間，以及與與II型糖尿病相 關的肥胖症之間具有高度的和顯著的相關性的發現。SNP代表遺傳變異的最普遍的形式中的一種形式。當基因組中的單個核苷酸發生 改變(如經取代、添加或缺失)時，這些多態性出現。序列的就多態性位點而言的每一個版 本被稱為多態性位點的「等位基因」。SNP傾向於從一代之一代之間進化得穩定，因此SNP能 用於研究整個人群之中的特異性的遺傳異常。如果SNP出現在蛋白質編碼區，它能導致變 異形式的蛋白質的表達，這些變異形式的蛋白質有時是有缺陷的蛋白質，這些形式的蛋白 質的表達可導致遺傳性疾病的發生。一些SNP可出現在非編碼區，但是雖然如此，仍可導致 有差別的或缺陷性的剪切或改變蛋白質的表達水平。因此，SNP能用作遺傳性疾病的有效 的指示。SNP還能用作鑑定對某種疾病具有遺傳易感性(predisposition)的個體的診斷工 具，用於對患病個體進行基因分型的工具，和基於發現的靶蛋白在致病過程中的作用的知 識，用作促進藥物開發的工具。為了避免被人懷疑，本發明所述的方法不包含在人體上實施的診斷方法。本發明 所述的方法優選在以前自個體取出的樣品上進行。在下文描述的本發明所述的試劑盒可包 括自個體提取樣品的方法。本發明所述的方法能夠在發病之初或發病之前精確評價個體健康罹患肥胖症和/ 或II型糖尿病的風險，因此，降低或減小了肥胖症和/或II型糖尿病的負面效果。尤其是， 本發明能夠更好地預測患肥胖症和/或II型糖尿病的風險，並因此能夠更好地預測患後續 的併發症的風險。本發明所述的方法能應用於無臨床症狀和肥胖症和/或II型糖尿病表 現的人，在這些人中有些已經患有肥胖症和/或II型糖尿病，有些具有肥胖症和/或II型 糖尿病的家族史，或者有些已經有肥胖症和/或II型糖尿病的危險因子的水平升高。在本發明的上下文中，「生物標記」(本文也稱為「標記」)是一種指示人類的肥胖 症和/或II型糖尿病的遺傳標記，也就是說，是一種其特異地和顯著地參與肥胖症和/或 II型糖尿病發病的核酸序列。在本發明的上下文中，這種標記可還被稱為「肥胖症和/或 II型糖尿病風險SNP標記」或「風險SNP標記」或「風險標記」或「SNP標記」。通常，本發明所用的遺傳標記是與肥胖症和/或II型糖尿病相關的「多態位點」 的特定的等位基因。基因組中的在人群中在該位置上可能有一個以上的序列的核苷酸位置 被稱為「多態位點」。當多態位點是單個核苷酸長時，該位點一般被稱為「SNP」。例如，如果在特定的染色體位置上，人群中一個成員是腺嘌呤，而在同一位置人群中另一個成員是胸 腺嘌呤，那麼這個位置是多態性位點，並且更明確地說，該多態性位點是SNP。由於，例如，插 入、缺失、轉換、取代、複製或轉座，多態性位點可以是幾個核酸長。就多態性位點而言的序 列的每個版本被稱為多態性位點的「等位基因」。因此，在之前的例子中，SNP可以是腺嘌呤 等位基因也可以是胸腺嘌呤等位基因。這些等位基因是「變異體」等位基因。核苷酸序列 變異體，其位於編碼區或者位於非編碼區，能導致編碼多肽的序列發生改變，因而影響其性 能(活性改變，分布改變，穩定性改變等)。或者，核苷酸序列變異體，其位於編碼或非編碼 區，能導致發生影響基因的轉錄或它的mRNA的翻譯的變化。在所有情況下，改變可定性或 定量，或既可定性也可定量。本領域技術人員將可容易地識別出能通過能夠確定在多態性位點存在核苷酸的 任何方法或技術進行在個體的核酸中在本文所公開的一個或幾個SNP標記上存在的核苷 酸的分析。例如，一個人能用本發明所述的方法通過進行測序、微測序、雜交、限制性片段分 析、寡核苷酸連接檢測、等位基因特異性PCR或聯合應用上述方法檢測生物標記。當然，這 一列表僅是示例性的，並且絕不用於限制本發明。本領域技術人員可使用任何合適的方法 來實現這種檢測。存在於SNP標記中的核苷酸能從任一核酸鏈或從雙鏈上被確定，這在本領域是顯 而易見的。在本發明的上下文中所用的生物標記是與FTO基因「相關」的，這意味著所述的生 物標記是結構上與FTO基因相關，例如，該生物標記或者在FTO基因座內或者在與其高度近 似的基因座內，和/或意味著所述的生物標記與FTO基因功能相關，例如與FTO基因或其表 達產物相互作用或影響FTO基因或其表達產物的生物標記。