真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞的製作方法

2023-12-10 06:21:37

專利名稱：真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域的基因啟動子、重組載體及宿主細胞，具體是
一種真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞。
背景技術：
金針菇(Fla匪lina velutipes)，學名毛柄金錢菌，屬傘菌目(Agaricales) ， 口蘑禾鬥(Tricholomataceae)，金針燕屬(Flammulina)。 金針燕(Flammulina velutipes)分布廣泛。金針菇除了味道鮮美，具有極高的營養價值外，還含有多種藥用成分，是一種重要的藥用資源。金針菇中含有多種生物活性物質，如火菇素(Flammulin)，溶細胞素(Flammutoxin)，真菌免疫調節蛋白(FIP-fve)，抗病毒蛋白，跨上皮電抗性蛋白(TEER-TDP)和金針菇多糖(FVP)(金湘，婁愷，毛培宏.金針菇生物活性物質結構與功能的研究進展.中草藥.2007,38(10) :1596， 10001,10002)。其中，真菌免疫調節蛋白是近年來研究的比較多的一種重要的生物活性物質。 真菌免疫調節蛋白是從一些高等擔子菌(蘑菇類)子實體中提取的與植物凝集素和免疫球蛋白的結構和免疫功能相似的一類小分子蛋白質。自1989年日本學者Kino等從赤靈芝(Ganoderma lucidi咖)子實體中分離提取出第一個真菌免疫調節蛋白(LZ-8)以來，已分別從松杉靈芝(G. tsugae)，金針菇(Flammulina velutipes)，草燕(Volvariellavolvacea)，紫芝(G. japoncium)，小抱靈芝(G. microsporum)及紫芝(G. sinense)分離得到了七種FIP，即LZ-8 (FIP-glu) ， FIP-gts， FIP-fve， FIP-vvo，FIP-gja，FIP-gmi，FIP-gsi，形成了一個新的蛋白質家族月出IPs。在真菌免疫調節蛋白家族中，其一級結構有著60 70%的同源性。該家族的蛋白也同樣具有相似的生理功能，對機體具有重要的免疫調節功能。FIP能夠促進人外周血淋巴細胞和小鼠脾細胞的有絲分裂；誘導淋巴細胞產生細胞因子；減少抗原誘導型抗體的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫。不同的真菌免疫調節蛋白家族成員不僅在胺基酸序列上存在差異，在體內與體外也具有不同程度的免疫調節功能。 Ko， J丄等在《European Journal of Biochemistry》(歐洲生化雜誌)1995年第2期244 249頁發表了題為《A New Fungal Immunomodulatory Protein, FlP-fveIsolatedfrom the Edible Mushroom, Flammulina velutipes and its Complete AminoAcidSequence》(從食用真菌金針菇中分離得到了一種新的真菌免疫調節蛋白，FIP-fve，及其完整的胺基酸序列) 一文，文中評述，金針菇真菌免疫調節蛋白(FIP-Fve)在體外具有凝集人紅細胞的作用，能提高IL-2與幹擾素Y的轉錄表達，可激活人外周血淋巴細胞，在體內也能抑制過敏反應。利用基因工程重組表達的FIP-fve同樣也具有相同的免疫調節功能。 在基因工程中常用的啟動子按照其功能分為組成型啟動子，組織特異型啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子是指在該類啟動子調控下，結構基因的表達基本恆定在一定水平上，並且在不同時期、不同組織及不同部位的表達水平沒有明顯差異。組織特異啟動子是指在這類啟動子調控下，基因只在某些特定的器官或組織部位表達，並表現出發育調節的特性。誘導型啟動子是指在某些特定的物理或化學信號的剌激下，該啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄表達水平。選擇組織特異型啟動子或誘導型啟動子，對於利用基因工程手段改良物種等方面具有重要意義。利用特異型或誘導型的啟動子，可以使轉化的目的基因在特異的部位及特異的時期表達，從而達到真正的可控。對降低病蟲害，減少轉基因物種的危害性都具有指導意義。 經對現有技術的文獻檢索發現，尚沒有與本發明的真菌免疫調節蛋白基因啟動子重、組載體及宿主細胞有關的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞。本發明的金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子，可啟動報告基因GUS-GFP融合蛋白基因在菸草的根及葉表皮毛中高效表達。
