一種天然防腐劑的工業化純化工藝的製作方法
2023-12-05 18:00:46 2
專利名稱：一種天然防腐劑的工業化純化工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種天然防腐劑純化工藝，具體的說涉及乳酸鏈球菌素工業化純化工藝。
背景技術：
乳酸鏈球菌素又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽，英文名為Nisin，是N型血清的某些乳酸鏈球菌在代謝過程中合成和分泌的具有很強殺菌作用的小肽。Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的細菌，特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。另外，Nisin還可以和某些絡合劑(如EDTA或檸檬酸)等一起作用，可是只有部分革蘭氏陰性菌對之敏感。Nisin的在食品防腐和化妝品中都有應用，但其純度較低。如果要進一步藥用就必須解決其純度的問題。
J.Meghrous等研究了Nisin的純化工藝，文章發表於Journal of AppliedMicrobiology 1997，83，133-138，但是他的純化工藝步驟多，總共需要4步純化，而且純化得率太低，純化總得率僅為3-6％。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種乳酸鏈球菌素純化工藝，以克服現有技術存在的純化得率低的缺陷，滿足有關下遊產品開發的需要。
本發明的方法包括如下步驟(1)上樣將用預冷的無菌水稀釋至電導為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品以每小時200～400釐米的流速通過預先用緩衝液平衡好層析柱；所說的樣品為含乳酸鏈球菌素(nisin)的乳酸鏈球菌培養上清；所說的層析柱採用的介質是顆粒大小為100～300μm的強陽離子瓊脂糖凝膠(由安瑪西亞生物技術有限公司生產，商品名為SP Sepharose BigBead)；
(2)清洗用10～50mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩衝液，以每小時80～200釐米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測保證層析柱已清洗至基線；(3)洗脫用含0.5～1mol/L氯化鈉的10～15mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩衝液，以每小時8～20釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫並收集洗脫峰。
上述步驟亦稱為離子交換層析，其中緩衝液平衡層析柱包括如下步驟用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液平衡裝有適量體積的SP Sepharose BigBead介質的層析柱，以每小時80～200釐米的流速平衡5～10個柱體積，通過紫外檢測保證層析柱已平衡至基線。
上述步驟的活性多肽回收率為75％～85％；純化後樣品的純度可以達到68.83％，多肽純化倍數為14以上，此方法的優點是處理速度快、處理量大、凝膠載樣量大、濃縮效果好、回收率高及重複性好等，含一定量的色素。因此按照本發明優選的方案，還包括如下的反向高效液相色譜的純化步驟(1)樣品預處理在上述的層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液，使得稀釋後的樣品可以直接上樣；所說的層析洗脫液為離子交換層析過程中洗脫並收集到的洗脫峰所得到的液體。
(2)上樣以每小時20～60釐米的流速將預處理後的洗脫液通過預先用0.1％TFA平衡好的高效液相色譜柱；所說的高效液相色譜柱採用的介質是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18矽膠填料(富士公司提供)；(3)清洗用含有濃度為0.1％TFA的水溶液，以每小時20～60釐米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測保證層析柱已清洗至基線；(4)洗脫用含有濃度為50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小時20～60釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，並收集洗脫峰。
離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產品純度達到98％以上。
反向高效液相色譜層析的多肽回收率為65％～75％，多肽純化倍數為3以上；本發明建立了簡單快速的方法從含nisin的乳酸鏈球菌培養上清中純化nisin。該方法包括離子交換和反向高效液相色譜層析，處理45升樣品只需2個工作日，總回收率為50％以上，HPLC結果顯示純度在98％以上。比所公開的現有技術得率提高了10倍以上。
圖1為10毫昇陽離子交換柱SP Sepharose BigBead層析圖譜。
圖2為SP Sepharose BigBead陽離子交換層析後產品的純度分析結果。
圖3為C18，100A，10um填料的HPLC層析圖譜。
圖4HPLC純化後產品的純度分析結果。
具體實施例方式
實施例1離子交換層析裝有10ml顆粒大小為100～300μm的強陽離子瓊脂糖凝膠(由安瑪西亞生物技術有限公司生產，商品名為SP Sepharose BigBead介質的層析柱，層析柱直徑為2.5釐米。
樣品含nisin的乳酸桿菌培養上清100毫升；含85300單位nisin。
層析設備安瑪西亞生物技術有限公司生產的AKTA explorer 100；平衡、清洗緩衝液15mmol/L pH 4.5的醋酸緩衝液；洗脫緩衝液含1mol/L NaCl的15mmol/L pH 4.5的醋酸緩衝液。
平衡用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液平衡裝有10毫升體積的SPSepharose BigBead介質的層析柱，以每小時120釐米的流速平衡8個柱體積，通過紫外檢測保證層析柱已平衡至基線；樣品預處理將100毫升樣品(含nisin的乳酸鏈球菌培養上清)用預冷的無菌水稀釋至電導為3.5ms/cm，並用磷酸調節pH至4.5。