優選地，在本發明所述的方法和試劑盒中所使用的生物標記選自下表2、3和6-9 中任何一個表中所列出的單核苷酸多態性(SNP)(見下列實施例的第II部分)。然而優 選地，表2、3和6-9中任何一個表中所列出的一些具有高度的顯著的預測價值的SNP選 自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rsl7817449、rs3751812、rsll075990、rs9941349、 rs7206790、rs8047395、rsl0852521、rsl477196 或 rs4783819。在該組中，SNPrs9940128、 rsl421085、rsll21980、rs3751812、rs7206790、rs8047395 和 rsl7817449 尤其令人感興趣。 然而更優選的是，將至少使用SNP rsl421085或rsl7817449。另外，生物標記可以是選自下表2、3和6-9中任何一個表中所列的至少一個SNP 相關的多態性位點。正如以上定義，術語「相關」意味著所述的生物標記與所述的SNP在結 構上和/或功能上相關。更特異的是，術語「相關」意味著所述的生物標記與所述的SNP高 度連鎖不平衡，即這些生物標記與所述SNP在HapMap歐洲數據集中和/或在如下文所顯示 的發明人進行的實驗性分析的人群中呈現出的關聯名為r2的至少0. 6，和/或名為D'的 為 0. 5。然而另外，生物標記可以是與選自下表2、3和6-9中任何一個表中所列的至少一 個SNP完全連鎖不平衡的多態性位點。因此，本發明的第一方面涉及在人類受試者中進行體外風險評價和/或診斷和/ 或預測肥胖症和/或II型糖尿病的方法，其至少包含a)檢測來自所述的人類受試者的樣品中的核苷酸中的至少一種與FTO基因相關的生物標記；和b)將所述的人類受試者中獲得的在步驟a)中獲得的生物標記的數據與健康和/ 或患病人群的生物標記數據進行比較，對所述人類受試者做出肥胖症和/或II型糖尿病的 風險評價和/或診斷和/或預測。「風險評價」在本文意味著本發明使評價或評估人類受試者發生肥胖症和/或II 型糖尿病的風險成為可能(也可稱作「易感性或敏感性評價」)。在這方面，處於患肥胖症 和/或II型糖尿病「風險」的個體是至少具有一種帶有一個或多個「肥胖症和/或II型糖 尿病風險SNP標記」的風險等位基因或單倍型的個體。此外，「存在患病風險」的個體也可 有至少一種已知有助於發生肥胖症和/或II型糖尿病的風險因子，包括例如-肥胖症和/或II型糖尿病家族史；- 一些遺傳性疾病，如Prader-Wi 11 i症候群；-基礎性疾病(如甲狀腺功能低下)；-高血壓和血壓升高；-與進食有關的疾病；-某些藥物(如非典型的抗精神病藥物)；-久坐的生活方法；-高血糖(glycemic)飲食，由產生高餐後血糖的膳食組成；-體重反彈，由多次試圖通過節食減肥引起；-精神應激；-睡眠不足；-戒菸等。預測或風險一般意味著風險增加或下降。對於可在本發明的上下文中使用的核苷酸的類型沒有限制。在這方面，可用例如 DNA樣品、基因組DNA樣品、RNA樣品、cDNA樣品、hnRNA樣品或mRNA樣品。「患病」的人在本發明所述的方法中是指患有肥胖症和/或II型糖尿病的人們。根據各種具體實施方式
，上文描述的方法用於-鑑定人類受試者發生肥胖症和/或II型糖尿病的風險；-診斷人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病；-對患有肥胖症和/或II型糖尿病的人類受試者選擇有效的和安全的治療方法；-監測對患有肥胖症和/或II型糖尿病的人類受試者所使用的治療方法的效果；-預測在由此治療需要的人類受試者中治療肥胖症和/或II型糖尿病的有效性；-選擇對有發生肥胖症和/或II型糖尿病的風險的人類受試者有效安全的預防性 的治療方法；-監測對有發生肥胖症和/或II型糖尿病的風險的人類受試者所使用的預防性的 治療方法的效果；-預測在有風險的人類受試者中預防肥胖症和/或II型糖尿病的治療方法的有效 性。