寡核苷酸n3′→p5′硫代氨基磷酸酯,其合成及應用的製作方法

2023-12-08 08:00:06 3

專利名稱：寡核苷酸n3′→p5′硫代氨基磷酸酯,其合成及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有新的含核苷間3′-NHP(O)(S-)O-5′連鍵的糖-磷酸骨架的寡核苷酸，更具體地，本發明涉及硫代氨基磷酸酯(thiophosphoramidate)寡核苷酸組合物，其作為診斷劑或治療劑的用途，及合成硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的方法。
背景技術：
核酸聚合物化學在藥物、診斷和分析領域、更具體地在反義和反基因治療學、組合化學、分支DNA信號擴增和基於陣列的DNA診斷學和分析亞領域的許多開發技術中起重要作用(例如Uhlmannand Peyman，化學綜述90543-584，1990；Milligan等，醫學化學雜誌361923-1937，1993；DeMesmaeker等，結構生物學當前觀點5343-355，1995；Roush，科學2761192-1193，1997；Thuong等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32666-690，1993；Brenner等，美國科學院院報895381-5383，1992；Gold等，生物化學年度綜述64763-797，1995；Gallop等，醫學化學雜誌371233-1258，1994；Gordon等，醫學化學雜誌371385-1401，1994；Gryaznov，國際申請PCT/US94/07557，Urdea等，美國專利5,124,246；Southern等，基因組131008-1017，1992；McGall等，美國專利5,412,087；Fodor等，美國專利5,424,186；Pirrung等，美國專利5,405,783)。
這一化學主要涉及改善天然核酸聚合物如DNA的結合強度，特異性和核酸酶抗性。不幸的是，一個性質如核酸酶抗性的改善通常涉及其它性質如結合強度的犧牲。這種犧牲的例子非常多肽核酸(PNA)展示良好的核酸酶抗性和結合強度，但是在測試培養物中細胞攝入降低(例如Hanvey等，科學2581481-1485，1992)；硫代磷酸展示良好的核酸酶抗性和可溶性，但是典型地是作為P-手性混合物合成並顯示若干非序列特異性生物學作用(例如Stein等，科學2611004-1012，1993)；甲基膦酸酯展示良好的核酸酶抗性和細胞攝入，但是也是典型地作為手性混合物合成並具有降低的雙螺旋穩定性(例如Mesmaeker等，(如上所述))；等等。
最近，一類新的寡核苷酸類似物被開發出來，其具有所謂的N3′→P5′氨基磷酸酯核苷間連鍵，其展示有利的結合性質、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov and Letsinger，核酸研究203403-3409，1992；Chen等，核酸研究232661-2668，1995；Gryaznov等，美國科學院院報925798-5802，1995；Gryaznov等，美國化學協會雜誌1163143-3144，1994)。氨基磷酸酯化合物在每個2′-脫氧呋喃糖核苷殘基含有3′氨基基團代替3′-氧原子。寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成和性質也在Gryanov等，美國專利5,591,607；5,599,922；5,726,297；和Hirschbein等，美國專利5,824,793中有描述。
寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯與互補DNA、特別是RNA鏈形成非常穩定的雙螺旋，與DNA雙螺旋形成穩定三螺旋，並且它們還抗核酸酶(Chen等，核酸研究232661-2668，1995；Gryaznov等，美國科學院院報925798-5802，1995)。另外，寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯在體外和體內均是比硫代磷酸衍生物更強的反義製劑(Skorski等，美國科學院院報943966-3971，1997)。同時，相對於天然磷酸二酯相應物，氨基磷酸酯表觀上對胞內和胞外蛋白質具有低親和性，和增加的酸不穩定性(Gryaznov等，核酸研究241508-1514，1996)。寡核苷酸氨基磷酸酯的這些特徵對於某些應用潛在地負面影響其藥物學性質。特別是，考慮到需要使用寡核苷酸製劑作為口服藥物，寡核苷酸的酸穩定性更是重要的品質。
為了克服與寡核苷酸類似物相關的上述問題，需要一類新的化合物，其能包括寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸的最佳特徵。本發明描述了寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成、性質和用途。
發明概述本發明的組合物和方法涉及具有由亞單位間連鍵結合的連續核苷亞單位的多核苷酸。在本發明的多核苷酸中，至少兩個連續亞單位通過N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵而結合，所述連鍵由式3′-[NH-P(＝O)(-SR)-O-]-5′啶義，其中R選自氫、烷基、芳基及其鹽組成的組。在本發明的一個優選的實施方案中，R是氫或其鹽。本發明的多核苷酸的組成可以是使得所有亞單位間連鍵均是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。或者，本發明的多核苷酸可以含有第二類亞單位間連鍵如磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、p3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯連鍵。
