一種納米殼聚糖衍生物,其製備方法和用途的製作方法

2023-12-10 01:42:51

專利名稱：：一種納米殼聚糖衍生物,其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學納米材料
技術領域：
。具體而言，本發明提供一種納米殼聚糖衍生物，其製備方法以及利用該納米殼聚糖衍生物高選擇性和特異性富集和純化磷酸化多肽的方法。
背景技術：
：翻譯後蛋白質的修飾是蛋白質組學中研究的熱點課題。蛋白質的磷酸化是最常見的、最重要的一種蛋白質翻譯後修飾方式，人類基因所編碼的蛋白質中，約有30%的蛋白質可進行磷酸化，蛋白質磷酸化和去磷酸化幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發育和分化，神經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等，蛋白質磷酸化還是主要的信號傳遞方式。蛋白質磷酸化分析的傳統方法如放射性同位素標記，Edman降解，凝膠電泳和色譜分析等方法。這些方法操作繁瑣，需要高超的實驗技巧和較多的蛋白質，而且存在潛在的放射性危險。質譜技術已經發展成為鑑定磷酸化蛋白的重要工具之一。質譜在鑑定磷酸化蛋白時，仍面臨巨大的挑戰，其具體體現是第一，磷酸化蛋白在細胞內所有蛋白中為低豐度；第二，磷酸化多肽的負電性使其在質譜檢測中難以質子化；第三，酶解產物中存在的大量非磷酸化肽的質譜信號通常會淹沒磷酸化多肽的離子信號。因此，直接用質譜分析複雜蛋白酶解產物中的磷酸化多肽是非常困難的，一般要求將磷酸化多肽純化後再用質譜分析。磷酸化多肽的富集使用最多的是固定化金屬親和螯合色譜(Immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)。在這種技術中，一般採用將螯合劑亞胺基二乙酸鍵合在色譜基質上，然後利用螯合作用將Fe3+、Ga3+等金屬離子固定在色譜基質上。由於磷酸化多肽中的磷酸基團與固定化的F^+等金屬離子的相互作用而保留在色譜基質上獲得分離。這種方法的缺點是特異性不強，一些酸性非磷酸化肽也會被富集起來，從而幹擾對磷酸化肽的檢測。雖然這種技術取得了很大的進展，但是用於大規模地富集磷酸化多肽仍需提高其選擇性和有效性，解決的方法包含如下兩方面1)、優化富集磷酸化多肽的過程，包括吸附，洗滌，和洗脫來選擇性地富集磷酸化多肽。2)、優化進行IMAC的親和基質，包括選擇不同的過渡金屬，親和官能團和固載基質。現已用的固載基質有瓊酯糖，葡聚糖，矽膠和合成的聚合物衍生物如纖維素，聚(苯乙烯/二乙烯基苯基)，聚(羥基/甲基丙烯酸)等。殼聚糖(Chitosan)又稱可溶性甲殼質、甲殼胺、幾丁聚糖等，化學名為2-氨基-|3-1，4-葡聚糖，它是甲殼素經脫乙醯基而得到的一種天然陽離子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗腫瘤等優異性能，廣泛應用於醫藥、食品、化工、環保等行業，素有萬能多糖的美譽(R.Jayakumaretal.CarbohydratePolymers62(2005)142-158)。甲殼素在自然界分布非常廣，是一種廉價易得的原料。但是未見用殼聚糖衍生物作為固載基質來富集和純化磷酸化多肽的報導。
發明內容本發明的目的是提供一種納米殼聚糖衍生物，其製備方法，以及利用該納米殼聚糖衍生物高選擇性、特異性的富集和純化磷酸化多肽的方法。本發明提供一種納米殼聚糖衍生物，其特徵在於顆粒大小為l-300nm，優選為20-100nm，以及固載基質為殼聚糖。在一個實施方案中，該衍生物帶有活性環氧基團(中間體1)，所述活性環氧基團選自取代或未取代的丙烯酸環氧丙酯或取代或未取代的丙炔酸環氧丙酯，其中取代基為QC1Q直鏈或支鏈烷基，QC1Q直鏈或支鏈烷氧基，QC1Q直鏈或支鏈烯基，QQ。直鏈或支鏈炔基，或卣素，優選選自甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯。在另一實施方案中，該衍生物帶有活性羧基官能團(中間體2)，任選進一步與過渡金屬離子絡合，其中活性羧基官能團選自亞胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸，過渡金屬離子選自Fe3+，Ti4+，Ni2+，Zr4+或Ga3+。