術語「治療」和「治療方法」不僅是指減輕與肥胖症和/或II型糖尿病相關的症 狀，而且是指預防或延遲該病的發病，和/或還是指減輕該病的症狀的嚴重程度或發生頻率，和/或也是指預防或延遲該病的另一次發作的發生。本發明的第二方面涉及在人類受試者中體外鑑定與肥胖症和/或II型糖尿病的 敏感性相關的SNP單倍型的方法，其中所述的方法至少包含a)檢測所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因的至少一種SNP，其中所述的 至少一種SNP預示肥胖症和/或II型糖尿病的敏感性；和b)鑑定所述的人類受試者中的所述的SNP單倍型，其中所述的SNP單倍型包含步 驟a)中檢測的所述的至少一種SNP。正如本領域所熟知，「單倍型」是指遺傳標記的任何組合。單倍型能包含兩個或更 多的等位基因。發現本文所述的單倍型(或「風險單倍型」)在具有患肥胖症和/或II型 糖尿病風險的個體中比在無肥胖症和/或II型糖尿病患病風險的個體中更頻繁和更顯著。 因此，這些單倍型對於檢測肥胖症和/或II型糖尿病風險，或者個體對於肥胖症和/或II 型糖尿病的敏感性具有預測價值。「風險單倍型」因此旨在包括本文所述的與肥胖症和/或 II型糖尿病高度相關和顯著相關的標記上的一種單倍型或單倍型組合。能通過本領域所熟知的檢測多態性位點的序列的方法來進行單倍型的檢測。優選地，在步驟a)中檢測的SNP(s)選自下表2、3和6至9中任何一個表中所列 的 SNP。本發明的第三方面提供檢測試劑盒，所述試劑盒是在人類受試者中進行肥胖症和 /或II型糖尿病的風險評價和/或診斷和/或預測的體外方法中使用，其中所述試劑盒包 含用於進行下列步驟的適當的工具a)評價至少一種與所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因相關的生物標記 的類型和/或水平；和b)將所述的人類受試者的在a)中評價的生物標記數據與健康的和/或患病的人 的生物標記數據進行比較，來做出所述的人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病的風險評 價和/或診斷和/或預測。本發明的第四方面與檢測試劑盒有關，所述試劑盒在鑑定人類受試者中的與肥胖 症和/或II型糖尿病敏感性相關的SNP單倍型的體外方法中使用，所述試劑盒包含用於進 行下列步驟的適當的工具a)檢測所述的人類受試者的核酸樣品中的FTO基因的至少一種SNP，其中所述至 少一種SNP預示著肥胖症和/或II型糖尿病的敏感性；和b)鑑定所述的人類受試者的SNP單倍型，其中所述SNP單倍型包含所述在a)中檢 測的所述至少一種SNP。術語「檢測試劑盒」和「試劑盒」是同義詞並可互換使用。在本發明的上下文中，當是指檢測試劑盒時，術語「適當的工具」是指任何用於達 到所指明的目的的任何技術手段。作為這種適當的工具的非限制性例子，能列舉試劑和/ 或材料和/或流程和/或說明書和/或軟體等。本發明所述的所有試劑盒可包含適當的包 裝和說明書用於在本文所公開的方法中使用。試劑盒可進一步包含適當的緩衝液和聚合 酶，如耐熱聚合酶，例如Taq聚合酶。這種試劑盒也包含對照引物和/或探針。根據優選的具體實施方式
，本發明所述的檢測試劑盒可至少包含a) —對分離的PCR引物，其由正向引物和反向引物組成，用於特異性擴增目的核酸；和/或b) 一對分離的用於特異性延伸目的核酸的引物；和/或c) 一對分離的用於與目的核酸特異性結合的核酸探針；和/或d) 一個分離的特異性結合目的核酸所編碼的蛋白質的抗體；和/或e) 一塊微陣列或多孔板，其包含上述a)至d)中至少一個。術語「目的核酸」本文是指含有預示肥胖症和/或II型糖尿病的生物標記的核酸 區域或片段。在這方面，目的核酸可比生物標記大，或者可將目的核酸限定為生物標記。「探針」和「引物」是以鹼基特異性的方法與核酸分子的互補鏈雜交的寡核苷酸。 「鹼基特異性的方法」是指兩個序列必須具備足以使引物或探針與之雜交的核酸互補的程 度。因此，引物或探針序列不是必需的是與模板序列完全互補。如果鹼基取代不會抑制雜 交的話，非互補鹼基或修飾鹼基能分散於引物或探針內。