經皮免疫之佐劑的製作方法

2023-11-11 15:55:12 2

專利名稱：經皮免疫之佐劑的製作方法
背景技術：
本發明涉及經皮免疫及可用於其中的佐劑，以誘導抗原特異性免疫應答。
經皮免疫既要求抗原能穿過通常無法穿透的皮膚表面屏障，又要求對該抗原的免疫應答。美國申請號08/749,164中用霍亂毒素作抗原，刺激產生了強烈的抗體應答，並有較好重複性；該抗原可以鹽溶液形式用於皮膚，其中含或不含脂質體。本申請將展示使用佐劑的經皮免疫，所述佐劑例如有細菌外毒素及其亞基，以及相關毒素等。
Paul等(1995)曾報導使用轉移體進行經皮免疫。在該報導中，利用轉移體作為蛋白質(牛血清白蛋白和間隙連接蛋白)的載體，針對該蛋白質，產生了對抗原致敏化脂質體的補體介導的溶解作用。將含有該蛋白質的溶液施用於皮膚並未誘導免疫應答；只有轉移體能運送抗原穿過皮膚，並產生免疫效應。如美國申請號08/749,164所述，轉移體均非脂質體。
Paul等(1995)的

圖1顯示，對抗原致敏的脂質體的裂解分析可知只有抗原加轉移體的製劑才誘導免疫應答。溶液形式抗原的製劑、抗原與混合微團的製劑及抗原與脂質體的製劑(即smecticmesophases)用於皮膚時，所誘導的免疫效果均不及皮下注射的。因此，有陽性對照(抗原加轉移體)可證實Paul等的陰性結論，即抗原加脂質體不能誘導經皮免疫。
Paul等(1995)在第3521頁稱，皮膚是有效的保護性屏障，「分子量多達750 DA的物質就無法穿過」，大免疫原無法透過完整皮膚實現非侵入性免疫。因此根據該文獻，不應使用霍亂毒素(85,000道爾頓)這樣的分子，因為不能指望它們穿過皮膚，就不能指望獲得免疫效果。因此本發明公開之前的觀點均認為皮膚屏障是佐劑或霍亂毒素類抗原無法穿透的。
Paul和Ceve(1995)在第145頁稱，「大分子通常不能透過哺乳動物皮膚。因此不可能用單純肽或蛋白質溶液進行外表皮免疫。」他們得出結論，「皮膚上施用脂質體或混合微團式免疫原，不管它們是否與免疫佐劑脂質A聯合作用，均如同單純蛋白質溶液一樣不具備生物學活性」。
Wang等(1996)將卵白蛋白(OVA)水溶液置於剃毛小鼠皮膚上以誘導過敏型應答，作為特應性皮炎模型。將小鼠麻醉，敷一封閉性補片，內含不超過10mg OVA，持續與皮膚接觸4天。兩周後重複操作一次。
在Wang等(1996)的圖2中，用ELISA測定IgG2a抗體應答，結果顯示沒有對OVA的IgG2a抗體應答，但能測到與過敏反應相關的IgE抗體。進一步的實驗中，小鼠被敷貼上更大面積OVA溶液，貼4天，隔兩周重複一次，其重複5次，即小鼠共貼補片20天。如此高劑量的OVA仍然沒能產生顯著的IgG2a抗體，卻產生了顯著水平的IgE抗體。
作者們在第4079頁稱「我們建立了一種動物模型，顯示外表皮接受蛋白質抗原(Ag)刺激，即使無佐劑，也能致敏動物，並誘導較強的Th2樣應答，同時伴有高水平IgE」。外表皮大面積接觸高劑量蛋白質抗原並不能產生顯著的IgG抗體，但能誘導出IgE抗體，這是過敏型反應的標誌。故Wang等(1996)告誡上述OVA接觸方式是特應性皮炎的模型，並非免疫接種模式。因此，根據該文獻的教導，可以推論，抗原經皮免疫方式如確有抗原穿過皮膚並誘導免疫應答，就會產生高水平IgE抗體。然而，我們意外地發現，將抗原鹽溶液加佐劑置於皮膚上誘導的是高水平IgG和一些IgA，而非IgE。
與上述引用文獻相比，本發明人發現，將抗原加佐劑施用於皮膚，產生了經皮送遞抗原體系，可誘導IgG和IgA的抗原特異性應答。佐劑優選是ADP-核糖基化外毒素。此外，也可在經皮送遞體系中使用水化作用、促穿透劑或封閉敷料。
發明簡述本發明旨在提供一種經皮免疫體系，在動物或人體內誘導免疫應答(如體液和/或細胞效應物)。
該體系只需簡單地將含佐劑和抗原的製劑施用於生物體的完整皮膚，就能誘導針對該抗原的特異性免疫應答。
具體地說，該佐劑可激活免疫體系的抗原呈遞細胞(如表皮朗格漢斯細胞，皮膚樹突細胞，樹突細胞，巨噬細胞，B淋巴細胞)，還/或可誘導抗原呈遞細胞吞噬抗原。然後抗原呈遞細胞將抗原呈遞給T細胞和B細胞。在朗格漢斯細胞的情形中，抗原呈遞細胞可能從皮膚移行至淋巴結，將抗原呈遞給淋巴細胞(如T和/或B細胞)，由此誘導抗原特異性免疫應答。
除了激發免疫反應導致產生抗原特異性B淋巴細胞和/或T淋巴細胞(包括細胞毒性T淋巴細胞，CTL)之外，本發明的另一目的是用經皮免疫體系影響抗原特異性T輔助淋巴細胞(Th1，Th2或兩種全影響)，從而對免疫體系的各成分進行正和/或負調節。
在本發明的第一個實施方案中，將含有佐劑和抗原的製劑施用於生物體的完整皮膚後，抗原被呈遞給免疫細胞，未經皮膚穿孔就誘導產生了抗原特異性免疫應答。該製劑中可以包含其他抗原，使得經皮施用製劑可誘導對多種抗原的免疫應答。此時，所用各種抗原可以是來源相同，也可不同，但應具備不同化學結構，以便誘導對不同抗原特異的免疫應答。抗原特異性淋巴細胞有可能參與免疫應答，如在B淋巴細胞的參與下，抗原特異性抗體可能是一部分免疫應答。
本發明的第二個實施方案中，上述方法被用來處理生物體。如果所用抗原來自病原體，則進行接種，使該生物體可抵抗該病原體的侵襲，或抵抗其致病作用，如因毒素分泌而導致的致病作用。包含腫瘤抗原的製劑也許能治療癌症，包含自身抗原的製劑也許能治療該生物體自身免疫體系所致疾病(如自身免疫疾病)，包含變應原的製劑也許可用於對變態反應性疾病作免疫治療。
在本發明的第三個實施方案中，提供了可用於上述方法的補片。補片中含有敷料，有效量的抗原和佐劑。敷料可為封閉性或非封閉性的。補片中可能還包含其他抗原，使得敷用該補片後，會誘導針對多種抗原的免疫應答。在這種情況下，所用抗原可以來源相同，也可不同，但應有不同化學結構，以便激發對不同抗原特異的免疫應答。為達到有效處理效果，可間隔性地多次重複敷用多塊補片一段時間，也可持續敷用一段時間。
此外，在本發明的第四個實施方案中，使用一塊或多塊補片，將製劑敷到完整皮膚上，接觸部位涵蓋不止一個引流淋巴結區。製劑中可能含有其他抗原，使得敷到完整皮膚上時，可誘導對多種抗原的免疫應答。在這種情況下，所用抗原可來源相同，也可不同，但應有不同化學結構，以便誘導對諸不同抗原特異的免疫應答。
本發明的產品及方法可用於治療已有疾疾，預防疾病，或減輕病性和/或縮短病程。但以不誘導過敏反應、特應性疾病、皮炎或接觸性超敏反應為佳。
製劑中不止含有抗原和佐劑，還可含水化劑(如脂質體)，促穿透劑，或二者均有。例如，抗原-佐劑製劑中可能還含有用AQUAPHOR製成的乳劑(凡士林，礦物油，礦物蠟，羊毛蠟，泛醯醇，bisabol和甘油)，乳劑(如水性乳膏)，水包油乳劑(如油性乳膏)，無水脂質加水包油乳劑，無水脂質加油包水乳劑，脂肪，蠟，油，蛙酮，溼潤物(如甘油)，凝膠(如SURGILUBE，KY凝膠)，或以上各試劑的組合物。製劑可以製成水溶液形式。
製劑中較優選不含有機溶劑。可在用酒精擦拭皮膚後施用製劑。但不優選在經脫髮劑處理除去了角質細胞層的皮膚表面給藥。
抗原可得自能感染生物體的病原體(如細菌、病毒、真菌或寄生蟲)，或可得自細胞(如腫瘤細胞或正常細胞)。抗原也可以是腫瘤抗原或自身抗原。從化學角度看，抗原可以是糖類、糖脂、糖蛋白、脂類、脂蛋白、磷脂、多肽或以上各類的化學或重組偶聯物。抗原分子量可以大於500道爾頓，較優選大於800道爾頓，更優選大於1000道爾頓。
抗原可經重組方式、化學合成方式獲得，也可從天然來源中純化而得。較優選蛋白性抗原或與多糖的偶聯物。抗原可以是至少部分純化成無細胞形式。或者，抗原可以是活病毒、減毒活病毒或滅活病毒的形式。
佐劑的引入可能對免疫應答產生增強或調節作用。而且，選擇適當的抗原或佐劑可優先誘導體液免疫或細胞免疫應答，產生特異性抗體同種型(如IgM，IgD，IgA1，IgA2，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，或其組合)，和/或產生特異性T細胞亞群(如CTL，Th1，Th2，TDTH，或其組合)。
佐劑較優選為ADP-核糖基化外毒素或其亞基，或者也可用朗格漢斯細胞的激活劑。
另一選擇是，抗原、佐劑或二者可作為編碼相應抗原或佐劑的核酸形式(如DNA，RNA，cDNA，cRNA)加入到製劑中。該技術稱基因免疫接種。
本發明中術語「抗原」指被呈遞給生物體的免疫細胞時，能誘導特異性免疫應答的物質。抗原可包含能被B細胞受體(即B細胞的細胞膜上抗體)或T細胞受體識別的一個或多個免疫原性表位。一種分子可能既是抗原又是佐劑(如霍亂毒素)，因此，製劑中可能只含一種成分。
本發明所用術語「佐劑」指加入製劑中以輔助誘導對抗原之免疫應答的物質。一種物質可能既是佐劑又是抗原，可誘導免疫刺激反應，及特異性抗體或T細胞應答。
本發明中術語「有效量」指能誘導抗原特異性免疫應答的抗原量。這種免疫應答的誘導可用於治療中，比如免疫保護、脫敏、免疫抑制、自身免疫疾病調節、癌症免疫監視的強化或對已患的傳染病進行的治療接種。
本發明中術語「引流淋巴結區」指淋巴匯集後濾過一組淋巴結(如頸部、腋窩、腹股溝、肱骨內上髁(epitrochelear)及胸、腹部的淋巴結)所流經的解剖學區域。
附圖簡述圖1顯示霍亂毒素(CT)誘導增強主要組織相容性複合體(MHC)II類抗原在朗格漢斯細胞(LC)表面的表達，誘導LC的形態改變，及誘導LC的丟失(推測是通過遷移)。對BALB/C小鼠(H-2d)於耳部經皮免疫含250μg CT或其B亞基(CTB)的鹽溶液。已有事前實驗證實小鼠耳部皮膚易於被免疫(單次免疫接種後可產生7000ELISA單位的抗CT抗體)。16小時後，製備表皮片，並對MHC II類分子染色(標度尺50μm)。各部分指(A)僅用鹽溶液作陰性對照，(B)用CT鹽溶液進行的經皮免疫，(C)用CTB鹽溶液進行的經皮免疫，(D)皮內注射腫瘤壞死因子α(10μg)作陽性對照。
發明詳述經皮免疫體系將物質送遞至能產生免疫應答的特殊類群細胞(如抗原呈遞細胞，淋巴細胞)(Bos，1997)。這類物質被稱為抗原。抗原可由以下化學物質組成，如糖類、糖脂、糖蛋白、脂類、脂蛋白、磷脂、多肽、蛋白質，及以上各類的偶聯物，或已知能誘導免疫應答的其他任何物質。抗原可以是完整生物體，如細菌或病毒顆粒；抗原也可得自完整細胞或膜的提取物或裂解產物；或者，抗原可經化學合成，或重組產生，或通過滅活病毒得到。
製備藥物製劑的方法為本領域熟知，藉此方法，將抗原和佐劑與藥學可接受的載體結合使用。合適的載體及其製備已有文獻描述，如E.W.Martin的Remington′s藥物科學。這類製劑應含有效量的抗原和佐劑，及適當量的載體，以製備藥學可接受的組合物，使之適於對人或動物施用。製劑可以乳膏、乳劑、凝膠、洗劑、軟膏、糊劑、溶液、懸浮液形式或本領域已知的其他形式施用。尤其優選能增強皮膚水化作用、穿透作用或同時有這兩類作用的製劑。其中還可摻入其他藥學可接受的添加劑，包括如稀釋劑、粘合劑、穩定劑、防腐劑和著色劑。
增加對角質層的水化可提高所用溶液的經皮吸收速率(Roberts和Walker，1993)。本發明的「促穿透劑」不包括以下物質，如水，生理緩衝液，鹽溶液，及無法穿透皮膚的酒精。
本發明的目的之一是提供一種通過完整皮膚的新免疫接種方法，其中毋需穿透皮膚。該經皮免疫體系提供了一種方法，使抗原和佐劑可被運送至免疫體系，特別是送至皮下的特化抗原呈遞細胞，如朗格漢斯細胞。
沒有任何特別的理論支持，只是為了解釋我們的發現，我們假定該經皮免疫送遞體系攜帶抗原至免疫體系的細胞，在此誘導免疫應答。抗原可能穿過皮膚的正常保持性外表層(即角質層)，直接誘導免疫應答，或通過某種抗原呈遞細胞(如巨噬細胞、組織巨噬細胞、朗格漢斯細胞、樹突細胞、皮膚樹突細胞、B淋巴細胞或枯否細胞)，將加工後的抗原呈遞給T淋巴細胞，從而誘導免疫應答。也可能抗原藉助毛囊或皮膚小器官(如汗腺、脂腺)穿過角質層。
用細菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)進行的經皮免疫可能靶向的是上皮朗格漢斯細胞，它是最有效的抗原呈遞細胞(APC)之一(Udey，1997)。我們發現，將bARE的鹽溶液施用於皮膚外表面可激活朗格漢斯細胞。朗格漢斯細胞指導特異性免疫應答，即朗格漢斯細胞通過吞噬抗原、遷移至淋巴結、並在其中充當APC，將抗原呈遞給淋巴細胞(Udey，1997)，從而誘導有效的抗體應答。儘管皮膚通常被認為是生物入侵的屏障，但遍布表皮的大量朗格漢斯細胞證實了這道屏障有缺陷，這些細胞的存在意義就在於當有生物體從皮膚入侵時，即產生對抗該生物體的免疫應答(Udey，1997)。
Udey(1997)的觀點是「朗格漢斯細胞來源於骨髓，它們存在於所有哺乳類的復層扁平上皮中。這些細胞構成了未發炎表皮中存在的所有輔助細胞活性，在當前實例中，它們是啟動和擴大針對外表皮所施抗原產生的免疫應答所必需的。朗格漢斯細胞是有效輔助細胞家族(『樹突細胞』)的成員，這類細胞廣泛分布於上皮和實體器官及淋巴樣組織中，但很少被提及…」「現已認識到朗格漢斯細胞(可能還有其他樹突細胞)的生命周期至少有兩個截然不同的時期。表皮中的朗格漢斯細胞組成了捕獲抗原的監視細胞常規網絡。表皮朗格漢斯細胞能攝入顆粒，包括微生物，並有效地加工處理複合抗原。但它們只表達低水平的MHC I類和II類抗原及共同刺激分子(ICAM-1，B7-1和B7-2)，也難以刺激未接觸抗原的T細胞。與抗原接觸後，一些朗格漢斯細胞被激活，從表皮移出，並遷移至局部淋巴結的T細胞依賴區，在此處作為成熟樹突細胞定居下來。在移出表皮並遷移至淋巴結的過程中，攜帶抗原的表皮朗格漢斯細胞(現在是「信使」)在形態、表面表型和功能方面發生巨大變化。與表皮朗格漢斯細胞相比，淋巴樣樹突細胞基本上沒有吞噬能力，也不能有效地加工蛋白質抗原，但可表達高水平的MHC I類和II類抗原及各類共同刺激分子，而且是已鑑定出的原初T細胞的最強有力刺激物。」我們預計，可以利用表皮朗格漢斯細胞的有效抗原呈遞能力，開發經皮送遞疫苗。應用皮膚免疫體系產生經皮免疫應答要求經被動擴散只將疫苗抗原送遞至角質層(由角質化細胞和脂質共同組成的皮膚最外層)朗格漢斯細胞，及隨後激活朗格漢斯細胞，使之攝取抗原，遷移至B細胞濾泡和/或T細胞依賴區，並將抗原呈遞給B細胞和/或T細胞(Stingl等人，1989)。如果待被朗格漢斯細胞吞噬的抗原(如BSA)不是bARE，則這些抗原也可被帶到淋巴結，並呈遞給T細胞，隨後誘導針對該抗原(如BSA)的特異性免疫應答。故經皮免疫的特徵之一是對朗格漢斯細胞的激活，推測這種激活是由細菌ADP-核糖基化外毒素、ADP-核糖基化外毒素結合性亞基(如霍亂毒素B亞基)或其他朗格漢斯細胞激活物進行的。