本發明還提供納米殼聚糖衍生物的製備方法，包括下列步驟(l)將殼聚糖溶於0.1%-20^%稀酸水溶液，其中所述稀酸選自甲酸或乙酸，與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，進行自聚反應和接枝反應，得到帶有活性環氧基團的殼聚糖衍生物，(2)接著與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸進行開環加成反應，得到帶有羧基活性官能團的殼聚糖衍生物，(3)再與選自Fe3+，Ti,Zr,Ni2+或Ga3+的過渡金屬離子發生螯合作用，製得所述納米殼聚糖衍生物，其中自聚和接枝的反應溫度為40-10(TC，開環反應溫度為50-80°C。在一個實施方案中，自聚和接枝的反應加入選自偶氮二異丁腈，正丁基鋰，過硫酸鉀，硝酸鈰銨，硫代碳酸_溴酸鉀，二高碘酸銅酸鉀，或過硫酸氨和硫代硫酸鈉的引發劑，其中引發劑加入量為反應單體重量的1_5%。在另一實施方案中，與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸發生開環加成反應時，pH值為8-12。在另一實施方案中，與過渡金屬離子發生螯合作用時，Fe3+的濃度為10mM-100mM。本發明還提供一種利用上述納米殼聚糖衍生物富集和純化磷酸化多肽的方法，包括將含有磷酸化多肽的混合物溶於上樣液中，其中所述上樣液為含有2，5-二羥基苯甲酸的乙腈和三氟乙酸的水溶液，再加入上述納米殼聚糖衍生物進行富集，洗滌後得到選擇性吸附有磷酸化多肽的納米殼聚糖衍生物，並以高的pH溶液洗脫負載的磷酸化多肽，任選以氨水洗脫負載的磷酸化多肽。在一個實施方案中，選擇適當的條件，用質譜技術直接測定和鑑定分析物。在另一實施方案中，將上述納米殼聚糖衍生物塗在晶片上進行微量的磷酸化多肽的富集和純化。在另一實施方案中，將上述納米殼聚糖衍生物填充入色譜柱中進行大規模的磷酸化多肽的富集和純化。在另一實施方案中，分析物是血清、血漿、體液、組織或細胞裂解液的酶解產物。本發明的納米殼聚糖衍生物相對於傳統的材料而言，所選擇材料廉價，易得，具有良好的生物相容性，性質穩定，顆粒大小為l-300nm，外比表面積大，具有很強的吸附能力，可制膜和填充於色譜柱中。另外，由於殼聚糖是天然陽離子多糖，磷酸化多肽中的磷酸基團帶負電荷，這有利於磷酸化多肽中的磷酸基團與固定化的Fe3+等金屬離子和殼聚糖衍生物的相互作用而保留在納米材料上以及被分離，且不利於一些酸性非磷酸化肽的富集，這樣該納米殼聚糖衍生物能高選擇性、特異性的富集和純化磷酸化多肽。再用質譜技術鑑定生物標識物或疾病相關靶。本發明利用殼聚糖衍生物納米材料富集和分離磷酸化多肽的方法可按本領域常規操作步驟進行，但是優化了富集磷酸化多肽的過程，包括吸附、洗滌和洗脫來選擇性地富集磷酸化多肽。該方法具有很高的特異性，可用於生物樣品中低豐度磷酸化多肽的純化和富集。此外，本發明將所述納米材料作為色譜填料，用於磷酸化多肽的富集和純化，從而實現大規模的磷酸化多肽的分離提純。本發明具體操作步驟如下(1).殼聚糖與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯進行自聚反應得到的聚合物進行接枝反應；(2).與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸進行開環加成反應；上述殼聚糖衍生物與一定濃度的Fe3+，Ti4+，Ni2+，Zr4+，Ga3+等金屬離子發生螯合作用，使金屬離子固定在納米材料的表面。(3).在不同的吸附和洗脫條件下，將磷酸化多肽特異性的吸附結合在上述納米材料上；將含有磷酸化多肽的混合物溶於上樣液中，其中上樣液為含有2，5-二羥基苯甲酸(DHB)的乙腈和三氟乙酸的水溶液，其中的DHB和三氟乙酸的濃度依據樣品的複雜程度而不同，分別為0.lmg/mL-lOOmg/mL和0.1%_5%。(4).用質譜直接測定上述納米材料所吸附磷酸化多肽譜圖或將特異性的吸附結合磷酸化多肽從上述納米材料中洗脫下來，再進行進一步的分離和質譜的鑑定。上述步驟(1)中，反應介質為稀酸水溶液，殼聚糖的含量為1.5%_2.5%，甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯的含量為2%_10%，控制反應溫度為40-100°C，自聚接枝反應時間為0.5-4小時為宜。在反應過程中要加入引發劑引發反應，採用的引發劑為偶氮二異丁腈，正丁基鋰或過硫酸氨和硫代硫酸鈉，引發劑加入量以反應單體重的1_5%。與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸發生開環加成反應的反應介質為水溶液，pH值為8-12，反應溫度為50-80°C。下面通過實施例結合附圖對本發明進一步說明。圖1為納米殼聚糖衍生物的合成線路圖。