苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物抗氧化保肝及保護腦損傷用途的製作方法

2023-11-07 17:03:37 2

專利名稱：苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物抗氧化保肝及保護腦損傷用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物化學和藥理學領域，具體而言，本發明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物的抗氧化、保護肝明和腦損傷活性，以及它們作為相關藥物的用途。該類化合物通過全合成和半合成的方法得到。本發明將該系列化合物對過氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細胞損體外模型進行了肝細胞損傷保護活性篩選，該類化合物被發現具有保護肝細胞和促進肝細胞修復的作用。本發明又對該類化合物抗氧自由基活性進行了測試，發現其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導之脂質過氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預期用於製備預防或治療急、慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現出很強的對抗自由基引起的大鼠腎上嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)損傷作用，即對模擬腦神經細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在與陽性對照藥物槲皮素同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比槲皮素還高。此外，該類化合物還表現為對鐵離子具有強效螯合作用，從而預期其可以延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經纖維糾結。說明其對保護腦神經、抗氧化、防治老年性痴呆症有積極作用。以上活性表明該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物可以預期用於製備預防或治療急、慢性肝損傷或腦損傷類疾病，以及由氧自由基引起或與氧自由基有關的其他生理改變或疾病的藥物。
背景技術：
氧壓是由機體細胞產生和清除自由基之間的失調所引起的，可誘發多種疾病。氧壓可引起神經系統疾病，如中風，帕金森氏病，阿爾茨海默病。另外它還跟其它疾病的病理途徑有關，如心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此尋找新的高效抗氧化劑成為治療由氧壓引起的各種疾病的有效途徑。
姜科薑黃屬植物薑黃(Curcuma longa L.)是一種常用的中藥，薑黃素(Curcumin，簡稱Cur)是從薑黃中提取的有效成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用。近年來有關薑黃素各種藥理作用的研究已越來越受到醫藥工作者的重視。
薑黃素除上述藥理作用外，尚有對肝臟保護作用的廣泛報導，Nanji等研究發現薑黃素通過抑制NF-κB基因的表達對酒精性肝疾病起到保到作用[Nanji等，Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression ofNF-kappa B-dependent genes，American Journal Physiology，Castrointes LiverPhysiology，2003，284(2)，G321-327]。Park等研究薑黃素對四氯化碳造成的大鼠急性或亞急性肝損傷的保護作用時發現其能顯著降低血清中丙氨酸轉氨酶和天門冬氨酸轉氨酶含量[Park 等，Protective effect of curcumin in rat liver injuryinduced by carbon tetrachloride，Journal ofPhamacy and Pharmacology，2000，52(4)，437-440]。提示薑黃素具有保肝、抗肝纖維化的作用。維生素A、C、E是體內主要的非酶類抗氧化劑，可作為供氫體與自由基反應而使其滅活。Kaul等發現給大鼠飼餵薑黃素或薑黃能夠抑制因維生素A缺乏所致的大鼠肝、腎、脾、大腦脂質過氧化水平升高[Kaul等，Influence of retinol deficiency and curcumin/turmeric feeding on tissue microsomal membrane lipid peroxidation and fatty acids inrats，Molecularand Cellular Biochemistry，1997，175(12)，43-48]。
