一種調控小尾寒羊骨骼肌生長的myl1基因及其應用的製作方法

2023-11-08 05:33:57

一種調控小尾寒羊骨骼肌生長的myl1基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，特別提供了一種可以調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL1基因，其包括兩種cDNA可變剪接體MYL1a和MYL1b，其中MYL1a的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MYL1b的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO.4所示；該基因具有調控骨骼肌生長的功能，應用該基因可以通過對該基因的表達調控進行操作，為實現培育生長速度快的綿羊品種奠定基礎，具有重要的現實意義。
【專利說明】-種調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL1基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種可以調控小尾寒羊骨骼 肌生長的MYLl基因及其在綿羊育種中的應用。

【背景技術】
[0002] 羊肉肉質細嫩，脂肪和膽固醇含量低，逐漸受到人們的青睞。近年來，隨著羊肉價 格的不斷攀升，提高羊只生長速度、改善羊肉品質對增加動物生產者的經濟收益、滿足廣大 消費者對優質羊肉的需求具有重大意義。
[0003] 肌球蛋白輕鏈是骨骼肌纖維中的一類重要蛋白質，這類蛋白質主要與肌球蛋白重 鏈結合而對其構型和活性起調控作用。不同類型的肌球蛋白輕鏈及構成比例與不同類型的 肌纖維密切相關，從而導致肌肉的生長速度和肌肉品質顯著不同。
[0004] 到目前為止，哺乳動物中肌球蛋白輕鏈家族已發現有四種不同的類型，其中肌球 蛋白輕鏈I(MYLl)在斑馬魚的骨骼肌衛星細胞分化為快肌纖維的早期階段表達，並且發現 在增殖速度較慢的成肌細胞中高表達，因而認為該基因可能具有抑制成肌細胞增殖而促進 肌細胞的分化的功能。目前，綿羊基因組中公布了 MYLl基因的預測序列，還未見到該基因 確切序列的報導，並且關於該基因對肌肉生長和發育的調控還不清楚。


