一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法
2023-12-05 15:21:16
專利名稱：一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法
技術領域：
本發明屬於植物中有效成分提取方法領域。具體地說，涉及一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。
背景技術：
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook f.)，衛矛科，雷公藤屬，主產於福建、浙江、安徽、湖南等地。同屬的植物還有昆明山海棠(Tripterygium Hypoglaucum(Levl.)Hukeda)、蒼山雷公藤(Tripterygium Forretii Dials)、東北雷公藤(Tripterygium RegelliSprague et Taketa)等。雷公藤中含有多種具有多種生物活性的化合物，是著名的藥用和殺蟲植物之一，用於抗癌及殺蟲已有上百年的歷史，還有顯著的抗炎、抗生育及免疫調節作用。在臨床上已廣泛用於類風溼性關節炎、腎病綜合症、抗腫瘤以及免疫性疾病等多種疾病的治療。在植物農藥方面的研究和開發也得到很大的發展，如專利申請號為CN01141888.5、CN03115750.5、CN0310108822.3等專利申請的主要是雷公藤植物提取物作為農藥殺蟲劑的應用。
國內外對雷公藤的化學成分已進行了大量的研究工作，至今已從雷公藤中分離到上百種成分，主要為生物鹼類、二萜類、三萜類、倍半萜類、衛矛醇、衛矛鹼以及苷類等多種化合物。提取雷公藤中有效成分的方法有浸漬法、滲濾法、回流法、超臨界提取法、超聲提取法等，提取溶劑一般為水、乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯等。工藝規模製備雷公藤有效成分都採用物理提取法，較成熟的有雷公藤內酯醇、生物鹼及多苷製備工藝。
兒茶素類化合物在植物中的分布非常廣泛，其中以兒茶、兒茶鉤藤、大黃、山茶、紅七葉樹等植物中最多，此外在銀杏、沙棗、麻黃、日本苦楝、杜仲等多種植物也有分布。兒茶素類化合物普遍具有顯著的抗癌、抗炎、抗氧化以及防治心血管疾病等多種生物活性，已在醫藥、日用化工、食品添加劑等領域大量應用。其中兒茶素的結構式為 至今未見有從雷公藤屬植物中提取、分離兒茶素及表兒茶素的報導。
發明內容
本發明的目的在於提供一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。發明人經過對雷公藤屬植物的提取、分離、純化研究，獲得了兒茶素及表兒茶素，發明了此提取方法，完成了本發明。
本發明提供了一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法，它包括如下步驟(1)將雷公藤屬植物的植物組織粉碎後製成原料A備用；(2)取原料A加入溶媒進行提取，製得提取物B備用；(3)將提取物B離心，取上清液，加入萃取劑進行萃取，取有機層，減壓濃縮，製得C液備用；(4)將C液進行柱層析分離，用洗脫劑進行洗脫，收集含有兒茶素及表兒茶素的組分進行結晶，製得結晶D；(5)將結晶D用結晶液進行重結晶，製得兒茶素及表兒茶素。
本發明中雷公藤屬植物選自雷公藤、昆明山海棠、蒼山雷公藤、東北雷公藤中的一種或多種；植物組織選自根、莖、葉中的一種或多種。
本發明中溶媒媒是由酸、鹼、水中的一種或多種與有機溶劑組成，其pH 1～11；其中有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或多種。
本發明中萃取劑選自乙醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一種或多種。
本發明中洗脫劑選自石油醚、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇中的一種或多種，有選的洗脫劑為石油醚和乙醚，按體積計用量比為2∶3。
本發明中柱層析分離所使用的柱填充物為100目～300目矽膠，優選的柱填充物為200目～300目矽膠。
本發明中結晶液選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚中的一種或多種。
所述方法詳述如下(1)粉碎植物材料將雷公藤屬植物的根、莖、葉等植物組織洗淨，切片，曬乾，粉碎，製成原料A備用。
(2)用溶媒進行提取方法1稱取原料A，按1∶3～10(W/V)加入溶媒(2％～30％有機溶劑+0.2％～15％濃鹽酸+水)，採用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過濾。濾渣重複提取三次，過濾，合併濾液，製得提取物B。
方法2稱取原料A，用氨水(5％～20％)浸潤，按1∶3～10(W/V)加入有機溶劑，採用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過濾；濾渣重複提取三次，過濾，合併濾液，製得提取物B。
方法3稱取原料A，用蒸餾水浸潤，按1∶3～10(W/V)加入有機溶劑，採用室溫或加溫(65℃～95℃)提取，過濾；濾渣重複提取三次，過濾，合併濾液，製得提取物B。