探針或引物一般包含與核酸模板的至少約8個，優選約10、12、15個，更優選約20、 25、30、35個，且在某些情況下約40、50、60、70個連續的核苷酸雜交的核酸區域。引物或探針通常與連續的或互補的核酸序列(「模板」)具有至少70%的同一性。 同一性優選是至少80%,90%,95%,且更優選是98%、99%、99. 5%、99. 8%。有利地，引物和探針進一步包含標記，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶的 輔因子。本發明的第五方面是針對選擇用於預防和/或治療人類受試者的肥胖症和/或II 型糖尿病的藥物製劑的方法，其至少包含a)將候選製劑施用於含有人的FTO基因的模型生命系統；b)測定所述的候選製劑對於涉及所述的FTO基因和/或其表達產物的生物機制的 效果；和c)選擇具有改變所述的生物機制的效果的製劑，其中所選定的製劑被認為可用於 預防和/或治療人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病。「藥物製劑」是指生物製劑或化學製劑或兩者都是，如果這些製劑能被認為可用於 預防和/或治療人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病。生物製劑的例子是核酸，包括 siRNA ；多肽，包括內毒素、酶、抗體(多克隆抗體或單克隆抗體)；核酸與多肽的組合，等。化 學製劑的例子包括化學分子、化學分子複合物、化學基元(chemical moieties)等(如放射 性同位素等)。在第六方面，本發明涉及含有人的FTO基因的模型生命系統在研究肥胖症和/或 II型糖尿病中所涉及的病理生理學和/或分子機制中的用途。當本文是指「模型生命系統」時，優選是指非人的轉基因動物，或培養的微生物、昆 蟲或哺乳動物細胞，或哺乳動物組織或器官。更優選的是，所述的模型生命系統表達或過表 達人的FTO基因。本發明的第七方面涉及一種在人類的受試者中進行FTO基因單倍型分析的體外 的方法，其至少包含a)在所述的人類受試者的核酸樣品中檢測在「肥胖症和/或II型糖尿病敏感性 單倍型」的每個等位基因位置上的核苷酸，該單倍型包括至少一種在表2、3和6至9中任何 一個表中所列的SNP，或者與其連鎖不平衡的多態性；和
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b)根據在a)中檢測到的核苷酸，將所述人類受試者的確定為特定的單倍型。在優選具體實施方式
中，該方法進一步包含根據在步驟b)中確定的特定的單倍 型來確定所述的人類受試者發生肥胖症和/或II型糖尿病的風險的步驟。在每個等位基因的位置上的核苷酸可在上述方法中的步驟a)中用任何適當技術 檢測。例如，該檢測可使用酶催化的擴增來進行，如聚合酶鏈式反應或等位基因特異性擴增 所述的核酸樣品。另外，所述的檢測可使用測序來檢測。此外，本文所公開的SNP和單倍型可對患者分層(stratification)。鑑定為發生 肥胖症和/或II型糖尿病的風險增加或降低的個體的亞群能被用於，尤其是，用於定向臨 床試驗項目和遺傳藥理學治療，其中對於多態性的了解用於幫助鑑定最適合用特定藥物制 劑進行治療的患者。本文所述的SNP和單倍型代表有價值的信息資源，其有助於鑑定，例如，就它們的 同一性和對於疾病發病/發生的敏感性或用特定藥物進行治療的敏感性而言的個體。因此，本發明的第八方面是針對選擇參與臨床試驗的人類受試者以評價治療和/ 或預防肥胖症和/或II型糖尿病的治療方法的有效性的方法，其至少包含a)將人類受試者根據每個人類受試者所屬的特定的FTO基因單倍型進行分組；並 且b)從在a)中獲得的至少一個單倍型組中選擇至少一個人類受試者，使其包含在 所述的臨床試驗中。在這個方法中，特定FTO基因單倍型是有利地在體外通過檢測每個人類受試者的 核酸樣品中的「肥胖症和/或II型糖尿病敏感性單倍型」的每個等位基因的位置上的核苷 酸而測定，上述「肥胖症和/或II型糖尿病敏感性單倍型」包括列在表2，3和6至9中任 何一個表中所列的至少一種SNP或與其連鎖不平衡的多態性。