一種測定β-葡聚糖合成酶活力的方法

2023-12-10 02:40:31 1

專利名稱：一種測定β-葡聚糖合成酶活力的方法
技術領域：
本發明涉及的是酶學與酶技術領域，具體涉及一種測定β-葡聚糖合成酶活力的方法。
背景技術：
葡聚糖是一類非澱粉類多糖，它是由β-1，3-葡萄糖苷鍵和/或β-1，6_葡萄糖苷鍵以及少量的β-1，4-葡萄糖苷鍵組成的鏈狀多糖，是真菌和植物細胞壁的重要組成成分。大量的化學和藥理分析表明，富含葡聚糖的真菌多糖(如灰樹花多糖、香菇多糖)具有明顯的抗腫瘤、抗病毒、免疫調節、調節血糖、降血壓等作用。葡聚糖合成酶對 β-葡聚糖的合成具有至關重要的作用。目前，該酶活力的檢測方法中大都是以UDP-[14c] 葡萄糖為底物，通過使用液體閃爍計數儀測定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的變化來測定 β-葡聚糖合成酶的活力，這類方法需要昂貴的底物(udp-[14c]葡萄糖)和檢測儀器，實驗成本高，而且放射性底物udp-[14c]葡萄糖具有明顯的危害性，所以這類方法很難被廣泛應用。本發明以葡萄糖為底物、用3，5-二硝基水楊酸作為顯色劑來測定β -葡聚糖合成酶的活力。該方法不受磷酸鹽緩衝液的幹擾，所得酶濃度曲線與酶促反應速度在較寬的酶濃度範圍內呈線性相關。該法不需要昂貴的儀器，大大節省了實驗成本，而且該方法使用不含有放射性的葡萄糖作為底物，安全性高，便於大規模推廣應用。

發明內容
針對已有技術的缺點，本發明提供一種測定葡聚糖合成酶活力的方法，該方法以葡萄糖為底物、用3，5-二硝基水楊酸作為顯色劑來測定葡聚糖合成酶的活力。該方法與使用UDP-[14C]葡萄糖為底物、通過使用液體閃爍計數儀測定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的變化來測定葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大大降低實驗成本，而且該方法使用不含有放射性的葡萄糖作為底物，實驗的安全性高。本方法靈敏度高，操作簡單安全，方便快捷。該測定β -葡聚糖合成酶活力的方法包括以下工藝步驟(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取1.0-5. Og β-葡聚糖合成酶，加入 50-100ml 7. Ommol/L NaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸鹽緩衝液攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. Olg/ ml-0. lg/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml, 不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解，停止加熱；冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至1000ml， 過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存；室溫下存放7d後可以使用，有效期為6個月；(4)葡萄糖溶液標準曲線的製作分別取6-15組具有不同濃度的葡萄糖標準溶液2. 0ml，濃度範圍在0_500 μ g/ml 之間，加入DNS試劑1. 5ml，沸水浴加熱5-20min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25ml後于波長510-570nm處測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；以上加量可按比例增減；根據每組葡萄糖濃度與測得的光密度值之間的關係，以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪製標準曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白(Img)具有的酶活力單位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力，單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，μ g ；T——反應時間，min;M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定將終濃度為l_5mg/ml的預熱至測定溫度的葡萄糖溶液加入到預熱至相應溫度的 β -葡聚糖合成酶溶液中開始合成反應，反應溫度為10-40°C，反應時間為60min以內，將該酶促反應液與1. 5ml的DNS溶液迅速混合後於沸水中加熱5-20min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25ml後于波長510-570nm處測定光密度值，根據步驟(4)製作的葡萄糖濃度與相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測β-葡聚糖合成酶在合成β-葡聚糖反應中單位時間內所消耗的葡萄糖的含量，代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式， 計算出β-葡聚糖合成酶的活力。上述β -葡聚糖合成酶溶液以pH = 7. 0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝液作為溶劑。上述測定光密度值的最佳波長為MOnm。本發明的優點是本發明以葡萄糖作為酶促反應底物，用3，5-二硝基水楊酸作為顯色劑對葡聚糖合成酶合成葡聚糖後消耗的葡萄糖的量在可見光下進行檢測來確定葡聚糖合成酶的活力。該方法與使用UDP-[14C]葡萄糖為底物、通過使用液體閃爍計數儀測定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的變化來測定葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大大降低實驗成本，而且該方法使用不含有放射性的葡萄糖作為底物，實驗的安全性高。本方法靈敏度高，操作簡單安全，方便快捷。便於大規模推廣應用。本發明可廣泛用於糖類與酶類產品的研究與開發中。
具體實施例方式以下介紹詳細本發明的實施例。實施例1 主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，HH-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司。(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取1. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. 02g/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明，再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. Og、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 IOOOml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月；(4)葡萄糖溶液標準曲線的製作分別取6組具有不同濃度的葡萄糖標準溶液2. 0ml，濃度範圍在0_500 μ g/ml之間，加入DNS試劑1. 5ml，沸水浴加熱5-20min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25ml後于波長 510-570nm處測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖濃度與測得的光密度值之間的關係，以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中X——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，μ g ；T-反應時間，min ；M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定取1. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin，加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液1. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β -葡聚糖合成酶濃度，可以將待測的葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為 60min以內，迅速加入1. 5mlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後於540nm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量，代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，即可計算出β -葡聚糖合成酶的活力。實施例2 主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，ΗΗ-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司。(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取2. