多聚磷酸鈉的應用及含有多聚磷酸鈉的疫苗劑的製作方法

2023-12-10 07:45:42

本發明屬於免疫學技術領域，具體涉及多聚磷酸鈉的應用及含有多聚磷酸鈉的疫苗劑。

背景技術：

佐劑是一種能夠增強對疫苗組分抗原特異性免疫應答或改變免疫反應的物質。鋁佐劑是最早被批准用於人類疫苗的佐劑，作為廣泛應用於多種疫苗的佐劑，鋁佐劑具有較高的安全性，價格便宜，免疫應答持續時間長等優點，但同時也具有許多不足之處，如刺激局部產生紅斑，肉芽腫，皮下結節，不能很好的誘導細胞免疫。鋁鹽佐劑在提高抗體水平和安全方面已獲得長期的實踐證實，但其與許多新型疫苗如重組蛋白和亞單位疫苗抗原共同免疫時不能有效的激發免疫應答，使之很難滿足新型疫苗發展的需要。

隨著生物技術的發展，儘管已有大量的新型疫苗佐劑處於研究開發和臨床試驗階段，但是真正獲得批准用於人用疫苗的佐劑屈指可數。

多聚磷酸鹽是廣泛存在於自然界中的線性多聚體，由多個磷酸鹽殘基(pi)通過高能磷酸鍵聚合形成，常以鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等多種形式存在。多聚磷酸鹽作為重要的食品添加劑廣泛應用於食品工業中。近來的研究發現，多聚磷酸鹽還與骨改建和骨代謝關係密切，促進成纖維細胞的增殖和成熟，促進成牙骨質細胞中骨橋蛋白的基因轉錄。

骨橋蛋白(opn)是磷酸化、糖基化的細胞外基質蛋白，是骨形成和骨改建的標誌性蛋白之一。opn刺激骨的礦化，參與細胞免疫應答和組織修復，並與牙周炎和種植體周圍炎相關。多聚磷酸鹽和opn在骨代謝和骨改建中發揮重要的生物學功能。

技術實現要素：

現有疫苗佐劑不能很好的滿足新型疫苗的需求，為解決這一問題，本發明提供一種有效的多聚磷酸鈉佐劑以及含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗劑。

為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下：

多聚磷酸鈉作為疫苗佐劑的應用。

本發明還提供一種含有多聚磷酸鈉的疫苗劑，每單份疫苗劑中含有多聚磷酸鈉0.5mg～1.5mg。

所述的多聚磷酸鈉為市購產品，分子式為分子式為na5p3o10；分子量為367.91。

所述每單份疫苗劑為臨床使用的常規單次注射參考量。

本發明同時提供上述含有多聚磷酸鈉的疫苗劑的製備方法，在抗原劑中加入多聚磷酸鈉，再加生理鹽水至注射所需量，按常規混合均勻，即得含有多聚磷酸鈉的疫苗劑。

所述抗原劑為常規A肝抗原或B肝抗原中的一種。

本發明與現有技術相比，其有益效果為：

（1）本次發明將多聚磷酸鈉應用於疫苗佐劑，拓寬了新型疫苗佐劑的種類；

（2）本發明將多聚磷酸鈉作為疫苗佐劑，多聚磷酸鈉的安全性高，在水中的溶解度較高，可以延緩蛋白的降解而且價格便宜，具有較好的佐劑效應；

（3）本發明提供的多聚磷酸鈉佐劑與B肝亞單位抗原共同免疫，能力有效的激發小鼠體液免疫應答，並且產生抗體水平顯著高於鋁佐劑激發產生的抗體水平。說明多聚磷酸鈉佐劑能與亞單位疫苗抗原共同免疫有效的激發免疫應答。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。

本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用材料或設備未註明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的常規產品。

實施例1

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉0.5mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉0.5mg、A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。該抗原為常規A肝病毒滅活抗原，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供，多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

實施例所得A肝病毒滅活抗原疫苗的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉佐劑組是將實施例1所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及A肝病毒滅活抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－havigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－havigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表1為使用實施例1提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-havigg抗體水平（抗體效價值）。

表1

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-havigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值。

8周、12周、16周多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組與鋁佐劑組的抗體水平相近，表明單一的多聚磷酸鈉0.5mg組具有一定的疫苗佐劑效應。

實施例2

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉1.0mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉1.0mg、A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。該抗原為常規A肝病毒滅活抗原，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供，多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得A肝病毒滅活抗原疫苗的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉組是將實施例2所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及A肝病毒滅活抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－havigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－havigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表2為使用實施例2提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-havigg抗體水平（抗體效價值）。

表2

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-havigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值，此後逐漸下降。4周、8周、12周及16周，多聚磷酸鈉組的抗體水顯著高於無佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05）。12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平顯著高於鋁佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05）。表明單一的多聚磷酸鈉具有較好的佐劑效應且在一定劑量可以優於鋁佐劑組，但是多聚磷酸鈉作為佐劑的持續性較鋁佐劑差。

