用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針及其檢測方法
2023-11-10 23:06:22 2
專利名稱：用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及的是一種食品安全技術領域的方法，具體是一種採用螢光能量共振現象監測重金屬離子作為輔助因子使核酸分子發生水解反應後的結構變化而用於定性定量檢測金屬離子的方法，適用於有害重金屬快速檢測研究。
背景技術：
重金屬鉛汙染具有隱蔽性、表聚性與不可逆性等特點，不僅影響農作物的生長發育、產量、品質等，而且通過食物鏈對人體健康造成嚴重的危害，尤其是最近一段時間，我國相繼發生了幾起與重金屬鉛汙染相關的公共衛生事件，讓人們對環境鉛汙染更加關注。鉛的傳統的檢測技術要麼費時費力，要麼價格昂貴，都難以滿足環境與食品安全監控的需求，因此，建立方便、快速的重金屬檢測技術十分必要。核酸分析方法用於病原檢測的已經比較多，但是將其用於環境汙染物檢 測方面的研究還不多見。本研究中所用的核酸一8-17脫氧核酶(DNAzyme8-17)是一種反式寡核苷酸,一個單鏈的DNA片段、非蛋白質、非生物體組成成分，具有分子量小，穩定性高，易人工合成，與其靶RNA配對的精確性高，但是需要特定的金屬離子作為輔助因子才能發生水解。經研究發現在鉛離子是使DNAzymeS-17發生水解的輔助因子，而其他的金屬離子則使DNAzymeS-17的雙鏈結構產生摺疊，用螢光基團DNAzyme8-17，根據螢光基團的螢光變化來反應核酸的結構變化情況，用來檢測鉛離子。經過對現有技術的檢索發現，戢太雲徐魯榮周培在《核酸螢光探針檢測鉛離子的研究》(核酸螢光探針檢測鉛離子的研究，2010年I期)中公開了一種方法，將8-17DNAzyme增加2個〃G-C〃鹼基對進行增強熱穩定性的結構修飾，並標記上I個螢光基團〃FAM〃和2個螢光猝滅基團"Dabcyl"，設計成雙猝滅Pb2+螢光探針.研究了該探針對Cd2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+6種二價金屬離子的響應，結果表明探針對Pb2+具有很強的特異性，在探針濃度為2.5X l(T7mol/L時，Pb2+濃度在8.5X 1(T8 7.5X l(T6mol/L範圍內和探針的螢光強度呈線性關係，檢出限為8.5X10_8mol/L.該探針可用於Pb2+的定性和定量檢測。但該探針的穩定性無法達到現有檢出要求。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針及其檢測方法，將核酸分析法結合發光方法，用於重金屬鉛的檢測。其檢測過程簡單快速，為是否需要進行後續的精準檢測提供依據，為加強我國環境和食品安全控制和監督提供技術支撐。本發明是通過以下技術方案實現的:本發明涉及一種用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針，即DNAzymeS-17螢光探針，其DNA序列由以下:A) 5』 -FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3』，以及B) 3' -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5』 所組成。
本發明涉及上述探針的製取方法，通過用DNA/RNA合成儀分別合成設計好螢光標記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，將酶:底物:水=1:1:78的體積比配成的混合液置於PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解後過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產物，得到雙鏈螢光探針。本發明涉及一種基於上述探針的重金屬鉛快速定性檢測方法，通過對比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的螢光強度，得到所述探針對於鉛離子的特異性結果，並通過螢光強度變化實現Pb2+的定性檢測。本發明涉及一種基於上述探針的重金屬鉛快速定量檢測方法，通過對探針中加入已知濃度的Pb2+，並且在260nm處掃描螢光強度，從而構建出Pb2+濃度與螢光強度之間的線性關係曲線；隨後將待測樣品在260nm處掃描出的螢光強度值帶入線性關係曲線，從而得到Pb2+的濃度並實現定量檢測。本發明原理在於:基於DNAzymeS-17在Pb2+的輔助作用下，會從其水解位點處發生水解反應，導致DNAzyme8-17的雙鏈結構發生改變，而其他的金屬離子卻不能作為輔助因子促使DNAzyme8-17發生水解反應。
技術效果與現有技術相比，本發明通過改進的核酸螢光探針，不僅不受檢測的環境溫度必須控制在4°C以內的約束，在室溫下就可以進行；並且通過雙淬滅設計實現對更低濃度的鉛離子的檢出。操作簡單、快速。
圖1為本發明改進探針的結構示意圖。圖2為本發明不同Pb2+濃度下螢光強度變化趨勢示意圖。圖3為實施例探針的特異性示意圖。圖4為Pb2+濃度與螢光強度間的線性關係示意圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1本實施例包括以下步驟:1)用DNA/RNA合成儀分別合成設計好螢光標記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，
將酶:底物冰=1:1:78的體積比配成的混合液置於PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解後過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產物，得到DNA序列如圖1所示的雙鏈螢光探針；然後將紫外分光光度計260nm處OD=L 000濃度的，雙鏈探針ImL分別在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30V六個溫度下避光放置3小時。2)在室溫下將5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無菌水490 u L均勻混合，掃描探針的背景螢光強度；隨後分別取40ii L濃度為5.0X10_6mol/L的鎘、鋅、鎂、銅、錳、鉛6種二價金屬鹽的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無菌水450 u L均勻混合的探針溶液中，掃描螢光強度；根據探針中加入不同的金屬離子以後的螢光強度變化，確定探針對Pb2+的特異性，從而實現Pb2+的快速定性檢測。3)將螢光探針的初始濃度設計為2.5X10_7mol/L、l.25X 10_7mol/L兩個濃度梯度，Pb2+的初始濃度設計為 1.0Xl(T5mol/L、7.5X 10_6mol/L、5.0X 10_6mol/L、2.5Xl(T6mol/LU.25X l(T6mol/L、l.0X l(T6mol/L、5.0X l(T7mol/L、2.5 X l(T7mol/L、1.25 X l(T7mol/L、
