一株豬鼻支原體菌株、疫苗組合物及其製備方法和應用的製作方法
2023-12-03 09:14:01 2
一株豬鼻支原體菌株、疫苗組合物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一株支原體屬豬鼻支原體LYH株，以及由該豬鼻支原體LYH株製備的疫苗組合物，尤其是一種包括豬鼻支原體、豬肺炎支原體的疫苗組合物。該疫苗組合物可以有效防治豬鼻支原體、豬肺炎支原體單獨感染或混合感染引起的豬地方流行性肺炎（SEP），尤其在混合感染情況下，該疫苗組合物的免疫效果明顯超過各單苗的免疫效果。CCTCC NO：V 2013342013.08.20CCTCC NO：M 20122302012.06.13
【專利說明】一株豬鼻支原體菌株、疫苗組合物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株新的豬鼻支原體菌株、疫苗組合物，以及其製備方法和應用，屬於 獸用疫苗領域。
【背景技術】
[0002] 豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis，Mhr)是小豬上呼吸道中的常見寄生病原 (Ross and Young於1993年檢測），在豬群中檢出率高，單獨並不致病。Switzer於1953、 1954U955年先後分離到該支原體，並對其正式命名為豬鼻支原體（Mhr)。豬鼻支原體 (Mhr)的感染主要通過呼吸道傳播，通常是由母豬或大豬傳給小豬。和豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp) -樣，豬鼻支原體能夠粘附到呼吸道的纖毛上皮細胞， 破壞纖毛屏障造成其他細菌繼發感染引起豬肺炎、多發性漿膜炎、關節炎、咽鼓管炎、耳炎、 結膜炎等。目前對該病原的預防還未有疫苗產品上市，加之不同地方分離的菌株致病性差 異明顯，篩選合適的疫苗株變得極其困難。
[0003] 豬喘氣病又稱豬支原體肺炎或豬地方流行性肺炎（SEP)，是由豬肺炎支原體引起 的一種接觸性慢性呼吸道傳染病，普遍存在於世界各地。患病豬主要表現為咳嗽和氣喘，生 長遲緩，飼料轉化率低，體溫基本正常。解剖時以肺部病變為主，尤以兩肺心葉、尖葉、膈葉 和中間葉出現"胰樣變"和"肉樣變"為其特徵。本病發病率高，死亡率低，主要危害是使豬 群生長受阻和飼料轉化率大幅下降，並能引起繼發感染，是造成養豬經濟損失最重要的疾 病之一。在國內養殖場中豬肺炎支原體、豬鼻支原體往往混合感染，某些豬鼻支原體菌株會 促進豬地方流行性肺炎的發生。此外，有研究者在一起免疫豬肺炎支原體疫苗後感染豬地 方流行性肺炎的病理解剖中僅分離到了豬鼻支原體，通過進一步的人工感染試驗證實，意 外地發現豬鼻支原體可以單獨引發豬地方流行性肺炎。
[0004] 臨床發現，豬鼻支原體的感染率在呈逐年增加趨勢。為此，急需開發一種豬鼻支原 體疫苗，用來預防豬鼻支原體病原，尤其是預防豬鼻支原體引起的豬地方流行性肺炎。
【發明內容】
[0005] 為解決現有技術的不足，本發明提供了一種支原體屬豬鼻支原體分離株，名稱為 支原體屬豬鼻支原體LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH)，其保藏編號為CCTCC No. V201334,保藏於中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，保藏日 期：2013年8月20日。
[0006] 本發明中所用術語"支原體屬豬鼻支原體"也簡稱為"豬鼻支原體"。
[0007] 類似的，本發明中所用術語"支原體屬豬鼻支原體LYH株"也簡稱為"豬鼻支原體 LYH 株"。
[0008] 本發明還提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的豬鼻支原體抗原以 及藥學上可接受的載體。所述藥學上可接受的載體包括防腐劑、稀釋劑、佐劑。
[0009] 優選地，所述豬鼻支原體抗原為含有豬鼻支原體LYH株或其培養物的減毒全菌抗 原、滅活全菌抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。所述疫苗組合物為含有豬鼻 支原體LYH株或其培養物的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗或基因工程疫 苗。
[0010] 優選地，所述疫苗組合物包含佐劑，所述佐劑為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、 GelOl、蜂膠、ISA206、ISA760VG。更優選地，所述佐劑為卡波姆、GelOl、ISA206、ISA760VG。 進一步優選地，所述佐劑為卡波姆、GelOl。最優選地，所述佐劑為GelOl。
