一種雙水相萃取白英中總皂苷的方法
2023-12-08 14:51:01
專利名稱：一種雙水相萃取白英中總皂苷的方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，涉及一種雙水相萃取白英中總皂苷的方法。
背景技術：
白英為茄科植物lyratum Thunb.的乾燥全草，又名白毛藤，主產於江 蘇、浙江、江西，性微寒，味苦。最早見於《本經》記載，列為上品，為傳統中藥。具有清熱解毒、 祛風化痰、除溼等功效，用於治療癌症腫瘤、皰疹、瘧疾、黃疸、水腫、淋病、風溼性關節炎、白 帶異常等病證。白英含有多種化學成分，主要有留體皂苷類、留體生物鹼類、有機酸類等化 合物。其中皂苷類成分主要包括以薯蕷皂苷元、替告皂苷元、雅姆皂苷元等皂苷元為母核的 多種留體皂苷。藥理研究顯示白英中總皂苷在體內外均具有一定的抗腫瘤作用，且存在一 定的選擇性。現代研究證實以薯蕷皂苷元為母核的留體皂苷具有抗腫瘤、改善心血管功能、調 節免疫、抗血小板聚集、降血脂等多種藥理作用，同時也是目前合成各種留體激素類藥物的 重要原料。因此，含此類成分中藥的應用前景十分廣闊，是備受關注的天然化合物之一。白英中的皂苷大多以糖苷形式存在，一般提取時多採用水、甲醇、乙醇水溶液做提 取溶劑，用正丁醇做萃取劑。另據報導，有人採用大孔吸附樹脂的方法提取分離皂苷類化合 物。採用正丁醇萃取，使用的溶劑毒性較大，而且需重複三次，操作繁瑣；採用大孔吸附樹 脂，前處理方法複雜，而且提取率較低，費時。雙水相萃取技術(Aqueous two-phase extraction, ATPS)是指親水性聚合物水 溶液在一定條件下可以形成雙水相，利用被分離物在兩相中分配的不同而分離的技術。雙 水相萃取技術以其萃取條件溫和，分相快速、處理容量大、回收率高、能耗低、萃取原理簡 便、設備投資費用少、操作簡單，且不存在有機溶劑殘留問題等優點，目前已在生物化學，細 胞生物學和生物化工等領域得到廣泛應用。中草藥有效成分分子中多具有疏水性結構，因 此雙水相萃取技術在中草藥有效成分分離純化中的應用是當前研究的熱門。
發明內容
為了避免現有技術的不足之處，本發明提供了一種雙水相萃取白英中總皂苷的方 法，這種方法不但避免了有毒溶劑的使用，提高了白英中總皂苷的提取率，而且方法本身操 作簡便、經濟。本發明的技術方案為
(1)固液浸提將白英藥材粉碎，加入溶劑，固液浸提，過濾除雜後得到白英粗提液；
(2)雙水相萃取取上述白英粗提液，濃縮至原來體積的1/5，加入無水乙醇/硫酸銨形 成的雙水相系統，加水使系統總量為一定值，混勻，靜置後分為上下兩相；
(3)減壓蒸餾，真空乾燥取出含有大量白英總皂苷的無水乙醇相，對其進行減壓濃縮， 得到白英總皂苷提取物。上述加入的無水乙醇質量分數為系統總量16%_30%，加入的硫酸銨質量分數為系統總量的17%_22%。為了進一步提高白英總皂苷的回收率，本發明可進一步優化反應條件、步驟。(1)在固液浸提中，加入的溶劑為甲醇、乙醇、水或者它們的組合溶液，加熱回流提 取1小時，提取三次。合併三次提取後的濾液，減壓蒸餾，真空乾燥。(2)在雙水相萃取中，無水乙醇質量分數為16%_30%，硫酸銨的質量分數為 17%-22%，分相溫度為300C -800C，分相時間為10分鐘，pH為5. 0-9. 0。(3)在減壓蒸餾，真空乾燥中，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C。利用高氯酸顯色，可見分光光度法測定雙水相萃取體系中白英總皂苷的濃度，按 公式(1)計算回收率。回收率Y=RK/(1+RK) X 100%(1) 相比R=Vt/Vb
分配係數K=Ct/Cb
V0Vb——分別是上下相體積(ml) C0Cb——分別是上下相白英總皂苷的質量濃度(μ g/ml) 總皂苷的含量測定採用分光光度法，對照品和樣品的吸收光譜圖如圖1、圖2。具體步驟如下稱取一定量的白英總皂苷提取物，精密稱定，加入一定體積的高氯 酸，在65°C水浴中加熱15min，立即取出於冰水冷卻放置15min，以空白溶液做參比，在410 nm波長處測定吸光度，代入標準曲線計算白英中總皂苷的含量。薯蕷皂苷元的含量測定採用高效液相法，對照品和樣品的色譜圖如圖3、 圖4。具體步驟如下稱取一定量的白英總皂苷提取物，精密稱定，加入一定量的2mol/ L的鹽酸，在100°C的水浴中加熱水解池，冷卻後加入適量氯仿，加熱回流萃取三次，每次 15min,合併氯仿萃取液，水浴蒸乾，甲醇定容至一定刻度的容量瓶，過0.45 μ m的微孔濾 膜，取續濾液，進樣20μ1，即得。採用外標法定量。平行測定3份。與已有技術相比，本發明所提供的雙水相萃取白英中總皂苷的方法的優點在於 (1)分相迅速，回收率高
在實驗中觀察到，採用雙水相萃取法，約10分鐘即可分相，並且沒有乳化層，縮短了實 驗周期，且回收率高。(2)過程集成