實施例3

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉1.5mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉1.5mg、A肝病毒滅活抗原、18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。該抗原為常規A肝病毒滅活抗原，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供，多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得A肝病毒滅活抗原疫苗的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉組是將實施例3所得含有佐劑以及A肝病毒滅活抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將A肝病毒滅活抗原18eu與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－havigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗-havigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表3為使用實施例3提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-havigg抗體水平（抗體效價值）。

表3

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-havigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值，此後逐漸下降。12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組但差異不具有統計學意義（p>0.05）。4周、8周、12周、16周，多聚磷酸鈉組的抗體水平均低於鋁佐劑組，表明多聚磷酸鈉的佐劑效應在一定劑量內具有劑量依賴性，達到一定劑量後出現下降，存在最佳劑量。

實施例4

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉0.5mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉0.5mg、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。B肝抗原為常規的含B肝表面抗原1μg，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供。多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得B肝抗原的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉佐劑組是將實施例4所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及B肝抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將B肝抗原與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－hbvigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－hbvigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表4為使用實施例4提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-hbvigg抗體水平（抗體效價值）。

表4

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-hbvigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值。12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05），8周、16周多聚磷酸組的抗體水平高於無佐劑組但差異不具有統計學意義（p>0.05），與鋁佐劑的抗體水平相近，表明單一的多聚磷酸鈉0.5mg組具有一定的疫苗佐劑效應。

實施例5

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉0.75mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉0.75mg、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。B肝抗原為常規的含B肝表面抗原1μg，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供。多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得B肝抗原的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉佐劑組是將實施例5所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及B肝抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將B肝抗原與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－hbvigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－hbvigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表5為使用實施例5提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-hbvigg抗體水平（抗體效價值）。

表5

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-hbvigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值。12周、16周，多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05），4周、8周多聚磷酸組的抗體水平高於無佐劑組但差異不具有統計學意義（p>0.05），4周、12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平與鋁佐劑的抗體水平相近，表明單一的多聚磷酸鈉0.75mg組具有一定的疫苗佐劑效應。

實施例6

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉1.0mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉1.0mg、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。B肝抗原為常規的含B肝表面抗原1μg，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供。多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得B肝抗原的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉佐劑組是將實施例6所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及B肝抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將B肝抗原與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗-hbvigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－hbvigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表6為使用實施例6提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-hbvigg抗體水平。

表6

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-hbvigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值。4周、8周、12周、16周，多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05），12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平顯著高於鋁佐劑組且差異具有統計學意義（p﹤0.05）。4周、8周、16周，多聚磷酸鈉組的抗體水平與鋁佐劑組的抗體水平相近，表明單一的多聚磷酸鈉1.0mg組具有較好的疫苗佐劑效應。多聚磷酸鈉組的抗體水平於12周達到峰值後較鋁佐劑組下降較快，說明多聚磷酸鈉組佐劑效應的持久性較差。

實施例7

本實施例提供的佐劑由下列成分組成：多聚磷酸鈉1.5mg。

本實施例提供的含有多聚磷酸鈉佐劑的疫苗是將多聚磷酸鈉1.5mg、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液。B肝抗原為常規的含B肝表面抗原1μg，由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供。多聚磷酸鈉購於中國醫藥集團上海化學試劑公司。

本實施例所得B肝抗原的免疫試驗和效果如下：

a、免疫

將5～6周齡、18～22g的清潔級icr小鼠分為多聚磷酸鈉佐劑組、氫氧化鋁佐劑組、無佐劑組和空白組，共四組，每組6隻。

多聚磷酸鈉佐劑組是將實施例4所得含有多聚磷酸鈉佐劑以及B肝抗原的疫苗液200μl經背部皮下注射到小鼠體內。

氫氧化鋁佐劑組是將氫氧化鋁300ug、B肝抗原與生理鹽水混合均勻製備成總體積為200μl的疫苗液，經背部皮下注射到小鼠體內。

無佐劑組是將B肝抗原與生理鹽水均勻混合製備成總體積為200μl的疫苗液，再經背部皮下注射到小鼠體內。

空白組；僅對每隻小鼠注射200μl生理鹽水。

免疫方案：在第0周經背部皮下多點注射到小鼠體內，免疫次數為一次。

b、elisa檢測血清抗－hbvigg水平

在免疫後的第4、8、12、16周，採集小鼠尾靜脈血，分離血清，elisa檢測血清抗－hbvigg水平，按kpl公司生產的小鼠iggelisa試劑盒說明書進行檢測操作。

c、數據分析

對所獲得的實驗數據進行單因素方差分析，以（p﹤0.05）認為差異具有統計學意義。

表7為使用實施例7提供的多聚磷酸鈉佐劑後，16周內，各實驗組小鼠血清抗-hbvigg抗體水平（抗體效價值）。

表7

通過數據分析，除空白對照組外，各組小鼠在免疫後第4、8、12、16周，均產生抗-hbvigg，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，於第12周達到峰值。8周、12周、16周，多聚磷酸鈉組的抗體水平高於無佐劑組但差異不具有統計學意義（p>0.05）。12周，多聚磷酸鈉組的抗體水平與鋁佐劑組相近，其餘時間段的抗體水平低於鋁佐劑組且下降較快。表明單一多聚磷酸鈉具有一定的佐劑效應但持久性較鋁佐劑組差。

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。