一種舉例性的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵具有下式 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽組成的組；R1選自由氫、O-R2、S-R2和滷素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當Z是甲基或OMe時，R1不是H。組成多核苷酸的核苷亞單位可以選擇組成一確定序列如與單鏈核酸靶序列互補的鹼基序列，或者能使多核苷酸和靶雙螺旋之間形成三螺旋結構的序列。由至少一個如上所述N3′→P5 ′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵結合的核苷亞單位與具有氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸相比具有優異的酸水解抗性，同時仍保持相同的熱穩定性。
本發明還包括合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的方法。在這一方法中，將第一個核苷5′-琥珀醯基-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷附著於固相支持物上。該第一個核苷還另外具有保護3′氨基基團。該保護3′氨基基團隨後脫保護以形成游離3′氨基基團，向其加入第二個核苷。第一個核苷的游離3′氨基基團與3′-保護氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷醯胺單體反應形成核苷間N3′→P5′亞磷醯胺連鍵。該核苷間N3′→P5′亞磷醯胺基團隨後硫化形成第一個和第二個核苷之間的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯核苷間連鍵。
本發明另一個實施方案中，提供了一種將本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與DNA或RNA靶雜交的方法。該硫代氨基磷酸酯多核苷酸包含由至少一個下式定義的亞單位連接成的核苷亞單位序列，所述公式為 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，R1選自由氫、O-R2、S-R2和滷素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當Z是甲基或OMe時，R1不是H。將硫代氨基磷酸酯多核苷酸與RNA靶接觸以使該多核苷酸與RNA靶之間形成雜交複合物。
本發明還包括藥物組合物和試劑盒，其包括具有至少一個如上所述N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵的多核苷酸。本發明寡核苷酸特別適用於基於雜交作用的口服治療應用，如反基因和反義應用，包括抑制端粒酶活性。
附圖簡述參照下述描述和附圖，本發明的上述方面和許多優點將變得更易理解，其中

圖1A示出寡核苷酸硫代磷酸酯的核苷間連鍵結構。
圖1B示出寡核苷酸氨基磷酸酯的核苷間連鍵結構。
圖1C示出舉例性的本發明寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的核苷間連鍵結構。
圖2示出均勻修飾的寡核苷酸硫代氨基磷酸酯的逐步合成示意圖。
圖3示出將二核苷酸硫代氨基磷酸酯轉變為其氨基磷酸酯相應物的示意圖，以及由二核苷酸硫代氨基磷酸酯水解得到的產物。
圖4示出用增加量的與端粒酶RNA互補的SEQ ID NO2的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸，或含有核苷酸錯配的SEQ ID NO4進行的體外端粒酶抑制分析結果。
圖5示出用增加量的與端粒酶RNA互補的SEQ ID NO10的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸進行的體外端粒酶抑制分析結果。
圖6示出與端粒酶RNA互補的SEQ ID NOs2和10以及含有核苷酸錯配的SEQ ID NO4對HME50-5E細胞生長的作用結果。
圖7示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸對HME50-5E細胞的端粒長度的作用結果。
圖8示出測定的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2的IC50值。
詳細描述定義「烷基」是指具有1-20個碳原子的烷基或取代烷基，如甲基、乙基、丙基等。低級烷基典型是指C1-C5，中級烷基典型是指C6-C10。
「芳基」是指具有5-20個碳原子的芳香環基團，如苯基、萘基、蒽基或取代芳基，如烷基或芳基取代如甲苯基、乙基苯基、聯苯基等。還包括環中具有一或多個氮、氧或硫原子的雜環芳香環基團。
「寡核苷酸」典型地是指具有約3-50個連續亞單位的核苷亞單位聚合物。核苷亞單位可通過各種亞單位間連鍵而連接，所述連鍵包括但不限於圖1A-1C中所示的那些。另外，「寡核苷酸」包括本領域熟練技術人員已知的對糖骨架(例如核糖或脫氧核糖亞單位)、糖(例如2′取代)、鹼基和3′和5′末端的修飾。本文所用術語「多核苷酸」具有相同含義，因為術語「寡核苷酸」和「多核苷酸」在本文可互換地使用。
當寡核苷酸由字母序列如「ATGUCCTG」表示時，應理解核苷酸從左至右是5′→3′順序。