雙水相萃取既達到了預處理的目的，又濃縮了料液，濃縮倍數達到4倍以上。(3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用，採用了低毒的無水乙醇，利於環保且節約試 劑。(4)界面張力小，有助於兩相之間的質量傳遞。(5)大量雜質可與固體物質一同除去，有利於純化樣品。(7)易於工藝放大和連續操作，與後續純化工序可直接相連，無需進行特殊處理。( 8 )本發明方法簡單，易於掌握，且條件溫和，整個操作過程在常溫常壓下進行。
圖1為薯蕷皂苷元對照品紫外吸收光譜圖橫坐標為吸收波長(nm)，縱坐標為吸光度(A)，最大吸收波長為410 nm。圖2為總皂苷提取物紫外吸收光譜圖
橫坐標為吸收波長(nm)，縱坐標為吸光度(A)，最大吸收波長為410 nm。圖3為薯蕷皂苷元對照品高效液相色譜圖
橫坐標為時間(t)，縱坐標為響應(mv)，保留時間為12. 17 min。圖4為總皂苷提取物的高效液相色譜圖
橫坐標為時間(t)，縱坐標為響應(mv)，保留時間為12. 17 min。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例1 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇質量分數為 25%，硫酸銨的質量分數為17%，pH為5. 8，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無 水乙醇相的收率為76. 8%。(3)取出無水乙醇相，置於70°C減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例2 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇質量分數為 25%，硫酸銨的質量分數為22%，pH為5. 8，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水 乙醇相的收率為77. 0%。(3)取出無水乙醇相，置於75°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。 實施例3
(1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約1. 0 g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇濃度為16%， 硫酸銨濃度為20%，pH為5. 8，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收 率為65. 4%ο
(3)取出無水乙醇相，置於80°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例4 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇濃度為30%， 硫酸銨濃度為20%，pH為5. 8，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收 率為94. 5%ο(3)取出無水乙醇相，置於70°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例5: (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，，其中無水乙醇濃度為30%， 硫酸銨濃度為20%，pH為5. 0，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收 率為93. 5%ο(3)取出無水乙醇相，置於70°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例6 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣品 溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，，其中無水乙醇濃度為30%， 硫酸銨濃度為20%，pH為9. 0，30°C放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收 率為92. 4%ο(3)取出無水乙醇相，置於80°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例7 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約ι. O g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重反覆3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣 品溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇濃度為30%， 硫酸銨濃度為20%，分相溫度為30°C，pH為7. 0，放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收率為95. 2%。(3)取出無水乙醇相，置於75°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物. 實施例8