圖2為納米材料的紅外吸收光譜圖，其中l為原料殼聚糖，2為殼聚糖-GMA環氧納米材料，3為殼聚糖-GMA-IDA納米材料，4為殼聚糖-GMA-IDA-Fe(III)納米材料。圖3為殼聚糖衍生物納米材料的透射電鏡圖，其中3A和3B分別為殼聚糖-GMA環氧納米材料和殼聚糖-GMA-IDA納米材料的負染透射電鏡圖，3C為殼聚糖-GMA-IDA-Fe(III)納米材料的透射電鏡圖。由圖可以看出，此納米材料為球型，外表與金屬鐵離子結合。圖4為殼聚糖衍生物納米材料對P-酪蛋白酶解產物中磷酸化多肽的富集和純化的MALDI質譜圖，其中*為磷酸化多肽，#為脫去磷酸基團的多肽。圖5為六種蛋白酶解產物混合物的MALDI質譜圖。圖6為殼聚糖衍生物納米材料對六種蛋白酶解產物中磷酸化多肽的富集和純化的MALDI質譜圖，其中*為磷酸化多肽，#為脫去磷酸基團的多肽。圖7為殼聚糖衍生物納米材料對13-酪蛋白酶解產物中的磷酸化多肽富集後用nano-LC-ESI-MS/MS鑑定分子量為830.85雙電荷峰磷酸化多肽的序列圖。實施例1:殼聚糖-GMA環氧介質(chitosan-GMA)的製備在裝有攪拌器，溫度計和冷凝管的100mL三口燒瓶中，將0.5克的殼聚糖(青島海匯生物有限公司)溶於30mL含有稀乙酸(2wt%)的水溶液中，加入O.5mL的甲基丙烯酸環氧丙酯，攪拌，再加入0.035克過硫酸銨和0.035克硫代硫酸鈉，升溫至50°C，反應2小時，停止反應，降至室溫後，離心去上清液，再用水洗滌，得到固體物。結構特徵圖3A是殼聚糖-GMA環氧介質負染透射電鏡圖，由圖可以看出，此材料為球型，大小為20-100nm;其紅外波譜(圖2.2)特徵峰為3410.2，2927.2，1730.7，1639.8，1452.3，1259.8，1157.9，1076.9，905.7，846.0，752.4;元素分析結果為C48.69%，H7.05%，N2.51%。殼聚糖的紅外波譜(圖2.1)特徵峰為3446.5，2925.2，1652.4，1608.2，1510.9，1454.6，1419.6，1380.9，1300.5，1248.6，1155.5，1085.8，1036.6，832.2，666.0，575.8，元素分析結果為C39.99%，H7.23%，N7.19%。實施例2:殼聚糖-GMA-IDA羧酸介質(chitosan-GMA-IDA)的的製備在裝有攪拌器，溫度計和冷凝管的lOOmL三口燒瓶中，裝入實施例1製備的複合介質，加入0.5克的亞胺基二乙酸鈉，O.25克氯化鈉和20mL濃度為2N的碳酸鈉溶液，升溫到60°C，反應5小時，停止反應，降至室溫後，過濾，用水洗滌至中性，得到固體物。結構特徵圖3B殼聚糖-GMA-IDA羧酸介質的負染透射電鏡圖，由圖可以看出，此材料為球型，大小為20-100nm;其紅外波譜(圖2.3)特徵峰為:3437.9，2929.8，1929.5，1640.1，1607.3，1452.1，1387.3，1253.4，1154.4，1072.1，908.5，842.1，754.6;元素分析結果為C46.89%，H7.19%，N2.46%。實施例3:製備固定過渡金屬離子的殼聚糖-GMA-IDA-Fe(III)(chitosan-GMA-IDA-Fe(III))將實施例2製備的殼聚糖-GMA-IDA裝入燒杯中，加入20mL濃度為lOOmM三氯化鐵溶液，攪拌，室溫反應2小時，過濾，用水洗滌，烘乾，碾磨得固體粉末。結構特徵圖3C是殼聚糖-GMA-IDA-Fe(ni)的透射電鏡圖，由圖可以看出，該納米材料的顆粒大小為20-100nm，表面與金屬鐵離子結合；用電感耦合等離子體發射光譜儀測定鐵的含量為15.52mg/g(三次平均值)。其紅外波譜(圖2.4)特徵峰為3424.0，2927.2，1728.8，1635.0，1510.4，1454.5，1384.7，1249.7，1158.1，1073.1，908.9，834.4，753.0。元素分析為C43.87%，H6.93%，N2.33%。實施例4:磷酸化多肽的富集(1).樣品溶液的製備lmgP-酪蛋白(Sigma，純度為90X)溶於lmL50mM的碳酸氫氨溶液中(PH8.2)，按照與胰蛋白酶的質量比為(40:1)的比例加入胰蛋白酶進行酶解反應，反應時間為6小時，酶解溫度控制在37t:，加入2%三氟乙酸(TFA)終止反應。獲得的蛋白酶解溶液儲存在-8(TC冰箱中備用。其他的蛋白牛血清蛋白、卵清蛋白、細胞色素C、血紅蛋白、胰蛋白酶原的酶解方法同上，反應時間為14小時。(2).磷酸化多肽的富集和MALDI分析將2yL2*10—6mM的P-酪蛋白酶解溶液溶於198iiL上樣液中，其中上樣液為含有3iiLlmg/ml的DHB的50%乙腈和0.25%三氟乙酸的水溶液，加入約O.5mg上述納米材料中。