本文所用術語「核苷」包括天然核苷，如2′-脫氧和2′-羥基形式，例如如Komberg和Baker在《DNA複製》第2版(Freeman，舊金山，1992)所述，及其類似物。核苷「類似物」包括具有修飾的鹼基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷，例如，如Scheit在《核苷酸類似物》(John Wiley，紐約，1980)所述。這種類似物包括設計用於增強結合性質如穩定性、特異性等的合成核苷，如Uhlmann和Peyman(化學綜述90543-584，1990)所揭示的那些。
「鹼基」在本文中的定義包括(i)典型的DNA和RNA鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶)和(ii)修飾的鹼基或鹼基類似物(例如5-甲基胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，或肌苷)。鹼基類似物是一種化合物，其分子結構模擬典型DNA或RNA鹼基的分子結構。
本文所用「嘧啶」是指在天然核苷中存在的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，及其常見類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、滷代等取代基的類似物。該術語進一步包括附著有常見保護基的嘧啶，如N4-苯甲醯胞嘧啶。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48223-2311，1992)公開了其它常見嘧啶保護基。
本文所用「嘌呤」指在天然核苷中存在的嘌呤，包括腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤，及其常見類似物，如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、氨基、硫代、滷代等取代基的類似物。該術語進一步包括附著有常見保護基的嘌呤，如N2-苯甲醯鳥嘌呤，N2-異丁醯鳥嘌呤，N6-苯甲醯腺嘌呤等。Beaucage和Iyer(Tetrahedron 48223-2311，1992)公開了其它常見嘌呤保護基。
本文所用的作為化合物名稱的組成部分的術語「保護」是指本領域熟知的對於一化合物的特定部分的保護基團，例如核苷的「5′-保護羥基」包括三苯基甲基(即trityl)，對茴香基二苯基甲基(即單甲氧基三苯甲基或MMT)，二-對茴香基二苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)。本領域熟知的保護基團包括下述參考文獻中描述的保護基團Gait編輯的《寡核苷酸合成實用途徑》(IRL出版社，牛津，1984)；Amarnath and Broom，化學綜述77183-217，1977；Pon等，生物技術6768-775，1988；Ohtsuka等，核酸研究106553-6570，1982；Eckstein編輯的《寡核苷酸和類似物實用途徑》(IRL出版社，牛津，1991)，Greene and Wuts，《有機合成中的保護基團》第2版(John Wiley Sons，紐約，1991)，Narang編輯的《DNA和RNA合成及應用》(學術出版社，紐約，1987)，Beaucage and Iyer(文獻同上)等。
術語「滷素」或「滷代」以其常規含義應用，是指氯、溴、氟或碘取代基。在本文所述及所要求的化合物中，滷素取代基通常是氟、溴或氯，優選是氟或氯。
本發明的化合物可用於抑制或降低端粒酶活性和/或具有端粒酶活性的細胞的增殖。在這些前後關係上，抑制或降低酶活性或細胞增殖是指相對於酶或細胞未用測試化合物處理的對照實驗所測活性水平降低。在特定的實施方案中，所測活性的抑制或降低為至少10％降低或抑制。本領域熟練技術人員將會理解所測活性降低或抑制至少20％、50％、75％、90％或100％對於特定應用可能是優選的。
本發明一般地涉及含有至少一個硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸，合成這種多核苷酸的方法，以及使用本發明寡核苷酸作為治療化合物及用於診斷的方法。
舉例性的寡核苷酸具有下式 其中每個B獨立地被選擇是嘌呤或嘧啶或其類似物，如尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶和肌苷，Z1是O或NH，Z2是OR，SR或甲基，其中R選自由氫、烷基、芳基和其鹽組成的組，R1選自由氫、O-R2、S-R2、NHR2和滷素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，R3和R4選自由羥基、氨基和氫組成的組，m2是1-50之間的整數。
組成本發明的多核苷酸核苷酸的核苷亞單位可以選擇組成一確定序列如能特異地與單鏈核酸靶序列雜交的鹼基序列，或者能使多核苷酸和靶雙螺旋之間形成三螺旋結構的序列。優選地，核苷亞單位序列通過至少一個是如下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位連接 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物，Z是OR，SR或甲基，其中R選自由氫、烷基、芳基和其鹽組成的組，R1選自由氫、O-R2、S-R2、和滷素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當Z是甲基或OMe時，R1不是H。
例如，多核苷酸的所有亞單位間連鍵均可以是由下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵 本發明的寡核苷酸可以用於與靶核酸序列如RNA和DNA雜交。如果需要，本發明的寡核苷酸可以用報導基團如放射性標記、生物素標記、螢光標記等標記以促進檢測多核苷酸本身，以及其在例如雜交複合物中的存在。