(3)離心、萃取將提取物B用氨水調至pH 8～10，離心；將上清液轉至分液漏鬥中，立即用萃取劑萃取三次。合併有機層，減壓濃縮，製得C液，低溫保存備用。
(4)柱層析分離純化將C液用100目～300目矽膠拌樣，C液與矽膠的比例視C液的濃度而定。置於紅外燈下烘乾，經100目～300目矽膠柱層析，用洗脫劑洗脫；經高效液相色譜法跟蹤檢測，收集不同流份，進行結晶，製得得結晶D。
(5)重結晶將結晶D用結晶液進行重結晶，製得兒茶素及表兒茶素。
兒茶素及其類似物的結構鑑定兒茶素白色針狀結晶(甲醇)，mp154℃-156℃(甲醇)；1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ3.42(1H，dd，J＝8.4，16.0Hz，H-4a)，3.78(1H，dd，J＝5.5，16.0Hz，H-4b)，4.69(1H，ddd，J＝5.5，7.7，8.4Hz，H-3)，5.31(1H，d，J＝7.7Hz，H-2)，6.73(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.78(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，7.31(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，7.32(1H，d，J＝8Hz，H-6′)，7.65(1H，s，H-2′)。13C-NMR(C5D5N，500MHz)δ29.8(C-4)，68.3(C-3)，83.4(C-2)，95.7(C-8)，96.8(C-6)，101.1(C-10)，116.2(C-2′)，116.4(C-5′)，119.8(C-6′)，132.3(C-1′)，147.2(C-3′)，147.3(C-4′)，157.4(C-9)，158.5(C-5)，158.9(C-7)。其波譜數據與文獻(《Journal ofChinese Pharmaceutical Sciences》2004，13(3)214～216)報導的兒茶素catechin一致。
表兒茶素白色針狀結晶(甲醇)，mp249～251℃；1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ3.55(1H，dd，J＝3.2，16.2Hz，H-4a)，3.46(1H，dd，J＝4.5，16.2Hz，H-4b)，4.78(1H，s，H-2)，5.37(1H，s，H-3)，6.67(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.70(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.31(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，7.36(1H，dd，J＝1.5，8.2Hz，H-6′)，7.91(1H，d，J＝1.2Hz，H-2′)。13C-NMR(C5D5N)δ81.3(C-2)，66.7(C-3)，29.8(C-4)，156.7(C-9)，157.2(C-5)，157.8(C-7)，96.4(C-6)，95.5(C-8)，99.5(C-10)，132.2(C-1′)，115.3(C-2′)，115.7(C-5′)118.7(C-6′)，146.8(C-3′)，146.9(C-4′)。其波譜數據與文獻(《雲南植物研究》1997，19(2)201～206)報導的表兒茶素(-)epicatechin一致。
本發明從雷公藤屬植物中提取兒茶素的方法所採用的設備簡單，即使用的是常規的柱層析法及常規的矽膠，而不需要葡聚糖凝膠、超臨界流體提取儀、高速逆流色譜儀等昂貴的試劑或儀器。大大簡化了兒茶素單體分離純化設備，方法簡便易行，成本低廉，回收率高，且產品純度可達99％以上，易於推廣使用。
圖1兒茶素的高效液相色譜圖。
圖2表兒茶素的高效液相色譜圖。
具體實施例方式
實施例1取雷公藤根的木質部切片，風乾，粉碎。粉碎細度20目。按體積計用量，水80％、乙醇17％、濃鹽酸3％的比例混勻製成提取溶媒。取粉碎好的雷公藤藥材1公斤，加提取溶媒3升，浸泡過夜。然後65℃提取50min。冷卻後，將提取液用氨水調至pH 9，4000rpm/min離心20min，去沉澱。取上清液，按體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取三次，合併酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進行柱層析分離。採用矽膠(200目～300目)作為固定相，流動相為石油醚-乙醚梯度洗脫，分離物經高效液相色譜法檢測後分部收集各組分，揮去流動相。得純度為97.5％的兒茶素251mg，純度為91.2％的表兒茶素84mg。再將上述粗品用少量的丙酮溶解後，加石油醚-乙醚(1∶2)重結晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實施例2取昆明山海棠根皮1公斤，經乾燥、粉碎後，加少量蒸餾水浸泡潤溼過夜，再用10升乙醇熱回流提取。冷卻後，將提取液用氨水調至pH 9，3000rpm/min離心25min，去沉澱。