經由朗格漢斯細胞活化、遷移和呈遞抗原進行的經皮免疫機制已被以下證據證實在用CT或CTB經皮免疫的表皮小片中，表皮朗格漢斯細胞增加了對MHC II類的表達。此外，由經皮免疫誘導的抗體應答水平和同種型變換成IgG佔優勢，通常是由抗原呈遞細胞如朗格漢斯細胞或樹突細胞(Janeway和Travers，1996)刺激的T輔助細胞以及由IgG1和IgG2a的產生揭示的Th1和Th2兩條途徑的激活(Paul和Seder，1994；Seder和Paul，1994)所造成的。而小鼠經CT+OVA免疫後顯示有針對抗原OVA的T細胞增殖。另一方面，用直接激活B細胞的胸腺非依賴性抗原1型(TI-1)可誘導產生巨大的抗體應答(Janeway和Travers，1996)。
接觸性皮炎和特應性皮炎可代表更常見的一類皮膚免疫應答。接觸性皮炎是朗格漢斯細胞激活的致病性表現，它是由朗格漢斯細胞所導致的。朗格漢斯細胞吞噬抗原，遷移至淋巴結，呈遞抗原，使T細胞致敏從而在皮膚感染處產生強烈的破壞性細胞應答(Dah1，1996；Leung，1997)。特應性皮炎中也發生類似的朗格漢斯細胞作用，但與Th2細胞有關，並通常伴隨產生高水平的IgE抗體(Dah1，1996；Leung，1997)。
另一方面，用霍亂毒素及相關bARE進行經皮免疫是一種新型免疫應答，在霍亂毒素免疫接種後的24，48和120小時內並未發生淋巴細胞浸潤，表明沒有出現表面的和微觀的免疫接種後皮膚變化(即無發炎皮膚)。這說明朗格漢斯細胞「含有未發炎表皮中存在的所有輔助細胞活性，在當前實例中，是啟動和擴大針對外表皮所施抗原的免疫應答所必需的」(Udey，1997)。此處經皮免疫應答的獨特性還體現在抗原特異性IgG抗體的高水平、所產生的抗體類別(如IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgA)，以及無抗CT的IgE抗體。
故我們發現，細菌衍生毒素用於皮膚表面時，可激活朗格漢斯細胞或其他抗原呈遞細胞，並誘導有效的免疫應答，表現為產生高水平的抗原抗異性循環IgG抗體。對於一些置於皮膚上時本身並無免疫原性的蛋白質，可在經皮免疫中使用這種佐劑，以增加對所述蛋白質的IgG抗體應答。
經皮靶向朗格漢斯細胞還可用於使其抗原呈遞功能失活，從而阻止發生免疫或致敏作用。使朗格漢斯細胞失活的技術包括，如用白細胞介素10(Peguet-Navarro等，1995)，白細胞介素1β的單克隆抗體(Enk等，1993)，或經超抗原消除朗格漢斯細胞，如經葡萄球菌腸毒素A(SEA)誘導表皮朗格漢斯細胞缺失(Shankar等，1996)。
經皮免疫可由CT、LT或諸如CTB這樣的亞基的神經節苷脂GM1結合活性誘導(Craig和Cuatrecasas，1975)。神經節苷脂GM1是廣泛存在於所有哺乳動物細胞膜上的糖脂(Plotkin和Mortimer，1994)。CT B亞基五聚體結合至細胞表面時，會形成親水孔，可容許A亞基穿過脂質雙層(Ribi等，1988)。
我們已顯示，用CT或CTB進行經皮免疫，可能需神經節苷脂GM1結合活性。當用CT、CTA和CTB經皮免疫小鼠時，只有CT和CTB引起了免疫應答。CTA含有ADP-核糖基化外毒素活性，但只有含結合活性的CT和CTB才能誘導免疫應答，說明經皮膚免疫必需B亞基，且只要B亞基即足夠了。我們得出結論，朗格漢斯細胞或其他抗原呈遞細胞可由於CTB結合至它的表面而被激活。抗原本發明的抗原可經重組表達，較優選是作為與親和標記或表位標記的融合體表達(Summers和Smith，1987；Goeddel，1990；Ausubel等，1996)；化學合成的寡肽，不管是游離的還是偶聯於載體蛋白上，均可用於獲得本發明的抗原(Bodanszky，1993；Wisdom，1994)。寡肽被視為多肽的一類。
較優選長為6至20個殘基的寡肽。多肽也可被合成為分支結構，就如美國專利號5,229,490和5,390,111所述的那些多肽。抗原性多肽包括，如合成或重組B細胞和T細胞表位，T細胞通用表位，以及來自不同生物體或疾病的B細胞表位和T細胞表位的混合體。
經重組或肽合成方式獲得的抗原，及得自天然來源或提取物中的本發明抗原，均可藉助於抗原的物理或化學性質純化，較優選通過分級分離或層析進行純化(Janson和Ryden，1989；Deutscher，1990；Scopes，1993)。
可以用多價抗原製劑同時誘導對不止一種抗原的免疫應答。偶聯物可用於誘導對多種抗原的免疫應答，或可用於加強免疫應答，或用於二者。此外，毒素免疫可用類毒素加強，或類毒素免疫可用毒素加強。經皮免疫可用於最初經其他免疫途徑如注射、口服或經鼻途徑誘導的應答進行加強。
抗原包括如毒素、類毒素、其亞基，或其組合(如霍亂毒素、破傷風類毒素)。
可將抗原溶於水或其他溶劑(如甲醇)中，或溶於緩衝液中。適合的緩衝液有，但不限於，不含Ca++/Mg++離子的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)，生理鹽水(溶於水中的150mM NaCl)，及Tris緩衝液。可以將不溶於中性緩衝液中的抗原溶於10mM醋酸中，再用中性緩衝液(如PBS)稀釋至所需體積。至於只在酸性pH可溶的抗原，可用稀醋酸溶解，再用酸性pH的醋酸鹽-PBS作稀釋劑。本發明中甘油可作為合適的非水性緩衝液使用。
如果抗原(如A肝病毒)本身並不可溶，則抗原可以懸浮液或甚至是凝聚物的形式存在於製劑中。
疏水性抗原可溶於去汙劑中，如含跨膜結構域的多肽抗原。而且，對於含脂質體的製劑，可以將去汙劑溶液中的抗原(如細胞膜的提取物)與脂類混合，再經稀釋、透析或柱層折去除去汙劑即可形成脂質體。某些抗原，如來自病毒(如A肝病毒)的那些抗原，並不需要它們本身可溶，而可以病毒體形式直接摻入到脂質體中(Morein和Simons，1985)。
Plotkin和Mortimer(1994)提供的抗原可用於免疫接種動物或人體，以誘導對具體病原體特異的免疫應答，他們還提供了製備抗原、確定抗原的合適劑量、免疫應答誘導量的測定以及治療病原體(如細菌、病毒、真菌或寄生蟲)所致感染的方法。
細菌包括例如炭疽，彎曲桿菌，霍亂菌，白喉菌，腸產毒性大腸桿菌，賈第鞭毛蟲，淋球菌，幽門螺桿菌(Lee和Chen，1994)，B型流感嗜血桿菌，非典型流感嗜血桿菌，腦膜炎球菌，百日咳菌，肺炎球菌，沙門氏菌，志賀氏菌，B族鏈球菌，A族鏈球菌，破傷風菌，霍亂弧菌，耶爾森氏菌，葡萄球菌，各種假單胞菌及各種梭菌。
病毒包括腺病毒，登革病毒1至4血清型(Delenda等，1994；Fonseca等，1994；Smucny等，1995)，伊波拉病毒(Jahrling等，1996)，腸道病毒，甲、乙、丙、丁、戊各血清型肝炎病毒(Blum，1995；Katkov，1996；Lieberman和Greenberg，1996；Mast，1996；Shafara等，1995；Smedila等，1994；美國專利號5,314,808和5,436,126)，單純皰疹病毒1型或2型，人類免疫缺陷病毒(Deprez等，1996)，流感病毒，日本馬腦炎病毒，麻疹病毒，諾沃克病毒，乳頭瘤病毒，細小病毒B19，脊髓灰質炎病毒，狂犬病毒，輪狀病毒，風疹病毒，牛痘病毒，含有可編碼其他抗原(如瘧疾抗原)的基因的牛痘病毒構建物，水痘病毒以及黃熱病毒。
寄生蟲包括溶組織內阿米巴(Zhang等，1995)；瘧原蟲(Bathurst等，1993；Chang等，1989，1992，1994；Fries等，1992a，1992b；Herrington等，1991；Khusmith等，1991；Malik等，1991；Migliorini等，1993；Pessi等，1991；Tam，1988；Vreden等，1991；White等，1993；Wiesmueller等，1991)，利什曼原蟲(Frankenburg等1996)，弓形體和蠕蟲。
抗原也包括用於生物戰的那些物質，如蓖麻蛋白，對其可通過抗體達到保護效果。佐劑製劑中還含有佐劑，雖然單單一種分子可能既有佐劑性質又有抗原性質(如霍亂毒素)(Elson和Dertzbaugh，1994)。佐劑是用於特異性或非特異性地增強抗原特異性免疫應答的物質。通常在呈遞抗原之前混合佐劑和製劑，但也可以在一個較短的時間間隔內分別呈遞抗原和佐劑。
佐劑包括例如油乳劑(如完全或不完全弗氏佐劑)，趨化因子(如防衛素1或2，RANTES，MIP1-α，MIP-2，白細胞介素8)或細胞因子(如白細胞介素-1β、-2、-6、-10或-12；γ-幹擾素；腫瘤壞死因子-α；或粒細胞-單核細胞集落刺激因子(Nohria和Rubin的綜述，1994)，胞壁醯二肽衍生物(如murabutide，蘇氨醯基-MDP或胞壁醯三肽)，熱休克蛋白或其衍生物，Leishmaniamajor LeIF衍生物(Skeiky等1995)，霍亂毒素或霍亂毒素B，脂多糖(LPS)衍生物(如脂質A或單磷醯基脂質A)，或超抗原(Saloga等，1996)。可用於免疫接種的佐劑亦可參見Richards等(1995)。
所選佐劑可優選誘導抗體或細胞效應物，特異性抗體同種型(如，IgM，IgD，IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgE，IgG1，IgG2，IgG3和/或IgG4)，或特異性T細胞亞群(如CTL，Th1，Th2和/或TDTH)(Glenn等，1995)。
霍亂毒素是細菌外毒素，屬ADP-核糖基化外毒素(bARE)家族。大多數bARE均為A∶B二聚體形式，有一個結合性B亞基和一個含ADP-核糖基轉移酶的A亞基。這類毒素包括白喉毒素，假單胞菌外毒素A，霍亂毒素(CT)，大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)，百日咳毒素，肉毒梭菌毒素C2，肉毒梭菌毒素C3，泥渣梭菌胞外酶，蠟狀芽孢桿菌胞外酶，假單胞菌外毒素S，金黃色葡萄球菌EDIN和球形芽孢桿菌毒素。
霍亂毒素是由A和B亞基組成的範例bARE。B亞基是結合亞基，由B亞基五聚體組成，其非共價結合於A亞基。B亞基五聚體排列成對稱的環形結構，與靶細胞表面的GM1神經節苷脂結合。A亞基使包括Gs蛋白在內的異三聚體GTP蛋白(G蛋白)亞群的α亞基發生ADP核糖基化，從而提高胞內環腺苷酸(cAMP)水平。就霍亂而言，這將刺激腸細胞釋放離子和液體。
霍亂毒素(CT)及其B亞基(CTB)用作肌內或口服免疫原時具有佐劑性質(Elson和Dertzbaugh，1994；Trach等，1997)。另一種抗原-大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)，與CT在胺基酸水平有80％同源，並具有相似的結合特性；它也可在腸內結合GM1神經節苷脂受體，並有相似的ADP-核糖基化外毒素活性。另一種bARE，假單胞菌外毒素A(ETA)，能結合α2巨球蛋白受體-低密度脂蛋白受體相關蛋白(Kounnas等，1992)。bARE由Krueger和Barbieri(1995)進行了綜述。
口服、鼻內和肌內途徑施用CT帶來的毒性限制了它可用作佐劑的劑量。在一項對比試驗中，肌內注射CT後，在注射部位引發了大面積腫大。相比之下，等量或更大劑量的CT用於皮膚上則無毒性產生。
以下實施例顯示，霍亂毒素(CT)、其B亞基(CTB)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)及百日咳毒素均是經皮免疫的有效佐劑，可誘導高水平的IgG抗體，但不產生IgE抗體。其中還顯示，沒有CT只有CTB也能誘導產生高水平IgG抗體。所以說bARE及其衍生物以簡單的溶液形式用於皮膚外表面時均能有效引起免疫。此外，這些實施例還證實CT、CTB和bARE既可作佐劑，又可作抗原。
BSA用於皮膚上時一般並沒有免疫原性，但與佐劑如CT混合後，可誘導抗BSA抗體。單獨用白喉類毒素不能誘導免疫應答，但同時用百日咳毒素作佐劑就可以誘導產生對白喉類毒素的免疫應答。所以說，bARE在經皮免疫體系中可用作非免疫原性蛋白質的佐劑。
其它蛋白質也可以既作佐劑又作抗原。如FLUZONE(Lederle)，分離的流感病毒甲型和乙型病毒體疫苗中含有強免疫免原性神經氨酸酶和血凝素，可作為其自身抗原和佐劑，經皮引起有效免疫，產生保護作用。類毒素，如經甲醛處理形成的白喉類毒素，經過氧化氫處理形成的百日咳類毒素；或是毒素突變體，如經基因工程技術破壞核糖基轉移酶活性而被類毒素化的霍亂毒素或大腸桿菌不耐熱腸毒素，仍可能保留了佐劑特性，既可用作抗原，又可用作佐劑。
對白喉、百日咳和破傷風(DPT)等危及生命的感染可經誘導高水平的循環性抗毒素抗體而對機體產生保護作用。有些研究人員認為百日咳是個例外，其保護作用必需有針對該侵染生物體其它部位的抗體，儘管對此有爭議(見Schneerson等，1996)，且最新代的非細胞性百日咳疫苗仍以PT(百日咳毒素)作為其中的成分(Krueger和Barbieri，1995)。DPT致病的病理機制直接與其毒素的作用有關，抗毒素抗體在保護作用中當然佔有重要位置(Schneerson等，1996)。