在3(TC，振速為1500rpm下，振動20分鐘，離心去上清液，用含DHB的上樣液洗滌一或二次，再用50%乙腈的水溶液洗滌一次，加入5yL50%乙腈的水溶液用於質譜分析。吸取0.8yL上述富集有磷酸化多肽材料的混濁液點在靶板上，再與含1%H3P04和50%乙腈的DHB(20mg/mL)基質溶液混合，用槍頭抽吸幾次，放幹，用MALDI-TOF-MS測定得質譜圖。所有的MALDI-T0F質譜分析是在島津的AXIMA-CFPplus(KRATOSAnalytical,ShimadzuGroupCompany)飛行時間質譜儀上完成，N2脈衝雷射的波長為337.lnm，實驗中所得數據都在線性正離子模式中進行，質譜分子量的校正採用外標法，所用標準物為IIBradykinin(fragment1-7)(M/z757.3997)，血管緊張素月太(AngiotensinII，M/z1046.5423)，[Glul]-Fibrinop印tideB(M/zl570.6852)和ACTH(fragment18-39)(M/z2465.1989)。所得譜圖再用內標法進行校正，所用內標為m/zl031.34,2061.83和3122.27(3).分析結果由圖4可見有26個磷酸化多肽峰。P_酪蛋白酶解產物中的磷酸化多肽被所用納米材料捕獲，而非磷酸化多肽被洗脫，由於所用的13-酪蛋白純度為90%，其中含有a-Sl-酪蛋白，a-S2-酪蛋白和富酪蛋白，其酶解產物中的磷酸化多肽，也被此納米富集，其中分子量為1190.5和1270.4的峰來自富酪蛋白，其他分析結果見下表一，說明此納米材料能特異的和高效的富集和純化低豐度的磷酸化多肽。實施例5:特異性富集和純化磷酸化多肽(1).樣品的製備和分析將2yL2pmo1的磷酸化蛋白(P-酪蛋白和卵清蛋白)與非磷酸化蛋白(牛血清蛋白，細胞色素C，血紅蛋白，胰蛋白酶原)的酶解多肽混合液溶於198iiL的上樣液中，其中上樣液為含有10iiLlmg/ml的DHB的50%乙腈和0.5%三氟乙酸的水溶液，加入約0.5mg上述納米材料中。在30°C，振速為1500rpm下，振動20分鐘，離心去上清液，用含DHB的上樣液洗滌二次，再用50%乙腈的水溶液洗滌一次。吸取0.8yL上述富集有磷酸化多肽材料的混濁液點在靶板上，再與含1%H3P04的DHB(20mg/mL)基質溶液混合，用槍頭抽吸幾次，放幹，用MALDI-TOF-MS測定得質譜圖4。(2).分析結果圖5是0.5iiL2pmo1的上述六種蛋白的多肽混合液與0.5yL的含1%H3P04的DHB(20mg/mL)基質溶液點在靶板上所得質譜圖，由圖可知，沒有一個磷酸化多肽被檢出，全為非磷酸化多肽。圖6是用納米殼聚糖衍生物富集和純化後所得的質譜圖，有22個磷酸化多肽被檢出，而非磷酸化多肽被洗脫，分析結果見下表一，說明此納米材料能特異的和高效的富集和純化低豐度的磷酸化多肽。表一檢測到的磷酸化多肽序號、胺基酸序列、磷酸化數位點數及理論分子量(其中磷酸化位置以下劃線表示，P-C表示P-酪蛋白，a-Sl和a-S2表示a-S酪蛋白，0v表示卵清蛋白)序號[M+H]+磷酸化位點數胺基酸序列r1031.341FQ旦EEQQQTEDELQDK(P-C)(SEQIDNO:1)21411.502EQLSTSEENSK(a-S2)(SEQIDNO:2)31466.611TVDMESTEVFTK(a-S2)(SEQIDNO:3)tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9a磷酸化多肽為[M+Na]+;b磷酸化多肽為[M+Fe]+，Fe單同位素分子量為53.94;e為雙電荷峰。實施例6:磷酸化多肽的富集及質譜分析(nano-LC-ESI-MS/MS)將10iiL2*10—6慮的P-酪蛋白酶解溶於190iiL上樣液中，其中上樣液為含有DHB的50%乙腈和0.5%三氟乙酸的水溶液，加入約1.5mg上述納米材料中。在在30°C，振速為1500rpm下，振動20分鐘，離心去上清液，用含DHB的上樣液洗滌二次，再用50%乙腈的水溶液洗滌一次。加入100iiL12.5%朋4011洗脫負載的磷酸化多肽，洗脫兩次，將洗脫液濃縮乾燥，加入5iiL的0.1%三氟乙酸的水溶液，取1.4iiL進行nano-LC-ESI-MS/MS(Q-TOF-MS)，對分析的肽斷進行檢索並鑑定之。所有的nano-LC-ESI-MS/MS是在沃特其j公司的毛細管液相色譜儀(Capillaryliquidchromatographysystem;Waters)及四極杆飛行時間質譜儀(Q-TOFUltimaGlobalmassspectrometer;Waters)上進行C即LC-ESI-MS/MS全自動分析。