[0011] 優選地，所述佐劑在疫苗組合物中為10?60% (v/v)。
[0012] 優選地，在所述疫苗組合物中，所述豬鼻支原體含量為1〇8?KTCXU/ml。更優選 地，在所述疫苗組合物中，所述豬鼻支原體含量為4. 5X 108(XU/ml。
[0013] 本發明所用的術語"培養物"是豬鼻支原體的不同代次傳代培養物，本領域技術人 員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會發生微小的變異。
[0014] 本發明所用的術語"疫苗"或"疫苗組合物"可互換使用，其是指包含至少一種在 動物中誘導免疫應答的免疫原性組合物的藥物組合物。
[0015] 本發明所用的術語"活疫苗"指的是以毒力已經減弱但仍可在宿主體內或細胞上 複製的病原體製備的疫苗。本發明所用的術語"減毒"用於指以使病原喪失致病性、但保持 免疫原性的方式對基因進行突變來人工降低病原體毒性。通常，通過UV輻射、化學處理或 體外連續高階繼代培養實現減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失 以使毒力減弱。
[0016] 本發明所用的術語"滅活疫苗"，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原以產生免疫力 的滅活病原體的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可 以很容易地產生滅活疫苗。例如，通過用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解 型疫苗可在用醚處理後由病毒包膜製備得到。
[0017] 本發明所用的術語"亞單位疫苗"指的是利用基因工程方法將病原體的保護性抗 原基因克隆到原核或真核表達系統中，使其高效表達而製成的疫苗。它比全病毒疫苗引起 副反應的可能性小。
[0018] 本發明所用的術語"合成肽疫苗"指的是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用 人工方法按天然蛋白質的胺基酸順序合成保護性短肽，與載體連接後加佐劑所製成的疫 苗。
[0019] 本發明的另一個目的在於提供所述疫苗組合物在製備預防和治療豬鼻支原體相 關疾病的藥物中的應用。
[0020] 本發明所用術語"豬鼻支原體相關疾病"用於指由豬鼻支原體感染引起的疾病。它 的例子包括隱性感染、繼發感染豬鼻支原體引起的相關症狀，包括豬地方流行性肺炎等，但 不限於此。
[0021] 本發明所用術語"預防"指通過給予根據本發明的疫苗組合物抑制豬鼻支原體感 染或推遲疾病發作的所有行為。術語"治療"指通過給予根據本發明的疫苗組合物使豬鼻 支原體感染引起的症狀減輕或轉好的所有行為。
[0022] 此外，本發明的疫苗組合物可與其他失活病原體或抗原組合使用以製備抵抗包括 豬鼻支原體感染在內的各種疾病的聯合疫苗或複合疫苗。
[0023] 本發明所用術語"聯合疫苗"用於指從本發明的豬鼻支原體與至少一種不同支原 體的支原體混合物製備的疫苗。術語"複合疫苗"指的是由本發明的豬鼻支原體與病毒或 /和細菌混合或組合製備的疫苗。
[0024] 本發明的又一主要目的在於提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免 疫量的豬鼻支原體抗原、免疫量的豬肺炎支原體抗原和藥學上可接受的載體。所述藥學上 可接受的載體包括防腐劑、稀釋劑、佐劑。
[0025] 優選地，所述豬鼻支原體抗原為豬鼻支原體或其培養物的減毒全菌抗原、滅活全 菌抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體 其培養物的減毒全菌抗原、滅活全菌抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0026] 本發明所用術語"豬鼻支原體抗原"是指由豬鼻支原體分離株製備的抗原，所述抗 原接種豬可誘導、刺激或增強抗豬鼻支原體感染的免疫應答。優選地，所述豬鼻支原體抗原 包括減毒的活的豬鼻支原體抗原、滅活的豬鼻支原體抗原、含豬鼻支原體的免疫原性氨基 酸序列的亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
