一種重組磁螺菌及其應用的製作方法

2023-07-20 04:48:56

一種重組磁螺菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種重組磁螺菌及其構建方法。具體為首先構建丟失了磁小體膜蛋白基因的趨磁細菌突變株，然後將一個磁小體膜蛋白基因與一個功能性蛋白基因進行基因融合，連接到pMD18-T Simple Vector上，轉化入E.coli DH5α感受態細胞，構建得到重組質粒。通過本發明方法構建得到的重組磁螺菌可用於合成表面展示有功能性蛋白的磁小體，所述磁小體可以很容易地與抗體，乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成具有特定功能的磁性複合體，該複合體既能夠用於磁性分離，還可以組裝成特定結構的磁性材料或構件。
【專利說明】一種重組磁螺菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種磁螺菌，具體地說，涉及一種合成功能化磁小體的重組磁螺菌及 其應用。

【背景技術】
[0002] 趨磁細菌（Magnetotactic bacteria, MTB)是水生原核生物的一個多系類群 (polyphyletic group),有球狀、卵狀、杆狀、弧狀和螺旋狀等形狀,可以是單細胞,也可以 是多細胞，一般具有端生或雙生鞭毛。在系統發育上屬於變形桿菌門（Proteobacteria)的 α _ 變形桿菌綱（Alphaproteobacteria)、δ -變形桿菌綱（Deltaproteobacteria)、Y -變 形桿菌綱（Gammaproteobacteria)和硝化螺旋菌門（Nitrospirae)。
[0003] 趨磁細菌可以從環境中吸收大量的鐵，形成一種特殊的細胞器，其內部含有一個 單磁疇的四氧化三鐵（Fe 3O4)或四硫化三鐵（Fe3S4)的晶體，外部有脂類和蛋白組成的單位 膜包被，稱為磁小體。不同的菌株可以合成不同形狀的磁小體，具有種專一性。磁小體主要 有平截八面體、稜柱狀、子彈狀、箭頭狀、齒狀等，直徑30?120nm。在細胞內，磁小體通常高 度有序地排列成一條或幾條鏈，形成一個或多個"小磁針"，從而使菌體可以感知外界磁場。
[0004] 磁小體的形成過程屬於生物礦化（biomineralization)，其整個過程多在50nm左 右的泡囊內進行，受到嚴格的生物調控，條件溫和，產物為單磁疇晶體，粒徑均一、晶形穩 定，在同類材料中磁性最強，是名副其實的"納米工廠（Nanofactory)"。同時，磁小體有單 位膜包被，與裸露的磁性材料相比，易於分散，目前尚無法人工模擬。
[0005] 由於氧化鐵磁性顆粒（磁珠）已經廣泛用於磁性分離、固定化酶、食品檢測、環境 監測、醫學診斷、造影劑、磁共振成像、磁熱療、靶向治療、磁性記錄材料等許多領域，因此， 成分與之類似的磁小體也受到了學者的關注。研究表明，不同趨磁細菌形成的磁小體形狀 多樣，而同一種趨磁細菌合成的磁小體大小、晶型、磁學性質均一，且由於有單位膜包被，磁 小體相對容易分散，是理想的三維納米磁性材料。同時，磁小體膜上含有大量的磷脂醯乙醇 胺，可提供豐富的氨基，用於偶聯功能性的分子，便於對磁小體的化學修飾。
[0006] 日本學者松永是（Tadashi Matsunaga)利用雙功能交聯劑分別嘗試了將酶、抗 體、核酸等連接在磁小體上，構建成磁性複合物，用於固定化酶，富集和檢測血液中的蛋 白、食品中的病原菌、環境中的有害物質等。我們也用類似的方法建立了對7種沙門氏菌 (Salmonella)、大腸桿菌（Escherichia coli) 0157、B肝抗原 HBsAg、禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus)、葡萄扇葉病毒（Grapevine fanleaf virus)、李環斑壞死病毒（Prunus necrotic ringspot virus)、菌麻毒素（Ricin)和腸毒素（Enterotoxin)的檢測方法。從理 論上講，市售磁珠多為微米級的多磁疇顆粒或球體（如Dynabeads),其磁性（矯頑力）小於 磁小體，當前者用於磁性分離時，效果應遜於磁小體。但實際上，二者的在檢測或診斷方面 的測試靈敏度相仿。分析上述實驗可以看出，這些實驗主要是利用抗體的氨基與磁小體相 連，而這些氨基更多地分布於其氮末端，這也正是抗體與抗原結合的區域（Fab)，如果Fab 與磁小體偶聯，則無法再去結合抗原，從而造成抗體活性的損失。同時，在上述方法中，磁小 體與抗體偶聯，仍然需要通過昂貴的雙功能試劑，沒有發揮出磁小體作為生物材料的優勢。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種重組磁螺菌的構建方法。
