一種b群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗及其製備方法
2023-11-11 09:22:32 2
專利名稱：一種b群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，更具體的說，本發明涉及一種B群腦膜炎重組蛋 白嵌合疫苗。同時，本發明還涉及所述疫苗的製備方法。
背景技術：
流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)是由奈瑟氏腦膜炎球菌(Nesseria meningitidis) 引起的急性呼吸道傳染病，流腦是細菌性腦脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病，引起相當 高的病死率和致殘率。流腦呈世界範圍分布，全世界流腦的平均年發病率為1 10/10萬， 在流行地區流行期間其年發病率可達500/10萬以上。流腦從病原體的發現至今已超過100 年，目前在世界上許多國家仍未能得到有效控制，仍是世界範圍的一個嚴重公共健康問題。
腦膜炎疫苗是全球兒童常規接種的細菌性疫苗之一。目前，該類疫苗的使用形式 主要是採取多糖或者多糖結合蛋白疫苗兩種形式。由於A、C、W、Y群多糖疫苗的應用，有效 地降低了腦脊髓膜炎的發病率。而B群腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis group B, MenB)莢膜多糖結構因與人體神經細胞黏附分子同源，而不能激發有效的保護性免疫， 因此其多糖不能有效預防B群腦膜炎奈瑟菌的感染。因此，發展通用的蛋白質疫苗勢在必 行。
能作為候選疫苗的具有免疫原性的蛋白質需具備以下特點在大多數菌株中都表 達且結構保守；可誘生殺菌抗體或保護性抗體。現有技術中，研製與應用的有B群外膜囊 泡(OMV)疫苗，其主要包括單價的VA-MENG0C-BC (古巴)、MenBvac (挪威)、MENZBTM (新西 蘭)，以及荷蘭研製出的6價PorA OMV疫苗，此類疫苗有其局限性，只能保護特定型別的B 群Nm。瑞士諾華公司(Novartis)研製的5CVMB疫苗三種主要的抗原為GNA2132、GNA1870、 NadA，另外的兩種抗原為GNA1030、GNA2091，但是此類疫苗也具有菌株的保護性差異。另外 諾華公司研製的FHBP蛋白疫苗，方法是對FHBP進行胺基酸的替換和刪除，已經開始二期臨 床試驗。
當前，國內外B群Nm疫苗研究主要集中於一些特別的外膜蛋白上。其中腦膜炎球 菌外膜上，與腦膜炎球菌致病性密切相關的FHBP (Factor Η-binding Protein)，是一外膜 脂蛋白。由於具有較高的保守性成為了最有希望的MenB候選疫苗抗原之一。FHBP即為為 H因子結合蛋白。因子H是補體替代途徑的關鍵調節子，它在因子I介導的Ob裂解為滅活 片段iC!3b過程中發揮輔助因子作用。也促進替代途徑C3轉化酶C3bBb的衰變。FHBP和 因子H結合可下調替代途徑，從而有利於腦膜炎奈瑟菌生存。根據FHBP胺基酸的差異，可 以將MenB分為VI、V2、V3三個FHBP變異型，變異型內高度保守而變異型間差異較大，針對 FHBP的抗體在變異型內具有保護作用。分析FHBP胺基酸序列發現，FHBP包含有三個結構 域ABC，A結構域在三個變型中是一致的，抗Vl的抗體由B結構域誘導產生，而抗V2或V3 的抗體由位於C結構域174-216位的胺基酸誘導產生。因此，由Vl變異型的全長FHBP和 V2變異型位於C結構域的一段抗原表位組成的融合蛋白(FHBP-C2)能誘發機體產生針對所 有MenB的保護性抗體。
本發明利用基因工程的手段，構建表達純化了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合 疫苗。此融合蛋白(FHBP-C2)大小約為37KD，能誘導機體產生高效價的抗體，並且此抗體 能誘發補體依賴的殺菌反應。另外，由於該蛋白能在大腸桿菌中表達，例如BL21，因而有利 於大規模培養製備。發明內容
本發明的目的在於針對現實狀況的迫切需要，利用基因工程的手段，提供一種B 群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。同時，本發明還提供一種所述重組蛋白嵌合疫苗的製備 方法。該方法所建立的質粒的構建、蛋白的分離純化方法，可以製備數種腦膜炎球菌重組蛋 白嵌合疫苗。
本發明的目通過下述技術方案予以實現。
*除非另有說明，本發明中所採用的百分數均為質量百分數。
A.本發明提供了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，該疫苗由下列成分組 成含有基因工程表達並純化的B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白75000 μ g / ml，氫氧化鋁 佐齊[J Img / ml。
其中，①B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群腦膜炎球菌FHBP蛋白Vl變異型全 長胺基酸序列和V2變異型位於C結構域的一段抗原表位通過Gly-Pr0-Gly連接肽融合而 成；②按照FHBP蛋白的趨異性可以將B群腦膜炎球菌分為三個變異型，該重組蛋白疫苗是 由變異型Vl的全長FHBP與變異型V2的位於174-216位的一段胺基酸(以)連接而成，中 間是一段連接肽Gly-Pro-Gly。