在本發明的另一方面，提供了用於分離或檢測樣品中的靶RNA的試劑盒，該試劑盒含有一種寡核苷酸，該寡核苷酸具有由至少一個下式定義的亞單位間連鍵而連接的核苷亞單位確定序列 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物；Z是OR，SR或甲基；R1選自由氫、O-R2、S-R2、和滷素組成的組，而R2是H，烷基或(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S，或NH，條件是當Z是甲基或OMe時，R1不是H，以及其中該寡核苷酸與靶RNA雜交。
所述寡核苷酸還可配製成在與靶基因的過表達相關的疾病情況中抑制細胞轉錄或翻譯的藥物。
優選地，核苷亞單位序列由至少一個是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位間連鍵而連接。或者，多核苷酸的所有亞單位間連鍵均是由下式定義的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵 在其它方面，本發明涉及用Nelson等(有機化學雜誌627278-7287，1997)的亞磷醯胺轉移方法學的修改技術合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的固相方法。該合成策略採用購自Cruachemand JBL Scientific，Inc.(Aston，PA和San Luis Obispo，CA)的3′-NH-三苯甲基保護3′-氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷醯胺(Nelson等，文獻同上)。用下述化學程序進行每一合成循環(見圖2)1)脫三苯甲基化，2)偶聯，3)加帽，4)硫化。對於在偶聯步驟後形成的核苷間亞磷醯胺基團的逐步硫化，用硫化劑代替碘/水基氧化劑，可以使用元素硫S8或常用的Beaucage試劑3H-1，2-苯並二硫羥-3-酮(Iyer等，有機化學雜誌554693-4699，1990)。用在無水乙腈中的1％Beaucage試劑溶液或在CS2/Et3N，99/1(vol/vol)中的15％S8作為硫化劑進行寡核苷酸合成(1μmole合成規模)。
嵌合N3′→P5′氨基磷酸酯-硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的製備可採用偶聯步驟後的氧化步驟進行，該步驟導致形成氨基磷酸酯核苷間基團。類似地，磷酸二酯-硫代氨基磷酸酯可通過用5′-亞磷醯胺-3′-O-DMTr保護的核苷酸作為單體構件製備。這些合成途徑均是本領域已知的。
用兩種硫化劑製備模型氨基磷酸酯胸腺嘧啶二核苷TnpsTn，其具有3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷間基團。分析反應混合物並經離子交換(IE)和反相(RP)HPLC以及31P NMR證實該化合物的結構。分析揭示用Beaucage試劑對核苷間亞磷醯胺基團的硫化導致形成約10-15％的具有3′-NHP(O)(O-)O-5′氨基磷酸酯連鍵的氧化二核苷(31PNMRδ，ppm7.0於D2O中)。或者，用分子硫S8產生所需的含3′-NHP(O)(S-)O-5′核苷間基團的二核苷，用31P NMR和IE HPLC分析判斷其具有有實際應用價值的產量(31P NMRδ，ppm 56.4，59.6於D2O中，Rp，Sp異構體)。
合成模型寡核苷酸11聚體GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO1)也獲得類似的硫化效率結果，其中用Beaucage試劑硫化產生含有約15％氨基磷酸酯連鍵的全長產物，這是用反應混合物的31P NMR分析確定的。主峰的化學位移約為57和60ppm(寬雙峰)和7ppm(寬單峰)，其分別相應於硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯基團。相反，根據31P NMR分析，用S8硫化僅在11聚體產物中產生約2％氨基磷酸酯連鍵。寡聚物的IE HPLC分析與31P NMR譜吻合很好。最終寡核苷酸產物的結構和純度用MALDI-TOF質譜分析、31P NMR及聚丙烯醯胺凝膠電泳分析證實。硫代氨基磷酸酯寡聚物GT2AG3T2AG(SEQID NO1)和TAG3T2AGACA2(SEQ ID NO2)的分子量分別計算為3577.11和4202.69。經MALDI-TOF質譜分析實驗確定的硫代氨基磷酸酯寡聚物GT2AG3T2AG(SEQ ID NO1)和TAG3T2AGACA2(SEQID NO2)的分子量分別為3577和4203；在15％PAGE中相對於等序列(isosequential)氨基磷酸酯的遷移率分別為0.95和0.97。
如IE HPLC和31P NMR(31P NMRδppm7.0)(見圖3)所鑑定的，通過用在吡啶/THF/H2O 1/4/0.1(vol/vol)中的0.1M碘溶液在55°C處理15分鐘，模型氨基磷酸酯核苷TnpsTn被定量轉變為氨基磷酸酯相應物TnpTn。將TnpsTn二核苷用10％乙酸在55℃處理48小時出人意料地僅導致核苷間氨基磷酸酯連鍵的部分水解(約10％)。為在這些條件下進行比較，將親本氨基磷酸酯二聚體TnpTn完全水解。該二核苷硫代磷酸酯中的N-P鍵的裂解同時伴有脫硫過程(約15％)，隨後是所得氨基磷酸酯-NHP(O)(O-)O-基團的快速水解，如IE HPLC和31P NMR所揭示(圖3)。