[0008] 本發明的另一目的是利用重組磁螺菌合成具有不同功能的磁小體。
[0009] 為了實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：
[0010] 本發明提供了一種重組質粒，所述重組質粒是將一個磁小體膜蛋白基因與一個功 能性蛋白基因進行基因融合，構建重組質粒；
[0011] 其中，磁小體膜蛋白基因為mamC、mmsl3或mamF ;功能性蛋白基因為spa、beep或 msa〇
[0012] 本發明還提供了一種含有上述重組質粒的重組磁螺菌的構建方法，其特徵在於， 步驟如下：
[0013] 1)構建趨磁細菌突變株；
[0014] 2)構建得到上述的重組質粒；
[0015] 3)將步驟2)得到的重組質粒導入步驟1)得到的趨磁細菌突變株，構建重組磁螺 菌。
[0016] 具體地，所述步驟1)還包括以下步驟：
[0017] (1)通過PCR擴增趨磁細菌磁小體膜蛋白基因的上遊長約Ikb的基因序列記作S 片段，下遊長約Ikb的基因序列記作X片段；
[0018] (2)將所述兩個片段和0.8kb的慶大黴素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體 PUX19的多克隆位點，構建成重組自殺質粒pUX19-S-Gm-X ;優選地，所述的磁小體膜蛋白基 因為mamC或mamF ;
[0019] (3)用抗性基因置換磁小體膜蛋白基因的片段以實現同源雙交換，得到丟失了磁 小體膜蛋白基因的趨磁細菌突變株。
[0020] 當磁小體膜蛋白基因為mamC時，S片段如SEQ ID No. 1所示，X片段如SEQ ID No. 2 所示。
[0021] 當磁小體膜蛋白基因為mamF時，S片段如SEQ ID No. 3所示，X片段如SEQ ID No. 4 所示。
[0022] 本發明還提供了上述的構建方法的步驟1)得到的趨磁細菌突變株。
[0023] 本發明還提供了上述的構建方法得到的重組磁螺菌。
[0024] 本發明還提供了利用一種表面展示有功能性蛋白的磁小體，所述磁小體通過上述 重組磁螺菌合成。
[0025] 本發明還提供了上述磁小體在與功能性蛋白相連、磁性分離或組裝成特定結構的 磁性材料中的應用。
[0026] 所述磁小體易與抗體，乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成 具有特定功能的磁性複合體，該複合體既能夠用於磁性分離，還可以組裝成特定結構的磁 性材料或構件。
[0027] 磁小體上展示有SpA蛋白，該蛋白可與多數哺乳動物抗體的碳末端（Fe)結合，Fe 端遠離抗體與抗原結合的部分（antigen binding fragment，Fab片段，位於氮末端），可以 有效地形成磁小體-抗體複合物，而不會影響抗體的活性（滴度），以這種複合物為載體，用 磁性免疫分離的方法富集相應的抗原，提高監測和診斷的靈敏度。
[0028] 磁小體上展示有重組單體鏈黴親和素（SA)，SA可以特異性地與生物素（biotin) 迅速、高效、牢固地結合，從而可以使磁小體與生物素化的蛋白、核酸、糖類、脂類結合，形成 複合體，執行相應的功能；
[0029] 磁小體上展示有生物素分子。由於天然的鏈黴親和素是四聚體，可以結合4個生 物素分子，這些磁小體可以佔據鏈黴親和素的1?2個生物素結合位點，則剩餘的位點可與 生物素化的蛋白、核酸、糖類、脂類結合，形成磁小體複合體，執行相應的功能；還可以與展 示有重組單體鏈黴親和素的磁小體組裝成特定的膠體晶體結構。