一般而言，毒素可經化學失活處理使其毒性減弱但仍保留免疫原性，成為類毒素。我們預計，在經皮免疫體系中用基於毒素的免疫原和佐劑能獲得有足夠保護作用的抗毒素水平以抵抗這些疾病。抗毒素抗體可通過用毒素或基因工程減毒的類毒素本身、或聯合使用類毒素與佐劑如CT、或單獨用類毒素而免疫產生。預計經基因工程改造後，其ADP-核糖基化外毒素活性有所改變，但結合活性未變的類毒素化毒素，在用於經皮免疫時，可以作為抗原呈遞細胞的無毒性激活物，發揮特別作用。
我們預計CT可作為佐劑，通過經皮免疫誘導抗原特異性CTL(見Bowen等，1994；CT在口服免疫接種中用作佐劑的用途參見Porgador等，1997。)bARE佐劑可經化學作用偶聯至其他抗原，如糖類、多肽、糖脂和糖蛋白抗原。這些抗原與毒素、其亞基或類毒素的化學偶聯物在施用於外表皮時預計能增強對這些抗原的免疫應答。
為克服毒素的毒性問題(例如，已知白喉毒素很毒，其一個分子即可殺死一個細胞)，並克服處理這種強毒性毒素如破傷風毒素時的危險性，一些工作者採用了重組方法生產基因工程化類毒素。這依據的是通過基因缺失使ADP-核糖基轉移酶的催化活性失活。這些毒素與天然毒素相比，保留了結合能力，但無毒性。該方法由Burnette等，(1994)，Rappuoli等(1995)和Rappuoli等(1996)進行了描述。這種基因工程類毒素化的外毒素可用於經皮免疫體系中，這是因為類毒素被視為沒有毒性，也就不會帶來安全問題。它們既可為抗原，又可作佐劑，增強對其自身或所添加抗原的免疫應答。另有好幾種技術可用於對會產生同樣問題的毒素進行化學類毒素化(Schneerson等，1996)。或者，可利用毒素或類毒素的片段，如破傷風毒素的C片段。在某些應用中，尤其在幼兒應用中，由於攝入毒素(如白喉毒素)可能會引起不利反應，這些技術就顯得很重要。
或者，可以利用朗格漢斯細胞激活物作佐劑。這種激活物的例子包括熱休克蛋白誘導物；接觸致敏劑(如三硝基氯苯，二硝基氟苯，氮芥，十五烷基兒茶酚)；毒素(如志賀菌毒素，葡萄球菌腸毒素B)；脂多糖，脂質A及其衍生物；細菌DNA(Stacey等，1996)；細胞因子(如腫瘤壞死因子-α，白細胞介素-1β，-10，-12)；以及趨化因子(如防衛素1或2，RANTES，MIP-1α，MIP-2，白細胞介素8)。
本發明中可以使用不同佐劑的組合物。例如，含CpG核苷酸序列的細菌DNA與ADP-核糖基化外毒素的組合物可以用於介導對經皮施用之抗原的T輔助細胞應答。因此，利用非甲基化CpG細菌DNA，或其他蛋白質，如LeIF或鈣通道阻斷劑，可使針對佐劑為CT的抗原的Th1或Th2樣應答發生切換。
CpG結構模式可使免疫系統識別其致病性部位，激發固有免疫應答，產生適應性免疫應答(Medzhitov和Janeway，Curr.Opin.Immunol.，1997年，第9期，4-9頁)。這些結構被稱為病原體相關性分子模式(PAMP)，包括脂多糖、磷壁酸、非甲基化CpG基元、雙鏈RNA和mannin。
PAMP誘導可介導炎症反應的內源信號，作為T細胞功能的共同刺激物，並控制效應物的功能。PAMP誘導這些反應的能力對於它們作為佐劑的能力是很重要的，其靶點是APC，如巨噬細胞和樹突細胞。皮膚的抗原呈遞細胞亦可由穿過皮膚送遞的PAMP所刺激。如朗格漢斯細胞這類樹突細胞，可被皮膚上的PAMP溶液與經皮弱免疫原性分子所激活，並被誘導遷移，將該弱免疫原性分子呈遞給淋巴結中的T細胞，誘導針對該弱免疫原性分子的抗體應答。PAMP亦可與其他皮膚佐劑(如霍亂毒素)結合使用，以誘導不同的共同刺激分子，並控制不同效應物功能，從而指導免疫應答，如從Th2至Th1的應答。
若免疫抗原有足夠能力激活朗格漢斯細胞，則不必另用佐劑，如既可作抗原又可作佐劑的CT就是如此。預計全細胞製劑、活病毒、減毒病毒、DNA質粒和細菌DNA均能有效地經皮免疫。或許可以用低濃度的接觸致敏劑或其他朗格漢斯細胞激活物誘導免疫應答，而不會帶來皮膚損傷。脂質體及其製備脂質體為封閉小泡，內包水相空間。內部區室與外界介質間被由分散的脂質分子組成的脂質雙層所隔開。本發明中，可穿過完整皮膚將抗原送遞至免疫體系的特化細胞，在那裡誘導抗原特異性免疫應答。經皮免疫可用脂質體完成；但正如實施例中所示，脂質體並非激發抗原特異性免疫應答所必需的。
可採用多種技術，利用膜脂質製備脂質體(由Gregoriadis，1993綜述)。可先形成脂質體，再混合抗原。可將抗原溶解或使其呈懸浮狀態，再將其加入(a)凍幹狀態的已成型脂質體，(b)作為溶脹溶液或懸浮液的幹脂質，或(c)用於形成脂質體的脂質溶液。也可用從角質層提取的脂質(如神經醯胺和膽固醇衍生物)製成脂質體(Wertz，1992)。
氯仿是較優選的脂溶劑，但它在貯存時易變質。因而每隔1至3個月，氯仿需重蒸餾後再用作形成脂質體的溶劑。蒸餾後可加入0.7％乙醇作防腐劑。乙醇和甲醇也是適合的溶劑。
將用於形成脂質體的脂溶液置於一圓底瓶中。較優選梨形燒瓶，尤其是Lurex Scientific的產品(Vineland，新澤西，產品目錄號JM-5490)。燒瓶的體積應比預期加入的脂質體水懸液體積至少大10倍，以便在形成脂質體過程中可以適當地攪動。
用旋轉蒸發器，藉助附於水龍頭上的抽濾器，在負壓下於37℃除溶劑10分鐘。再將燒瓶置於乾燥器中，在低真空(即低於50毫米汞柱)下進一步乾燥1小時。
為將抗原包入脂質體中，可將抗原水溶液按一定體積加入至凍幹的脂質體脂質中，使脂質體脂質終濃度約為200mM，並搖晃或振蕩直至所有幹脂質體脂質全變溼。然後可將脂質體-抗原混合液於4℃放置18至72小時。該脂質體-抗原製劑可立即使用，也可存放數年。較優選直接在經皮免疫體系中採用這種製劑，而不去除未被包入脂質體的抗原。可用水浴超聲處理之類的技術使脂質體變小，以增強經皮免疫。
可不將抗原加至水溶液中，而仍按上述方法製備脂質體。再在制好的脂質體中加入抗原，因而抗原可以是溶液形式，和/或與脂質體相關，但未被其包裹。製備含有脂質體的製劑這一方法因其簡便而較為優選。可用水浴超聲處理之類的技術改變脂質體的大小和/或層數以增強免疫。
儘管本發明的實施並不要求，但加脂質體至製劑中可促進對角質層的水化作用。脂質體已用作載體，與佐劑共同增強對混合於、包裹於、附著於脂質體或與其關聯的抗原的免疫應答。抗原的經皮送遞用本發明可以獲得有效的免疫，因為抗原的經皮運送可靶向朗格漢斯細胞。這些細胞大量存在於皮膚中，是有效的抗原呈遞細胞，產生T-細胞記憶，並發生有效免疫應答(Udey，1997)。由於皮膚中大量朗格漢斯細胞的存在，經皮送遞的效率可能與皮膚表面接觸抗原和佐劑的面積相關。事實上，經皮免疫之所以如此有效，可能就是因為它靶向的是比肌內免疫更大量的有效抗原呈遞細胞。但只需少量朗格漢斯細胞或樹突細胞便足以引起免疫。
我們預計，本發明將增強免疫接種方式，並誘導有效免疫應答。因為經皮免疫不涉及穿透皮膚及其複雜性和困難，對訓練有素之人、無菌技術、無菌設備的需求有所降低。而且，也消除了對於在多個位點免疫或進行多次免疫的屏障。我們還預計，可通過一次施用製劑而進行免疫接種。
用單純的抗原加佐劑溶液浸透紗布，置於封閉性補片內，或用其它補片技術，進行外表皮施用，可以完成免疫接種；還可用乳油，浸透劑，油膏和噴霧劑等其它可能的施用方法。免疫接種可由未經訓練者完成，亦可自己完成。由於易於操作，故可進行大面積免疫接種。此外，一次簡單的免疫接種操作即可改善對幼兒患者、成年人和第三世界國家人們的免疫接種。
類似地，動物亦可用本發明免疫。可在耳、下腹、爪、結膜、皮膚擦破處或肛門區等解剖學部位用藥，或用蘸、浸等方法用藥。
過去的疫苗製劑是用針注射入皮膚內的。用針注射疫苗有些缺點，如注射伴有痛感，需無菌針頭和注射器，需訓練有素的醫務人員來完成疫苗接種，注射會引起不適，及用針穿刺皮膚會帶來一些潛在的併發症。不用針而通過皮膚免疫(即經皮免疫)避免了上述缺點，因而是疫苗送遞的一大進步。
本發明的經皮免疫送遞體系也無需用聲能或電能穿透完整皮膚。這種用電場誘導擊穿角質層電介質的體系在美國專利號5,464,386中有述。
此外，經皮免疫可能優於用針免疫，因為在前一情況下，使用靶向皮膚表面大面積的多位點免疫接種，可能會靶向更多的免疫細胞。足以誘導免疫應答的治療有效量抗原既可在單一皮膚部位、又可在覆蓋多個引流淋巴結區(如頸部，腋窩，腹股溝，肱骨內上髁，膕，那些胸腹部區域)一塊完整皮膚區域進行經皮送遞。與在單一部位，經皮內、皮下或肌內注射少量抗原相比，在遍布全身的各部位靠近大量不同淋巴結的這種部位進行接種會對免疫體系產生更廣泛刺激。
穿過或進入皮膚的抗原可能會遇到抗原呈遞細胞，它們以某種方式加工抗原而誘導免疫應答。多處免疫接種可募集更大量抗原呈遞細胞，而募集的更大量抗原呈遞細胞群體會更強烈地誘導免疫應答。經皮免疫可在十分接近淋巴結引流處用藥，因而能提高免疫接種的效率或效力。我們設想，經皮膚吸收可將抗原送遞至皮膚的吞噬細胞，如皮膚樹突細胞，巨噬細胞，及其他皮膚抗原呈遞細胞；抗原還可被送遞至肝、脾及骨髓的吞噬細胞內，已知這些細胞能通過血液或淋巴系統而充當抗原呈遞細胞。結果將會是抗原被廣泛分送至抗原呈遞細胞，這是目前所用的免疫方法很少能達到的。
經皮免疫體系可直接施用於皮膚，並且使其風乾；亦可擦入皮膚或頭皮內；與敷料、補片或吸收劑一起附在皮膚上；或通過如襪子、施鞋、手套或襯衫等裝置而附著；或噴在皮膚上以儘可能大面積地接觸皮膚。抗原製劑可在吸收劑敷料內或紗布內施用。製劑亦可包裹在封閉性敷料內，諸如在抗原和AQUAPHOR(凡士林，礦物油，礦物蠟，羊毛蠟，泛醯醇(panthenol)，bisabol和甘油，均來自Beiersdorf提供)，塑料膜，浸漬聚合物，COMFEEL(Coloplast)或凡士林的乳劑中；或包裹在非封閉性敷料內，如DUODERM(3M)或OPSITE(Smith Napheu)。封閉性敷料完全不容許水通過。部分封閉性敷料(如TEGADERM(可提供水化作用，並可使補片較長時間敷用，或防止皮膚發生浸漬。
製劑可以被施用於單一或多個位點，或者單一或多處肢體，或通過完全浸入而施用於皮膚表面大面積區域。亦可將製劑直接施用於皮膚。
基因免疫已由美國專利號5,589,466和5,593,972進行了描述。製劑中所含核酸可編碼抗原、佐劑，或同時編碼二者。該核酸可以能夠或不能夠複製；可以是非整合性的和非感染性的。該核酸中還可含有與編碼抗原或佐劑之序列有效地連接在一起的調節區(如啟動子、增強子、沉默子、轉錄啟動位點和終止位點、RNA剪切受體位點和供體位點，多聚腺苷酸化信號，內部核糖體結合位點、翻譯起始點和終止點)。該核酸可以與促進轉染的試劑(如陽離子脂質，磷酸鈣，DEAE-葡聚糖，Polybrene-DMSO，或其組合物)複合。該核酸還可含有來源於病毒基因組的區域。這些物質和技術均描述於Kriegler(1990)和Murray(1991)中。
免疫應答可包括體液效應物(即抗原特異性抗體)和/或細胞效應物(即抗原特異性淋巴細胞，如B細胞，CD4+T細胞，CD8+T細胞，CTL，Th1細胞，Th2細胞，和/或TDTH細胞)。而且免疫應答還可包括NK細胞，其介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。
本發明製劑所誘導的免疫應答可以包括激發抗原特異性抗體和/或細胞毒性淋巴細胞(CTL，Alving和Wassef，1994中進行了綜述)。可用免疫檢測技術測定抗體，並可測出各種同種型(如IgM，IgD，IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgE，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)。亦可用中和試驗檢測免疫應答。
抗體是B淋巴細胞產生的保護性蛋白質。它們具有高度特異性，通常靶向抗原的其中一個表位。在抵抗疾病的保護作用中，抗體常通過與導致該病之病原體來源的抗原發生特異性反應而起著一定的作用。免疫接種可誘導產生對該免疫抗原(如霍亂毒素)特異的抗體。當抗原經脂質體穿過皮膚送遞時，可誘導產生抗原特異性抗體。
CTL是特殊的保護性免疫細胞，可抵抗病原體感染。它們也是高度專一的。免疫接種可誘導產生對抗原(如基於瘧疾蛋白以及自身主要組織相容性抗原的合成多肽)特異的CTL。通過經皮免疫送遞體系免疫接種誘導的CTL可殺死被病原體感染的細胞。免疫接種也可用於產生記憶性應答，表現在加強抗體和CTL的應答，抗原刺激後淋巴細胞培養物中淋巴細胞發生增殖，及皮內單用抗原刺激皮膚引起的延遲型超敏反應。
鈣通道阻斷劑(如利心平、Verpamil)能通過抑制抗原代謝及隨後的表皮朗格漢斯細胞呈遞，而抑制接觸性超敏反應，估計可以利用這種鈣通道阻斷劑對經皮免疫誘導的T-輔助細胞應答進行操縱。經皮施用鈣通道阻斷劑估計會影響共同刺激分子(如B7相關家族)的表面表達及後續T輔助細胞應答的產生。估計加入鈣通道阻斷劑還可能會抑制延遲型超敏反應，可用於選擇以細胞免疫為主的應答或是以體液免疫為主的應答。
在病毒中和試驗中，將血清的連續稀釋液加入宿主細胞中，然後用感染性病毒攻擊，觀察細胞的感染情況。或者，可將血清的連續稀釋液與感染性滴度的病毒溫育後再接種動物，然後觀察接種動物是否出現感染症狀。
本發明的經皮免疫體系可用動物或人的攻擊模型進行評估，其中評估的是抗原接種保護受試者抵抗疾病的能力。有這種保護作用就證明了有抗原特異性免疫應答。攻擊模型中，達到5IU/ml或更高的抗白喉抗體效價通常就認為是最佳保護作用，將此看作有保護作用的替代標誌(Plotkin和Mortimer，1994)。
此外，鐮狀瘧原蟲攻擊模型可用於誘導人的抗原特異性免疫應答。可對人志願者接種含有衍生自瘧疾寄生蟲之寡肽或蛋白質(多肽)的經皮免疫體系，再用實驗手段或經自然感染瘧疾。利用Plasmodium yoelii小鼠瘧疾攻擊模型可以評價小鼠中抗瘧病的保護作用(Wang等，1995)。