該疫苗選自下述任一胺基酸序列①SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列；②在嚴謹 的雜交條件下與編碼①的胺基酸酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列；SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體後，導入大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達， 表達產物經SDS-PAGE及Western鑑定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的融合蛋白，該融 合蛋白具有SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列。
本發明對所述的B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗進行了蛋白含量的檢測，檢測結果 如下半成品蛋白含量MOOOOyg/ml ； 成品蛋白含量為75mg/ml ； 殺菌力試驗殺菌抗體滴度達到1:32。
B.本發明提供了一種所述的B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的製備方法，該方法採用下 述順序的步驟(1)採用基因工程的方法，搭橋PCR構建含有Vl的全長FHBP和V2變異型的位於C結 構域的一段抗原表位的融合基因片段，中間是一段連接肽基因，即為SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體後，IPTG誘導表達；(2)表達產物經SDS-PAGE及Western鑑定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的蛋白 純度達到90%以上；分子量的大小約為37kD，可以判定為FHBP-C2融合蛋白，具有SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列；該抗原組分在測定蛋白含量後作為半成品疫苗；(3)根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與AL(0H)3以對倍 (V/V)混合，製成實驗性蛋白疫苗，並對其進行檢測；其半成品蛋白含量〉50000μ g/ml，成品 蛋白含量為75mg/ml ；該疫苗即為所需的腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。
本發明所提出的質粒的構建、蛋白的分離純化方法還可用於製備數種腦膜炎球菌 重組蛋白嵌合疫苗。
與現有技術相比，本發明具有下述突出的優點(1)保護率高本發明研製的B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，雖然僅含有FHBP-C2 一個免疫原性的強的蛋白亞單位，但是具有抗三個變異型菌株的抗原表位，因此可以誘發 機體產生針對所有MenB的保護性抗體。
(2)有效性高將本發明研製的人用腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗免疫小鼠， ELISA結果檢測顯示本蛋白疫苗能夠產生很高的抗體效價。充分說明本蛋白疫苗由於含有 一個免疫原性較強的蛋白亞單位，因此能夠誘導機體產生較強的免疫應答效果。
(3)安全性好該融合蛋白相對分子質量相對較小，只保留了具有抗原性的蛋白亞 單位；因此副反應大大降低，具有更好的安全性。
圖1是PCR產物的電泳圖譜；圖中泳道1表示成功擴增出目的基因FHBP，大小約 為 750bp 。
圖2是酶切產物的電泳圖譜；圖中泳道1、2表明融合基因FHBP-C2成功的克隆到 了表達載體pET-30-a上，大小約為900bp。
圖3是第二峰3號管的SDS-PAGE (14%)電泳圖譜，出現一條帶，大小為37KD。
圖4是3號管的Western Blot結果，採用腦膜炎球菌診斷血清作為一抗，可見出 現一條特異性條帶，根據電泳中條帶位置的分子量的大小，可明確為FHBP-C2融合蛋白。
圖5是血清IgG的效價圖，兩次免疫血清IgG滴度15849，實驗組小鼠的抗體水平 較PBS對照組有顯著性差異(P<0. 05)，轉陽率達到100%。證明FHBP-C2能後有效地誘導機 體產生特異性的IgG抗體。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明作進一步詳細說明。應當理解，所描述的具體實施例僅僅用於解釋本發明，並不用於 限定本發明的保護範圍。
實施例1——基因工程菌的構建採用基因工程的方法，搭橋PCR構建含有B群腦膜炎球菌Vl變異型全長FHBP蛋白和 V2變異型的位於C結構域的一段抗原表位的融合基因片段，中間是一段連接肽基因，即為 SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，克隆入pET30a(+)載體後，轉化大腸桿菌DH5a菌株。單 克隆擴增，提質粒用BamH I /EcoR I雙酶切鑑定，篩選陽性克隆，測序。經鑑定序列準確， 融合基因成功的克隆到pET-30-a中。將測序正確的重組質粒pET30-a- FHBP-C2轉化大腸 桿菌BL21 (DE3)，挑取單克隆，接種於5ml LB培養基，37°C培養過夜。再以1%接種量接種到5ml LB培養基中，0D600值達0. 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度100mg/ml，誘導後每小 時取樣，14% SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況，結果顯示誘導劑濃度達到100mg/ml，誘導 時間為6個小時，蛋白表達量最高，選取表達量最高的的單菌落作為發酵用的工程菌種子。