【發明內容】

[0005] 基於上述的原因，本發明提供了一種可以調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYLl基因， 其包括兩種cDNA可變剪接體MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所 示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其 編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；該基因具有調控骨骼肌生長的功能，應用該基因可 以通過對該基因的表達調控進行操作，為實現培育生長速度快的綿羊品種奠定基礎，具有 重要的現實意義。
[0006] 本發明所提供的調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYLl基因，根據現有條件，在骨骼肌 中獲得了 V端有所不同的兩種cDNA可變剪接體MYLla和MYLlb，未見其他序列。其中 MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0007] 其中MYLla的cDNA序列除poly⑷外長849bp，該序列中的開放讀碼框編碼150 個胺基酸；MYLlb的cDNA序列除poly (A)外長1046bp，該序列中的開放讀碼框編碼192個 胺基酸。
[0008] 上述的MYLl基因是通過如下方法獲得的：
[0009] (1)小尾寒羊肌肉總RNA的提取和反轉錄：
[0010] 採用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉組織總RNA，提取的RNA以Agilent 2IOOBioanalyzer進行檢測，要求總RNA含量在10 μ g以上且RIN (RNA完整性指標）彡7. 5， 並根據現有技術經Roche公司的cDNA反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈；
[0011] ⑵MYLl基因 cDNA序列保守區的擴增：
[0012] 比對已有物種MYLl基因的cDNA序列，根據保守區設計上下遊引物，以步驟⑴中 的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增克隆測序得到保守區序列；
[0013] (3)應用3'降落巢式PCR法對MYLl基因 CDNA序列的3'端進行擴增：
[0014] 根據所得保守區序列設計MYLl基因的3'特異內側和外側引物；
[0015] 以3'特異外側引物和3'通用外側引物採用退火溫度逐漸降落法對上述cDNA第 一鏈進行第一輪PCR擴增；
[0016] 然後以3'特異內側引物和3'通用內側引物採用同樣的退火溫度逐漸降落法對 第一輪PCR擴增產物進行第二輪PCR擴增；
[0017] 對第二輪PCR產物經克隆測序得到MYLl基因 cDNA序列的：V端序列；
[0018] (4)應用Y RACE法對MYLl基因 cDNA序列的5'端進行擴增：
[0019] 對小尾寒羊肌肉組織經TRIzoI法所提總RNA依次進行常規的去磷酸化處理、"去 帽子"反應、與接頭序列連接並以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP試劑盒反 轉錄合成cDNA的第一鏈；
[0020] 根據所得保守區序列設計MYLl基因的5'特異外側和特異內側引物；
[0021] 以5'特異外側和5'通用外側引物進行第一輪PCR擴增；
[0022] 以Y特異內側和Y通用內側引物進行第二輪PCR擴增；
[0023] 內側PCR產物經克隆測序得到MYLl基因 cDNA序列的Y端序列；
[0024] (5)全長序列拼接及克隆測序驗證：
[0025] 根據重疊區域對上述步驟獲得的cDNA的保守區、5'和3'所得序列進行拼接，獲 得MYLl基因的全長cDNA序列；設計兩端序列為上下遊引物，PCR擴增並克隆測序得到MYLl 基因的全長cDNA序列，由於5'端序列的差異，最終獲得了可變剪接體MYLla和MYLlb，其 中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0026] 之後發明人利用qRT-PCR法測定MYLl基因在小尾寒羊的心、肝、肌肉等組織間 的表達量，並最終發現MYLla和MYLlb在背最長肌中的表達量最高，顯著高於其他組織 (p〈0. 05)，表明該基因具有調控骨骼肌生長的功能。
[0027] 綜上所述，本發明提供了一種可以調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYLl基因，其包括 兩種cDNA可變剪接體。應用該基因可以通過對該基因的表達調控進行操作，為實現培育生 長速度快的綿羊品種奠定基礎，具有重要的現實意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA保守區擴增圖，
[0029] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYLl基因 cDNA的保守區序列；
[0030] 圖2為本發明中小尾寒羊MYLl基因3'端擴增圖，
[0031] 圖中M為DL2000分子量標準；另一條為MYLl基因 cDNA的3'端序列；
[0032] 圖3為本發明中小尾寒羊MYLl基因 Y RACE擴增圖，
[0033] 圖中M為DL2000分子量標準；另一個電泳道中上面的一條為MYLlb的5'端序列， 下面的一條為MYLla的Y端序列；
[0034] 圖4為本發明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA全長序列擴增圖，
[0035] 圖中M為DL2000分子量標準；另兩條分別為MYLla和MYLlb的全長cDNA序列；
[0036] 圖5為本發明中MYLla在小尾寒羊不同組織間的表達水平柱狀圖，
[0037] 圖中a、b表示小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0.05) ;MYLla主要在背最長肌 中表達；
[0038] 圖6為本發明中MYLlb在小尾寒羊不同組織間的表達水平柱狀圖，
[0039] 圖中a、b和c表不小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0. 05) ;MYLlb在背最長肌 中的表達量顯著高於其他組織。