2′-R3N3′→P5′硫代氨基磷酸酯可如上所述從相應的氨基磷酸酯獲得。2′-R3N3′→P5′氨基磷酸酯是通過設計用於合成寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的亞磷醯胺轉移方法學獲得。2-O-烷基N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成作為這一方法學的舉例而詳細描述。
根據下述方案1-3所示的一系列化學轉化製備合適保護的2′-O-烷基-3′氨基核苷-5′-亞磷醯胺構件4，6，11和15。製備這些化合物的一創造性步驟是在嘧啶的亞氨基官能性或嘌呤的N-7原子存在下對2′-羥基選擇性甲基化。兩個嘧啶基單體得自己知的3-疊氮-2′-O-乙醯基-5′-O-甲苯醯基-3′-脫氧-β-D-核糖呋喃糖基尿嘧啶1。典型地，1的N-3/O-4亞氨基氮首先用保護基團保護，如通過在二甲基氨基吡啶存在下甲基propyolate的反應而進行(方案1)。粗反應產物隨後選擇性地2′-O-去乙醯化，然後得到的游離2′-羥基被烷基化，如通過用碘甲烷和氧化銀進行甲基化。N-3保護基團被除去，3′-疊氮基被還原成胺，隨後其被立即保護，如與4-單甲氧基三苯甲基氯反應，得到前體3。隨後用鹼性溶液裂解5′-甲苯醯基酯，接著用已知方案進行phosphitylation，得到所需的2′-O-甲基尿苷亞磷醯胺單體4。通過將尿苷中間體3轉化為3′-氨基胞苷類似物5而獲得2′-O-甲基胞嘧啶亞磷醯胺。 2′-O-烷基腺苷類似物的合成需要使用大保護基團，主要用於環外氨基以防止在2′-羥基甲基化期間N-7的烷基化(方案2)。3′-疊氮-2′-O-乙醯基-5′-O-N6-苯甲醯-3′-脫氧腺苷7首先被脫保護，如與NH3/MeOH(1/1，v/v)反應，以提供3′-疊氮-3′-脫氧腺苷。然後，用大保護基團如叔丁基二苯基甲矽烷基或4-單甲氧基三苯甲基對5′-羥基和N-6部分選擇性再保護。在5′-O和N-6位置的兩個大取代基的組合立體封閉N-7，由此使得在2′-位置選擇性導入甲基，以產生中間體8。然後如通過用在有機溶劑如二氯甲烷中的3％三氯乙酸處理除去N-6 4-單甲氧基三苯甲基基團，接著進行N-6的再保護。使用苯甲醯氯再保護N-6獲得兩個苯甲醯基團的加成。第二個苯甲醯基團隨後通過鹼處理除去，產生中間體9。然後還原疊氮基團，並用4-單甲氧基三苯甲基保護所得3′-氨基而形成10。最後，裂解5′-甲矽烷基保護基團，phosphitylation得到2′-O-甲基亞磷醯胺單體11。方案2 鳥苷基2′-O-烷基亞磷醯胺15的合成如方案3所示。用鹼處理使3′-疊氮基-2′-O-乙醯基-5′-O-甲苯醯基-N2-異丁醯基-O6-二苯基氨甲醯基-3′-脫氧鳥苷12去封閉。通過與叔丁基二苯基甲矽烷基氯反應再保護5′O-和O-6。該雙甲矽烷基化中間體隨後被2′-O-烷基化。O-6甲矽烷基被選擇性脫保護，得到化合物13。N-2基團被再保護，3′-疊氮基團被還原，得到的3′-氨基基團被保護以產生核苷14。最後，通過除去5′-保護基團，隨後將暴露的5′-羥基phosphitylation而得到2′-O-烷基鳥苷亞磷醯胺單體15。方案3 在本發明的另一實施方案中，寡核苷酸的酸穩定性通過將由N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵連接的亞單位置於寡核苷酸中而增強。相對於具有磷酸二酯或氨基磷酸酯亞單位間連鍵的互補DNA或RNA鏈，評價硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的雜交性質。從氨基磷酸酯寡核苷酸和磷酸二酯寡聚物產生的雙螺旋的熱穩定性數據總結於表1中(實施例3)。
硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與互補核酸的雜交是序列特異性的並由合適的Watson-Crick鹼基配對決定。由具有一單鹼基錯配的氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO3與端粒酶的RNA靶成分形成的雙螺旋(實施例6，表2，實驗2)的穩定性比由完全互補於端粒酶RNA成分的寡核苷酸SEQ ID NO1形成的雙螺旋差許多(實施例6，表2，實驗1)。含有核苷間3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯連鍵的寡核苷酸的應用合成寡核苷酸SEQ ID NO2 3′-NHP(O)(S-)O-5′硫代氨基磷酸酯，這一化合物令人驚奇地具有酸穩定性並與互補RNA靶形成穩定的複合物。本發明的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯多核苷酸具有反義和反基因診斷/治療應用的巨大潛力。在本發明的一個優選實施方案中，所述寡核苷酸是寡脫氧核糖核苷酸。A.端粒酶抑制應用最近出現了對正常細胞達到衰老狀態的機制的了解，該狀態即細胞在正常經歷細胞老化過程中的增殖能力的喪失。真核生物染色體末端或稱端粒處的DNA通常由串聯重複的簡單序列組成。科學家長久以來已知道端粒在保持染色體結構和功能方面有重要的生物學作用。近來科學家推測在重複細胞分裂中端粒DNA的累積喪失可能引發細胞衰老和老化，而參與保持端粒長度的酶即端粒酶的調節可能具有重要的生物學應用。參見Harley，1991，突變研究256271-282。Bodnar等的實驗已證實端粒和端粒酶在控制培養的正常人細胞的複製壽命中的重要性，參見Bodnar等，1998，科學279349-352。