本發明是通過以下技術方案實現的， 本發明涉及一種真菌免疫調節蛋白基因啟動子，該啟動子的核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示。 所述的啟動子的引物對具體為 上遊引物TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC ; 下遊弓|物AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT 。 本發明還涉及一種重組載體，該載體含有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。
所述重組載體使用的載體為pCAMBIA 1304。 本發明還涉及一種宿主細胞，該宿主細胞含有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列。
所述宿主細胞為菸草葉片細胞。 本發明還涉及一種分離的核苷酸，其序列與SEQID NO :1所示核苷酸序列至少有85%的同源性。 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果本發明的金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子，可啟動報告基因GUS-GFP融合蛋白基因在菸草的根及葉表皮毛中高效表達，本發明的基因啟動子在植物組織特異型表達中有重要作用。 本發明涉及的菌株大腸桿菌DH5a已在《汪玲玲，楊輯，黃誠之，王海洪；大腸桿菌holo-ACP的過表達、分離純化及長鏈脂醯ACP的合成，微生物學報，2008，48(7) :963-969》中公開；可通過公開市售的商業渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號航星商務樓1號樓606室。 本發明中涉及的根癌農桿菌EHA105已在《王丹王丕武付永平厲志；大豆根部特異性啟動子的克隆及功能分析，大豆科學，2009，28(2) :195-199》中公開；可通過公開市售的商業渠道取得，如中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所。


圖1金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列分析 圖2轉基因菸草根GUS染色結果 圖3轉基因菸草葉表皮毛螢光檢測結果圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子的克隆
步驟一，金針菇菌絲的培養 將在斜面中培養的金針菇菌株(已在《孔祥輝張介馳張丕奇於德水楊志興；
金針菇免疫調節蛋白基因表達及活性初步研究，中國生化藥物雜誌，2007， 28 (5) :304
308》文獻中公開)2『C活化24h，挑取斜面試管菌種的菌絲接至馬鈴薯綜合培養基(Potato
DextroseAgar, PDA)平板上，28"恆溫培養7天。將lcm2左右的平板菌種接至PDA液體培
養基，在28°C 、 120rpm條件下培養5天。 步驟二，金針燕基因組DNA的分離 採用高鹽低pH法提取基因組DNA，包括以下步驟 (1)將lg左右經液氮研磨的樣品放入65t:預熱的提取緩衝液中，放入65t:水浴鍋保溫30min，緩慢振搖，室溫下10， 000 X g離心10min ; (2)在上清液中加入2/3體積的2. 5mol/L的KAc高鹽溶液，混勻後置於(TC保持30min沉澱蛋白質； (3)在4t:下10，000Xg離心10min，棄蛋白質沉澱。上清液加入由氯仿和異戊醇按照24 : 1的體積比配成的等體積的氯仿和異戊醇的混合物抽提，在6，000Xg離心10min，取出水相轉入另一離心管，如果中間層仍有白色沉澱，則再用由氯仿和異戊醇按照24 : 1的體積比配成的氯仿和異戊醇的混合物抽提一次； (4)在上清液中加入三分之二體積的預冷異丙醇，混勻後置於-2(TC靜置30min，以沉澱核酸，用體積比為70%乙醇清洗沉澱，在空氣中乾燥5min，將DNA沉澱溶解在TE緩衝液中，分裝存放於-2(TC或4t:冰箱中保存。