將上清液用正丁醇萃取(體積比1∶3)三次，合併酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進行柱層析分離。採用矽膠(100目～200目)作為固定相，流動相為石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，分離物經高效液相色譜法檢測後分部收集各組分，揮去流動相。得純度為93.5％的兒茶素194mg，純度為90.8％的表兒茶素95mg。再將上述粗品用甲醇重結晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實施例3取蒼山雷公藤莖粉1公斤，用10％氨水浸泡潤溼，再加6升丙酮室溫浸提24小時。將提取液用氨水調至pH 10，5000rpm/min離心15分鐘，去沉澱。將上清液用乙醚萃取(體積比1∶2)三次，合併酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進行柱層析分離。採用矽膠(200目～300目)作為固定相，流動相為石油醚-甲醇梯度洗脫，分離物經高效液相色譜法檢測後分部收集各組分，揮去流動相。得純度為93.5％的兒茶素205mg，純度為90.8％的表兒茶素63mg。再將上述粗品用石油醚-甲醇(19∶1)重結晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實施例4取東北雷公藤根的木質部切片，風乾，粉碎。粉碎細度20目。按體積計用量水82％、甲醇15％、濃鹽酸3％的比例混勻成為提取溶媒。取粉碎好的雷公藤藥材1公斤，加提取溶媒3升，浸泡過夜。然後90℃提取50min。冷卻後，將提取液用氨水調至pH 9，4000rpm離心20分鐘，去沉澱。上清液用乙酸乙酯萃取(體積比1∶1)三次，合併酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進行柱層析分離。採用矽膠(200目～300目)作為固定相，流動相為石油醚-乙醚梯度洗脫，分離物經高效液相色譜法檢測後分部收集各組分，揮去流動相。得純度為97.5％的兒茶素232mg，純度為91.2％的表兒茶素90mg。再將上述粗品用少量的丙酮溶解後，加石油醚-乙酯乙酯的(9∶1)重結晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
實施例5取蒼山雷公藤葉粉1公斤，用5％氨水浸泡潤溼，再加5升乙酸乙酯室溫浸提24小時。將提取液用氨水調至pH 10，4000rpm離心20分鐘，去沉澱。上清液用乙酸乙酯萃取(體積比1∶1)三次，合併酯層，45℃下減壓濃縮。
將上述得到的濃縮液進行柱層析分離。採用矽膠(200目～300目)作為固定相，流動相為石油醚-甲醇梯度洗脫，分離物經高效液相色譜法檢測後分部收集各組分，揮去流動相。得純度為93.0％的兒茶素208mg，純度為91.8％的表兒茶素65mg。再將上述粗品用二氯甲烷重結晶，得純度≥99％的兒茶素及表兒茶素。
權利要求
1.一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法，它包括如下步驟(1)將雷公藤屬植物的植物組織粉碎後製成原料A備用；(2)取原料A加入溶媒進行提取，製得提取物B備用；(3)將提取物B離心，取上清液，加入萃取劑進行萃取，取有機層，減壓濃縮，製得C液備用；(4)將C液進行柱層析分離，用洗脫劑進行洗脫，收集含有兒茶素及表兒茶素的組分進行結晶，製得結晶D；(5)將結晶D用結晶液進行重結晶，製得兒茶素及表兒茶素。
2.根據權利要求1所述的方法，其中雷公藤屬植物選自雷公藤、昆明山海棠、蒼山雷公藤、東北雷公藤中的一種或多種；
3.根據權利要求1所述的方法，其中植物組織選自根、莖、葉中的一種或多種。
4.根據權利要求1所述的方法，其中溶媒是由酸、鹼、水中的一種或多種與有機溶劑組成。
5.根據權利要求4所述的方法，其中有機溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一種或多種。
6.根據權利要求1所述的方法，其中的萃取劑選自乙醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一種或多種。
7.根據權利要求1所述的方法，其中洗脫劑選自石油醚、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇中的一種或多種。
8.根據權利要求7所述的方法，其中洗脫劑為石油醚和乙醚，按體積計用量比為2∶3。
9.根據權利要求1所述的方法，其中柱層析分離所使用的柱填充物為100目～300目矽膠。
10.根據權利要求1所述的方法，其中結晶液選自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚中的一種或多種。
全文摘要
本發明涉及一種從雷公藤屬植物中提取兒茶素及表兒茶素的方法。將雷公藤屬植物的根、莖、葉組織經提取，萃取、柱層析分離、重結晶後，得到兒茶素及表兒茶素。
文檔編號C07D311/62GK1884276SQ20051001198
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月22日 優先權日2005年6月22日
發明者曾水雲, 吳華, 林開春 申請人:武漢天惠生物工程有限公司, 武漢綠世紀生物工程有限責任公司