實施例2 ——發酵方法將高表達的工程菌接種到五個三角瓶(每個瓶中300mlLB培養基)，過夜培養，至OD值 達到1. 2時，接種到含15L LB培養基的發酵罐中，優化發酵條件，控制PH在7. 0，連續培養 約4小時，溶氧控制在20%—30%，每過一個小時測其PH和OD值，並通過補加濃氨水調節PH， OD值達到2時，逐級補料，OD值達到4. 5時左右時，開始加誘導劑15ml，誘導後6個小時開 始收菌。
實施例3——目的蛋白的純化將表達優勢菌株發酵擴大培養，收集菌體超聲破菌。分別用TE+300mMNaCl，TE+l%Trit on-x-100, TE+3M尿素依次洗滌，然後先後過CM離子柱和Q-HP離子柱，純度達90%以上，經 SDS-PAGE電泳分析以及Wfesrernblot,分子量的大小約為37kD，確定目的蛋白是FHBP-C2 融合蛋白。其具SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列，目的蛋白經TE+5%甘油+50mMNacl溶液 ( 冊.0)透析241!復性，超濾濃縮；該抗原組分在測定蛋白含量後作為半成品疫苗。如表1 所示，處理後的包涵體液先後過CM柱和Q-HP柱後，採用試管共收集到三個峰。
權利要求
1.一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗，其特徵在於，該疫苗由下列成分組成含有 基因工程表達並純度在90%以上的B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白75000 μ g / ml，氫氧化 鋁佐劑Img / ml ；其中，B群腦膜炎球菌FHBP融合蛋白由B群腦膜炎球菌FHBP蛋白Vl變異型全長氨基 酸序列和V2變異型C結構域抗原表位通過Gly-Pr0-Gly連接肽融合而成。
2.按照權利要求1所述的疫苗，其特徵在於，該疫苗選自SEQID N0:2所示的胺基酸 序列。
3.按照權利要求2所述的疫苗，其特徵在於，該疫苗選自下述核苷酸序列在嚴謹的雜 交條件下與編碼的SEQ ID N0:2所示的胺基酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的胺基酸序 列。
4.按照權利要求3所述的疫苗，其特徵在於，具有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
5.一種含有權利要求4的任意一項所述核苷酸序列的表達載體。
6.一種含有權利要求5的表達載體的宿主細胞。
7.一種B群腦膜炎球菌蛋白嵌合疫苗的製備方法，其特徵在於，該方法採用下述順序 的步驟(1)採用基因工程的方法，搭橋PCR構建含有B群腦膜炎球菌FHBPVl變異型的全長 胺基酸序列和FHBP V2變異型的C結構域融合而成的基因片段，克隆入pET30a(+)載體後， IPTG誘導表達；(2)表達產物經SDS-PAGE及Western鑑定分析，鎳離子親和層析柱純化，獲得的蛋白純 度達到90%以上；分子量的大小約為37kD，與B群腦膜炎球菌抗血清特異結合，可以判定為 FHBP-C2融合蛋白；該抗原組分在測定蛋白含量後作為半成品疫苗；(3)根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與AL(OH)3以對倍 (V/V)混合，製成實驗性蛋白疫苗，並對其進行檢測；其半成品蛋白含量>50000μ g/ml，成 品蛋白含量為75mg/ml ；該疫苗即為所需的腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。
8.權利要求7所述的質粒的構建、蛋白的分離純化方法在製備數種腦膜炎球菌重組蛋 白嵌合疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗及其製備方法。系採用搭橋PCR構建含有B群腦膜炎球菌V1變異型全長FHBP蛋白和V2變異型的位於C結構域的一段抗原表位的融合基因片段，克隆入pET30a(+)載體後，IPTG誘導表達，表達產物經層析柱純化，獲得的融合蛋白純度達到90%以上。該融合蛋白在經SDS-PAGE及Western鑑定分析、蛋白含量等測定後作為半成品疫苗。根據半成品疫苗蛋白濃度，以生理鹽水稀釋至150mg/ml，同時與氫氧化鋁佐劑製成所需的B群腦膜炎球菌重組蛋白嵌合疫苗。免疫小鼠後，能引起較高的FHBP特異抗體和血清殺菌抗體，顯示該疫苗能對B群腦膜炎球菌起到較好的預防作用。
文檔編號A61P31/04GK102028941SQ20101061013
公開日2011年4月27日 申請日期2011年2月11日 優先權日2011年2月11日
發明者姬秋彥, 彭世澤, 徐維明, 李健峰, 李智華, 畢研偉, 高丹丹 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所