端粒酶是一種核糖核蛋白酶，其合成端粒DNA的一條鏈以用作該酶的RNA成分中所含的序列的模板。參見Blackburn，1992，生物化學年度綜述61113-129。人端粒酶的RNA成分已被測序，其長度為460個核苷酸並含有一系列11個鹼基的序列重複，該序列重複互補於端粒重複。人端粒酶活性可被各種互補於端粒酶的RNA成分的寡核苷酸抑制。參見Norton等，自然生物技術14615，1996；Pitts等，美國科學院院報9511549-11554，1998；Glukhov等，生物化學生物物理研究通訊248368-371，1999。本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與端粒酶RNA的10-50個核苷酸互補。優選地，本發明的端粒酶抑制劑硫代氨基磷酸酯寡核苷酸具有與端粒酶RNA互補的10-20個連續鹼基序列。
已經描述了用於檢測端粒酶活性以及鑑別調節或影響端粒酶活性的化合物的方法，還描述了通過控制端粒長度和端粒酶活性而治療或診斷細胞衰老和永生化的方法。見Feng等，1995，科學2691236-1241；Kim等，1994，科學2662011-2014；PCT專利出版物93/23572，1993年11月25日公開；美國專利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936。
抑制端粒酶活性的化合物的鑑別對治療人類疾病的努力提供了重要有利之處。抑制端粒酶活性的化合物可用於治療端粒酶介導的疾病如癌症，因為癌症細胞表達端粒酶活性，而正常人體細胞不具備生物學相關水平(即足以在許多次細胞分裂中保持端粒長度的水平)的端粒酶活性。不幸的是，僅鑑別和鑑定的非常少的這種化合物，特別是具有高效力或活性的化合物，以及在口服投藥後具有生物利用性的化合物。因此，目前仍有需要獲得具有相對高效力或活性並且是口服可生物利用的作為端粒酶抑制劑的化合物，以及治療癌症和異常存在端粒酶活性的其它疾病的組合物和方法。
本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸化合物是酸穩定的，因此作為有害的端粒酶活性的抑制劑有許多有價值的用途，如治療人類癌症。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的藥物組合物可用於治療方案中，以體內抑制癌細胞，或者可用於來自體內(ex vivo)癌細胞。因此，本發明提供了治療癌症的治療化合物和組合物，以及治療哺乳動物(例如牛、馬、綿羊、小公牛、豬和獸醫動物如貓及狗)的癌症。另外，本發明的氨基磷酸酯寡核苷酸也可用於治療其它端粒酶介導的狀態或疾病，如其它過度增生或自身免疫疾病。
如上所述，細胞的永生化特別涉及端粒酶的活化。更具體地，端粒酶活性與許多腫瘤細胞系保持永生的能力之間的聯繫已通過端粒酶活性分析被證實(Kim等，文獻同上)。這一分析，連同表明端粒長度的縮短在正常細胞中可提供複製衰老信號的數據(見PCT申請93/23572)證實抑制端粒酶活性可以是有效的抗癌療法。因此，端粒酶活性可通過防止端粒長度的正常縮短以及在許多次細胞分裂後在正常體細胞中發生的細胞複製的同時停止而防止正常複製衰老的開始。在癌細胞中，當惡性表型是由於細胞周期的喪失或生長控制或其它遺傳損傷所致時，端粒酶活性的缺失使得細胞分裂期間端粒DNA喪失，導致染色體重排和異常，由此最終導致細胞死亡。但是，在具有端粒酶活性的癌細胞中，在細胞分裂期間端粒DNA不喪失，由此使癌細胞變得永生化，導致患者預後不良。能抑制腫瘤細胞中的端粒酶活性的製劑對於各種癌症和其中具有端粒酶活性的永生細胞是疾病進程的因素或者其中端粒酶活性的抑制是治療目的所需的其它病症(如真菌感染)提供了治療益處。本發明的端粒酶抑制劑也可用於在種系細胞中抑制端粒酶活性，其可用作避孕目的。
另外，應理解的是治療癌症的治療益處可通過將本發明的端粒酶抑制劑與其它抗癌劑結合而實現，所述其它抗癌劑包括端粒酶的其它抑制劑，如美國專利5,656,638，5,760,062，5,767,278，5,770,613和5,863,936所述。這種結合的選擇基於各種因素，包括但不限於疾病類型、患者年齡和總的健康狀況、疾病進程的攻擊性、待治療的疾病細胞的TRF長度和端粒酶活性以及患者對包含該結合的製劑的耐受能力。例如，如果腫瘤進程已到達高度狀態，推薦將本發明的端粒酶抑制化合物與有效降低腫瘤大小的其它製劑和治療方案(例如放射、手術、化療和/或激素治療)結合。另外，在某些情況下推薦將本發明的端粒酶抑制劑與一或多種治療疾病的副作用的製劑如止痛劑結合，或者與有效刺激患者自身免疫應答的製劑(例如集落刺激因子)結合。
如下所述，本發明的化合物證實具有體內針對端粒酶活性的抑制活性。本發明的體外活性已用本文所述方法證實。本文所用術語「體外」是指用組織培養的活細胞進行的試驗。這種程序也已知為「來自體內(ex vivo)」。
本部分描述的寡核苷酸端粒酶抑制劑典型地包括與端粒酶RNA成分互補的序列。人端粒酶RNA成分的序列見美國專利5,776,679。其它物種的端粒酶RNA成分也可使用，這取決於意欲治療的個體。
通常，寡核苷酸包括10-100個特異於端粒酶的核苷酸(即它們與端粒酶RNA成分在低濃度或更高嚴格性條件下雜交，所述更高嚴格條件是相對於其與其它RNA酶成分或預計在靶細胞或治療旁觀者細胞中存在並有功能活性的其它RNA分子的雜交條件而言)。所述寡核苷酸包括約10-25個核苷酸，實施例中舉例示出了12-15個核苷酸的寡核苷酸。在許多情況下，寡核苷酸應精確與端粒酶RNA中相同長度的連續序列互補。但是，應理解的是即使當寡核苷酸中有錯配殘基或間隙或添加時，特別是當RNA中的相應互補序列長度超過15個核苷酸時，雜交仍可以是特異性的。