[0030] 本發明的優勢在於建立了磁小體表面展示技術，通過磁小體膜蛋白的融合表達， 分別將SpA蛋白、鏈黴親和素、生物素展示在磁小體的表面。使磁小體可以很容易地抗體， 乃至核酸、糖類、脂類、非抗體蛋白等功能性蛋白相連，形成具有特定功能的磁性複合體，既 能夠用於磁性分離，還可以組裝成特定結構的磁性材料或構件。

【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0032] 實施例1
[0033] M. gryphiswaldense MSR-1 的 mamC 突變株和 mamF 突變株的構建
[0034] 通過構建重組質粒，分別用PCR擴增的方法，將mamC基因上、下遊長約Ikb的片段 (分別記作s、X片段，S片段如SEQ ID No. 1所示，X片段如SEQ ID No. 2所示），將這兩個 片段和0. 8kb的慶大黴素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體pUX19的多克隆位點，構 建成重組自殺質粒pUX19-MamC-S-Gm-X，再通過同源雙交換將mamC基因片段用抗性基因置 換下來。具體步驟如下：
[0035] 1、分別用引物 mamC-S-F-Xba I /mamC-S-R-Kpn I 和 mamC-X-F-Kpn I / mamC-X-R-Pst I擴增mamC基因上、下遊區域（以全基因組方向來看其上下遊），電泳分離 擴增產物，切膠回收，然後連接到PMD18-T Simple Vector【購自TaKaRa寶生物工程(大連） 有限公司】上，轉化入大腸桿菌（E.c〇li)DH5a感受態細胞【購自普洛麥格（北京）生物技 術有限公司】。經PCR驗證正確後，分別命名為重組質粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，測序，確 定上下遊基因的正確性。
[0036] 其中，引物 mamC-S-F-Xba I 如 SEQ ID No. 5 所示；
[0037] 引物 mamC-S-R-Kpn I 如 SEQ ID No. 6 所示；
[0038] 引物 mamC-X-F-Kpn I 如 SEQ ID No. 7 所示；
[0039] 引物 mamC-X-R-Pst I 如 SEQ ID No. 8 所示。
[0040] 2、分別用內切酶Xba I /Kpn I和Kpn I /Pst I (內切酶XbaI購自TaKaRa公司， 1500U，Code D1093A ;內切酶KpnI 購自 TaKaRa 公司，5000U，1068A ;內切酶PstI 購自 TaKaRa 公司，3000U，D1073A)雙酶切重組質粒pT-MamC-S和pT-MamC-X，以獲得mamC基因上、下遊片 段（分別記作S、X片段）。再以內切酶Xba I /Pst I雙酶切自殺載體pUX19,以獲得該質粒 的其開環片段；並用內切酶Kpn I單酶切抗性質粒pUC-Gm，以獲得慶大黴素（Gm)抗性基因 片段。分別電泳分離酶切後的產物，並切膠回收目的片段：mamC基因的上下遊片段mamC-S 和mamC-X、抗性片段Gm和自殺載體pUX19。用T4DNA連接酶(購自TIANGEN公司，目錄號： RT406,60u)連接上述酶切後得到的四個片段，構建成重組自殺質粒pUX19-MamC-S-Gm-X。
[0041] 3、將上述自殺質粒轉入E. coli S17-1感受態細胞，並在慶大黴素和卡那黴 素（Km)雙抗性平板上篩選陽性克隆。用菌落PCR篩選，以獲得Gm基因反向插入的突變 株，避免Gm片段插入後對下遊基因的表達產生影響，即極性效應的產生。命名為E. coli S17-1 (pUX19-MamC-S-Gm-X)。
[0042] 4、將菌株E. coli S17-l(pUX19-MamC-S-Gm-X)作為供體菌與MSR-I野生型分別做 接合實驗，接合後菌液塗布在Gm和萘啶酮酸（Nx)雙抗性平板上篩選。所得菌落，如在Km抗 性平板上不生長，而在Gm抗性標記的抗性平板上生長良好，可初步鑑定為雙交換突變株。
