一種天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-05 19:46:31 1

專利名稱：一種天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是ー種具有抗氧化活性的多肽一天然抗氧化肽Macrotympanain-AI及其製備方法和在化妝品中的應用。
背景技術：
自由基是機體氧化反應中產生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老效應。在正常生理狀態下，機體內自由基的產生與清除處於動態平衡狀態，但當機體處於不良環境狀態下，以及隨著年齢的增長，體內的自由基將會產生過多或清除過慢。自由基清除劑也稱為抗氧化劑，可清除體內多餘的自由基，減輕它們對機體的損傷。目前，一直公認的自然界生物體中存在著2套抗氧化系統，第一套是蛋白質大分子，比如SOD ；第二套為有機小分子，比如Vc、BHT等。化學合成的抗氧化劑如BHA、BHT等， 本身具有毒、副作用，各國政府紛紛對其強制規定了 ADI值，控制其過量添加。化妝品中常見的抗氧化劑，如維生素C、維生素E及SOD等，其氧化活性又有限。而天然蝦青素之類的天然抗氧化劑的添加產品，由於其賣點為「天然」，售價普遍過高，難以為大眾所接受。

發明內容
本發明的目的是提供ー種天然抗氧化肽Macrotympanain-AI及其製備方法和在化妝品中的應用，用中國特有臭蛙的皮膚中存在的天然抗氧化肽替代傳統的抗氧化劑，開發新一代天然，極低毒、高效的抗氧化類化妝品。隨著多肽組學和基因組學的發展，本發明在青蛙皮膚中發現了第三套抗氧化系統，其由基因編碼的多肽構成，這種多肽多由10-20個胺基酸殘基組成。這種天然抗氧化肽是高原地區兩棲動物的皮膚對抗紫外損傷有效而強大的武器，對其生存是至關重要的，且其來源天然，低毒、高效的特性，更符合現代人對化妝品的要求。本發明所獲得的天然抗氧化肽來源於中國特有的臭蛙(Odorrana andersonii)的皮膚分泌物。蛙類，是動物從水生生活到陸生生活的重要過渡類型，其皮膚裸露，富含腺體， 能分泌大量的活性物質，包括抗菌肽、激肽、鎮痛肽等，其中還有大量未知功能的多肽。臭蛙是蛙類動物的「祖先」，因其皮膚在受刺激時能分泌具有刺激性氣味的混合物而得名。根據以往工作的經驗顯示，選取祖先種提取到的有效成分，其活性較強，本發明選用了蛙類的祖先雲南臭蛙，且實驗結果符合預期的推測。本發明的天然抗氧化肽Macrotympanain-AI按以下方法製備①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激雲南臭蛙的皮膚6s，之後以25mM Tris-HCl緩衝液(pH = 7.8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物於 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍乾燥，並儲存於_80°C備用；②多肽的純化將凍幹的上清液樣品重新溶解，上預先用25mM Tris-HCl緩衝液(pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的S印hadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產物用280nm監測，繪製分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，並用C4柱除去裡面的鹽分後冷凍真空乾燥。之後，用20mM的NaAc-HAc緩衝液(pH =4. 0)溶解樣品，用相同緩衝液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl 的同一緩衝液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監測，收集到具有抗氧化活性的成分，之後用含0.1% (v/v)TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離， 利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監測，最終獲取天然抗氧化肽Macrotympanain-Al純品。抗氧化活性評估樣品抗氧化活性的評估反映在其對自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS,避光反應至少6小吋，之後，立即用水稀釋125倍，50微升溶於水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之後，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算
(riMaIik-riSample) X Ιθθ/Ablank。經上述方法製備得到天然抗氧化肽Macrotympanain-Al，其為基因編碼產物。N端到C端的序列FLPGLECVW。活性0. 5ug/ml的濃度下即可清除15%的自由基，2ug/ml的濃度下取出98%的自由基。此外，具有一定的殺菌、免疫調節以及水平衡調節的活性。產品主要技術指標抗氧化肽的活性評估標準是能發揮作用的最小濃度(ug/ml
5 umol/m丄ノ 。本發明的天然抗氧化肽Macrotympanain-Al，應用於化妝品的製備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，具有純天然、高效的特點，並具有一定的殺菌、免疫調節以及水平衡調節的活性。本發明與現有技術相比較具有以下優點①採自中國特有臭蛙的皮膚，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害——回歸本源、純天然，符合現如今大眾的消費要求。②活性比傳統的抗氧化劑BHT強1000倍。③除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調節活性、抑制黑色素形成活性。本發明的應用是化妝品行業的一次創舉，將成為化妝品行業的新一枝標杆。