本發明的第九方面提供根據上述的方法用於體外進行人類受試者FTO基因單倍 型分析的檢測試劑盒，其中所述的檢測試劑盒包含用於下列步驟的適當的工具a)檢測所述人類受試者的核酸樣品中的「肥胖症和/或II型糖尿病敏感性單倍 型」的每個等位基因的位置上的核苷酸，該單倍型包括選自列在表2、3和6至9中任何一個 表中所列的至少一種SNP或與其連鎖不平衡的多態性；和b)根據在a)中檢測到的核酸確定所述的人類受試者的特定的單倍型。此外，本發明於第十方面涉及上述的檢測試劑盒在將人類受試者分成特定單倍型 組的各層的用途。有利地，該檢測試劑盒進一步用於從至少一組單倍型組中選擇至少一個人類受試 者參與臨床試驗以評價治療和/或預防肥胖症和/或II型糖尿病的治療方法的有效性。第^^一方面，本發明涉及體外測定人類FTO基因的至少一種選自表2、3和6至9 中任何一個表中所列的SNP的同一性的檢測試劑盒，其包含進行該測定的適當的工具。通過非限制性的下列附圖來解釋本發明

圖1 連鎖不平衡結構和在FTO區域內的相關性。A)連鎖不平衡2個矩陣2個矩陣地出現，深灰色代表非常高的連鎖不平衡(r2)， 且白色代表SNP之間缺乏關聯性。b)顯示對於每個SNP而言，第III類肥胖症(880人)比上對照(2700)分析的ρ值的log1Q。圖2 :FT0基因在人類組織中的表達。來自脂肪組織(BioChain Institute, USA)、胰島、FACS-純化的β細胞(由the Human Pancreatic Cell Core Facility, University Hospital, Lille, France 提供)禾口 多種組織 cDNA 嵌板(panel) (BD BiosciencesClontech)的人的 cDNA 中 FTO 表達，其中 1 FTO 陰性對照，2 =GAPDH, 3 =GAPDH 陰性對照，4 :GAPDH+FT0, 5 :GAPDH+FT0 陰性對照，6 分子 量標記50bp、150bp、300bp、500bp、750bp和lkb，7 脂肪組織，8 脂肪組織RT陰性對照，9 胰島，10 胰島RT陰性對照，11 心臟，12 腦，13 胎盤，14 肺，15 肝，16 骨骼肌，17 腎， 18 胰腺，19 胰臟β細胞。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內對照。β細胞通過免 疫化學(98%胰島素陽性細胞)和PCR(用外分泌細胞特異性的糜蛋白酶引物無擴增，用β 細胞特異性的Pdxl引物有擴增)。所用的FTO引物是5 『 -TGCCATCCTTGCCTCGCTCA-3 『 (S EQID Ν0.1)和 5' -TGGGGGCTGAATGGCTCACA-3『 (SEQ ID No. 2)。這兩個引物經高性能液 相層析純化。根據說明書，用M-MLV逆轉錄酶(Promega，USA)隨機逆轉錄1 μ g脂肪組織、 胰島和β細胞RNA。根據說明書，以1. 25mmol/l MgCl2，每種引物0. 4 μ mol/1和5 μ 1單 鏈cDNA，用快速啟動(FastStart)Taq DNA聚合酶試劑盒(Roche，Germany)進行PCR，使用 如下的改良的熱啟動PCR方法95°C 4min, 40個循環95°C，30s, 68°C，2min進行40個循環， 然後68°C，3min。在2% (wt/vol)瓊脂糖凝膠上分離PCR產物，用溴化乙啶和在紫外線照 射下使之顯像。圖3 推定的成因基因座在FTO基因上的位置的分布的驗後概率的分布。位置在 染色體16上以kb表示。點代表單SNP關聯性ρ值的log1(1。線代表95%、90%和75%可 信區間的界限。在讀完下列實施例後將理解本發明所述的其他具體實施方式