此外，1985年Kuttan等報導了薑黃素的細胞毒作用[Kuttan等，Potentialanticancer activity of turmeric(Curcuma longa)，Cancer Letters(Shannon，Ireland)，1985，29(2)，197-202]，發現薑黃素在1.2μM可明顯抑制中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的生長。同樣濃度的薑黃素對淋巴細胞和Dalton淋巴廇細胞也產生明顯的細胞毒作用。後來，相繼有報導證明薑黃素在體外對許多腫瘤細胞株均有明顯的細胞毒作用，且一般的濃度範圍在0.03～0.3μM [Bhaumik等，Curcumin-mediatedapoptosis in AK-5 tumor cells involves the Production ofreactive oxygen intermediates，FEBS Letters，1999，456(2)，311-314；Fujisawa等，Cytotoxicity，ROS-generationactivity and radical-scavenging activity of curcumin and related compounds，Anticancer Research，2004，24(2B)，563-569]。
薑黃素除了存在潛在的細胞毒性之外，還有光毒性和皮膚毒性。Tonnesen研究發現低濃度(0.68-13.5μM)薑黃素即對傷寒沙門菌(S.typhimurium)和大腸埃希菌(E.coli)有光毒性作用[Tonnesen等，Studies on curcumin andcurcuminoids，IXInvestigation of the photobiological activity of curcumin usingbacterial indicator systems，Journal of pharmaceutical sciences，1987，76(5)，371-373]。薑黃素的光毒性在有氧的條件下，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更敏感；其機制可能是產生了過氧化氫。Goh等早在1987年就報導了1例職業性接觸薑黃素引起的皮膚過敏。隨後陸續有報導接觸含薑黃素成分的藥物、手術前皮膚消毒用的洗必泰和職業性暴露引起急性接觸性皮炎，往往表現為邊界清晰的水腫性紅斑、丘疹和/或水皰，常伴有瘙癢症狀[Goh等，Allergic contact dermatitis to Curcumalonga(turmeric)，Contact dermatitis，1987，17(3)，186]。
由以上活性及不足，我們看到對薑黃素深入的合成改造，以期發現更高效抗氧化、低毒性、有新活性的的薑黃素類似物，對開發該類抗氧化天然產物衍性物新藥進入保護肝損傷和腦損傷醫藥領域是十分必要的。因比我們根據以往的合成經驗，以從蓮葉橐吾醇啟發得到的二聚體進行比對，發現此類化合物與薑黃素有著極其相似的結構組成，並且用酯基代替了薑黃素中的亞甲基，可能會給分子帶來新的活性。同時，在苯環上取代基的變化也能給我們更多機會找到新的抗氧化構效關係，為開發此類新藥提供積累。有鑑於此，我們重新合成了一批如下圖所示類姜素結構的蓮葉橐吾二聚體，並對其進行了一系列活性測試。該類化合物及其製備方法已經在本發明人的相關發明中予以公開[趙昱等，發明專利《苯丙烯酸苯丙烯酯和苯丙酸苯丙酯類化合物及其製備方法和用途》申請號200410102894.1；公開號CN1796363A]，本發明中各化合物的製備方法與上述公開的內容基本相同，在此不再贅述。
本發明用體外抑制黃嘌呤氧化酶作用、體外清除陰離子超氧化自由基的活性、體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-dupheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性、自由基誘導之脂過氧化物生成的抑制等試驗說明本發明權利要求中化合物的抗氧化活性；本發明還測定了化合物對雙氧水(H2O2)所致PC12(大鼠腎上嗜鉻細胞瘤)細胞損傷的保護作用、化合物對鐵離子的螯合作用試驗以預測其延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經纖維糾結能力。

發明內容
本發明的目的是提供一種苯丙烯酸苯丙烯酯和其類似物及其可藥用鹽或其溶劑化物的新用途。具體而言，本發明提供了一種式(1)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯和其類似物及其藥用鹽或其溶劑化物抑制黃嘌呤氧化酶、清除自由基活性、保護肝臟細胞及肝臟器質性損傷、保護和治療腦損傷以及防治早老性痴呆症的活性。
其中取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分別獨立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1-8個碳的烷基，含1-8個碳的烷氧基，含1～8個碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1-15碳的不飽和烴氧基，含1-8個碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的醯氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8，不能同時是氫；取代基X可以是氫(H)2，羥基(OH)2，氧，硫；基團R可以是氧，硫，氮，含1～8個碳的亞烷基，含1～8個碳的亞烷胺基，含1～8個碳的亞烷氧基，含1～8個碳的亞烷硫基；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷胺基，或苯基。