自動進樣系統裝備一個C18脫鹽預柱(5mmX350ym)和一個C18毛細管柱(100mmX75iim)進行梯度洗脫。毛細管電壓為3.5KV，碰撞氣為氬氣，源溫15(TC，錐孔電壓50V，TOF加速電壓9.lkV，進樣流速為200300nL/min進行正離子的MS/MS測定。用200fmol/uL[Glul]-Fibrinop印tideB的MS/MS質譜進行外標校正，分子質量誤差為±0.1Dalton。測定後的數據經ProteinLynx2.0(Waters)軟體處理，生成pkl文件，通過Mascot(http:〃www.matrixscience.com)檢索Swissprot資料庫進行蛋白質鑑定。圖7是鑑定分子量為830.85雙電荷峰的多肽序列實施例圖。實施例7:與實施例1的方法相同，除了其中的自聚原料為丙烯酸環氧丙酯之外。實施例8-9:與實施例1的方法相同，除了其中的引發劑分別為偶氮二異丁腈或正丁基鋰之外。實施例10:與實施例3的方法相同，除了其中的過渡金屬離子為G^+之外。序列表〈110>北京大學〈120〉一種納米殼聚糖衍生物，其製備方法，以及利用該納米殼聚糖衍生物富集和純化磷酸化多肽的方法〈130>SPI085226-00〈160>25PatentInversion3.3〈210>1〈211>16〈212>PRT〈213>人工序列〈400〉1PheGlnSerGluGluGlnGlnGlnThrGluAspGluLeuGinAspLys1510152〈211>11〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2GluGlnLeuSerThrSerGluGluAsnSerLys1510〈210>312〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>3ThrValAspMetGluSerThrGluValPheThrLys1510〈210>4〈211>12〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>4GluGlnLeuSerThrSerGluGluAsnSerLysLys1510〈210>5:0087]〈211>12:0088]〈212>PRT:0089]〈213〉人工序列:0090]〈400>5:0091]GluGinLeuSerThrSerGluGluAsnSerLysLys:0092]1510:0093]〈210>6:0094]〈211>16:0095]〈212>PRT:0096]〈213〉人工序列:0097]〈400>6:0098]PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLys:0099]151015:0100]〈210>7:0101]〈211>25:0102]〈212>PRT:0103]〈213>人工序列:0104]〈400>7:0105]ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSerLeu:0106]151015:0107]SerSerSerGluGluSerlieThrArg:0108]2025:0109]〈210>8:0110]〈211>13:O川]〈212>PRT:0112]〈213>人工序列:0113]〈400>8:0114]ThrValAspMetGluSerThrGluValPheThrLysLys:0115]1510:0116]〈210>9:0117]〈211>14:0118]〈212>PRT:0119]〈213>人工序列:0120]9:0121]ValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg:0122]1510:0123]〈210>10:0124]〈211>16:0125]〈212>PRT〈213〉人工序列10AsplieGlySerGluSerThrGluAspGinAlaMetGluAsplieLys151015〈210>11〈211>16〈212>PRT〈213>人工序列〈400>11TyrLysValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg151015〈210>12〈211>16〈212>PRT〈213>人工序列〈400>12PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLys151015〈210>13〈211>16〈212>PRT〈213>人工序列〈400>13PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLys15101514〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈400>14GluValValGlySerAlaGluAlaGlyValAspAlaAlaSerValSer151015GluGluPheArg20〈210>15〈211>19〈212>PRT〈213>人工序列〈400>15:0165]lieGluLysPheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeu:0166]151015:0167]GinAspLys:0168]〈210>16:0169]〈211>20:0170]〈212>PRT:0171]〈213>人工序列:0172]〈400〉16:0173]PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLys:0174]151015:0175]lieHisProPhe:0176]20:0177]〈210>17:0178]〈211>21:0179]〈212>PRT:0180]〈213>人工序列:0181]〈400>17:0182]AsnThrMetGluHisValSerSerSerGluGluSerlielieSerGin:0183]151015:0184]GluThrTyrLysGin:0185]20:0186]〈210>18:0187]〈211>24:0188]〈212>PRT:0189]〈213>人工序列:0190]〈400>18:0191]GluLeuGluGluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSerLeuSer:0192]151015:0193]SerSerGluGluSerlieThrArg:0194]20:0195]〈210>19:0196]〈211>25:0197]〈212>PRT〈213>人工序列〈400>19AsnAlaAsn1AlaGluVal13GluGluGluTyrSerlieGlySerSerSerGluGluSer51015AlaThrGluGluValLys〈210>20〈211>25〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>20ArgGluLeuGlu1SerSerSerGlu20〈210>21〈211>25〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>21ArgGluLeuGlu1SerSerSerGlu20〈210>22〈211>25〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>22ArgGluLeuGlu1SerSerSerGlu20〈210>23〈211>24〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>23LysAsnThrMet1GinGluThrTyr20〈210>24〈211>25〈212>PRTGluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSerLeu51015GluSerlieThrArg25GluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSerLeu51015GluSerlieThrArg25GluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSerLeu51015GluSerlieThrArg25GluHisValSerSerSerGluGluSerlielieSer51015LysGinGluLys〈213〉人工序列〈400>24ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlyGlulieValGluSer151015SerSerSerGluGluSerlieThrArg2025〈210>2525〈212>PRT〈213〉人工序列〈400〉25GinMetGluAlaGluSerlieSerSerSerGluGlulieValPro151015SerValGluGinLysHislieGinLys202權利要求一種納米殼聚糖衍生物，其特徵在於顆粒大小為1-300nm，優選為20-100nm，以及固載基質為殼聚糖。