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. 04g/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 IOOOml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月；(4)葡萄糖標準曲線的製作分別加入6組不同濃度的葡萄糖標準溶液4. 0ml，加入DNS試劑3. 0ml，混勻，於沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至50ml，于波長540nm波長下測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶液濃度與測得的相應光密度值之間的關係繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，μ g ；T——反應時間，min ；M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定取2. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin， 加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液2. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β -葡聚糖合成酶濃度，可以將待測的β -葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為30min以內，迅速加入3. OmlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後用蒸餾水定容至 50ml，於MOnm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的β-葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量， 代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。實施例3:主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，ΗΗ-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司。(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取5. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4,pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. lg/ml，4°C保存備用；。(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 IOOOml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月；(4)葡萄糖標準曲線的製作分別加入6組不同濃度的葡萄糖標準溶液6. 0ml，加入DNS試劑4. 5ml，混勻，於沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至75ml，于波長540nm波長下測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶液濃度與測得的相應光密度值之間的關係繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，μ g ；T-反應時間，min ；M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定取3. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin， 加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液3. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β -葡聚糖合
8成酶濃度，可以將待測的β -葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為30min以內，迅速加入4. 5mlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後用蒸餾水定容至 75ml，於MOnm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的β-葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量， 代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。實施例4 主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，ΗΗ-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司。(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取5. Og β -葡聚糖合成酶，加入IOOml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. 05g/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 IOOOml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月；(4)葡萄糖標準曲線的製作 分別加入6組不同濃度的葡萄糖標準溶液8. Oml，加入DNS試劑6. Oml，混勻，於沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至100ml，于波長540nm波長下測定光密度值； 每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶液濃度與測得的相應光密度值之間的關係繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，Pg;T——反應時間，min;M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定取4. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin，加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液4. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β-葡聚糖合成酶濃度，可以將待測的β -葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為30min以內，迅速加入6. OmlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後用蒸餾水定容至 100ml，於510nm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量， 代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。實施例5:主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，ΗΗ-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司；(1)制樣——β-葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取4. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. 08g/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 IOOOml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月；(4)葡萄糖標準曲線的製作分別加入6組不同濃度的葡萄糖標準溶液10. 0ml，加入DNS試劑7. 5ml，混勻，於沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至125ml，于波長MOnm波長下測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶液濃度與測得的相應光密度值之間的關係繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，Pg;T——反應時間，min;M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ； (7) β -葡聚糖合成酶活力的測定