本發明優選的式(1)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中當式(1)中的取代基X為氧，取代基R為氧肘，為式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物 其中取代基R6，R7，R8，R6，R7和R8可以相同或不同，分別獨立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，含1～8個碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的醯氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6，R7，和R8，不能同時是是氫；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷胺基，或苯基。
本發明優選的式(I)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中R6，R7，R8，R6′R7′或R8′可以相同或不同，分別獨立的選自氫，硝基，含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷胺基，含1～8個碳的烷氧基，含1～15個碳的不飽和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的烷氧基烷氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同時是氫；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷胺基，或苯基。
本發明進一步優選的式(I)化合物及其可藥用鹽或溶劑化物是，其中R6，R7，R8，R6′，R7′或R8′可以相同或不同，分別獨立地選自氫，硝基，含1～8個碳的烷氧基，含1～15個碳的不飽和烯氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的烷氧基烷氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′不能同時是氫；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基。
本發明優選的式(I)化合物包括I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-j.(E)-(7-羥基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；
I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)苄基)-苯丙烯酯；I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)苄基)-苯丙烯酯；I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)苄基)-苯丙稀酯；I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酯；I-t.(E)-(6，7-二羥基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
本發明的另一個目的是提供了式(1)化合物用於製備防治肝臟細胞及肝臟器質性損傷的藥物用途。
本發明的另一個目的是提供了一種含有式(1)化合物的用於製備基於抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經糾結機制的抗衰老、防治早老性痴呆症的藥物用途。
本發明的再一個目的是提供了一種含有式(1)化合物的用於製備基於抗氧化自由基、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經糾結機制的抗衰老、防治早老性痴呆症的藥物組合物。
本發明的又一目的是提供了式(I)化合物的用於製備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的用途。
本發明的再一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用於製備防治由氧自由基引起或與氧自由基有關的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的藥物組合物。
具體實施例方式
為了更好地理解本發明的實質，下面分別用藥理實施例的形式說明化合物活性測試的過程，藥理實施例給出了代表性化合物的部分生物活性數據。必須說明，本發明的實施例是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的簡單改進和藥理活性上的簡單擴展和外延都屬於本發明要求保護的範圍。式(1)化合物具有多種重要的生物活性，本發明將該系列化合物對過氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細胞損傷體外模型進行了肝細胞損傷保護活性篩選，發現該類化合物具有保護肝細胞和促進肝細胞修復的作用。本發明又對該類化合物抗氧自由基活性進行了測試，發現其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導之脂質過氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預期用於製備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現出很強的對抗自由基引起的PC12細胞損傷作用，即對模擬腦神經細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在與陽性對照藥物同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比陽性對照槲皮素還高。該類化合物還表現為對鐵離子強效螯合作用，從而預期其可以延緩或阻斷Aβ蛋白堆積以及腦部神經纖維糾結。說明其對保護腦神經、抗氧化、抑制Aβ蛋白生成和抑制腦部神經糾結、防治老年性痴呆症有積極作用。