上樣以每小時300釐米的流速使樣品通過預先用緩衝液平衡好層析柱。
清洗上樣完，用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液，以每小時150釐米的流速清洗層析柱，通過紫外檢測保證層析柱已清洗至基線。
洗脫清洗至基線後，用含1mol/L氯化鈉的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液，以每小時15釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，並收集洗脫峰10毫升。試驗結果如表1和圖1 SP Sepharose BigBead純化nisin結果。圖1中1為280nm波長下的吸收曲線，2為254nm波長下的吸收曲線，3為215nm波長下的吸收曲線，4為洗脫梯度曲線。1，2，3都反映了洗脫液中不同吸收波長的產品的含量的高低。4反映了不同時間內流過層析柱的洗脫液和平衡緩衝液的比例。
表1SP Sepharose BigBead純化nisin結果
離子交換層析處理速度快、濃縮效果好，層析規模很容易放大，多肽活性回收率好；多肽純化倍數為14以上；多肽純度達到68.83％；但含一定量的色素。
經過SP Sepharose BigBead離子交換純化後樣品的純度可以達到68.83％，結果如圖2(經過SP Sepharose BigBead陽離子交換層析後產品的純度結果)及表2(對圖2的分析結果)。
表2對圖2的分析結果的說明
分析結果表明，含有nisin的乳酸鏈球菌發酵液經過SP SepharoseBigBead陽離子交換層析後，純度可以達到68.83％(峰面積的百分比)。
實施例2
反向HPLC純化所說的高效液相色譜柱採用的介質是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18矽膠填料(富士公司提供)，層析柱直徑為2.5釐米。
樣品在上述的層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液，含nisin 70372.5U；層析設備Varian公司生產的SD-1；平衡、清洗緩衝液0.1％TFA水溶液；洗脫緩衝液含50％乙腈的0.1％TFA水溶液。
洗脫清洗至基線後，用含50％乙腈的0.1％TFA水溶液，以每小時250釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，並收集洗脫峰。離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產品純度達到98％以上，多肽回收率為65％～75％，多肽純化倍數為3以上。試驗結果如表2和圖3經過陽離子交換層析後的樣品經過反向HPLC純化結果。
表3經過陽離子交換層析後的樣品經過反向HPLC純化結果
離子交換層析洗脫液通過反向高效液相色譜層析，可以很好的去除色素和其他多肽，產品純度達到98％(峰面積的百分比)以上，如圖4(nisin經過反向HPLC層析後純度結果)及表4(對圖4的分析結果)。
表4對圖4的分析結果
權利要求
1.一種乳酸鏈球菌素工業化純化工藝，其特徵在於，包括如下離子交換層析步驟(1)上樣將電導為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品通過預先用緩衝液平衡好層析柱；所說的樣品為含乳酸鏈球菌素的乳酸鏈球菌培養上清；所說的層析柱採用的介質是顆粒大小為100～300μm的強陽離子瓊脂糖凝膠；(2).清洗用10-50mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩衝液清洗層析柱；(3)洗脫用含0.5～1mol/L氯化鈉的10～15mmol/L pH為3.5～4.5的醋酸緩衝液，以每小時8～20釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫並收集洗脫峰。
2.根據權利要求1所述的純化工藝，其特徵在於，緩衝液平衡層析柱包括如下步驟用15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液平衡裝有適量體積的SP SepharoseBigBead介質的層析柱，以每小時80～200釐米的流速平衡5～10個柱體積，通過紫外檢測保證層析柱已平衡至基線。
3.根據權利要求1所述的純化工藝，其特徵在於，將電導為3～4ms/cm、pH為3.5～4.5的樣品以每小時200～400釐米的流速通過預先用緩衝液平衡好層析柱。
4.根據權利要求1所述的純化工藝，其特徵在於，步驟(2)中，用醋酸緩衝液，以每小時80～200釐米的流速清洗層析柱。
5.根據權利要求1所述的純化工藝，其特徵在於，步驟(3)中，用醋酸緩衝液，以每小時8～20釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫並收集洗脫峰。
6.根據權利要求1～5任一所述的純化工藝，其特徵在於，還包括如下的反向高效液相色譜的純化步驟(1)樣品預處理在層析洗脫液中加入等體積的15mmol/L pH為4.5的醋酸緩衝液，使得稀釋後的樣品可以直接上樣；所說的層析洗脫液為離子交換層析過程中洗脫並收集到的洗脫峰所得到的液體；(2)上樣將預處理後的洗脫液通過預先用0.1％TFA平衡好的高效液相色譜柱；所說的高效液相色譜柱採用的介質是顆粒大小為10μm，孔徑為100A的C18矽膠填料；(3)清洗用含有濃度為0.1％TFA的水溶液，以每小時20～60釐米的流速清洗層析柱；(4)洗脫用含有濃度為50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小時20～60釐米的流速將多肽從層析柱上洗脫下來，並收集洗脫峰。
7.根據權利要求6所述的純化工藝，其特徵在於，步驟(2)中洗脫液通過的流速為每小時20～60釐米。
全文摘要
本發明公開了一種乳酸鏈球菌素工業化純化工藝，建立了簡單快速的方法從含乳酸鏈球菌素的乳酸鏈球菌培養上清中純化乳酸鏈球菌素。該方法包括離子交換和反向高效液相色譜層析，處理45升樣品只需2個工作日，總回收率為50％以上，HPLC結果顯示純度在98％以上。得率提高了10倍以上。
文檔編號C07K2/00GK1876674SQ20051002651
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月7日 優先權日2005年6月7日
發明者黃青山, 李國棟 申請人:上海高科聯合生物技術研發有限公司