圖1是本發明的天然抗氧化肽Macrotympanain-Al製備的エ藝流程圖。
具體實施例方式①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激雲南臭蛙的皮膚6s，之後以25mM Tris-HCl緩衝液(pH = 7. 8)清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物於 4000rpm離心15min，將上清液真空冷凍乾燥，並儲存於_80°C備用；②多肽的純化將凍幹的上清液樣品重新溶解，上預先用25mM Tris-HCl緩衝液 (pH = 7. 8，含有0. IM NaCl)平衡好的kphadex G-75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫，每IOmin收集一次。洗脫產物用280nm監測，繪製分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，並用C4柱除去裡面的鹽分後冷凍真空乾燥。之後，用20mM的NaAc-HAc緩衝液 (pH = 4. 0)溶解樣品，用相同緩衝液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl的同一緩衝液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監測，收集到具有抗氧化活性的成分，之後用含0.1% (v/v) TFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離，利用含有0. 1% (v/v)TFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監測，最終獲取抗氧化肽Macrotympanain-Al純品。其為基因編碼產物，N端到C端的序列 FLPGLECVW，活性0. 5ug/ml的濃度下即可清除15%的自由基，2ug/ml的濃度下取出98%的自由基。抗氧化活性評估樣品抗氧化活性的評估反映在其對自由基的清除率上，具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. 8mM過硫酸鉀和7mM ABTS，避光反應至少6小吋，之後，立即用水稀釋125倍，50微升溶於水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之後，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算
(riMaIik-riSample) X Ιθθ/Ablank。本發明的天然抗氧化肽Macrotympanain-Al應用於化妝品的製備，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中去，純天然、高效、具有一定的殺菌、免疫調節以及水平衡調節的活性。
權利要求
1.ー種天然抗氧化肽Macrotympanain-Al，其特徵在於天然抗氧化肽 Macrotympanain-Al，其為基因編碼產物，N端到C端的序列FLPGLECVW。
2.權利要求1所述的抗氧化活性的多肽的製備方法，其特徵在於按以下步驟進行①皮膚分泌物的獲取用6V的電壓刺激雲南臭蛙的皮膚6s，之後以25mMTris-HCl 緩衝液pH = 7. 8清洗臭蛙的身體，收集皮膚分泌物，將收集到的分泌物於4000rpm離心 15min，將上清液真空冷凍乾燥，並儲存於-80°C備用；②多肽的純化將凍幹的上清液樣品重新溶解，上預先用25mMTris-HCl緩衝液pH = 7. 8，含有0. IM NaCl平衡好的kphadex G_75凝膠過濾柱，以0. 3ml/min的流速進行洗脫， 每IOmin收集一次洗脫液；洗脫液用280nm監測，繪製分離純化圖譜，收集到抗氧化活性成分，並用C4柱除去裡面的鹽分後冷凍真空乾燥後，用20mM的NaAc-HAc緩衝液pH = 4. 0溶解樣品，用相同緩衝液平衡好的Resource S分離柱進行純化，利用含有IM NaCl的同一緩衝液、以lml/min的流速進行洗脫，洗脫液用215nm波長進行監測，收集到具有抗氧化活性的成分後，用含0. 1%V/VTFA的超純水平衡好的HPLC C18分離柱進行分離，利用含有0. 1% v/vTFA的乙腈以0. 7ml/min的流速洗脫，洗脫液在215nm下進行監測，最終獲取天然抗氧化 Ii Macrotympanain-Al MijjH1I。
3.根據權利要求2所述的天然抗氧化肽Macrotympanain-Al的製備方法，其特徵在於抗氧化活性評估具體如下首先配置ABTS儲存液在水溶液溶解2. SmM過硫酸鉀和7mM ABTS，避光反應至少6小吋，之後，立即用水稀釋125倍，50微升溶於水的樣品加入50微升 ABTS稀釋液，避光反應至少10分鐘，之後，在415nm波長下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進行計算(Ablank-Asample) X 100/Ablank。
4.權利要求1所述的天然抗氧化肽Macrotympanain-Al的應用，其特徵在於將抗氧化活性的多肽Macrotympanain-Al應用於化妝品的製備中，將天然抗氧化肽直接投入到化妝品的配方中。
全文摘要
本發明是一種天然抗氧化肽Macrotympanain-A1及其製備方法和應用。該天然抗氧化肽Macrotympanain-A1為基因編碼產物，N端到C端的序列RLFKCYKPDS。其採自中國特有臭蛙的皮膚製備而成，其在蛙類皮膚中的主要作用是保護裸露在外的皮膚不受紫外線的傷害，將抗氧化活性的多肽Macrotympanain-A1應用於化妝品的製備中。回歸本源、純天然，符合現如今大眾的消費要求。活性比傳統的抗氧化劑BHT強1000倍。除了具有抗氧化活性，還具有一定的抗菌活性、免疫調節活性、抑制黑色素形成活性。
文檔編號C07K7/06GK102532266SQ20121001426
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者梁醒財 申請人:梁醒財