本發明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結合，製備得到具有保護肝細胞急性和慢性傷活性、從而可以用於預防以及治療肝臟疾病的藥物組合物或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以採用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物還以與現已上市的肝臟保護及肝病治療藥物藥物如聯苯雙酯、水飛薊素、水飛薊賓葡甲胺、雙環醇、齊墩果酸、二氯乙酸二異丙胺、原卟啉鈉(protoporphyrin disodium)、馬洛替酯(malotilate)、熊去氧膽酸、還原型穀胱甘肽、輔酶Q10、維C肝、左旋肉鹼及其複方製劑、肝泰樂(葡萄糖醛酸內酯)、促肝細胞生長因子、山豆根及其有效成分注射液、苦參素(氧化苦參鹼)、五味子及其製劑、糖皮質激素、促皮質激素等聯合使用，製備得到具有保護肝臟活性的組合物，也可以與核苷類及非核苷類抑制B肝病毒如拉米呋啶(lamivudine)、利巴韋林(ribavirin)、阿昔絡韋(acyclovir)、泛昔絡韋(pancyclovir)、更昔絡韋(gamcyclovir)、阿德福韋(adevovir)、特諾福韋(tenofovir)、恩替卡韋(entecavir)等原料藥物或其製劑聯合或交叉使用，均可用於治療急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝極中毒性肝損傷疾病藥品或者保健品。上述各類藥物合物或者保健品可以採用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其熔劑化物可以與現已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)、白黎蘆醇、天然Vitamin E、槲皮素、茶多酚、地塞米松、巴比妥類、維生素C、氯丙嗪、甘露醇等聯合使用，製備得到具有防禦自由基引起的損害活性的抗氧化藥物合物或者保健品，用於治療上述肝部損傷疾病和治療傷類疾病如腦中風和中風後遺症、帕金森氏病、腦神經退化以及防治老年性痴呆症阿爾茨海默病。本發明的式(1)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物還可以與其他保護腦損傷藥物和防治老年性痴呆症藥物如石杉鹼甲、他可林(tacrine)、多奈哌齊(donepezil)、加當他敏、美曲磷脂、更斯的明、美金剛烷胺等聯合使用或交叉使用，用於治療上述疾病。上述各類藥物組合物或者保健品可以採用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
藥理實施例1苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t抑制黃嘌呤氧化酶(XO)活性試驗取SD大鼠，斷頭處死，迅速取出肝臟至預冷的磷酸緩衝液(100mM，pH8.75)中，去除血管，剪碎後用磷酸緩衝液1∶1(w/v)稀釋後勻漿，用磷酸酸緩衝液(1∶4)稀釋，離心(12000rpm/10分鐘，4℃)，取上清作為酶原。化合物I-t對XO的抑制作用測定採用酶聯免疫ELISA法。樣品孔中加入底物黃嘌呤(540μM，600微升)，酶(30微升)，化合物I-t用二甲亞碸溶解，用磷酸緩衝液稀釋，每孔30微升，使其終濃度為0.050毫克/毫升，加入硝基蘭四氮唑(NBT，100μM，30微升)和吩嗪甲硫酸酯(PMS，100μM，30微升，最後加入TritonX-100(0.4％，10微升L)，在37℃中水浴保溫2小時，於550nm波長下比色測定。空白孔中用相同體積的磷酸緩衝液代替底物。溶劑對照孔中加入與化合物等濃度的二甲亞碸。化合物I-t抑制率由樣品OD值對於空白和對照OD值計算。其中化合物I-t對XOD的半抑制濃度(IC50)由劑量效應曲線得到。薑黃素和別嘌醇為陽性對照。三次測試結果(平均值±標準差)見表一。
表一

a)別嘌醇對XO半數抑制濃度為3.9微克/毫升。
試驗結果表明，化合物I-t具有較強黃嘌呤氧化酶抑制作用，但是在同一濃度下，其清除能力和薑黃素相似而沒有別嘌醇對XO抑制活性高。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有一定黃嘌呤氧化酶抑制能力的抗氧化物質。
藥理實施例2苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗化合物I-t清除超氧陰離子自由基能力的檢測乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系統，用四唑氮藍(nitroblue tetrazolium)還原方法檢定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮藍和10μM吩嗪-N甲硫酸鹽在pH值為8.0的16mM Tris-HCl緩衝液中中產生出超氧陰離子自由基，對不同濃度的化合物I-t檢測其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍反應生成物的顏色用分光光度計在560nm波長下監測，薑黃素和槲皮素被用作陽性對照藥物。三次測試結果(平均值±標準差)見表二。