[0043] 5、將抗性篩選得到的雙交換突變株進行菌落PCR復篩驗證。具體過程是：在mamC 基因內部設計一對引物mamC-F和mamC-R，PCR擴增，驗證mamC基因是否被替換掉；同時還 需在引物mamC-S-F-Xba I所在基因之前設計引物mamC-F-F，在引物mamC-X-R-Pst I所在 基因之後設計引物mamC-R-R，驗證上下遊臂是否交換正確。提取所得突變株的基因組，進一 步驗證菌株是否汙染了野生型，並且要通過PCR擴增確保磁小體島上的其它基因如mamA、 mamP、mamS、mamR、mamB 等沒有丟失，即得 AmamC 突變株 Μ· gryphiswaldense MamC (菌株 1)。
[0044] 6、同法通過引物 mamF-S-Dl-Kpn I 如 SEQ ID No. 13 所示；引物 mamF-S-D2-Pst I 如 SEQ ID No. 14 所示；引物 mamF-X-Gl-Xba I 如 SEQ ID No. 15 所示；引物 mamF-X-G2_Kpn I 如 SEQ ID No. 16 所不。可得 AmamF 突變株 M.gryphiswaldense MamF(菌 株2)
[0045] 實施例2spa基因、beep基因的獲得和重組單體msa基因的構建
[0046] 培養金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) ATCC6538,提取其全基因組為模 板，用引物Spa-LF (如SEQ ID No. 9所示）和Spa-RB (如SEQ ID No. 10所示)，擴增得到全 長spa基因。其中，引物Spa-LF包含Linker序列（Gly4Ser) 3，引物Spa-RB包含BamHI酶 切位點。
[0047] 如上法提取磁螺菌野生型菌株MSR-I的基因組DNA，以之作為模板，用引物BCCP-F (如SEQ ID No. 11所示）和BCCP-R (如SEQ IDNo. 12所示）擴增得到生物素羧基載體蛋白 基因 beep。其中，引物BCCP-F包含Linker序列（Gly4Ser)3，引物BCCP-R包含XbaI酶切位 點。
[0048] 根據野生型阿維丁鏈黴菌（Streptomyces avidinii)鏈黴親和素基因（sa)序列， 我們將其編碼55位纈氨酸、76位蘇氨酸、109位亮氨酸和125位纈氨酸的密碼子GTC、ACG、 CTG、GTC分別更換為ACA、AGA、ACA、AGA，則其對應的四個胺基酸，即分別更換為蘇氨酸、精 氨酸、蘇氨酸和精氨酸（即T76R，V125R，V55T，L109T)，同時在起始密碼子前面加上了一段 Linker序列（Gly4Ser)3。把改造後得到的重組單體片段命名為msa，該片段由上海英濰捷 基生物技術有限公司合成，其蛋白產物命名為MSA片段。
[0049] 實施例3各融合蛋白基因的構建
[0050] 含有MamC與單體鏈黴親和素融合蛋白基因的表達質粒pMamC-MSA的構建，具體步 驟如下：
[0051] 1、用野生型MSR-I基因組作為模板，以mamC-expl-Kpnl作為上遊引物，mamC_exp2 作為下遊引物擴增mamC基因。切膠回收，然後連接到pMD18-T Simple Vector上，轉化入 E. coli DH5a感受態細胞，PCR驗證並測序正確後，將所得重組質粒命名為pT-MamC-exp。
[0052] 2、以pT-MamC-exp和重組單體鏈黴親和素片段MSA同時作為模板，用 mamC-expl-Kpnl作為上遊引物，MSA-EcoRI作為下遊引物，進行融合PCR，以獲得mamC基因 與msa基因的融合片段，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，然後連接到pMD18-T Simple Vector 上，轉化入E.coliDH5a感受態細胞，PCR驗證並測序正確後，將所得重組質粒命名為 pT-MamC-MSA。