2.權利要求l的納米殼聚糖衍生物，其中該衍生物帶有活性環氧基團。3.權利要求l的納米殼聚糖衍生物，其中該衍生物帶有活性羧基官能團。4.權利要求3的納米殼聚糖衍生物，其中該衍生物進一步與過渡金屬離子絡合。5.權利要求2的納米殼聚糖衍生物，其中活性環氧基團選自取代或未取代的丙烯酸環氧丙酯或取代或未取代的丙炔酸環氧丙酯，其中取代基為QC1Q直鏈或支鏈烷基，QC1Q直鏈或支鏈烷氧基，QQ。直鏈或支鏈烯基，QQ。直鏈或支鏈炔基，或卣素，優選選自甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯。6.權利要求3的納米殼聚糖衍生物，其中活性羧基官能團選自亞胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸。7.權利要求4的納米殼聚糖衍生物，其中過渡金屬離子選自Fe3+，Ti,Ni2+，Z,或Ga3+。8.權利要求l-7任一項的納米殼聚糖衍生物的製備方法，包括下列步驟(l)將殼聚糖溶於0.1%-20^%稀酸水溶液，與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，進行自聚反應和接枝反應，得到帶有活性環氧基團的殼聚糖衍生物，(2)接著與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸進行開環加成反應，得到帶有羧基活性官能團的殼聚糖衍生物，(3)再與選自Fe3+，Ti4+，Zr4+，Ni2+或Ga3+的過渡金屬離子發生螯合作用，製得所述納米殼聚糖衍生物，其中自聚和接枝的反應溫度為40-10(TC，開環反應溫度為50-80°C。9.權利要求8的製備方法，其特徵在於自聚和接枝的反應加入選自偶氮二異丁腈，正丁基鋰，過硫酸鉀，硝酸鈰銨，硫代碳酸_溴酸鉀，二高碘酸銅酸鉀，或過硫酸氨和硫代硫酸鈉的引發劑。10.權利要求8的製備方法，其中引發劑加入量為反應單體重量的1-5%。11.權利要求8的製備方法，其特徵在於與亞胺基二乙酸鈉或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸發生開環加成反應時，pH值為8-12。12.權利要求8的製備方法，其特徵在於與過渡金屬離子發生螯合作用時，Fe3+的濃度為10mM-100mM。13.—種利用權利要求l-7任一項的納米殼聚糖衍生物富集和純化磷酸化多肽的方法，包括將含有磷酸化多肽的混合物溶於上樣液中，其中所述上樣液為含有2，5-二羥基苯甲酸的乙腈和三氟乙酸的水溶液，再加入所述納米殼聚糖衍生物進行富集，洗滌後得到選擇性吸附有磷酸化多肽的納米殼聚糖衍生物，並以高的pH溶液洗脫負載的磷酸化多肽，任選以氨水洗脫負載的磷酸化多肽。14.權利要求13的富集和純化磷酸化多肽的方法，其特徵是選擇適當的條件，用質譜技術直接測定和鑑定分析物。15.權利要求13的富集和純化磷酸化多肽的方法，其特徵是將上述納米殼聚糖衍生物塗在晶片上進行微量的磷酸化多肽的富集和純化。16.權利要求13的富集和純化磷酸化多肽的方法，其特徵是將上述納米殼聚糖衍生物填充入色譜柱中進行大規模的磷酸化多肽的富集和純化。17.權利要求13的方法，其中分析物是血清、血漿、體液、組織或細胞裂解液的酶解產物。全文摘要本發明涉及生物醫學納米材料
技術領域：
。具體而言，本發明提供一種納米殼聚糖衍生物，其製備方法以及利用該納米殼聚糖衍生物高選擇性和特異性富集和純化磷酸化多肽的方法。所述製備方法包括將殼聚糖溶於稀酸後，與甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯混合，進行自聚反應和接枝反應，從而得到帶有活性環氧基團的納米複合介質殼聚糖衍生物，此複合介質與亞胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸進行開環加成反應得到帶有羧基活性官能團的納米介質殼聚糖衍生物，再與Fe3+，Ti4+，Zr4+，Ga3+等過渡金屬離子發生螯合作用而製得最終的納米殼聚糖衍生物。所述納米殼聚糖衍生物具有很高的特異性，可用於生物樣品中低豐度的磷酸化多肽的富集和純化，從而可用於生物和醫學領域，包括臨床診斷。文檔編號C08F8/42GK101747448SQ20081017971公開日2010年6月23日申請日期2008年11月28日優先權日2008年11月28日發明者劉丹,婁雅欣,彭嘉柔,楊彬,鄒霞娟,鍾麗君申請人:北京大學