表二

試驗結果表明，化合物I-t具有有一定的超氧陰離子自由基清除作用，但是在同一濃度下，其清除能力沒有薑黃素和槲皮素對超氧陰離子自由基清除活性高。
結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有一定超氧陰離子自由基清除活性的抗氧化物質。
藥理實施例3苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物I-t體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗DPPH的甲醇溶液在517nm有強吸收值，其被抗氧化物還原時，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越強。在250微升反應體系中含有各種不同濃度的化合物I-t25微升，DPPH(0.4毫克/毫升)的甲醇溶腋40微升及甲醇溶液185微升，37℃水浴反應30分鐘後，在517nm處測定吸光度。薑黃素和槲皮素作為陽性對照，三次測試結果(平均值±標準差)見表三。
表三

試驗結果表明，化合物I-t具有一定的二苯基苦基苯肼自由基清除作用，其清除能力略高於薑黃素但低於槲皮素。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有較強二苯基苦基苯肼自由基清除活性的抗氧化物質。
藥理實施例4苯丙烯酸苯丙烯酪類化合物I-t對雙氧水H2O2所致PC12細胞損傷的保護作用活性試驗H2O2是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經系統細胞的凋亡，PC12細胞(大鼠腎上嗜鉻細胞瘤)可模擬腦神經細胞，因此常用它來作為研究藥物與神經細胞之間關係的模型，用MTT測細胞的存活率，如果待測化合物有清除由H2O2引起的自由基，保護神經細胞的作用，OD值高，細胞存活率就高，反之就低。對唐希燦所報導的方去(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，27573-76)加以改進測定化合物的保護作用。PC12細胞用DMEM培養基培養，培養基中含10％胎牛血清，100U/毫升青黴素和100U/毫升鏈黴素。細胞以每孔8000個的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮溼空氣的培養箱中培養36小時。細胞存活率用倒置顯微鏡觀察和改良的MTT法。細胞經48小時的孵育後，分別加新配的化合物I-t的二甲亞碸溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時後加入新配的H2O2(終濃度為600μmol/L)作用3小時，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養液，加入新的培養液100微升，然後加入MTT10微升，3小時後，小心吸去培養液，加入150微升DMSO溶解甲臢，於570nm處讀數。用槲皮素作陽性對照，三次測試結果(平均值±標準差)見表四。
試驗結果表明，化合物I-t具有很強的對抗自由基引起的PC12細胞損傷作用，即對模擬腦神經細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比陽性對照槲皮素還高。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有強效保護模擬腦神經細胞的PC12細胞作用的抗氧化物質。
表四 化合物I-t及陽性對照槲皮素對雙氧水損傷PC12細胞保護率

測定化合物對H2O2所致PC12細胞損傷的保護作用可作為初步探討其保護中樞腦神經細胞的作用機理。故該類化合物表現出對雙氧水損傷所致PC12細胞的保護作用，說明其對老年性痴呆證的治療有積極作用。
藥理實施例5化合物I-t抑制自由基誘導之脂質過氧化物生成的活性試驗5.1.實驗原理脂質過氧化是自由基作用於多不飽和脂肪酸的產物，含量與自由基的生成正相關，由於機體有抗氧化的酶系及非酶系的保護作用，使自由基不斷產生又不斷被清除。隨著年齡的增長，體內的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質過氧化作用則增強，脂質過氧化產物增多。因此，測定樣品抗脂質過氧化作用，是篩選抗氧化，抗衰老藥物的重要指標之一。
5.2化合物I-t抑制自由基誘導之脂過氧化物生成乃通過鼠肝微粒體檢測。(1)肝微粒體的製備實驗大鼠斷頭處死，迅速取出腦，用超速離心法製備腦微粒體。(2)樣品對鼠腦脂質過氧化的抑制作用在含硫酸亞鐵(4μmol/L)與維生素Vc(50μmol/L)的1毫升緩衝液中加入200μg/mL微粒體中，以誘導產生脂質過氧化，同時加入不同濃度的I-t樣品，37℃孵育30分鐘後加入1微升三氯醋酸(20％)中止反應加入1.5微升硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴20分鐘，離心去除蛋白沉澱，在532nm波長下測定上消吸光度。脂質過氧化以反應中生成的丙二醛表示，實驗以槲皮素作為陽性對照。三次測試結果(平均值±標準差)試驗結果見表五。
表五.樣品對大鼠腦微粒體脂質過氧化的抑制作用

5.3試驗結果表明，化合物I-t具有很強的抑制自由基誘導之脂過氧化物生成能力，即對細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其對細胞抗氧化損傷能力比陽性對照槲皮素還高。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有強效保護細胞抗氧化物質。提示其具有保護腦細胞組織損傷以及預期用於製備預防或治療中風後遺症、早老性痴呆，還可用於治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