【具體實施方式】
[0040] 以下結合附圖對本發明的上述
【發明內容】
作進一步的詳細描述。應理解，這些實施 例僅為了說明本發明而不是為了限制本發明的保護範圍。
[0041] 下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照製造廠商所建議的實驗條 件或常規方法，如Sambrook等編著的分子克隆實驗手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0042] 實施例I :背最長肌組織總RNA的提取及反轉錄
[0043] 取小尾寒羊背最長肌約20g，使用康為世紀公司的總RNA提取試劑盒（No. CW0580)提取肌肉組織的總RNA ;將提取的RNA採用Roche公司的cDNA反轉錄試劑盒 (No. 05081955001)反轉錄合成cDNA第一鏈，-20°C保存備用。
[0044] 實施例2 :cDNA保守區序列的克隆與測序
[0045] (1)引物的設計：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種MYLl基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0軟體進行比對獲得保守區序列，設計該基因 cDNA的保守區引物為：Fl : TGAATTCAAGGAGGCATTTCTCC，如 SEQ ID NO. 5 所示，和 F2 :AAGGATGTTCTTTGACCC，如 SEQ ID NO. 6所示；
[0046] (2) PCR擴增：以實施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，採用TIANGEN的PCR MasterMix試劑盒（KT201)進行PCR擴增；50μ 1擴增體系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一鏈 2μ 1。擴增條件為：94°C，5min ;(94°C 30s， 52°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。擴增結果見附圖 I ;
[0047] (3)擴增條帶的回收：PCR擴增產物經I %瓊脂糖的TAE凝膠進行電泳凝，切取相 應條帶；採用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒（#0691)對PCR產物進行純化回收；
[0048] (4)回收產物與載體連接：載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8 ;根據擴增產物回 收後凝膠電泳情況將回收產物稀釋至標準濃度，依PMD18-T載體試劑盒說明書（No. 6011) 進行連接反應。
[0049] (5)連接產物的轉化：取適量連接產物，依TIANGEN公司的大腸桿菌感受態細胞 DH5a (CB101)使用說明進行轉化及細菌的培養操作；
[0050] (6)菌液PCR鑑定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依據（2)中PCR擴增體系和條件 進行擴增，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶；
[0051] (7)克隆產物的測序分析：如果凝膠檢測含有目的條帶且較純，則吸取Iml菌液測 序分析，得到長為719bp的一條保守區目標序列。
[0052] 實施例3 :cDNA 3'端序列的克隆與測序
[0053] 採用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具體步驟如下：
[0054] (1)引物的設計與合成：根據實施例2所得MYLl基因 cDNA保守區的測序結果， 設計兩條上遊嵌套式引物,3 ' GSP :TGATGGCAGGTCAGGAAGAC，如SEQ ID NO. 7所示，和 3' NGSP:GAACACCCATGACTAACTGTCC，如 SEQ IDN0. 8 所示；併合成兩條下遊：V 通用引物， 3，-UP:GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID N0.9K*jP01igodT-AP:GACTCGAGTCGATCGA(T)18， 如 SEQ ID NO. 10 所示。
[0055] (2)反轉錄合成cDNA第一鏈：取IOOpg?1μ g實施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP為反轉錄引物反轉錄合成cDNA第一鏈；
[0056] (3)夕卜側PCR擴增：以3 ' GSP和OligodT-AP為上下遊引物，依實施例2中PCR 反應試劑盒體系進行，擴增程序為：98°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, IOs ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, IOs ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, IOs ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0057] (4)內側PCR擴增：以:V NGSP和:V -UP為上下遊引物，步驟⑶的擴增產物稀 釋30倍為模板，依上述步驟（3)中反應條件和擴增程序進行目的條帶的擴增，擴增結果見 附圖2;
[0058] (5)PCR產物的克隆測序：擴增條帶的回收、與載體連接、連接產物的轉化及測序 同實施例2,得到長為274bp的一條序列。
[0059] 實施例4 :cDNA 5'端序列的克隆與測序 [0060] 採用5' RACE法克隆5'端序列，步驟如下：
[0061] (1)引物的設計與合成：根據實施例3所得MYLl基因 cDNA保守區的測序結果， 設計兩條下遊嵌套式引物,5 ^ GSP :CACGCAGACCCTCAACAAAG，如SEQ ID NO. 11所示，和 5/NGSP:GCCATCACCTGTTCTGTCATAC，如SEQIDN0·12所示 ；併合成兩條上遊5/通用引 *，5,-0uterPrimer :CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.13K*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 14 所示。
[0062] (2)mRNA的去磷酸化處理
[0063] ①配製去磷酸反應液：
[0064]

【權利要求】
1. 一種調控小尾寒羊骨骼肌生長的MYL1基因，其特徵在於：包括兩種cDNA可變剪接 體MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼的胺基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 根據權利要求1所述的MYL1基因，其特徵在於：其來源於小尾寒羊的肌球蛋白輕鏈 1〇
3. 權利要求1所述的調控骨骼肌生長的MYL1基因，在綿羊育種中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於：通過對MYL1基因的調控實現培育生長速 度快的綿羊育種。
【文檔編號】C07K14/47GK104263733SQ201410473379
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】王建民, 張春蘭, 王桂芝, 紀志賓, 候磊, 秦孜娟 申請人:山東農業大學