[0027] 本發明所用術語"豬肺炎支原體抗原"是指包含至少一種在對豬給藥後能誘導、刺 激或增強抗豬支原體肺炎的免疫應答的抗原的任何組合物。優選地，所述豬肺炎支原體抗 原為滅活的豬肺炎支原體抗原、改良的活的或減毒的豬肺炎支原體抗原，含豬肺炎支原體 的免疫原性胺基酸序列的亞單位抗原，或含豬肺炎支原體的免疫原性胺基酸序列的多肽或 基因工程抗原。
[0028] 優選地，所述疫苗組合物中豬鼻支原體為支原體屬豬鼻支原體LYH株；豬肺炎支 原體為豬肺炎支原體HN0613。
[0029] 本發明所述支原體屬豬鼻支原體LYH株（Mycoplasma hyorhinis strain LYH)， 保存於中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO : V201334,保藏日期為2013年08月20日。
[0030] 本發明所述豬肺炎支原體 HN0613(Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)， 系本實驗室分尚，保存於中國典型培養物保減中心（CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，保 藏號為CCTCC NO :M2012230,保藏日期為2012年6月13日。
[0031] 本發明所述豬肺炎支原體還可以用以下豬肺炎支原體中的一種或幾種：如勃林 格殷格翰公司的lngelvaC?M.hy〇 (J株）；哈藥集團公司的Respisure和RespisureOne (p-5722-3株）；美國先靈葆雅的Myco Silencer? (J株）；西班牙海博萊生物大藥廠的 MYPRAVAC sns (J株）；美國普泰克公司的MycoGard (P株）；美國輝瑞公司的RespiFend ΜΗ (P-5722-3株）；梅裡亞動物保健公司的豬克喘（BQ14株)。
[0032] 優選地，所述疫苗組合物中豬鼻支原體抗原和豬肺炎支原體抗原的比例為l:l(v/ V)。
[0033] 優選地，所述疫苗組合物中豬鼻支原體抗原含量為滅活前108?K^CXU/ml ;豬肺 炎支原體抗原含量為滅活前1〇8?KTCXU/ml。
[0034] 更優選地，所述疫苗組合物中所述豬鼻支原體抗原為滅活前4. 5 X108(XU/ml的滅 活豬鼻支原體LYH株全菌抗原，所述豬肺炎支原體抗原為滅活前4. 5X108CCU/ml的滅活豬 肺炎支原體HN0613全菌抗原；或
[0035] 所述豬鼻支原體抗原為滅活前KTCCU/ml的滅活豬鼻支原體LYH株全菌抗原，所 述豬肺炎支原體抗原為滅活前l〇lclCCU/ml的滅活豬肺炎支原體HN0613全菌抗原。
[0036] 優選地，所述疫苗組合物包括佐劑，所述佐劑為氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、 GelOl、蜂膠、ISA206、ISA760VG。更優選地，所述佐劑為卡波姆、GelOl、ISA206、ISA760VG。 進一步優選地，所述佐劑為卡波姆、GelOl。最優選地，所述佐劑為GelOl。
[0037] 優選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中為10?60%(v/v)。
[0038] 本發明的另一目的在於提供一種製備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：
[0039] 1)培養增殖所述豬鼻支原體菌液，濃縮、滅活；
[0040] 2)培養增殖豬肺炎支原體菌液，濃縮、滅活；
[0041] 3)按比例混合所述兩種抗原液，添加藥學上可接受的載體，混勻。
[0042] 本發明又一目的在於提供所述疫苗組合物在製備預防和治療豬地方流行性肺炎 (SEP)的藥物中的應用。
[0043] 本發明提供了一種豬鼻支原體分離株以及由其製備的疫苗組合物。該豬鼻支原體 分離株製得的疫苗組合物對引起豬地方流行性肺炎的豬鼻支原體顯示出顯著的免疫特性。 [0044] 此外，本發明還提供了一種含豬鼻支原體、豬肺炎支原體的疫苗組合物及其製備 方法和應用。該疫苗組合物具有以下優點：
[0045] 1)本發明研究過程中意外發現豬鼻支原體單獨感染可引發豬地方流行性肺炎 (SEP)，而豬鼻支原體、豬肺炎支原體往往混合感染，具有明顯的協同作用，本發明的含有豬 鼻支原體抗原、豬肺炎支原體抗原的疫苗組合物可以有效防治豬鼻支原體、豬肺炎支原體 單獨感染或混合感染引起的豬地方流行性肺炎；在發生混合感染時，該疫苗組合物的免疫 效果明顯超過注射豬鼻支原體疫苗單苗或豬肺炎支原體疫苗單苗的免疫效果，可以顯著提 升SEP的防控效果，更適合於臨床應用。