藥理實施例6化合物I-t對SD新生大鼠原代肝細胞雙氧水損傷模型的保護作用試驗無菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日齡內)肝臟，剪碎，用025％的胰蛋白酶消化，製成肝細胞懸液。將肝細胞懸液收集在錐形瓶中，用200目雙層尼龍過濾，再用清洗液清洗，離心3次，以培養液重懸，即可得到大部分為肝實質細胞的懸液。用1640培養液(內含10％小牛血清，105U/升青黴素，100毫克/克鏈黴素10毫克/克胰島素)稀釋純化的肝細胞懸液，每毫升含1.0×106個肝細胞。將上述肝細胞懸液加入96孔(每孔0.1毫升)培養板中，置5％CO2培養箱中，在37℃下培養12小時後，吸棄上清，加入0.6mmol/L的H2O2。作用1小時後，分別加入高、中、低3種不同濃度的I-t樣品試驗藥液，每一濃度至少設3個復孔，同時設溶劑和陽性對照組。繼續培養48小時後，吸棄上清，收集幹細胞樣品，570nm波長下用酶標儀計算保護率和增生指數，三次測試結果(平均值±標準差)試驗結果見表六。
試驗結果表明化合物I-t具有較強的保護SD新生大鼠原代肝細胞免受雙氧水損傷模型的能力，即對SD新生大鼠原代肝細胞有抗氧化損傷保護作用。但在同一濃度下，其對細胞抗氧化損傷能力比陽性對照槲皮素略低。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有有效保護細胞抗氧化物質。提示其具有保肝護肝以及預期用於製備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
表六 SD新生大鼠原代肝細胞雙氧水損傷模型的保護作用

藥理實施例7化合物I-t對鐵離子的螯合作用試驗據報導在AD病人腦中鐵元素顯著升高，很可能鐵離子參與催化神經糾結形成和Aβ蛋白堆積，從而加速早老性痴呆症狀。對鐵離子的螯合清除作用也是抗氧化、防治早老性痴呆的作用機制之一。樣品以20～100微克/毫升的濃度加入含有2mM硫酸亞鐵(5微升)and80％二甲亞碸(200微升)的溶液中，向溶液中加入10微升濃度為5mM的ferrozine 室溫下劇烈搖動10分鐘。在562nm波長下測溶液吸收OD值，計算百分抑制率。三次測試結果(平均值±標準差)試驗結果見表七。
表七化合物對鐵離子螯合作用的試驗結果

試驗結果表明化合物I-t具有非常強的螯合鐵離子活性，可預期具有保護腦細胞免受鐵離子催化神經糾結形成和Aβ蛋白堆積的能力，從而可以減緩或預防早老性痴呆症狀。其對鐵離子螯合能力比陽性對照薑黃素和槲皮素都要高出許多。結論該類苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物屬於具有強效鐵離子螯合劑。
權利要求
1.一種式(1)所示的化合物及其可藥用鹽或溶劑化物的抗氧化、清除自由基、保護肝及腦細胞氧化損傷的活性 式(1)其中取代R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分別獨立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，含1～8個碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的醯氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8』不能同時是氫；取代基X可以是氫(H)2，羥基(OH)2，氧，硫；基團R可以是氧，硫，氮，含1～8個碳的亞烷基，含1～8個碳的亞烷胺基，含1～8個碳的亞烷氧基，含1～8個碳的亞烷硫基；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷胺基，或苯基。
2.式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物的抗氧化、清除自由基、保護肝及腦細胞氧化損傷的活性，式(1)中的取代基X為氧，取代基R為氧時即為式(I)所示的苯丙烯酸苯丙烯酯類化合物， 其中取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8′可以相同或不同，分別獨立地選自氫，巰基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，含1～8個碳的烷胺基，1～15碳的不飽和烴基，1～15碳的不飽和烴氧基，含1～8個碳的烷氧基烷氧基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的芳烷氧基，含1～8個碳的醯氧基，其條件是取代基R6，R7，R8，R6′，R7′和R8』不能同時是氫；其中用於取代的取代基可以是含1～8個碳的烷基，含1～8個碳的烷氧基，滷素，羥基，氨基，硝基，氰基，含1～8個碳的烷胺基，或苯基。