Alving等(1986)將含有脂質A的作為佐劑的脂質體注射到兔子中，以誘導對霍亂毒素(CT)及對由瘧疾寡肽組成之合成蛋白質的免疫應答，所述瘧疾寡肽含有與BSA偶聯的4個四肽(Asn-Ala-Asn-Pro)。作者發現，與無脂質A的類似脂質體相比，將抗原包裹在含有脂質A的脂質體內，大大增強了對霍亂毒素或合成瘧疾蛋白的免疫應答。現已將衍生自鐮狀瘧原蟲環子孢子蛋白(CSP)或裂殖子表面蛋白的數種抗原，包裹於含脂質A的脂質體中。包入含脂質A的脂質體中的所有瘧疾抗原均顯示能誘導體液免疫效應物(即抗原特異性抗體)，其中一些顯示還能誘導細胞介導的應答。通過免疫螢光術，對整個固定的瘧疾子孢子或CTL對轉染了CSP的靶細胞的殺傷力進行分析，可以測定接種了瘧疾抗原的動物中產生免疫應答和免疫保護的情況。
小鼠經皮免疫霍亂毒素後可抵抗鼻內20μg霍亂毒素的攻擊、Mallet等(私人通信)發現，C57B1/6小鼠鼻內用CT攻擊後，產生了致死性的出血性肺炎。或者，小鼠可接受腹膜內一定劑量的CT攻擊(Dragunsky等，1992)。霍亂毒素特異性IgG或IgA抗體可提供對抗霍亂毒素攻擊的保護(Pierce，1978；Pierce和Reynolds，1974)。
人接受LT或CT免疫接種後，再相應用分泌LT的大腸桿菌或分泌CT的霍亂弧菌攻擊，預計可產生類似的保護效果。此外，還證實在CT和LT免疫接種者及CT和LT所致疾病患者中有交叉保護現象。
如以下實施例所示，黏膜免疫力可藉助於經皮接種途徑獲得。小鼠經皮接種CT後可檢測到黏膜IgG和IgA的存在。對於病理過程發生在黏膜部位的疾疾，如LT或CT所致疾病，或病原生物體的侵染發生在黏膜部位的疾病，或黏膜感染是重要致病因素的疾病，由經皮途徑引起黏膜免疫以達到保護作用可能有重要意義。
可以預計，針對流感之類疾病進行經皮免疫，由於能夠誘導黏膜免疫或全身性免疫，或者體液、細胞或黏膜免疫力之組合，因而這種免疫接種可能是有效的。
疫苗可有效抵抗某些宿主效應，如通過誘導抗鉗合蛋白抗體，可阻止瘧疾中紅細胞結合至血管內皮。
用滅活全病毒，病毒衍生的亞基或其重組產物，通過經皮途徑有可能誘導產生保護性抗體，如抗A肝、B肝或戊肝的抗體。
經皮免疫誘導產生的抗毒素抗體可抵抗破傷風、白喉及其它毒素介導性疾病。預計可以使用含有如CT及類毒素(如破傷風和白喉等類毒素)，或片段(如破傷風C片段)之類佐劑的破傷風「加強型」補片。初次免疫後，通過注射或經皮接種相同或相似抗原，可達到加強免疫。對於可誘導免疫力，但在加強免疫中有潛在負作用的注射性免疫接種，以經皮加強免疫為佳。口或鼻免疫均可用經皮途徑加強。還可同時使用注射途徑和經皮途徑免疫。
免疫接種也已用作癌症和自身免疫疾病的治療方法。例如，接種腫瘤抗原(如前列腺特異性抗原)後，可誘導抗體形成、CTL及淋巴細胞增殖等多種形式的免疫應答，使機體免疫體系識別並殺死腫瘤細胞。在癌症免疫治療中，已有結果表明，靶向樹突細胞(朗格漢斯細胞即為其中的特殊亞群)是一種重要戰略。可用於接種的腫瘤抗原已就黑色素瘤(美國專利號5,102,663，5,141,742，和5,262,177)、前列腺癌(美國專利號5,538,866)和淋巴瘤(美國專利號4,816,249，5,068,177和5,277,159)進行了描述。接種T細胞受體寡肽可誘導產生免疫應答，使自身免疫疾病的進程終止(美國專利號5,612,035和5,614,192；Antel等，1996；Vandenbark等，1996)。美國專利號5,552,300也描述了適於治療自身免疫疾病的抗原。
下文意在舉例說明本發明，但本發明的實施不受這些實施例的任何限制。
實施例免疫接種操作用40#剪刀對6-8周齡BALB/C小鼠剃毛。剃毛過程應不對皮膚造成任何損傷。剃毛範圍從胸廓中部至緊貼頸背下部。讓小鼠休息24小時。此前已對小鼠作了耳部標記以便辯認，並已預先取血以獲得免疫前血清。也在未去毛小鼠的每隻耳朵處施用多達50μl免疫溶液，對其進行經皮免疫。
然後按如下方法免疫小鼠。用20mg/ml甲苯噻嗪溶液0.03-0.06ml，100mg/ml氯胺酮0.5ml麻醉小鼠；這一劑量的麻醉劑使小鼠靜止不動約1小時。將小鼠腹面朝下置於溫暖的毯子上。
將免疫溶液按以下方法加到小鼠的去毛背部皮膚上將1.2cm×1.6cm的鏤空聚苯乙烯板輕輕放在小鼠背部，用浸透鹽水的無菌紗布部分溼潤皮膚(可用免疫溶液)，然後用滴管將免疫溶液加在鏤空板處，形成2cm2的免疫溶液補片。或者，在剃毛部位或耳部均勻地塗上固定體積的免疫溶液。小心使滴管尖不刮傷或擦傷皮膚。用滴管尖較光滑的一側將免疫溶液在欲覆蓋的區域內塗開。
使免疫溶液(約100μl至200μl)在小鼠背部靜置60至180分鐘。60分鐘後，輕輕抓住小鼠的脖子和尾部，用大量微溫的自來水衝洗10秒鐘。然後用一塊無菌紗布將小鼠輕輕拍幹，再洗10秒；再次拍幹後將小鼠放回籠中。小鼠看起來對麻醉、免疫接種、洗滌過程或外毒素的毒性沒表現出任何不適反應。免疫接種後，未見皮膚刺激或紅腫，小鼠生存狀態很好。用耳免疫方法同上，只是不必在免疫接種前去毛。抗原用以下抗原進行免疫接種和ELISA測定，並將抗原與無菌PBS或生理鹽水混合。霍亂毒素或CT(List Biologicals，目錄號101B，批號10149CB)，CT的B亞基(List Biologicals，目錄號BT01，批號CVXG-14E)，CT的A亞基(List Biologicals，目錄號102A，批號CVXA-17B)，CT的A亞基(Calbiochem，目錄號608562)；百日咳毒素(不含鹽)(List Biologicals，批號181120a)；破傷風類毒素(List Biologicals，批號1913a和1915a)；假單胞菌外毒素A(List Biologicals，批號ETA25a)；白喉類毒素(List Biologicals，批號15151)；大腸桿菌不耐熱腸毒素(Sigma，批號9640625)；牛血清白蛋白或BSA(Sigma，目錄號3A-4503，批號31F-0116)；流感嗜血桿菌B偶聯物(Connaught，批號6J81401)。ELISA-IgG(H+L)在類似於Glenn等(1995)的技術中，利用ELISA方法，測定CT、LT、ETA、百日咳毒素、白喉類毒素、破傷風類毒素、流感嗜血桿菌B偶聯物、流感病毒、鉗合蛋白和BSA的特異性抗體。所有抗原均溶於無菌鹽溶液中，濃度為2μg/ml。按每孔50μl(0.1μg)，將溶液加到IMMULON-2聚苯乙烯平板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)上，並在室溫溫育過液。然後用0.5％酪蛋白/0.05％吐溫20封閉緩衝溶液封閉平板1小時。血清用0.5％酪蛋白/0.05％吐溫20稀釋劑稀釋；在平板上的各欄中對各稀釋度進行處理。在室溫溫育2小時。
然後用PBS-0.05％吐溫20洗滌溶液洗滌平板4次，按1/500的稀釋度，將山羊抗小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶(HRP)連接的(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，目錄號170-6516)二抗稀釋於酪蛋白稀釋劑中，加在平板上，於室溫1小時。然後在PBS-吐溫洗滌溶液中洗滌平板4次。每孔中加入100μl 2，2』-連氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉)磺酸底物(Kirkegaard和Perry)，顯色20-40分鐘後在405nm的波長下讀取平板的吸光度。結果表示為各份血清的幾何平均值及ELISA單位(吸光度相當於1.0的血清稀釋度)平均值的標準誤差或ELISA單位形式的各種抗體應答。ELISA-IgG(γ)，IgM(μ)和IgA(α)在類似於Glenn等(1995)的技術中，利用ELISA方法，測定IgG(γ)，IgM(μ)和IgA(α)抗CT抗體。將CT溶於無菌鹽溶液中，濃度為2μg/ml。按每孔50μl(0.1μg)，將溶液加到IMMULON-2聚苯乙烯平板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)上，並在室溫溫育過液。然後用0.5％酪蛋白/0.05％吐溫20封閉緩衝溶液封閉平板1小時。血清用酪蛋白稀釋劑稀釋；在平板上進行連續稀釋。在室溫溫育2小時。
然後用PBS-吐溫洗滌溶液洗滌平板4次，按1/1000的稀釋度，將山羊抗小鼠IgG(γ)辣根過氧化物酶(HRP)連接的(Bio-RadLaboratories，Richmond，CA，目錄號172-1038)、山羊抗小鼠IgM(μ)HRP連接的(BioRad Laboratories，Richmond，CA，目錄號172-1030)或山羊抗小鼠IgA HRP連接的(Sigma，St.Louis，MO，目錄號1158985)二抗稀釋於酪蛋白稀釋劑中，加在平板上，於室溫1小時。然後在PBS-吐溫洗滌溶液中洗滌平板4次。每孔中加入100μl 2，2』-連氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉)磺酸底物(Kirkegaard和Perry，Gaithersburg，MD)，在405nm的波長下讀取平板的吸光度。結果表示為各份血清的幾何平均值及ELISA單位(吸光度相當於1.0的血清稀釋度)平均值的標準誤差。ELISA-IgG亞類如Glenn等(1995)所述，測定抗CT、LT、ETA和BSA的抗原特異性IgG亞類(IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3)。在IMMULON-2聚苯乙烯板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)上進行固相ELISA。每孔分別加入相應抗原的鹽溶液(0.1μg/50μl)，溫育過夜，並用0.5％酪蛋白-吐溫20封閉。對稀釋於0.5％酪蛋白中的每份小鼠血清進行連續稀釋，再在室溫下溫育4小時。二抗由辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠同種型特異性抗體(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，The Binding Site，San Diego，CA)組成。用小鼠骨髓瘤IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3(The Binding Site，San Diego，CA)，測定每亞類的標準曲線。標準孔用山羊抗小鼠IgG(H+L)(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA，目錄號172-1054)包被，以捕獲以連續稀釋度加入的骨髓瘤IgG亞類標準品。也用過氧化物酶偶聯的山羊抗小鼠亞類特異性抗體檢測骨髓瘤IgG亞類。待檢血清和骨髓瘤標準品均用2，2』-連氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉)磺酸(Kinkegaard和Preey，Gaithersburg，MD)作底物進行檢測。讀取405nm的吸收值。用對骨髓瘤標準品曲線計算出的線性滴定曲線上的值定量測定每種抗原特異性亞類，以μg/ml的形式表示。ELISA-IgE抗原特異性IgE抗體的定量測定按Pharmingen TechnicalProtocls，Research Products目錄，第541頁，1996-1997(Pharmingen，San Diego，CA)的程序進行。將於0.1M NaHCO3(pH8.2)中的2μg/ml純化抗小鼠IgE捕獲單克隆抗體(mAb)(Pharmingen，目錄號02111D)50μl加入IMMUNO平板(Nunc，目錄號12-565-136)上。將平板在室溫溫育過夜，用PBS-吐溫20洗3次，用含3％BSA的PBS溶液封閉2小時，再用PBS-吐溫洗3次。血清用含1％BSA的PBS稀釋，以1/100的梯度加入，並在各欄中連續稀釋(如1/100，1/200等等)。加入純化的小鼠IgE標準品(Pharmingen，目錄號0312D)，起始稀釋度為0.25μg/ml，並在各欄中連續稀釋。將平板溫育2小時，再用PBS-吐溫洗滌5次。
將生物素標記的抗小鼠IgE單克隆抗體(Pharmingen，目錄號02122D)溶於含1％BSA的PBS中，濃度為2μg/ml，溫育45分鐘，再用PBS-吐溫洗滌5次。加入抗生物素蛋白標記的過氧化物酶(Sigma A3151，1mg/ml溶液的1/400稀釋液)30分鐘後，用PBS-吐溫洗滌平板6次。待檢血清和IgE標準品均用2，2』-連氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉)磺酸(Kirkegaard和Perry，Gaithersburg，MD)作底物進行檢測。讀取405nm處的吸收值。用對IgE標準品曲線計算出的線性滴定曲線上的值定量測定各種抗原特異性亞類，表示為μg/ml。脂質體製備若經皮免疫用製劑中含有脂質體，則根據Alving等(1993)的方法製備由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油、膽固醇組成的多層脂質體。這三種試劑購自Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster，AL)。脂質的氯仿貯存液貯於-20℃冰箱中，使用時從中取出。