取5. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin， 加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液5. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β -葡聚糖合成酶濃度，可以將待測的β -葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為30min以內，迅速加入7. 5mlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後用蒸餾水定容至 125ml，於570nm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的β-葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量， 代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。實施例6:主要儀器數顯電熱恆溫水浴鍋，ΗΗ-4型，河南智誠科技發展有限公司；可攜式防水型pH/mV/°C測定儀，HI8424型，HANNA instruments ；可見分光光度計，723型，上海精密科學儀器有限公司。(1)制樣——β -葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取3. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸鹽緩衝液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. 06g/ml，4°C保存備用；(2)葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ml的葡萄糖標準溶液；(3) DNS溶液的配製稱取3，5- 二硝基水楊酸3. 15g(AR)，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C ；然後逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. Og、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml，不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解；停止加熱，冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至 1000ml ；過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7d後可以使用，有效期為6 個月。(4)葡萄糖標準曲線的製作分別加入6組不同濃度的葡萄糖標準溶液12. 0ml，加入DNS試劑9. 0ml，混勻，於沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用蒸餾水定容至150ml，于波長MOnm波長下測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；根據每組葡萄糖溶液濃度與測得的相應光密度值之間的關係繪製標準對應關係曲線；(5) β -葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白具有的酶活力單位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的計算β -葡聚糖合成酶的比活力計算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力單位，U/mg ；W——反應掉的葡萄糖的質量，Pg;T——反應時間，min;M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；
(7) β -葡聚糖合成酶活力的測定取6. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)於25ml試管中，於25°C恆溫水浴中預熱lOmin， 加入待測的β -葡聚糖合成酶溶液6. Oml進行合成反應，為確定合適的待測β -葡聚糖合成酶濃度，可以將待測的β -葡聚糖合成酶溶液稀釋成不同濃度梯度逐個檢測，反應時間為30min以內，迅速加入9. OmlDNS試劑於沸水中加熱5min，冷卻至室溫後用蒸餾水定容至 150ml，於540nm處測定光密度值，根據上一步驟製作的葡萄糖濃度與測得的相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測的β-葡聚糖合成酶的合成反應消耗掉的葡糖糖的量， 代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。本發明不限於上述操作，所有在本發明的實質範圍內作出的變化、改型、添加或替換，都應屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1. 一種測定葡聚糖合成酶活力的方法，包括以下工藝步驟 ⑴制樣——β-葡聚糖合成酶溶液的製備準確稱取1. 0-5. Og β-葡聚糖合成酶，加入50-100ml 7. 0 mmol/L NaH2PO4, 7.0 mmol/L Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸鹽緩衝液攪拌使其溶解，樣品的最終濃度為0. Olg/ ml-0. lg/ml，4°C保存備用； ⑵葡萄糖標準溶液的配製精確稱取IOOmg無水葡萄糖，加蒸餾水定容至100ml，得到濃度為1. Omg/ ml的葡萄糖標準溶液；⑶DNS溶液的配製稱取3，5-二硝基水楊酸3. 15g，加水500ml，攪拌溶解，水浴至45°C;然後逐步加入 IOOml 0. 2g/ml的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91. 0g、苯酚2. 50g和無水亞硫酸鈉2. 50g ；繼續45°C水浴加熱，同時補加水300ml, 不斷攪拌，直到加入的物質完全溶解，停止加熱；冷卻至室溫後，用蒸餾水定容至1000 ml, 過濾，取濾液，儲存於棕色瓶中，避光保存；室溫下存放7d後可以使用，有效期為6個月； ⑷葡萄糖溶液標準曲線的製作分別取6-15組具有不同濃度的葡萄糖標準溶液2. 0ml，濃度範圍在0-500 μ g/ml 之間，加入DNS試劑1. 5ml，沸水浴加熱5-20min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25ml後于波長510-570nm處測定光密度值；每個濃度做三個平行樣；以上加量可按比例增減；根據每組葡萄糖濃度與測得的光密度值之間的關係，以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪製標準曲線；(5)葡聚糖合成酶的活力單位β -葡聚糖合成酶的活力單位(U)被定義為每分鐘消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位；比活力(U/mg)定義為單位酶蛋白(Img)具有的酶活力單位；(6)葡聚糖合成酶的比活力的計算 β-葡聚糖合成酶的比活力計算公式X= W/ (TXM)式中Χ——酶的比活力，單位，U/mg ； W——反應掉的葡萄糖的質量，μ g ； T——反應時間，min ；M——待測樣品的質量，mg或待測樣品的體積，ml ；(7)葡聚糖合成酶活力的測定將終濃度為l_5mg/ml的預熱至測定溫度的葡萄糖溶液加入到預熱至相應溫度的 β -葡聚糖合成酶溶液中開始合成反應，反應溫度為10-40°C，反應時間為60min以內，將該酶促反應液與1. 5ml的DNS溶液迅速混合後於沸水中加熱5-20min，取出冷卻，加入蒸餾水定容至25ml後于波長510-570nm處測定光密度值，根據步驟(4)製作的葡萄糖濃度與相應光密度值之間的標準對應關係曲線確定待測β-葡聚糖合成酶在合成β-葡聚糖反應中單位時間內所消耗的葡萄糖的含量，代入步驟(6)中葡聚糖合成酶的比活力的計算公式，計算出葡聚糖合成酶的活力。
2.根據權利要求1所述的測定葡聚糖合成酶活力的方法，其特徵是上述測定 β -葡聚糖合成酶活力的方法是以葡萄糖為酶促反應的底物，用3，5- 二硝基水楊酸作為顯色劑來測定葡聚糖合成酶活力。
3.根據權利要求1所述的測定葡聚糖合成酶活力的方法，其特徵是所述步驟(7) 中β -葡聚糖合成酶溶液以7. 0 mmol/L NaH2PO4- Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩衝液作為溶劑。
4.根據權利要求1所述的測定葡聚糖合成酶活力的方法，其特徵是所述步驟(7) 中測定光密度值的最佳波長為^Onm。
全文摘要
本發明公開了一種測定β-葡聚糖合成酶活力的方法，本發明的優點是以葡萄糖作為酶促反應底物、用3,5-二硝基水楊酸作為顯色劑對β-葡聚糖合成酶合成β-葡聚糖後消耗的葡萄糖的量在可見光下進行檢測來確定β-葡聚糖合成酶的活力。該方法與傳統的使用UDP-[14C]葡萄糖為底物、通過使用液體閃爍計數儀測定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的變化來測定β-葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大幅度降低實驗成本，而且該方法不使用含有放射性的葡萄糖作為底物，實驗的安全性高。本方法靈敏度高，操作簡單安全，方便快捷，便於大規模推廣應用。本發明可廣泛用於糖類與酶類產品的研究與開發中。
文檔編號C12Q1/48GK102443621SQ20111038969
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者丁金聚, 侯啟昌, 古亞楠, 孟甜甜, 崔羽佳, 張鵬, 朱奎成, 李鵬, 王衛國, 趙永亮 申請人:河南工業大學, 王衛國