用於鑑別具有抑制端粒酶活性的特異序列的本發明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的一種方法涉及將細胞、組織或優選地含有端粒酶的細胞提取物或其它製備物與幾種已知濃度的與端粒酶的RNA成分互補的硫代磷酸酯寡核苷酸在端粒酶活性相容的緩衝液中接觸，測定每一濃度的硫代氨基磷酸酯多核苷酸的端粒酶活性。在給予端粒酶抑制劑之前或之後，可用標準試劑和方法確定端粒酶活性。例如，培養細胞中的端粒酶活性可用TRAP活性分析測定(Kim等，科學2662011，1997；Weinrich等，自然遺傳學17498，1997)。下述分析試劑盒可商購用於研究目的TRAPezeXK端粒酶檢測試劑盒(目錄s7707；Intergen公司，NY)；TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目錄2，013，89；Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)。
所述多核苷酸的IC50(即樣品製備物的觀察活性降低至其原始或對照值的一半時的多核苷酸濃度)用標準技術確定。基於本文所述內容，本領域技術人員顯而易見的是可以採用確定本發明的化合物針對端粒酶的抑制濃度的其它方法。
使用上述方法，測定本發明的幾種硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的IC50值，發現其低於10nM(見表2，實施例6)。
預計用互補於端粒酶的RNA成分的硫代氨基磷酸酯多核苷酸治療惡性疾病能誘導端粒酶陽性細胞系發生轉變。用硫代磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2處理自發永生化的HME50-5E人乳腺上皮細胞導致對端粒酶活性的抑制，如通過端粒長度降低所證實(見實施例6和圖4)。用互補於端粒酶的RNA序列成分的本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理其它端粒酶陽性細胞系如HEK-293和HeLa細胞也預計誘導處理的細胞中端粒長度的降低。
本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也預計在人腫瘤細胞系如卵巢腫瘤細胞系OVCAR-5和SK-OV-3中在細胞分裂期間誘導端粒縮短。但是重要的是，在用作對照的正常人細胞如成纖維細胞來源的BJ細胞中，觀察到的端粒長度的降低預期與用對照物質例如與互補端粒酶RNA靶有至少一個單鹼基錯配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理的細胞沒有不同。本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸還預期能證實在低於20μM濃度在正常細胞中沒有明顯的細胞毒性作用。
另外，本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸對端粒酶RNA的特異性可通過進行雜交試驗並將其針對端粒酶和其它已知具有重要RNA成分的酶如ribonucleoase P的活性(IC50)進行比較。具有與所篩選的其它酶的IC50值相比較低的針對端粒酶的IC50值的化合物據認為具有對端粒酶的特異性。
也可用小鼠異種移植模型例如將OVCAR-5腫瘤細胞移植至裸鼠上的模型進行體內測試，其中用本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸治療的小鼠預期具有的腫瘤質量在起始劑量後的一段時間平均會增加，但隨著持續治療質量會開始下降。相反，用對照(例如與互補端粒酶RNA靶具有至少一個單鹼基錯配的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)治療的小鼠預期其腫瘤質量持續增加。
本領域熟練技術人員從上述描述應理解本發明還提供了選擇涉及給予本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的治療方案的方法。對於這種目的，可能有利的是進行一末端限制片段(TRF)分析，該分析中通過用特異於非端粒(T2AG3)N序列的序列的限制酶消化而分析來自腫瘤細胞的DNA。消化DNA後，進行凝膠電泳以根據大小分離限制片段。隨後用特異於端粒序列的核酸探針探查分離的片段，以確定含有樣品細胞的端粒DNA的末端片段的長度。通過測量端粒DNA的長度，可以估計端粒酶抑制劑應給予多長時間，以及是否還應該採用其它治療方法(例如手術、化療和/或放療)。另外，在治療期間，可以測試細胞以確定是否隨著漸進細胞分裂發生端粒長度降低，以證實治療效果。
因此，在一個方面，本發明提供了可作為抗癌鬥爭中重要武器以抗表達端粒酶的惡性，腫瘤如皮膚、結締組織、脂肪、乳腺、肺、胃、胰腺、卵巢、宮頸、子宮、腎、睪丸、結腸、前列腺、中樞神經系統(CNS)、視網膜和循環系統腫瘤(如白血病和淋巴癌)的化合物。特別是，本發明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸可提供治療許多(如果不是大多數)惡性的高度通用方法，如用具有端粒酶活性的高變人腫瘤細胞系和腫瘤所證實的那樣。更重要地，本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可提供高度有效區分惡性和正常細胞的療法，從而避免大多數目前通用的化療方案所存在的危害性副作用，目前通用的化療方案基於無區別性殺死分裂細胞的藥劑。B.其它反義應用反義治療涉及給予結合位於細胞內的靶核酸(典型地為RNA分子)的外源寡核苷酸。用反義這一術語是因為所述寡核苷酸典型地於編碼細胞產物的mRNA分子(「有義鏈「)互補。