按0.9∶0.1∶0.75的摩爾比將二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼，二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油和膽固醇在一梨形瓶內混合。用旋轉蒸發器，於37℃，在負壓條件下處理10分鐘去除溶劑。再將燒瓶置於乾燥器內，低真空下進一步乾燥2小時以去除殘餘溶劑。用無菌水將脂質體溶脹成37mM磷脂，再凍幹並存於-20℃。將這些脂質體以其凍幹狀態與生理鹽水(pH7.0)混合，以獲得鹽溶液中的預計磷脂濃度。或者，也可將乾燥脂質溶脹於生理鹽水(pH7.0)中，以形成脂質體，且不再凍幹。
實施例1按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫接種溶液免疫小鼠將按上文「脂質體製備」中所述製備的脂質體與鹽溶液混合以形成脂質體，然後用鹽溶液(僅含脂質體的組)或溶於鹽溶液中的CT稀釋預先形成的脂質體，以產生免疫溶液，每100μl所述溶液中含有含10-150mM磷脂的脂質體和100μg CT。將CT與鹽溶液混合，以製備每100μl溶液含100μg CT的免疫溶液，供僅接受CT的組使用。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
在第0和3周對小鼠進行經皮免疫，加強免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗體水平，並與免疫前的血清相比較。如表1所示，除使用150mM脂質體的小鼠外，由無脂質體的CT誘導的抗CT抗體水平與使用脂質體產生的抗CT抗體水平沒有區別。僅鹽溶液中的CT就能免疫小鼠以抗CT，從而產生高的抗體滴度。
表1.抗CT抗體
*與僅施用CT的組顯著不同(P＜0.05)實施例2按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0和3周使用100μl按下述製備的免疫接種溶液免疫小鼠將BSA與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含200μg BSA的免疫溶液，供僅接受BSA的組使用；在鹽溶液中將BSA和CT混合以製備每100μl鹽溶液含200μg BSA和100μg CT的免疫溶液，供接受BSA和CT的組使用。當使用脂質體時，按上文「脂質體製備」中所述製備脂質體，並首先與鹽溶液混合以形成脂質體，然後用於鹽溶液中的BSA或BSA+CT稀釋所形成的脂質體以產生免疫溶液，每100μl免疫溶液中含有含50mM磷脂的脂質體，還含有200μg BSA，或每100μl免疫溶液中還含有200μg BSA+100μgCT。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
第二次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定血清中的抗體，結果示於表2。僅用BSA，含或不含脂質體都不能引發抗體應答，然而，加入CT即可刺激對BSA的免疫應答。CT作為對BSA之免疫應答的佐劑起作用，產生了高滴度的抗BSA抗體。
表2.抗BSA抗體
實施例3按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0和3周使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將LT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg LT的免疫溶液供僅接受LT的組使用。當使用脂質體時，按上文「脂質體製備」中所述製備脂質體，並首先與鹽溶液混合以形成脂質體，然後用鹽溶液中的LT稀釋預先形成的脂質體以產生免疫溶液，每100μl免疫溶液中含有含50mM磷脂的脂質體和100μg LT。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
第二次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗LT抗體，結果示於表3。含或不含脂質體的LT顯然都有免疫原性，在不同的組之間未檢測到顯著差異。LT和CT是細菌ADP-核糖基化外毒素(bARE)家族的成員，它們以A∶B酶原的形式組合在一起，其中A亞基中含有ADP-核糖基轉移酶活性，B亞基的功能是與靶細胞結合。在胺基酸水平上，LT與CT 80％同源，兩者具有相似的非共價結合的亞基組合、化學計量(A∶B5)，相同的結合靶點，神經節苷脂GM1，和相似的大小(MW約為80,000)。對CT和LT具有相似量的抗體應答(表1和3)反映出LT和CT的相似性似乎在經皮途徑中影響到它們的免疫原性。
表3.抗LT抗體
實施例4按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡C57B1/6小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠1次將LT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg LT的免疫溶液。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
單次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗LT抗體，結果示於表4。單次免疫中，LT明顯為免疫原性的，抗體的產生持續3周。抗體滴度的快速增加和對單次免疫接種的反應可能是經皮免疫方法的有用方面。可以想像得到快速的單次免疫對於流行病、旅行者和就醫較難的地方是有用的。
表4.抗LT抗體
實施例5按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的8至12周齡C57B1/6小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫接種小鼠1次將CT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μgCT的免疫溶液。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
單次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗CT抗體，結果示於表5。單次免疫中，CT即具有高免疫原性。抗體滴度的快速增加和對單次免疫接種的應答可能是經皮免疫方法的有用方面。可以想像得到快速的單次免疫對於流行病、旅行者和就醫較難的地方是有用的。
表5.抗CT抗體
實施例6按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0和3周使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將ETA與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg ETA的免疫溶液供僅接受ETA的組使用。當使用脂質體時，按上文「脂質體製備」中所述製備脂質體，並首先與鹽溶液混合以形成脂質體。然後用鹽溶液中的ETA稀釋預先形成的脂質體以產生免疫溶液，每100μl免疫溶液中含有含50mM磷脂的脂質體和100μgETA。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
第二次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定血清中的抗體，結果示於表6。含或不含脂質體的ETA顯然都有免疫原性，在不同的組之間未檢測到顯著差異。ETA與CT和LT的不同之處在於ETA是613個胺基酸的單肽，A和B結構域位於同一肽上，且ETA與完全不同的受體，即α2-巨球蛋白受體/低密度脂蛋白受體相關蛋白(Kounnas等，1992)結合。儘管ETA與CT在大小、結構和結合靶點上沒有相似性，但ETA也可誘導經皮的抗體應答。
表6.抗-ETA抗體
實施例7按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將CT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg CT的免疫溶液，將LT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg LT的免疫溶液，將ETA與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg ETA的免疫溶液，將CT和BSA一起與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg CT和200μg BSA的免疫溶液。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
在第0和3周對小鼠進行經皮免疫，加強免疫3周後，使用上文「ELISA IgG亞類」中所述的ELISA測定抗體水平，並與免疫前的血清相比較。對CT、BSA和LT的IgG亞類應答產生了相似的IgG1和IgG2a水平，這反映出激活了Th1和Th2淋巴細胞中的T輔助細胞(Seder和Paul，1994)，而對ETA的IgG亞類應答幾乎全部由IgG1和IgG3組成，這與Th2樣應答一致(表7)。由此看來使用經皮免疫可產生所有的IgG亞類。
表7.誘導抗體的IgG亞類
實施例8按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將LT與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含100μg LT的免疫溶液，供僅接受LT的組使用；將CT與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含100μg CT的免疫溶液，供僅接受CT的組使用；將ETA與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含100μg ETA的免疫溶液，供僅接受ETA的組使用；將BSA和CT與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含100μg BSA和100μg CT的免疫溶液，供接受BSA和CT的組使用。
在第0和3周對小鼠進行經皮免疫，加強免疫1周後，使用上文「ELISA IgE」中所述的ELISA測定抗體水平，並與免疫前血清相比較。如表8所示，儘管檢測的靈敏度為0.003μg/ml，但仍未發現IgE抗體。第二次免疫3周後，使用「ELISA IgG(H+L)」測定相同小鼠血清中的IgG抗體。對LT、ETA、CT和BSA的IgG抗體應答示於下文，結果表明動物成功地被免疫，並以高滴度的抗體對各個抗原作出應答。
表8.對LT，ETA，CT和BSA的IgE抗體
實施例9按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0和3周使用100ml按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將CT與鹽溶液混合以製備每100ml體積含100mg CT的免疫溶液。接種前將免疫溶液旋渦處理10秒鐘。
在第0和3周對小鼠進行經皮免疫，並使用上文「ELISA IgG(H+L)」和「ELISA IgG(γ)」中所述的ELISA測定抗體水平。初次免疫1和4周後進行檢測，並與免疫前血清比較。如表9所示，鹽溶液中的CT誘導了高水平的抗CTIgG(γ)抗體。使用IgM(μ)特異性第二抗體可檢測到少量的IgM。在4周內，抗體應答主要是IgG。數據以ELISA單位表示。
表9.IgG(γ)和IgM(μ
實施例10按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠1次將CT與鹽溶液混合以製備每100μl鹽溶液含100μg CT的免疫溶液。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。在第0和3周對小鼠進行經皮免疫。加強免疫5周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗體水平，並與免疫前血清比較。如表10所示，檢測到血清抗CT的IgA抗體。
表10.抗CT的IgA抗體
實施例11按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的6至8周齡BALB/c小鼠進行經皮免疫。使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將CT與鹽溶液混合以製備每100μl體積含100μg CT的免疫溶液。接種前將免疫溶液旋渦處理10秒鐘。
在第0和3周用100μl免疫溶液對小鼠進行經皮免疫，並使用上文「ELISA IgG(H+L)」和「ELISA IgG(γ)」中所述的ELISA測定抗體水平。初次免疫8周後進行抗體檢測並與免疫前血清比較。如表11所示，鹽溶液中的CT誘導了高水平的血清抗CT抗體。使用IgG(H+L)或IgG(γ)特異性抗體，通過ELISA可檢測到肺洗液中的IgG。由於通過用於收集黏膜抗體的灌洗法稀釋了在肺黏膜表面發現的抗體，因此，檢測到的抗體確切量不如可測抗體的存在本身那麼重要。
處死小鼠後得到肺洗液，小心解剖以暴露氣管和肺，在氣管分叉上方橫切氣管。插入22號聚丙烯管，結紮氣管以在邊緣形成密閉的封口。使用與管貼附的1ml注射器灌注0.5ml PBS，液體使肺緩緩充脹。取出液體重新灌注，共進行3次灌洗，然後將肺洗液置於-20℃凍存。