[0053] 3、提質粒pT-MamC-MSA，用內切酶KpnI/EcoRI雙酶切，獲得MamC-MSA融合基因片 段，兩端酶切位點為KpnI和EcoRI ;質粒pBBRlMCS-2 (美國五大湖生物能源研究中心發酵 實驗室，張耀平先生贈送)也用內切酶KpnI/EcoRI雙酶切，獲得pBBRlMCS-2開環片段，兩端 酶切位點為KpnI和EcoRI。將上述兩種酶切體系經瓊脂糖凝膠電泳，回收，再用T4DNA連 接酶連接，命名為重組質粒pMamC-SA。通過轉化入E. coli DH5a感受態細胞，PCR驗證、酶 切，並測序，以該質粒驗證含有MamC與MSA融合蛋白基因。
[0054] 同法,可構建重組質粒pMamC-Spa和pMamC-BCCP。
[0055] 與上述方法類似，可分別擴增mamF和mmsl3基因，並構建成重組質粒pMmsl3_MSA、 pMmsl3_BCCP、pMms13-Spa、pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa。
[0056] 實施例4重組磁螺菌的構建
[0057] 將含有 mamC 或 mmsl3 的質粒 pMamC-MSA、pMamC-SpA、pMamC-BCCP、pMmsl3_MSA、 pMmsl3-BCCP、pMmsl3_Spa 分別導入菌株 I [M. gryphiswaldense MSR-I 的 mamC 缺失突變株 (Δ mamC)]，得到重組磁螺菌 M. gryphiswaldense MamC-SpA (菌株 3)、MamC-MSA (菌株 4)、 MamC-BCCP (菌株 5)、Mmsl3-SpA (菌株 6)、Mmsl3-MSA (菌株 7)、Mmsl3-BCCP (菌株 8);將含有 mamF 基因的質粒 pMamF-MSA、pMamF-BCCP、pMamF-Spa 分別導入菌株 2 [M. gryphiswaldense MSR-I 的 mamF 缺失突變株（Δ mamF)]，即得菌株 M. gryphiswaldense MamF-SpA (菌株 9)、 MamF-MSA (菌株 10)、MamF-BCCP (菌株 11)。詳見表 1 :
[0058] 表1本發明中構建的菌株
[0059]

【權利要求】
1. 一種重組質粒，其特徵在於，所述重組質粒是將一個磁小體膜蛋白基因與一個功能 性蛋白基因進行基因融合，連接到PMD18-T Simple Vector上，轉化入E.coli DH5a感受 態細胞，構建得到重組質粒； 其中，磁小體膜蛋白基因為mamC、mmsl3或mamF ;功能性蛋白基因為spa、bccp或msa。
2. 含有權利要求1的重組質粒的重組磁螺菌的構建方法，其特徵在於，步驟如下： 1) 構建趨磁細菌突變株； 2) 構建權利要求1所述的重組質粒； 3) 將步驟2)得到的重組質粒導入步驟1)得到的趨磁細菌突變株，構建重組磁螺菌。
3. 如權利要求2所述的構建方法，其特徵在於，所述步驟1)包括如下步驟： (1) 通過PCR擴增趨磁細菌磁小體膜蛋白基因的上遊長約lkb的基因序列記作S片段， 下遊長約lkb的基因序列記作X片段； (2) 將所述兩個片段和0.8kb的慶大黴素（Gm)抗性基因片段定向克隆到自殺載體 PUX19的多克隆位點，構建成重組自殺質粒pUX19-S-Gm-X ; (3) 用抗性基因置換磁小體膜蛋白基因的片段以實現同源雙交換，得到丟失了磁小體 膜蛋白基因的趨磁細菌突變株。
4. 如權利要求3所述的構建方法，其特徵在於，所述的磁小體膜蛋白基因為mamC或 mamF。
5. -種趨磁細菌突變株，其特徵在於，所述趨磁細菌突變株是由權利要求2或3所述的 構建方法的步驟1)構建得到的。
6. 如權利要求2所述的重組磁螺菌的構建方法構建得到的重組磁螺菌。
7. -種表面展示有功能性蛋白的磁小體，其特徵在於，所述磁小體通過權利要求6所 述的重組磁螺菌合成。
8. 權利要求7所述的磁小體在與功能性蛋白相連、磁性分離或組裝成特定結構的磁性 材料中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK104278048SQ201310291562
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優先權日:2013年7月11日
【發明者】田傑生, 胡俊英, 徐俊, 王旭, 李麗, 劉凌子, 錢欣欣, 姜偉, 李穎, 李季倫 申請人:中國農業大學