(1)固液浸提
取粉碎的白英藥材約1. 0 g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱回流提 取lh，重反覆3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白英樣 品溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨雙水相系統，其中無水乙醇濃度為30%， 硫酸銨濃度為20%，分相溫度為80°C，pH為7. 0，放置10分鐘，靜置分相。其中總皂苷在無水乙醇相的收率為95. 4%。(3)取出無水乙醇相，置於70°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提取物。實施例9 (1)固液浸提
取粉碎的白英藥材三批，各約50 g，精密稱定，在90°C水浴中用體積分數為70%乙醇熱 回流提取lh，重複3次後過濾，濾液加熱濃縮得浸膏，以水分散至原濾液體積的1/5，即得白 英樣品溶液。(2)雙水相萃取
取上述白英樣品溶液，加入無水乙醇/硫酸銨(質量分數比1.5:1)雙水相系統，，其中 無水乙醇濃度為30%，硫酸銨濃度為20%，分相溫度為30°C，調節pH為7. 0，放置10分鐘，靜 置分相。(3)取出無水乙醇相，置於70°C下減壓蒸餾，真空乾燥後得到白英總皂苷提 取物。計算收率分別為0. 311%，0. 316%和0. 300%，平均收率為0. 309%。(4)含量測定
按總皂苷的含量測定項下方法測定總皂苷的含量；按薯蕷皂苷元含量測定項下方法測 定薯蕷皂苷元的含量，結果見表1。表1白英總皂苷提取物中總皂苷及薯蕷皂苷元的含量
權利要求
1.一種雙水相萃取白英中總皂苷的方法，其特徵在於(1)固液浸提將白英藥材粉碎，加入溶劑，固液浸提，過濾除雜後得到白英粗提液，(2)雙水相萃取取上述白英粗提液，濃縮至原體積的1/5，加入無水乙醇/硫酸銨形成 的雙水相系統，加水使系統總量為一定值，混勻，靜止後分為上下兩相，(3)減壓蒸餾，真空乾燥取出含有大量白英總皂苷的無水乙醇相，對其進行減壓濃縮， 得到白英總皂苷提取物。
2.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於在固液 浸提中，加體積分數為70%、體積為白英藥材10倍量的乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次1 小時。
3.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於在固液 浸提中，所述溶劑為甲醇、乙醇、水或者它們的組合溶液。
4.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於加入的 無水乙醇與硫酸銨質量分數比為1. 5:1。
5.根據權利要求1或4所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於加入 的無水乙醇質量分數為16%-30%，加入的硫酸銨質量分數為17%-22%。
6.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於在雙水 相萃取中，分相溫度為30°C -80°C，分相時間為10分鐘。
7.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於在雙水 相萃取中，其pH為5. 0-9.0。
8.根據權利要求1所述的一種雙水相萃取白英總皂苷的方法，其特徵在於在減壓 蒸餾，真空乾燥中，減壓蒸餾的溫度為70°C -80°C。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，涉及一種雙水相萃取白英中總皂苷的方法。本發明的特徵在於將白英藥材粉碎，加入溶劑，固液浸提，過濾除雜後得到白英粗提液；取上述白英粗提液，濃縮至原來體積的1/5，加入無水乙醇/硫酸銨形成的雙水相系統，加水使系統總量為一定值，混勻，靜置後分為上下兩相；取出含有大量白英總皂苷的無水乙醇相，對其進行減壓濃縮，得到白英總苷提取物。本發明的有益效果是提高了白英總皂苷的萃取率，所使用的溶劑低毒，有利於環保，同時方法本身既簡便又經濟。
文檔編號A61P37/02GK102133298SQ20101057085
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月3日 優先權日2010年12月3日
發明者孫立新, 賈玉榮 申請人:瀋陽藥科大學