3.根據權利要求2的生物活性，其特徵為式(I)化合物是I-a.(E)-7-甲氧基-苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-b.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-c.(E)-(7-硝基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-d.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7，8′-三甲氧基)苯丙烯酯；I-e.(E)-(7-甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯脂；I-f.(E)-(6，7-二甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基)苯丙烯酯；I-g.(E)-(6，7，8-三甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′二甲氧基)苯丙烯酯；I-h.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(6′，7′-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-i.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)苯丙烯酯；I-j.(E)-(7-羥基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-k.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-l.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯；I-m.(E)-(6，7-二甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基甲氧基)-苯丙烯酯；I-n.(E)-(7-甲氧基甲氧基)苯丙烯酸-(E)-(7′-甲氧基)苯丙烯酯；I-o.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″，4″-二氯)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_，4_-二氯)苄基)-丙烯酯；I-p.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；I-q.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(3″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(3_-溴)苄基)-苯丙烯酯；I-r.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-(2″-碘，4″-溴)苄基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-(2_-碘，4_-溴)苄基)-苯丙烯酯；I-s.(E)-(6，8-二甲氧基-7-O-香葉基)-苯丙烯酸-(E)-(6′，8′-二甲氧基-7′-O-香葉基)-苯丙烯酯；I-t.(E)-(6，7-二羥基)苯丙烯酸-(E)-苯丙烯酯。
4.根據權利要求1～3所述之生物活性，其用於製備預防或治療急慢性肝損傷類疾病、保肝護肝類藥物的用途；以及該類化合物用於製備防治由自由基引起或與自由基相關的其他生理改變或疾病、保護腦神經包括抗氧化、防治中風和中風後遺症、帕金森氏症、防治老年性痴呆症以及炎症、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態反應、動脈粥樣硬化等疾病藥物的用途。
5.根據權利要求4的用途所製備得到的保肝護肝藥、中風和中風後遺症藥物、帕金森氏症藥物、防治老年性痴呆症以及炎症藥物、抗自身免疫性疾病藥物、治療心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態反應和動脈粥樣硬化藥物、治療心血管及腦血管病變藥物、抗衰老藥物、和/或抗腫瘤藥物或藥物組合物。
6.一種用於製備清除自由基、防治中風和中風後遺症、帕金森氏症、防治老年性痴呆症以及炎症、抗自身免疫性疾病、治療心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態反應和動脈粥樣硬化、治療心血管及腦血管病變、抗衰老、和/或抗腫瘤、保護肝細胞損傷及急慢性肝損傷的藥物組合物，其含有作為活性成分的治療有效量的權利要求1～3所述之化合物或其可藥用鹽或溶劑化物或者它們的混合物和可藥用輔料。
7.根據權利要求6的藥物組合物，其可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以採用現代製藥界所公知的控釋或緩釋劑型。
全文摘要
本發明涉及苯丙烯酸苯丙烯酯型薑黃素類似物的抗氧化、保護肝臟和腦損傷活性的用途。試驗發現該類化合物具有保護大鼠乳鼠原代肝細胞損傷、促進肝細胞修復、體外清除超氧陰離子和二苯基苦基苯肼自由基、抑制脂質過氧化物生成的活性，對模擬腦神經細胞的大鼠腎上嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞有抗氧化損傷保護作用，對鐵離子有強效螯合作用。因而可以預期用於製備防治急慢性肝或腦損傷類疾病、防治中風和中風後遺症、帕金森氏症、老年性痴呆症以及炎症、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態反應、動脈粥樣硬化等疾病的藥物。
文檔編號A61P39/00GK101015543SQ20071006725
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月15日 優先權日2007年2月15日
發明者楊雷香, 張麗娟, 白驊, 呂旦旦, 趙昱 申請人:浙江海正天華新藥研發有限公司