表11表示在第8周，血清和肺洗液中針對霍亂毒素的IgG(H+L)和IgG(γ)抗體應答。數據以ELISA單位表示。所有小鼠的肺洗液中都可清楚地檢測到抗體。黏膜中抗體的存在對於針對黏膜活性疾病的保護作用可能是很重要的。
表11.針對CT的黏膜抗體動物號免疫組 IgG(H+L)IgG(γ)來源1501CT 133 34肺1502CT 75 12肺1503CT 162 28肺1504CT 144 18肺1505CT 392 56肺幾何平均值 156 261501CT 34,131 13,760 血清1502CT 11,131 2,928 血清1503CT 21,898 10,301 血清1504CT 22,025 8,876 血清1505CT 34,284 10,966 血清幾何平均值23,128 8,270實施例12在第0和3周，按上文「免疫接種方法」中所述對4隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。按上文「脂質體製備」中所述製備脂質體，並首先與鹽溶液混合以形成脂質體，然後用鹽溶液中的CT、CTA或CTB稀釋預先形成的脂質體以產生免疫溶液，每100μl免疫溶液中含有含50mM磷脂的脂質體和50μg抗原(CT、CTA或CTB)。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
加強免疫1周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗體，並與免疫前血清相比較，結果示於表12。CT和CTB顯然是免疫原性的，而CTA則無免疫原性，因此，CT的B亞基是必需的，並足以誘導強的抗體應答。
表12.針對CT、CTA和CTB的抗體
實施例13按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0和3周，用每100μl鹽溶液中含有100μg白喉類毒素和10μg百日咳毒素的免疫溶液免疫小鼠。接種前將溶液旋渦處理10秒鐘。
使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA定量測定抗體。僅在用百日咳毒素和白喉類毒素都免疫過的動物中檢測到抗白喉類毒素的抗體。應答最大的小鼠中抗白喉類毒素抗體的ELISA單位為1038。因此，少量百日咳毒素是作為白喉類毒素抗原的佐劑起作用的。僅有類毒素不能誘導免疫應答，這暗示著類毒素處理已影響到分子中負責ADP-核糖基化外毒素中所發現的佐劑效應的部分。
表13.針對白喉的抗體小鼠號 免疫抗原 IgG ELISA單位4731 DT+PT1,0394732 DT+PT14733 DT+PT 284734 DT+PT 154735 DT+PT 204621DT 04622DT 04623DT 04624DT 04625DT 0實施例14按上文「接種方法」中所述對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0、8和20周，用每100μl鹽水中含有50μg百日咳毒素(List，目錄號181，批號181-20a)的免疫溶液免疫小鼠1次。
使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA定量測定抗體。在最後一次加強免疫用百日咳毒素免疫過的動物1周後，檢測到抗百日咳毒素的抗體。最後一次免疫後，所有5隻動物的抗百日咳毒素抗體的水平都有所提高。因此，百日咳毒素可作為其自身的佐劑起作用，並可誘導PT特異性的IgG抗體。在如白喉/百日咳/破傷風/Hib的聯合疫苗中，PT的佐劑效應對於增強針對共同施用的抗原以及針對PT自身的抗體應答都是有用的。
表14.針對百日咳毒素的抗體應答小鼠號 抗原 2周 21周5156 PT 14 2565157 PT 22 3305158 PT 17 3035159 PT 33 2375160 PT 75 418實施例15按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0周，用每100μl鹽溶液中含有50μg破傷風類毒素和100μg霍亂毒素的免疫溶液免疫小鼠1次。
使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA定量測定抗體。第8周時，在動物5173中檢測到的抗破傷風類毒素抗體為443ELISA單位。
實施例16使用125I-標記的CT示蹤抗原/佐劑的去處，以評價上表皮施藥和隨後清洗施藥位點之後的飼養過程中發生口服免疫的可能性。麻醉小鼠，按上文「免疫接種方法」中所述，用100μg經125I-標記的CT(150,000cpm/μg CT)對小鼠進行經皮免疫。對照小鼠被持續麻醉6小時以免除飼養，將實驗小鼠麻醉1小時，清洗後進行飼養，至第6小時時，處死小鼠，將器官稱重並在Packard gamma計數器上計數125I。在免疫位點處的剃毛皮膚上檢測到總量為2-3μg的CT(14,600cpm/μg組織)，而在胃(661cpm/μg組織)和腸(9cpm/μg組織)中最多檢測到0.5μg的CT。
在第0和3周，用10μg於鹽溶液中的CT(不含NaHCO3)進行口服免疫(n＝5)，誘導出的6周平均IgG抗體應答＜1,000ELISA單位，而如上所述，用100μg CT進行經皮免疫可導致清洗後的皮膚中殘留低於5μg的CT，第6周時的抗CT應答為42,178ELISA單位。誘導對口服CT的免疫應答需要在免疫溶液中加入NaHCO3(Piece，1978；Lycke和Holmgren，1986)，因此，當將CT經表皮施用於皮膚時，口服免疫對檢測到的抗體沒有顯著的貢獻。
實施例17使用經上表皮施用於皮膚、具體為小鼠耳(其中易於觀察到大群體的朗格漢斯細胞(Enk等，1993；Bacci等，1997))的於鹽溶液中的霍亂毒素(CT)，並對在激活的朗格漢斯細胞中被上調的主要組織相容性複合體(MHC)II類分子進行染色(Shimada等，1987)，得到了朗格漢斯細胞激活的體內證據。
當小鼠被麻醉時，用100μg於鹽溶液中的CT，100μg於鹽溶液中的CTB或僅用鹽溶液覆蓋BALB/c小鼠耳的背側1小時，或對陽性對照皮內注射100pg LPS或10μg TNFα。然後徹底清洗耳，24小時後，摘下耳，如Caughman等人(1986)所述收集表皮塊，並對MHC II類表達進行染色。用MKD6(抗I-Ad)或陰性對照Y3P(抗I-Ak)對表皮塊進行染色，並將山羊抗小鼠FITC F(ab)2用作第二步試劑。先前已發現，耳上經皮免疫的小鼠(如上文所述，未剃毛)在單次免疫3周後具有7,000ELISA單位的抗CT抗體。
相對於對照而言，在用CT和CTB免疫過的小鼠的表皮塊中，通過染色強度檢測到MHC II類分子表達增強，朗格漢斯細胞數目降低(尤其是用霍亂毒素時)，並且朗格漢斯細胞形態學有變化(圖1)，這表明經表皮施用霍亂毒素激活了朗格漢斯細胞(Aiba和Katz，1990；Enk等，1993)。
實施例18朗格漢斯細胞代表了被稱為「樹突細胞」的有效佐細胞家族的表皮群體。人們認為朗格漢斯細胞(可能還有真皮中的相關細胞)是針對皮膚所遭遇的外源抗原的免疫應答所必需的。朗格漢斯細胞之「生命周期」的特徵在於至少有兩個完全不同的時期。表皮中的朗格漢斯細胞(「崗哨」)可攝取顆粒，並有效地處理抗原，但卻是未接觸抗原的T細胞的弱刺激物。與之形成對照的是，在與表皮抗原接觸之後被誘導遷移至淋巴結的朗格漢斯細胞(「信使」)吞噬能力差，處理抗原的能力有限，但卻是原初T細胞的強有力刺激物。如果朗格漢斯細胞既要充當其「崗哨」的角色，又要充當其「信使」的角色，它們必需能在表皮中存留，暴露於抗原之後也能以受控的方式離開表皮，因此，朗格漢斯細胞-角質形成細胞粘附作用的調節代表朗格漢斯細胞運輸和功能中的一個關鍵控制點。
朗格漢斯細胞表達E-鈣粘著蛋白(B1auvelt等，1995)，該蛋白是突出體現於上皮的同嗜性粘著分子。角質形成細胞也表達此粘著分子，在體外，E-鈣粘著蛋白明顯介導鼠朗格漢斯細胞對角質形成細胞的粘著。已知E-鈣粘著蛋白參與朗格漢斯細胞在表皮中的定位，見Stingl等人(1989)有關朗格漢斯細胞和角質形成細胞之鑑定和特性的綜述。
已知表皮朗格漢斯細胞(LC)的遷移及其將抗原從皮膚轉運至引流淋巴結在皮膚免疫應答(如接觸致敏)的誘導中是至關重要的。在至淋巴結的轉運過程中，朗格漢斯細胞經受了多種表型變化，這些變化是它們從皮膚處移動和獲得抗原呈遞能力所必需的。除了MHCII類分子的上調外，調節與周圍組織基質和T淋巴細胞之間相互作用的粘著分子的表達也有變化。已知朗格漢斯細胞的遷移與E-鈣粘著蛋白表達的顯著降低(Schwarzenberger和Udey，1996)和ICAM-1的平行上調(Udey，1997)相關。
細菌ADP核糖基化外毒素(bARE)的經皮免疫靶向表皮中的朗格漢斯細胞。bARE激活朗格漢斯細胞，將其從崗哨的角色轉化為信使的角色。攝入的抗原隨即被轉運至淋巴結並呈遞給B和T細胞(Streilein和Grammer，1989；Kripke等，1990；Tew等，1997)。在此過程中，表皮的朗格漢斯細胞成熟為淋巴結中呈遞抗原的樹突細胞(Schuler和Steinman，1985)；進入淋巴結的淋巴細胞分離為B細胞濾泡和T細胞區域。已知激活朗格漢斯細胞以使其成為可遷移的朗格漢斯細胞不僅與MHC II類分子的顯著增加有關，還與E-鈣粘著蛋白表達的顯著降低和ICAM-1的上調有關。
我們預計，霍亂毒素(CT)及其B亞基(CTB)可上調ICAM-1的表達並下調朗格漢斯細胞上E-鈣粘著蛋白的表達，以及上調朗格漢斯細胞上MHC II類分子的表達。CT或CTB通過使崗哨朗格漢斯細胞自由移動以呈遞如BSA或白喉類毒素之類的抗原而行使佐劑的作用，所述抗原在與用作佐劑的CT或CTB相遇的相同地點和時間被朗格漢斯細胞吞噬。從表皮細胞或朗格漢斯細胞自身釋放的包括TNFα和IL-1β的細胞因子可介導朗格漢斯細胞的激活，以上調ICAM-1的表達並下調E-鈣粘著蛋白的表達。
預計這種經皮免疫輔助法對可激活朗格漢斯細胞的任何化合物都起作用。激活可以下調E-鈣粘著蛋白和上調ICAM-1的方式發生。隨後，朗格漢斯細胞可將由這種朗格漢斯細胞激活化合物和抗原(如白喉類毒素或BSA)的混合物製成的抗原攜至淋巴結，在其中，抗原被呈遞給T細胞並引發免疫應答。因此，如bARE之類的激活物質通過激活朗格漢斯細胞以吞噬如白喉類毒素的抗原，遷移至淋巴結，成熟為樹突細胞並將抗原呈遞給T細胞，即可用作其它經皮非免疫原性的抗原(如白喉類毒素)的佐劑。
細胞因子和/或趨化因子的使用可影響對經皮免疫中所用抗原的T輔助細胞應答。例如，白細胞介素-10(IL-10)可將抗體應答歪曲為Th2 IgG1/IgE應答，而抗IL-10可增強IgG2a的產生(Bellinghausen等，1996)。
實施例19鉗合蛋白是在受瘧疾感染的紅細胞表面表達的分子，其作用是將瘧疾寄生的紅血細胞錨定於血管內皮。這是寄生蟲存活所必需的，並對死於腦型瘧疾之兒童中鐮狀瘧原蟲瘧疾的病理發生有直接作用。在腦型瘧疾中，由於鉗合蛋白分子與宿主內皮細胞受體CD36的特異性相互作用，腦毛細管被大量寄生的紅血細胞堵塞。Ockenhouse等人鑑定出了宿主受體CD36和介導此受體-配體相互作用的寄生分子(鉗合蛋白)。Ockenhouse等人已將與CD36受體相互作用的鉗合蛋白分子的結構域克隆和表達成由大腸桿菌產生的重組蛋白。在下文實施例中使用截短的79個胺基酸的鉗合蛋白產物。
用重組鉗合蛋白或編碼鉗合蛋白之基因的DNA進行活性免疫應該能引發抗體，所述抗體能阻斷被瘧疾寄生的紅細胞與宿主內皮細胞CD36的粘著，從而阻止寄生蟲生命周期的完成，因其不能與內皮細胞結合而導致寄生蟲死亡。策略是開發一種可引發高滴度阻斷抗體的免疫方法，這種方法之一是經皮送遞疫苗。對總抗體滴度以及阻斷活性和調理作用的測量構成這種經皮免疫方法的基礎。本實驗中所用的重組鉗合蛋白長度為79個胺基酸(約18KDa)，並含有分子的CD36結合結構域。我們還構建了裸露DNA構建體，該構建體由此結合域組成，用表皮基因槍送遞法引發了抗體。
按上文「免疫接種方法」中所述對BALB/c小鼠(n＝3)進行經皮免疫。在第0和8周使用120μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將編碼鐮狀瘧原蟲鉗合蛋白的質粒與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含80μg質粒、80μg CT(List Biologicals)的免疫溶液。用醇棉籤(Triad Alcohol pad，70％異丙醇)小心地清洗耳之後，將120μl免疫溶液施用於未經標記的耳上。不通過清洗除去免疫溶液。
在初次免疫3，4，7和9周後，從尾靜脈收集血清，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定血清中的鉗合蛋白抗體，結果示於表15。
第二次加強免疫後，鉗合蛋白DNA與CT一起誘導了可測的針對表達蛋白的抗體應答。為了引起免疫，該蛋白質需被免疫系統表達和加工，因此，對於針對由編碼鉗合蛋白之質粒表達的鉗合蛋白的免疫應答而言，CT行使的是佐劑的作用。
在非人靈長類動物中，已顯示出DNA疫苗可引發針對如瘧疾(Gramzinski，疫苗，15913-915，1997)和HIV(Shriver等，疫苗，15884-887，1997)之類疾病的中和性抗體，並在幾個實驗模型中顯示出不同程度的保護作用(McClements等，疫苗，15857-60，1997)。預期通過皮膚進行DNA免疫所引發的應答類似於靶向皮膚免疫系統的基因槍所引發的應答(Prayaga等，疫苗，151349-1352，1997)。