和優勢。 實施例I.材料和方法I. 1 統計分析a)關聯性檢驗。在多重模型(multiplicative model)下，使用對數回歸檢驗病例 對照(case-control)中的關聯性，且一般關聯度模型用皮爾森卡方檢驗。複製的ρ值是單尾的用於試驗肥胖兒童和成人中SNP rsl421085(resp. rsl7817449)上等位基因C(resp. G)頻率增加的特定假說。基於隊列的家族中的兩個SNP之間的關聯性檢驗使用TDT檢驗進行，TDT檢驗 將風險基因傳遞的數目與其預期進行比較，所述風險基因來自異源親本傳遞至受累後代。 McNemar X2檢驗評價顯著性。費希爾法用於合併不同研究的ρ值，其中η個ρ值的自然對數的負和(negative sum)的2倍符合2η的自由度的χ 2分布。b)遺傳模型。計算BMI變量的比例，所述的BMI變量的比例在我們的家族研究的人群(法國肥 胖兒童的父母)中的成人建立者(founder)，且萊比錫隊列(the Leipzig cohort)研究中 的兒童中解釋。將BMI標準化並用SDS表達。
使用QTL傾向閾值模型，其具有定量的傾向性L (在整個人群中均值0且SDl)和 閾值T，在此之上個體被分為受影響一類。傾向性L後面跟著三個正態分布Ν( μ g，σΕ)的 混合。口8是基因型L均值(取值_a，0和a)，且O2k是非由於基因座的剩餘方差的比例。 對於肥胖症，傾向性L可通過BMI確定，因為以BMI超過某個閾值而定義肥胖症。用這些參數，可通過術語基因型風險比例(Genotype Risk Ratios)來表達的患病 風險，GRRi = P(受累/G = i)/P(受累/G = 0)。所研究的基因座的方差直接來源於a和f 值，人群風險等位基因的頻率σ2α = 2. f. (l-f).a2(Eq 1)。以方差(。2α)解釋的變異百 分數來源於線性回歸模型，通過插入Eq 1。然後，反覆計算與10%的患病率對應的用於普 通肥胖症的GRR。I. 2基因型分析通過應用生物信息公司(the Applied Biosystems)的基於寡核苷酸連接檢測 (OLA)與多重 PCR 靶向擴增(http://www.appliedbiosystems.com)的 SNPIex 技術進行 最初的病例對照基因型分析。該檢測的化學反應基於一套通用的核心試劑盒和一套SNP特 異性連接探針，能在一個樣品中同時進行48個SNP的多重基因型分析。在檢測的每一個步 驟使用特異性內參照來包含質量控制的檢測(根據生產商說明書)。通過使用應用生物信 息公司的3730xlDNA分析儀和GeneMapperf. 7軟體進行毛細管電泳分析來辨別等位基因。 雙份樣品進行檢測，其一致率為100%。雙份樣品中的變異體rsl421085和rsl7817449使用TaqMan SNPGenotypingAssays (Applied Biosystems, Foster City, Calif. USA)進行高通量的基因 型分析。PCR引物和TaqMan探針根據生產商的流程通過Primer Express設計和優化。所有SNP為哈迪-溫伯格平衡(ρ >0.05)。在除瑞士肥胖個體外的來自所有人群 的全部和病例組和對照組的通知率(call rate)在95%以上。通知率和HWE檢驗的ρ值列於下表1中。表1基因型計數，哈迪_溫伯格檢驗和成功進行基因型分析的百分數
權利要求
一種在人類受試者中進行肥胖症和/或II型糖尿病的風險評價和/或診斷和/或預測的體外方法，其至少包含a)檢測所述的人類受試者的核酸樣品中的至少一個與FTO基因相關聯的生物標記；和b)將來自所述的人類受試者的在步驟a)中獲得的生物標記數據與來自健康和/或患病的人的生物標記數據進行比較以作出所述的人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病的風險評價和/或診斷和/或預測。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述的至少一個生物標記選自表2、3和6至9中 任何一個表中所列的單核苷酸多態性(SNP)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述的至少一個生物標記是與至少一個選自表2、 3和6至9中任何一個表中所列的SNP相關聯的多態性位點。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的至少一個生物標記是與選自表2、3和6至 9中任何一個表中所列的至少一個SNP完全連鎖不平衡的多態性位點。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述的方法是用於鑑定有患肥胖症 和/或II型糖尿病風險的人類受試者。