步驟三，金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子的克隆 利用基因組步移技術，通過採用TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit克隆金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列。 選取限制性內切酶EcoR I， Hind III， Pst I， Sal I以及Xba I分別對步驟二中提取的金針菇基因組DNA進行酶切。將酶切產物分別與對應的試劑盒所提供的EcoR ICassette, Hind III Cassette, Pst I Cassette, Sal I Cassette, Xba I cassette連接。根據金針菇真菌免疫調節蛋白基因的序列，設計合成兩條引物 SI:TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC(SEQ ID NO :2);
S2 :AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT(SEQ ID NO :3)。 分別以連接產物為模板，以SI和試劑盒提供的Primer CI為引物，進行第一輪的PCR擴增。PCR反應條件為按照94。C變性30s ;55。C退火30s ;72。C延伸lmin進行30個循環。之後再進行第二輪PCR擴增。分別以第一輪PCR產物稀釋100倍後的溶液做模板，以S2和試劑盒提供的Primer C2為引物進行第二輪PCR擴增。PCR反應條件為按照94。C變性30s ;55t:退火30s ;72t:延伸lmin進行30個循環。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測。將第一輪PCR的產物和第二輪PCR的產物相鄰檢測。理想的情況是，在第一輪PCR產物出現條帶的位置，第二輪PCR產物也有相同的條帶。將第二輪PCR產物的條帶回收，測序。
步驟四，金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列分析
將金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列利用 CARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/) 進行生物信息學分析，結果顯示，該序列含有多種基序。其中主要含有7個TATA-box， 7個CAAT-box， 1個G-box， 1個ABRE， 3個CGTCA-motif ， 6個Skn-1 motif 。其中，ABRE是與抗逆相關的順式作用元件，受ABA誘導表達；CGTCA-motif是甲基茉莉酸誘導元件；G-box是光誘導元件；Skn-l motif為誘導胚乳特異表達元件。預測轉錄起始位點位於ATG上遊100bp處(見圖l箭頭所示)。 經過利用CARE軟體對金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列分析，結果顯示該序列具有啟動子具有之基本元件。將測序所得的金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列提交GenBank中進行比對，結果顯示沒有可以與之比對的序列。說明所得到的1， 000bp的金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列是新發現的序列。
實施例2 金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子驅動的GUS-GFP融合蛋白基因的菸草轉化
步驟一，金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子的克隆 根據金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子的序列，設計能擴增出金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列全長的引物，在保證雙元表達載體(如pCAMBIA 1304)中GUS-GFP報告基因閱讀框架正確的前提下，在上遊引物和下遊引物上分別引入限制性內切酶位點(本實施例選用載體pCAMBIA 1304，上遊用Hind III和下遊用Nco I)，以便構建表達載體。以金針菇基因組DNA為模板，經PCR擴增後，將金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子序列克隆至中間載體(本實施例選用pMD 18-T simple vector)，測序結果與所得的1， 000bpFIP-fve-P的序列比較，一致性為100%，表明擴增沒有出現錯配。