[0046] 2)本發明的含豬鼻支原體抗原、豬肺炎支原體抗原的疫苗組合物，在對豬注射免 疫過程中，豬體的應激反應出人預料地小，且為一針劑注射，因此，本發明的疫苗組合物副 反應小、安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現的不良反應；同時具有簡化免疫程序、降 低免疫成本、更加經濟可靠、生產工藝簡單等優點。
[0047] 3)含有兩種或兩種以上抗原、可以預防兩種或兩種以上疾病的聯合疫苗以其方 便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點。與單一疫苗相比，本發明提供的含豬鼻支原 體抗原、豬肺炎支原體抗原的聯合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到 全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、儲存乃至全部使用過程均需在較低溫度下 進行，即所謂的"冷鏈"，這種環環相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用 聯合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優越性。
【具體實施方式】
[0048] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0049] 本發明中的術語"頭份"是指每頭豬注射的疫苗量。
[0050]本發明中所述的 "TCID5(I"（50%tissue culture infective dose)是指半數細胞 培養物感染量，是表不病毒感染力的一種表不方式。
[0051] 實施例1、豬鼻支原體疫苗組合物的製備
[0052] 1.菌(毒）株的來源
[0053] 支原體屬豬鼻支原體LYH株，系本實驗室分離，保存於中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，保藏號為CCTCC NO :V201334,保藏日期為2013年08月 20臼。
[0054] 2.豬鼻支原體疫苗半成品的製備及檢驗
[0055] 2. 1生產用種子的製備
[0056] 將豬鼻支原體LYH株凍幹菌種按10%接種液體培養基，置37°C培養1?3日，待培 養基顏色變黃，pH值下降至6. 8?7. 0時收穫菌液作為一級種子。
[0057] 將一級種子按5%接種液體培養基，置37°C培養1?3日，待培養基顏色變黃，pH 值下降至6. 8?7. 0時收穫菌液作為二級種子。
[0058] 液體培養基的配方（按1065ml計）：牛心浸出液300ml，ddH20360ml，校正pH值到 7. 4, 121°C滅菌15分鐘。再加入下列過濾除菌的成份：Hank' s平衡鹽溶液（10X)40ml， 0. 25%酚紅10ml馬血清200ml，5%水解乳蛋白100ml，25%酵母浸出液20ml，10000IU/ml青 黴素10ml，1%醋酸鉈溶液25ml。
[0059] 固體培養基的配方：在液體培養基中加入15g Noble Agar (純化瓊脂，終濃度為 1. 4%)即可。
[0060] 2. 2制苗用菌液的製備
[0061] 將豬鼻支原體二級種子液按5%?10%(v/v)接種於液體培養基中。37°C下培養 1?3日，待液體培養基顏色變黃，pH值下降至6. 8?7. 0時收穫菌液。
[0062] 2. 3含量測定
[0063] 將待檢豬鼻支原體菌液用Friis培養基進行10倍系列稀釋，即0. 2ml待檢菌液加 入裝有1. 8mlFriis培養基的西林瓶中混勻，然後連續稀釋成ΚΓ1至10_12,並設Friis培養 基作為對照。待檢樣品設2個重複。置37°C培養7日，每日觀察Friis培養基顏色變化，在 空白對照顏色不變的情況下，稀釋培養物顏色變黃並呈輕度均一渾濁的最高稀釋度為待測 菌液的C⑶滴度。取2個重複的平均值。
[0064] 2. 4濃縮和含量測定
[0065] 將制苗用豬鼻支原體菌液用密理博（Millipore公司）膜包(分子截留量為lOOKda 道爾頓）進行濃縮，活菌計數。製備的豬鼻支原體濃縮抗原滅活前含量為l〇nCCU/ml。
[0066] 2. 5 滅活
[0067] 取合格的豬鼻支原體菌液，按菌液體積總量緩慢加入終濃度為0. 2% (v/v)的甲醛 溶液，置37°C滅活24小時，每隔3?4小時攪拌一次。
[0068] 3疫苗的配製
[0069] 3. 1防腐劑的配製
[0070] 1% (w/v)的硫柳汞（國藥集團化學試劑有限公司20130508)水溶液
[0071] 3. 2稀釋劑的配製
[0072] 無菌的PBS (0· 01Μ，ρΗ=0· 02)緩衝溶液：在900ml純化水內溶解8g氯化鈉、0· 25g 氯化鉀、3. 63g磷酸氫二鈉、0. 24g磷酸二氫鉀，然後定容至1L，121°C高壓滅菌30min備用。