6.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於診斷人類受試者的 肥胖症和/或II型糖尿病。
7.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於選擇對患有肥胖症 和/或II型糖尿病的人類受試者有效和安全的治療方法。
8.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於監測施用於患有肥 胖症和/或II型糖尿病的人類受試者的治療方法的效果。
9.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於預測治療需要此種 治療的人類受試者的治療肥胖症和/或II型糖尿病的治療方法的有效性。
10.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於選擇對於有患肥胖 症和/或II型糖尿病風險的人類受試者有效和安全的預防性治療方法。
11.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於監測施用於有患肥 胖症和/或II型糖尿病風險的人類受試者的預防性治療方法的效果。
12.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述方法是用於預測有風險的人類 受試者中預防肥胖症和/或Π型糖尿病的治療方法的有效性。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的方法，其中列於表2、3和6至9中任何一個表 中的所述的至少一個 SNP 選自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rsl7817449、rs3751812、 rsll075990、rs9941349、rs7206790、rs8047395、rsl085252U rsl477196 或 rs4783819。
14.根據權利要求13所述的方法，其中列於表2、3和6至9中任何一個表中的所述的 至少一個 SNP 選自 rs9940128、rsl421085、rsll21980、rs3751812、rs7206790、rs8047395 或rsl7817449。
15.一種在如權利要求1至14中任一項所述的體外方法中使用的檢測試劑盒，其包含 用於下列步驟的適當的工具a)評價人類受試者的核酸樣品中與FTO基因相關聯的至少一種生物標記的類型和/或 水平；和b)將所述的人類受試者的在a)中評價的生物標記數據與健康和/或患病的人的生物標記數據進行比較以作出所述的人類受試者的肥胖症和/或II型糖尿病的風險評價和/ 或診斷和/或預測。
全文摘要
本發明提供人類的肥胖症和/或II型糖尿病的風險評價和/或診斷和/或預測的工具和方法，該方法是以檢測屬於fasto(FTO)基因上的一套SNP或與其相關的核酸生物標記為基礎。本發明也提供用於鑑定人類的肥胖症和/或II型糖尿病易感性相關的SNP單倍型的工具和方法，提供選擇預防和/或治療人類的肥胖症和/或II型糖尿病的藥物製劑的工具和方法，提供用於進行人類fasto(FTO)基因的單倍型分析的工具和方法。
文檔編號C12Q1/68GK101960019SQ200880015075
公開日2011年1月26日 申請日期2008年4月3日 優先權日2007年4月3日
發明者C·R·迪納, D·J-C·梅雷, J-C·謝弗爾, P·弗羅蓋爾, S·C·加利納德拉馬爾 申請人:國家科學研究中心;裡爾法律與醫療衛生第二大學;巴斯德研究院裡爾分院