步驟二，真核表達載體的構建 根據引物兩端設計的酶切位點，用雙酶切(本實施例採用的是pCAMBIA 1304載體，因此採用Hind I和Nco I進行雙酶切)將FIP-fve-P片斷從pMD 18_T simple vector上切下，把酶切後回收的FIP-fve-P片斷與經同樣的酶(本實施例採用的是pCAMBIA 1304載體，因此採用Hind I和Nco I進行雙酶切)酶切的載體片斷相連。將連接產物轉化DH5a菌株中，提取質粒DNA，用雙酶切鑑定，構建好的載體命名為pl304: :FIP-fve-P。
大量提取構建的表達載體(pl304: :FIP-fve-P)的質粒DNA，取20uL(約lug)轉化農桿菌EHA105感受態細胞，在LB培養基(30mg/L利福平，50mg/L鏈黴素，25mg/L卡那黴素)上2『C培養兩天，隨機挑選5個克隆做菌液PCR鑑定，均擴增出目標條帶。
步驟三，農桿菌轉化菸草葉片 (1)挑取LB選擇平板(30mg/L利福平，50mg/L鏈黴素，25mg/L卡那黴素)上的陽
6性單菌落，接種於2ml LB液體培養基(30mg/L利福平，50mg/L鏈黴素，25mg/L卡那黴素)， 28 °C ， 200rpm振蕩培養24 36小時; (2)取1ml以上培養物，加入50ml LB液體培養基(30mg/L利福平，50mg/L鏈黴素， 25mg/L卡那黴素)中，28。C，200rpm振蕩培養至0D6。。 = 0. 6 1. 0 ;
(3)將培養物4000rpm離心10分鐘，收集菌體； (4)用等體積MS。(MS粉4. 4g，蔗糖30g， pH5. 8)液體培養基懸浮，培養20 40min ;
(5)取生長兩周左右的菸草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約0. 5平方釐米 見方的小葉片； (6)將大約200片葉盤放入兩瓶200ml農桿菌培養液中，28°C ， 200rpm振蕩培養 5 6分鐘； (7)將葉片取出，放置在MS。(MS粉4.4g，蔗糖30g， pH5. 8)固體培養基上暗培養 36 48h ; (8)將葉片轉移至MSJMS。中加入O. lmg/La萘乙酸，lmg/L 6-苄基腺嘌呤， 250mg/L羧苄西林鈉)培養基中光照培養1周，每日光照12 16小時；
(9)將葉片轉移至MS2(在MS！中加入30mg/L潮黴素)培養基中光照培養，每日光 照12 16小時，每兩周繼代一次；每次將變黃的葉片或愈傷組織丟掉，大的愈傷組織切割 成小塊，經2 3次繼代後，培養的愈傷組織陸續分化出苗。 (10)當苗長至約2cm時，轉入MS3(在MS。中加入0. 5mg/La萘乙酸，30mg/L潮黴 素，250mg/L羧苄西林鈉)培養基中培養至生根； (11)將根系發育完全的菸草苗轉移至珍珠巖，在溫室中培養。
實施例3 菸草轉基因後代的分子檢測及FIP-fve-P啟動子活性的檢測
步驟一，菸草轉基因後代的分子檢測
(1)菸草總DNA小量提取 取移栽2 3周後的菸草幼嫩葉片(約100mg)放入1. 5mL Ep管中，加入600 ii L 65。C預熱SDS提取緩衝液(100mM Tris-HCl， pH8. 0， 0. 5M NaCl，50mM EDTA， pH8. 0， 1. 5% SDS(W/V)，使用前加入2% 3% P -ME(V/V))，用磨砂頭玻璃棒勻槳；65。C水浴50min，其間 小心顛倒混勻3次；然後加入300 ii L酚(Tris-HCl pH8. 0平衡)禾P 300 y L氯仿，混勻後 12， OOOrpm離心lOmin ;取500 y L上清移至新Ep管中，加入等體積氯仿並混勻，12， OOOrpm 離心lOmin ;重複上一步驟，以去除痕量的酚；吸上清，加2倍體積的無水乙醇(-2(TC預 冷)，充分混勻，12， OOOrpm離心lOmin ;棄上清，用75%的乙醇洗滌DNA 2次，稍離心，吸去 殘餘乙醇並在通風廚乾燥20min至乙醇完全揮發；加入50 ii L滅菌水和1 y L RNase混勻， 輕離心後置37。C水浴lh，降解RNA ;取3 ii L DNA用1 %瓊脂糖凝膠檢測，保存於_20°C ，備 用。
(2) PCR檢測 根據FIP-fve-P啟動子基因的序列設計一對引物Promoter-F和Promoter-R。用 這對引物檢測用SDS法提取的轉基因菸草基因組DNA。其中，PCR反應體系組成如下10X 緩衝液2. 5ii 1， dNTP混合物(每種lOmM)O. 5ii 1， Promoter-F(濃度為lOiiM)O. 5ii 1， Promoter-R(濃度為10 10 y M) 0. 5 y L， Taq酶(濃度為5U/1 y L) 0. 5 y L，轉基因菸草總