1.0X 10_7mol/L10個濃度梯度，室溫下向10 ii L探針與450 u L超純水混合液中分別滴加40 u L各濃度的Pb2+溶液，檢測各濃度樣品對應的螢光強度，並以Pb2+的ii M濃度為橫坐標x，260nm處掃描出的螢光強度為縱坐標y，得到如圖4所示的線性關係曲線為:I y M以下的曲線為y=118.llx+57.268 ;luM以上的曲線為y=96.68x+82.37 ;由此實現探針對Pb2+定量檢測。4)在自來水中添加Pb (NO3) 2標準溶液，配製成濃度為1.5 X l(T7mol/L、
7.5X 10_7mol/L、l.5X10_6mol/L的樣品溶液。為了避免自來水中雜質對測定結果的幹擾，配製的樣品溶液先用0.45 ii m和0.22 ii m的微孔濾膜過濾除去雜質。然後用0.25 ii M探針檢測，根據標準曲線計算出對應濃度，通過計算出的Pb2+濃度平均值除以添加濃度，得出添加回收率，從而驗證此方法的準確性。同時用火焰原子吸收光譜測定添加回收率，通過與常規檢測方法的對比，說明此方法用來檢測Pb2+濃度的可行性。螢光核酸探針檢測自來水中鉛的添加回收率以及FAAS檢測自來水中鉛的添加回收率如下所示:探針檢測結果FAAS檢測結果的比較
權利要求
1.一種用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針，其特徵在於，其DNA序列由以下:A)5』-FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3'，以及B)3』 -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5』 所組成。
2.一種製備權利要求1所述探針的方法，其特徵在於，用DNA/RNA合成儀分別合成設計好螢光標記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，將酶:底物:水=1:1:78的體積比配成的混合液置於PCR儀中95°C退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解後過ZipTipC18微量層析柱回收雙鏈產物，得到雙鏈螢光探針。
3.一種基於權利要求1所述探針的重金屬鉛快速定性檢測方法，通過對比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的螢光強度，得到所述探針對於鉛離子的特異性結果，並通過螢光強度變化實現Pb2+的定性檢測。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵是，所述的定性檢測是指:在室溫下將5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無菌水490 u L均勻混合，掃描探針的背景螢光強度；隨後分別取40 y L濃度為5.0X 10_6mol/L的鎘、鋅、鎂、銅、錳、鉛6種二價金屬鹽的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探針溶液10 u L、超純無菌水450 u L均勻混合的探針溶液中，掃描螢光強度；根據探針中加入不同的金屬離子以後的螢光強度變化，確定探針對Pb2+的特異性，從而實現Pb2+的快速定性檢測。
5.一種基於權利要求1所述探針的重金屬鉛快速定量檢測方法，通過對探針中加入已知濃度的Pb2+，並且在260nm處掃描螢光強度，從而構建出Pb2+濃度與螢光強度之間檢測體系及其線性關係曲線；隨後將待測樣品在260nm處掃描出的螢光強度值帶入線性關係曲線，從而得到Pb2+的濃度並實現定量檢測。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵是，所述的探針對不同濃度的特異性的含有不同濃度的Pb2+離子的檢測體系是指:將螢光探針的初始濃度設計為2.5X10_7mOl/L、1.25X10_7mol/L 兩個濃度梯度，Pb2+ 的初始濃度設計為 1.0X l(T5mol/L、7.5Xl(T6mol/L、5.0X l(T6mol/L、2.5 X l(T6mol/L、1.25 X l(T6mol/L、1.0 X l(T6mol/L、5.0 X l(T7mol/L、2.5Xl(T7mol/L、l.25X 10_7mol/L、1.0X 10_7mol/L10 個濃度梯度，室溫下向 IOy L 探針與450 u L超純水混合液中分別滴加40 ii L各濃度的Pb2+溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵是，所述的線性關係曲線是指:以Pb2+的PM濃度為橫坐標x，260nm處掃描出的螢光強度為縱坐標y，得到IyM以下的曲線為y =118.llx+57.268 ；luM 以上的曲線為 y=96.68x+82.37。
全文摘要
一種食品安全技術領域的用於重金屬鉛的快速檢測的核酸螢光探針及其檢測方法，通過對比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的螢光強度，得到所述探針對於鉛離子的特異性結果，並通過螢光強度變化實現Pb2+的定性檢測；通過對探針中加入已知濃度的Pb2+，並且在260nm處掃描螢光強度，從而構建出Pb2+濃度與螢光強度之間檢測體系及其線性關係曲線；隨後將待測樣品在260nm處掃描出的螢光強度值帶入線性關係曲線，從而得到Pb2+的濃度並實現定量檢測。本發明檢測過程簡單快速，為是否需要進行後續的精準檢測提供依據，為加強我國環境和食品安全控制和監督提供技術支撐。
文檔編號C12N15/11GK103160504SQ20131006618
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者周培, 邢海波, 戢太雲, 詹學佳 申請人:上海交通大學