表15.經鉗合蛋白(Seq)DNA和霍亂毒素(CT)免疫過的動物中針對Seq蛋白的血清抗體
實施例20按上文「免疫接種方法」中所述，使用鉗合蛋白對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0、2和8周，使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠在第0周，用410μl中含有59μg CT和192μg鉗合蛋白的免疫溶液對接受鉗合蛋白和CT之組的小鼠進行免疫，用410μl中含有192μg鉗合蛋白的免疫溶液對僅接受鉗合蛋白之組的小鼠進行免疫，用520μl中含有120μg CTB和250μg鉗合蛋白的免疫溶液對接受鉗合蛋白和CTB之組的小鼠進行免疫。2周後，用含有163μg鉗合蛋白的345μl鹽溶液對僅接受鉗合蛋白之組的小鼠進行加強免疫，用含有163μg鉗合蛋白和60μg CT的345μl鹽溶液對接受CT和鉗合蛋白之組的小鼠進行加強免疫，用含有163μg鉗合蛋白和120μg CTB的345μl鹽溶液對接受鉗合蛋白和CTB之組的小鼠進行加強免疫。在第二次加強免疫中，對僅接受鉗合蛋白之組的小鼠施用120μg鉗合蛋白，對接受CT和鉗合蛋白之組的小鼠施用120μg鉗合蛋白和120μg CT，對接受鉗合蛋白和CTB之組的小鼠施用120μg鉗合蛋白和120μg CTB。
在初次免疫3、5、7、9、10、11和15周後，使用上文「ELISAIgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗體，結果示於表16。僅用鉗合蛋白只誘導少量的但可測的抗體應答。然而，加入CT可刺激出強得多的針對鉗合蛋白的免疫應答，加入CTB可誘導出強於僅用鉗合蛋白所誘導的免疫應答。CT和CTB作為針對身為重組蛋白之鉗合蛋白的免疫應答的佐劑起作用。
表16 Seq，Seq+霍亂毒素(CT)，Seq+霍亂毒素B(CTB)IgG(H+L)ELISA單位動物號免疫組檢測抗原預先取血第3周 第5周第7周第8周 第9周 第11周 第15周2861 Seq Seq7 720 32 709 431 4082862 Seq Seq8 514 13633 4 62863 Seq Seq8 63 38 393467 348 4592864 Seq Seq5 926 10232 13 112865 Seq Seq9 19 76 111100 53 98幾何平均值9 13 29 114129 54 652866 Seq/CT Seq9231145 125 63943679 28963 429812867 Seq/CT Seq73 84 154 ND 942820653 274032868 Seq/CT Seq805370 1447 1105 ND 13169 76772869 Seq/CT Seq175760 1317 768113792 118989 2700402870 Seq/CT Seq153158 535 2413245ND 4277幾何平均值271336 456 60119747 31115 252792871 Seq/CTB Seq8 387 40 22 29 1922872 Seq/CTB Seq4 624 22 35 24 342873 Seq/CTB Seq107138 128 51 2074228322962874 Seq/CTB Seq6 722 18 41 40 4572875 Seq/CTB Seq515504 1910 1744 ND 71485563幾何平均值25 25 102 68 91 214 520匯集物 5
實施例21按上文「免疫接種方法」中所述，對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0周，使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將FLUSHIELD(Wyeth-Ayerst，純化的亞病毒顆粒，1997-98製劑，批號U0980-35-1)凍幹，並與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含有90μg FLUSHIELD亞病毒顆粒的免疫溶液，供僅接受流感病毒的組使用；在鹽溶液中將流感病毒和CT混合，以製備每100μl鹽溶液含有90μg FLUSHIELD抗原和100μg CT的免疫溶液，供接受流感病毒和CT的組使用。
在初次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定抗體，結果示於表17。僅用流感病毒不能誘導抗體應答。然而，加入CT可刺激出比僅用流感病毒所觀察到的強得多的免疫應答，因此，在針對FLUSHIELD、亞病毒顆粒流感疫苗、得自病毒之抗原混合物的免疫應答中，CT是作為佐劑起作用的。
表17.在僅用流感病毒(Inf)或用Inf+霍亂毒素(CT)免疫過的動物中針對甲型和乙型流感病毒的血清抗體
實施例22LT是ADP-核糖基化外毒素家族的成員，其分子量類似於CT，LT與神經節苷脂GM1結合，與CT具有80％的同源性，並具有相似的A∶B5化學計量。因此，在經皮免疫中，LT也被用作DT的佐劑。在第0，8和18周，按上述用每100μl鹽溶液含有100μg LT(Sigma，目錄號E-8015，批號17hH12000)和100μg CT(List Biologicals，目錄號101b)的鹽溶液免疫BALB/c小鼠(n＝5)。如表18所示，LT誘導了中等程度的抗DT應答。
ETA(List Biologicals，批號ETA 25A)是ADP-核糖基化外毒素家族的成員，但它是與不同受體結合的單個多肽。按上文所述，在第0、8和18周，在100μl含有100μg CT的鹽溶液中將100μg ETA送遞至BALB/c小鼠的背部。在第20周，ETA加強了抗DT應答，因此，其它ADP-核糖基化外毒素也能作為共同施用的蛋白質的佐劑起作用(表18)。表18.在用銅綠假單胞菌外毒素A(ETA)和DT或大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)和DT免疫過的動物中白喉類毒素(DT)抗體滴度的動力學
實施例23按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0、8和18周，用100μl含有100μg霍亂毒素(List Biologicals，目錄號101B，批號10149CB)，50μg破傷風類毒素(List Biologicals，目錄號191B，批號1913a和1915b)和83μg白喉類毒素(List Biologicals，目錄號151，批號15151)的鹽溶液免疫小鼠。
使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA定量測定針對CT、DT和TT的抗體。在初次免疫後23周檢測抗CT、DT或TT的抗體。所有經免疫小鼠中抗白喉類毒素和霍亂毒素的抗體水平均有升高。反應最大的小鼠中抗破傷風類毒素抗體的ELISA單位為342，約為在未免疫動物之血清中所檢測抗體水平的80倍。因此，不相關抗原的聯合(CT/TT/DT)可用於針對各個抗原的免疫。這表明霍亂毒素可用作多價疫苗的佐劑。
表19.用霍亂毒素、破傷風類毒素和白喉類毒素同時免疫的動物中的血清抗體
實施例25
使用CT經皮免疫可誘導強有力的免疫應答，使用CT作為佐劑和抗原，將肌內注射和口服免疫的免疫應答與經皮免疫的相比較。使用200μl取液器吸頭將溶於25μl鹽溶液中的25μg CT(ListBiologicals，目錄號101b)經口服施用於BALB/c小鼠(n＝5)。小鼠易於吞咽免疫溶液。按上文所述對經皮標記組中小鼠的耳施用鹽溶液中的1mg/ml CT 25μl。給肌內標記組小鼠的前腿肌內注射25μg於鹽溶液中的CT。
肌內注射了CT的小鼠在注射部位顯示出明顯的腫脹和觸痛，並產生了高水平的抗CT抗體。經皮免疫的小鼠在免疫部位未出現紅或腫脹，並產生了高水平的抗CT抗體。相對於經皮免疫的小鼠而言，經口服免疫的小鼠所產生抗體的水平低得多。這表明，在經皮免疫的小鼠中，通過飼餵進行口服免疫不是經皮免疫所誘導的高水平抗體的原因。總的說來，經皮免疫途徑優於口服或肌內免疫，因為經皮免疫可得到高水平的抗體，而且不會對免疫產生不良反應。
表20.通過經皮、口服或肌內途徑免疫的動物中霍亂毒素抗體滴度的動力學
實施例26按上文「免疫接種方法」中所述，對5隻小鼠一組的BALB/c小鼠進行經皮免疫。在第0、8和20周，使用100μl按下述製備的免疫溶液免疫小鼠將Hib偶聯物(Connaught，批號6J81401，86μg/ml)凍幹以濃縮抗原，將凍幹的產物與鹽溶液混合，以製備每100μl鹽溶液含有50μg Hib偶聯物的免疫溶液，供僅接受Hib偶聯物的組使用；在鹽溶液中將Hib偶聯物和CT混合，以製備每100μl鹽溶液含有50μg Hib偶聯物和100μg CT的免疫溶液，供接受Hib偶聯物和CT的組使用。
在第二次免疫3周後，使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA測定血清抗體，結果示於表21。僅用Hib偶聯物能誘導少量但可測的抗體應答。然而，加入CT刺激出了強得多的針對Hib偶聯物的免疫應答。CT在針對Hib偶聯物的免疫應答中是作為佐劑起作用的。這表明，通過本文所述的方法，可將多糖偶聯物抗原用作經皮抗原。
表21.針對流感嗜血桿菌b(Hib)的抗體
實施例27乳劑、乳膏和凝膠對於免疫化合物在皮膚表面、頭髮或身體皺褶處方便地塗抹具有實際可行的優點。另外，這種製劑可能還有能增強免疫效力的優點，如封閉或水合作用。
使用得自大腸桿菌的不耐熱腸毒素(LT)(Sigma，目錄號E-8015，批號17hH1200)來比較使用單純鹽溶液及公知的石油基軟膏-AQUAPHOR進行經皮免疫的效力，所述軟膏「可以單獨使用，或實質上使用水溶液與任何軟膏混合使用，或與其它油基物質和所有公知的局部藥物聯合使用」(p507 PDR，非處方藥物，1994，第15版)。用一系列劑量處理小鼠，以評價對比較性賦形劑中降低劑量的相對抗體應答。
除在背部施用免疫溶液3小時外，按上述免疫BALB/c小鼠。分別使用2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml或0.2mg/ml的溶液製備LT鹽溶液，以送遞50μl劑量的溶液和溶於溶液中的100μg、50μg、25μg或10μg抗原。3小時後，使用溼紗布輕擦背部以除去免疫溶液。
按下述製備油包水製劑在具有luer鎖緊套口的1ml結核菌素玻璃注射器中，使用與兩個注射器相連的15號乳化針頭將等體積的AQUAPHOR和鹽溶液中的抗原混合直至混合物混合均勻。分別使用鹽溶液中的4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml或0.5mg/ml的LT溶液與等體積的AQUAPHOR混合。將50μl此混合物施用於被剃光的背部3小時，然後用紗布擦拭以小心除去所述混合物。稱量含有LT的油包水乳劑中的抗原劑量以給藥50μl。通過將鹽溶液的比重(1.00g/ml)和AQUAPHOR的比重0.867gm/ml相加，總和除以2得到終比重0.9335gm/ml，可計算出重量/體積比。約47mg含有LT的油包水乳劑被施用於小鼠以進行免疫。
對鹽溶液和油包水乳劑送遞的LT均有明顯的劑量-反應關係(表22)，100μg誘導了最高水平的抗體，10μg誘導了較低但有效的免疫應答。油包水乳化的LT誘導的應答類似於鹽溶液中的LT，似乎為經皮免疫提供了便利的送遞機制。類似地，也可使用凝膠、乳膏或更加複雜的製劑，如油包水包油製劑，為經皮免疫送遞抗原。這種組合物也可與補片、封閉性補片或儲器一起使用，並且可以長期或短期使用免疫抗原和佐劑。表22.經鹽溶液中的LT或AQUAPHOR乳劑中的LT不同劑量免疫的動物中針對大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)的血清抗體
實施例28
按上文「免疫接種方法」中所述對5隻小鼠一組的小鼠進行經皮免疫。在第0、8和18周，用100μl僅含有50μg破傷風類毒素(List Biologicals，目錄號191B，批號1913a和1915b)和83μg白喉類毒素(List Biologicals，目錄號151，批號15151)，或還含有100μg霍亂毒素(List Biologicals，目錄號101B，批號10149CB)的鹽溶液免疫小鼠。
使用上文「ELISA IgG(H+L)」中所述的ELISA定量測定抗白喉類毒素的抗體。在用TT/DT或CT/TT/DT免疫過的動物中檢測到抗類毒素抗體的水平有所提高。然而，在使用CT作為佐劑的動物中，抗體滴度高很多。在每個再次免疫(8和18周)之後，兩組的抗類毒素抗體滴度都明顯增加。因此，儘管DT可誘導針對其自身的少量但明顯的應答，但是，1)霍亂毒素作為佐劑加入和2)用佐劑霍亂毒素和抗原(白喉類毒素)加強免疫可增加應答的量。典型的加強免疫應答依賴於T細胞記憶，在此實驗中，抗DT抗體的加強表明通過經皮免疫使T-細胞參與到應答中。