7DNA(濃度為20ng/ y L) 1 y L，滅菌水定容至25 y L， PCR檢測結果表明陽性菸草植株與待檢
測菸草植株的株數比為80%。 步驟二， FIP-fve-P啟動子活性的檢測 將PCR檢測結果為陽性的菸草植株，取其小苗的根和葉進行GUS染色及螢光檢測， 分析FIP-fve-P的組織特異性表達，具體步驟如下
(l)GUS蛋白檢測 ①X-gluc :用N， N- 二甲基甲醯胺配成20mM的儲存液，分裝成每管lOOuL，保存 於_20°C ;②底物溶液lmM X-gluc於lOOmM磷酸鈉緩衝液(pH為7)含10 lOOmM EDTA， 1 5mMK3 [Fe (CN) 6] ， 1 5mM K4 [Fe (CN) 6] ， 0. 1 % Tritron X-100 ;
③使用時，將X-gluc用底物溶液稀釋20倍； ④取一小片葉片及根放入GUS染液，37°〇反應過夜，75%乙醇脫綠。
結果見圖2，圖中，A:非轉基因菸草葉表皮毛(無色透明)；B:轉基因菸草葉表皮
毛(藍色)；C :非轉基因菸草根(無色透明)；D :轉基因菸草根(藍色)。 (2) GFP檢測 取一小片葉片在螢光顯微鏡下觀察。結果見圖3，圖中，A :非轉基因菸草葉表皮毛 (無色透明)；B:轉基因菸草葉表皮毛(綠色)。金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子驅 動的GUS-GFP報告基因檢測結果表明金針菇真菌免疫調節蛋白基因起始密碼子ATG上遊 1，000bp的序列(FIP-fve-P)足以啟動報告基因GUS-GFP在菸草的不同組織中表達。
序列表
〈110〉上海交通大學 〈120〉真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞
〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>1000
〈212>DNA 〈213>Flammulina velutipes
〈400〉 1 tcgacgtcgc gaacgacgag
gg朋3gagg3 gag朋3gagg
tcgaaaaatg aaccggatgt
gttcgcttcc gtacacgttc
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9
權利要求
一種真菌免疫調節蛋白基因啟動子，其特徵在於，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據權利要求1所述的真菌免疫調節蛋白基因啟動子，其特徵是，所述的啟動子的引物對具體為上遊引物TAGCTGCTTGGGGTACCACGGCC ;下遊弓I物AAGGTGAGCGACGTGGCGGACAT 。
3. —種真菌免疫調節蛋白基因重組載體，其特徵在於，該載體含有如SEQ ID NO:l所示核苷酸序列。
4. 根據權利要求3所述的真菌免疫調節蛋白基因重組載體，其特徵是，所述的重組載體所使用的載體為pCAMBIA 1304。
5. —種真菌免疫調節蛋白基因宿主細胞，其特徵在於，該宿主細胞含有如SEQ ID NO:l所示核苷酸序列。
6. 根據權利要求5所述的真菌免疫調節蛋白基因宿主細胞，其特徵是，所述的宿主細胞為菸草葉片細胞。
全文摘要
一種基因工程技術領域的真菌免疫調節蛋白基因啟動子、重組載體及宿主細胞；本發明涉及的基因啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；本發明還涉及一中擴增所述基因啟動子的引物對；本發明還涉及一種含有如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的重組載體；本發明還涉及一種含有如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的宿主細胞；本發明還涉及一種分離的核苷酸，其序列與SEQID NO1所示核苷酸序列至少有85％的同源性。本發明的金針菇真菌免疫調節蛋白基因啟動子，可啟動報告基因GUS-GFP融合蛋白基因在菸草的根及葉表皮毛中高效表達，本發明的基因啟動子在植物組織特異型表達中有重要作用。
文檔編號C12N5/10GK101705230SQ20091030988
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月18日 優先權日2009年11月18日
發明者周選圍, 李奇璋 申請人:上海交通大學