[0073] 3. 3佐劑的配製
[0074] GelOl (法國 SEPPIC 公司 20130302)，121°C高壓滅菌 30min 備用。
[0075] 3· 4 配苗
[0076] 取上述製備的豬鼻支原體濃縮滅活抗原，用無菌PBS(0. 01mol/L，pH值7· 2?7· 4) 稀釋至所需體積，然後將抗原液與GelOl佐劑按90:10 (ν/ν)混合，以500r/min攪拌30分 鍾，結束前加入終濃度為〇. 01%的硫柳汞即可。
[0077] 各豬鼻支原體疫苗的配比如表1所示。
[0078] 表1各豬鼻支原體疫苗的配比
[0079]
【權利要求】
1. 一種豬鼻支原體，所述豬鼻支原體為保藏號為CCTCC NO.V201334的支原體屬豬鼻 支原體LYH株，保藏於中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，保藏日 期：2013年8月20日。
2. -種疫苗組合物，其特徵在於，所述疫苗組合物包括免疫量的豬鼻支原體抗原以及 藥學上可接受的載體。
3. 根據權利要求2所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體抗原為含有豬鼻 支原體LYH株或其培養物的減毒全菌抗原、滅活全菌抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因 工程抗原。
4. 一種疫苗組合物，其特徵在於，所述疫苗組合物包括免疫量的豬鼻支原體抗原、免疫 量的豬肺炎支原體抗原和藥學上可接受的載體。
5. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體抗原為豬鼻支原 體或其培養物的減毒全菌抗原、滅活全菌抗原、亞單位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原； 所述豬肺炎支原體抗原為豬肺炎支原體其培養物的減毒全菌抗原、滅活全菌抗原、亞單位 抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。
6. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體為豬鼻支原體LYH 株，所述豬肺炎支原體為豬肺炎支原體HN0613。
7. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體抗原和豬肺炎支 原體抗原的比例為1:1 (v/v)。
8. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體抗原含量為滅活 前108?K^CXU/ml ;所述豬肺炎支原體抗原含量為滅活前108?K^CXU/ml。
9. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述豬鼻支原體抗原為滅活前 4.5X108CCU/ml的滅活豬鼻支原體LYH株全菌抗原，所述豬肺炎支原體抗原為滅活前 4. 5X 108CCU/ml的滅活豬肺炎支原體HN0613全菌抗原；或所述豬鼻支原體抗原為滅活前 KTCCU/ml的滅活豬鼻支原體LYH株全菌抗原，所述豬肺炎支原體抗原為滅活前KTCCU/ml 的滅活豬肺炎支原體HN0613全菌抗原。
10. 根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述疫苗組合物包括佐劑，所述 佐劑包括氫氧化鋁膠、礦物油、卡波姆、GelOl、蜂膠、ISA206、ISA760VG。
11. 一種製備權利要求4?10任一項所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： 1) 培養增殖所述豬肺炎支原體菌液，滅活； 2) 培養增殖所述豬鼻支原體菌液，滅活； 3) 按比例混合所述兩種抗原液，添加藥學上可接受的載體，混勻。
12. 如權利要求4?10任一項所述的疫苗組合物在製備預防和治療豬地方流行性肺炎 (SEP)的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K39/116GK104250623SQ201310706685
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】張許科, 孫進忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司