表23.經破傷風類毒素(TT)和白喉類毒素(DT)或霍亂毒素(CT)、TT和DT免疫的動物中DT抗體滴度的動力學IgG(H+L)ELISA單位動物號免疫組 檢測抗原 預先取血 第2周 第4周 第6周 第8周 第10周 第14周 第17周 第18周 第20周 第23周5196 TT/DTDT7 12 18 23 49 56 33 18 219 1665197 TT/DTDT5 11 11 10 15 17 16 17 125 755198 TT/DTDT1320 16 - 28 25 27 7 48 1725199 TT/DTDT138 10 10 11 22 12 217 178 2635200 TT/DTDT4 10 4 7 120 149 127 - 17309 14537幾何平均值7 12 10 11 31 38 29 26 332 3825176CT/TT/DT DT8 26 21 14 341658921930182663087 647045177CT/TT/DT DT8 6 7 8 424 189 149 175 16416 179415179CT/TT/DT DT8 3 4 8 4349198422361921124239 1145035216CT/TT/DT DT125 9 11 3238289625961514278281 2909645219CT/TT/DT DT8 15 13 12 5626435520361941343161 125412幾何平均值9 8 9 10 2582194512771125104205 86528匯集物 4
實施例29按上文所述，用CT(不含疊氮化物，Calbiochem)在C57B1/6小鼠被剃光的背部對小鼠進行經皮免疫。免疫後6周，使用致死攻擊模型攻擊小鼠(Mallet等，在小鼠霍亂毒素鼻內攻擊模型中霍亂弧菌毒素(CTK63)和大腸桿菌不耐熱毒素(LTK63)之無毒性突變體的免疫預防效力，提交給Immunology Letters)。在攻擊中，用20μl氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉小鼠，在麻醉狀態下用塑料取液器吸頭將溶於鹽溶液的20μg CT(Calbiochem，不含疊氮化物)鼻內施用於小鼠。在試驗#1中，14天後，15隻經免疫小鼠中的12隻在攻擊中存活，9隻未經免疫的對照小鼠中只有1隻存活。因麻醉使5隻對照小鼠在攻擊前喪失。攻擊#1中的小鼠具有15,000 ELISA單位(幾何平均數)的抗CT血清抗體，在攻擊時被處死的5隻經免疫小鼠的肺洗液中都可檢測到IgG。按上文所述收集肺洗液。
對C57B1/6幼鼠重複免疫和攻擊，16隻經免疫小鼠中的7隻在攻擊中存活，而17隻未經免疫的小鼠中只有2隻在攻擊中存活。攻擊#2中的經免疫小鼠具有41,947 ELISA單位(幾何平均數)的抗CTIgG抗體。在攻擊時被處死的5隻小鼠的肺洗液中可檢測到抗CT IgG和IgA(表24)。9隻小鼠中的8隻在其糞便樣品中可檢測到抗CT IgG和IgA(表25)。收集在攻擊時自發排便之動物的新鮮糞便樣品，將糞便置於-20℃冷凍。進行ELISA時，將糞便解凍，用100μl PBS勻漿，離心，對上清液進行ELISA。經免疫小鼠總的存活率是19/31或61％，而未經免疫之小鼠的總存活率為3/26或12％。
表24.肺洗液中抗霍亂毒素IgG和IgA抗體滴度樣品稀釋度 動物號89698970 8971 8972 8995IgG(H+L)抗CT (光密度)1∶10 3.613 3.368 3.477 3.443 3.3501∶20 3.302 3.132 3.190 3.164 3.1661∶40 3.090 2.772 2.825 2.899 2.6921∶80 2.786 2.287 2.303 2.264 2.0861∶160 2.041 1.570 1.613 1.624 1.4411∶320 1.325 0.971 1.037 1.041 0.9651∶640 0.703 0.638 0.601 0.644 0.5831∶1280 0.434 0.382 0.350 0.365 0.364IgA抗CT (光密度)1∶21.235 2.071 2.005 2.115 1.9841∶41.994 1.791 1.836 1.85 1.8011∶81.919 1.681 2.349 1.796 1.7421∶16 1.8 1.457 1.577 1.614 1.5361∶32 1.503 1.217 1.36 1.523 1.231∶64 1.189 0.863 1.044 1.101 0.881∶128 0.814 0.57 0.726 0.74 0.5951∶356 0.480.334 0.436 0.501 0.365
表25.糞便抗霍亂毒素IgG和IgA抗體滴度小鼠號(免疫組)樣品稀釋度 898589978987899089778976897589888994897990008983(CT)(CT)(CT)(CT)(CT)(CT)(CT)(CT)(無)(無)(無)(無)IgG(H+L) 抗CT (光密度)1∶10 1.011.912.330.030.741.981.201.450.090.050.020.181∶20 0.420.941.26- 0.311.190.500.910.04- - 0.081∶40 0.200.460.68- 0.120.580.240.49- - - 0.021∶80 0.100.210.34- 0.050.310.090.25- - - -1∶160 0.030.090.18- 0.020.140.050.12- - - -IgA抗CT(光密度)1∶40.321.140.430.000.191.000.581.210.02- 0.07-1∶80.160.670.24- 0.080.560.360.77- - - -1∶16 0.080.330.11- 0.030.270.170.40- - - -1∶32 0.060.160.05- 0.030.120.080.20- - - -1∶64 0.010.070.03- - 0.050.030.10- - - -
實施例30C57B1/6雌性小鼠得自Charles River實驗室。用200μg卵白蛋白(OVA)(Sigma，批號#14H7035，在PBS中的儲存濃度為2mg/ml)和50μg霍亂毒素(List Biologicals，批號#101481B，儲存濃度為5mg/ml)免疫小鼠。使用Packard Cobra Gamma計數器(#102389系列)測定所釋放的51Cr的量。
用0.03ml氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉C57B1/6小鼠，在不損傷皮膚的情況下用推剪剃光背部，讓小鼠休息24小時。將小鼠麻醉，然後在第0和28天將150μl免疫溶液置於2cm2面積的剃光皮膚上2小時以免疫小鼠，再用溼紗布將小鼠擦2次。麻醉、免疫或清洗步驟未對小鼠產生不良影響。每周重複這些步驟，共重複3周。
加強免疫後1周收集脾淋巴細胞，在RPMI-1640和10％FBS(含青黴素-鏈黴素，穀氨醯胺，非必需胺基酸，丙酮酸鈉和2-巰基乙醇)中將細胞體外培養6天，其間加入5％的大鼠伴刀豆球蛋白A上清液作為IL-2的來源，加入或不加入抗原。靶細胞僅由同系(H-2b)EL4細胞組成，將EL4細胞與CTL肽SINFEKKL，同種異型(H-2k)L929細胞和EG7細胞一起脈衝。每孔用0.1mCi51Cr(Na2CrO4，Amersham)將靶細胞(1×106個細胞/孔)標記1小時，按3∶1至100∶1的比例加入效應細胞。於37℃，5％ CO2的潮溼氣氛中，在96孔圓底組織培養板(Costar，目錄號#3524)中，用0.2ml完全RPMI-1640，10％FBS培養基將細胞混合物培養5小時。5小時培養結束時，用棉紗布條吸收上清液，對其進行處理以測定51Cr的釋放。按下述測定比裂解％比裂解＝100×[(實驗釋放值-自發釋放值)/(最大釋放值-自發釋放值)]。
如表26所示，在經CT+OVA免疫的組中，E∶T比例為100∶1的經EL4肽脈衝的細胞中可檢測到第1部分CTL。如果比裂解百分比不超過10％或不明顯超過培養基刺激的效應細胞裂解背景百分比，則CTL檢測為非陽性。類似地，如表26所示，在經CT+OVA免疫的組中，E∶T比例為100∶1的EG7細胞(被OVA轉染的細胞)中可檢測到第2部分CTL。因此，CT由經皮途徑輔助產生CTL。
表26.經皮誘導的OVA特異性CTL第1部分-靶細胞EL4+肽
第2部分-靶細胞EG7(轉染了OVA
實施例31按上文「免疫接種方法」中所述對C57B1/6小鼠(n＝6)進行經皮免疫。在第0和4周，用100μl含有100μg霍亂毒素(ListBiologicals，目錄號#101B，批號# 10149CB)和250μg卵白蛋白(Sigma，雞蛋白蛋白，Grade V目錄號#A5503，批號#14H7035)的鹽溶液免疫小鼠。
在第一次免疫後8周，由收集自動物的脾臟製備單細胞懸浮液。以8×105個細胞/孔的濃度，將脾細胞置於200μl含有所示濃度的OVA蛋白或不相關的伴白蛋白的培養基中培養。於37℃，在CO2培養箱中將培養物培養72小時，培養的同時向每孔中加入0.5μCi/孔的3H胸苷。12小時後，收穫培養板，通過液體閃爍計數定量測定摻入的放射性標記的胸苷以評估增殖情況。3H摻入量的粗略值以cpm表示，各個樣品的左邊示出了倍數增長(實驗cpm/培養基中的cpm)。倍數增長大於3被認為是顯著的。
僅當脾細胞被卵白蛋白刺激時才可檢測到顯著增殖，事實上諸動物原先已被卵白蛋白體內免疫，而未經不相關的伴白蛋白免疫。因此，用霍亂毒素和卵白蛋白經皮免疫在體外誘導了脾細胞發生抗原特異性增殖，這表明此方法引發了細胞免疫應答。
表27.經霍亂毒素(CT)和卵白蛋白(OVA)免疫之動物的脾細胞的抗原特異性增殖
本說明書中提及的所有專利以及其它所有公開文獻的全部內容都作為參考文獻全文引入本文。這些參考文獻是作為本領域技術人員的指示被提及的。
儘管就目前認為可行和優選的實施方案描述了本發明，但應懂得本發明並不局限於或受限於已公開的實施方案，相反，本發明欲在所附權利要求書的主旨和範圍之內覆蓋多種修飾和等價替代。
因此，應懂得所述發明的變化對於本領域技術人員而言是顯而易見的，它不背離本發明新的方面，這種變化欲包括在下文權利要求書的範圍之內。
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權利要求
1.含有抗原和佐劑的經皮免疫製劑，其中給完整的皮膚施用所述製劑即可誘導特異於所述抗原的免疫應答，而無需穿透皮膚。
2.權利要求1的製劑，其中還包括敷料以形成經皮免疫補片。
3.權利要求2的製劑，其中敷料是封閉性敷料。
4.權利要求2的製劑，其中敷料覆蓋了1個以上引流淋巴結區域。
5.權利要求1的製劑，其中佐劑增強了對淋巴細胞的抗原呈遞。
6.權利要求1的製劑，其中佐劑激活了抗原呈遞細胞。
7.權利要求6的製劑，其中抗原呈遞細胞是朗格漢斯細胞或皮膚樹突細胞。
8.權利要求1的製劑，其中佐劑增強了抗原呈遞細胞上主要組織相容性複合物II類分子的表達。
9.權利要求8的製劑，其中抗原呈遞細胞是朗格漢斯細胞或皮膚樹突細胞。
10.權利要求1的製劑，其中佐劑導致施用位點下的抗原呈遞細胞遷移至引流淋巴結。
11.權利要求10的製劑，其中抗原呈遞細胞是朗格漢斯細胞或皮膚樹突細胞。
12.權利要求1的製劑，其中佐劑給朗格漢斯細胞送遞信號使之成熟為樹突細胞。
13.權利要求1的製劑，其基本上由抗原和佐劑組成。
14.權利要求1的製劑，其中製劑中一種組分既是抗原又是佐劑。
15.權利要求1的製劑，所述製劑是水溶液。
16.權利要求1的製劑，所述製劑中不包含有機溶劑。
17.權利要求1的製劑，所述製劑中不包含穿透增強劑。
18.權利要求1的製劑，其被製成乳劑的形式。
19.權利要求1的製劑，其中抗原來源於選自由細菌、病毒、真菌和寄生蟲組成之組的病原體。
20.權利要求1的製劑，其中抗原是腫瘤抗原。
21.權利要求1的製劑，其中抗原是自身抗原。
22.權利要求1的抗原，其中抗原是變應原。
23.權利要求1的製劑，其中抗原的分子量大於500道爾頓。
24.權利要求1的製劑，所述製劑包括至少兩種不同的分離的抗原。
25.權利要求1的製劑，其中以編碼抗原之核酸的形式提供抗原。
26.權利要求25的製劑，其中所述核酸是非整合的和非複製的。
27.權利要求25的製劑，其中所述核酸另外還包括與編碼抗原之序列有效相連的調節區域。
28.權利要求25的製劑，所述製劑不包含穿透增強劑、病毒顆粒、脂質體或帶電脂質。
29.權利要求1至28中任一項的製劑，其中佐劑是ADP-核糖基化外毒素。
30.權利要求29的製劑，其中ADP-核糖基化外毒素是霍亂毒素或其功能性衍生物。
31.權利要求29的製劑，其中ADP-核糖基化外毒素是大腸桿菌不耐熱腸毒素、百日咳毒素或其功能性衍生物。
32.權利要求29的製劑，其中以編碼ADP-核糖基化外毒素的核酸形式提供佐劑。
33.權利要求1至28中任一項的製劑，其中製劑的施用不涉及損傷完整皮膚的物理能、電能或聲能。
34.權利要求1至28中任一項的製劑，其中免疫應答不是變應性反應、皮炎或特應性反應。
35.前述權利要求中任一項所述製劑的製備方法。
36.前述權利要求中任一項所述製劑在非人動物中誘導免疫應答的用途。
全文摘要
經皮免疫體系不傷及皮膚而將抗原送遞給免疫細胞,在動物或人中誘導免疫應答。對動物或人的完整皮膚經皮施用含有抗原和佐劑的製劑之後,該體系使用佐劑,優選使用ADP－核糖基化外毒素誘導抗原特異性免疫應答(如體液和/或細胞效應物)。在經皮送遞體系中加入水合劑(如脂質體)、滲透增強劑或封閉性敷料可增強免疫效力。此體系可激活皮膚中的朗格漢斯細胞,將朗格漢斯細胞遷移至淋巴結並呈遞抗原。
文檔編號A61P37/04GK1241906SQ97180947
公開日2000年1月19日 申請日期1997年11月14日 優先權日1996年11月14日
發明者G·M·格倫, C·R·阿爾文 申請人:(由國防部長代表的)美利堅合眾國政府