本文所述硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用於反義抑制基因表達(Matsukura等，美國科學院院報864244-4248，1989；Agrawal等，美國科學院院報867790-7794，1989；Zamecnik等，美國科學院院報834143-4146，1986；Rittner and Sczakiel，核酸研究191421-1426，1991；Stein and Cheng，科學2611004-1012，1993)。含有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵的寡核苷酸對於大量醫學顯著的靶均有治療應用，包括但不限於抑制癌細胞增殖和幹擾傳染性病毒。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用於獸醫和人的應用。本發明的寡核苷酸的高度酸穩定性及其在低濃度有效作為反義分子的能力(見下述)使得這些寡核苷酸作為治療反義劑是高度希望的。
反義劑典型地需要持續結合所有靶RNA從而失活這些靶RNA分子或者提供內源性核糖核酸酶H(Rnase H)活性的底物。由本發明方法產生的RNA/寡核苷酸複合物對Rnase H消化的敏感性可通過標準方法評價(Donia等，生物化學雜誌26814514-14522，1993；Kawasaki等，醫用化學雜誌36831-841，1993)。
本發明的化合物和方法相對於更傳統的反義劑有若干優點。首先，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與相應磷酸二酯寡核苷酸能更強地結合RNA靶。第二，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸抗酸性條件的降解的能力更強。第三，在化合物的細胞攝入中，不帶電的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸骨架比帶電的寡核苷酸能更有效地使氨基磷酸酯寡核苷酸進入細胞。
另外，當RNA由雙螺旋靶序列的大部分為嘌呤的鏈編碼時，靶向該雙螺旋的氨基磷酸酯類似物寡核苷酸還具有失活DNA的潛力，即失活單鏈和雙鏈形式的病原體的能力(見下述反基因治療的討論)。
序列特異性硫代氨基磷酸酯寡核苷酸分子對於以某種方式涉及RNA的幾乎任何疾病或症狀均是潛在的強治療劑。這種序列可被靶向而進行治療應用的舉例模式包括a)靶向表達參與感染因子如細菌、病毒、酵母和其它真菌的繁殖和/或保持的產物的RNA序列，例如由感染因子編碼的特異mRNA；b)形成雙螺旋分子，從而誘導RNA的裂解(例如，RNA/DNA
雜合雙螺旋分子的Rnase H裂解)；c)阻斷蛋白質與RNA序列的相互作用(例如，TAT和TAR的相互作用，見下述)；和d)靶嚮導致細胞基因的不適當表達或增殖的序列例如，與細胞周期調節；炎性過程；平滑肌細胞(SMC)增殖、遷移和基質形成(Liu等，循環791374-1387，1989)；某些遺傳病和癌症相關的基因(原癌基因)。
在一個實施方案中，不適當表達的細胞基因的翻譯或RNA加工被阻斷。舉例性的潛在靶序列是原癌基因，例如包括但不限於下述基因c-myc，c-myb，c-fos，c-kit，ras，和BCR/ABL(例如，Wickstrom編輯的《癌症和AIDS的反義核酸治療的前景》，Wiley-Liss，紐約，1991；Zalewski等，循環研究，881190-1195，1993；Calabretta等，癌症生物學研討會3391-398，1992；Calabretta等，癌症治療綜述19169-179，1993)，原癌基因(例如，p53，Bayever等，反義研究和發育3383-390，1993)和病毒基因(例如，乳多空病毒，Cowsert等，Antimicrob.Agents and Chemo 37171-177，1993；單純皰疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20115-130，1993)。增生反義治療的另一種合適靶是端粒酶的蛋白質成分(見WO99/50279)，其是端粒酶表達中的限制成分。人端粒酶逆轉錄酶的序列在美國專利6,093,809，WO98/14592和pGRN121(ATCC登錄號209016)中提供。進一步的舉例是，可被本發明方法靶向的HIV-1蛋白的兩個RNA區是REV-蛋白應答元件(RRE)和TAT-蛋白反式激活應答元件(TAR)。REV活性需要存在位於HIV包膜基因中的REV應答元件(RRE)(Malim等，自然338254-257，1989；Malim等，細胞58205-214，1989)。
RRE已被定位於一個據信形成4個莖-環結構和1個分支莖環結構的234個核苷酸的區域(Malim等，自然338254-257，1989)。得自足跡研究的數據(Holland等，病毒學雜誌645966-5975，1990；Kjems等，美國科學院院報88683-687，1991)提示REV與RRE的一個莖結構中的6個鹼基對結合，並與一相鄰莖環結構的3個核苷酸結合。莖-環II中的約40個核苷酸的最小REV結合區已由Cook等鑑別(核酸研究，191577-1583)。這一結合區可以是根據本發明方法使用一或多個硫代氨基磷酸酯寡核苷酸而產生RNA/DNA雙螺旋的靶(例如，Li等，病毒學雜誌676882-6888，1993)。
HIV-1 TAT對於病毒複製是重要的，並且是長末端重複(LTR)介導的病毒基因表達的強反式激活物(Dayton等，細胞44941-947，1986；Fisher等，自然320367-371，1986)。由TAT蛋白誘導的反式激活需要存在TAR元件(見美國專利5,837,835)，該元件位於病毒mRNA元件的非翻譯5′末端。
TAR元件能形成穩定的莖-環結構(Muesing等，細胞48691-701，1987)。TAR莖上的莖和3核苷酸(nt)凸起的完整性已被證實是TAT蛋白與TAR元件的特異和高親和性結合所需的(Roy等，基因發育41365-1373，1990；Cordingley等，美國科學院院報878985-8989，1990；Dingwall等，美國科學院院報866925-6929，1989；Weeks等，科學2491281-1285，1990)。這一區域可以根據本發明方法而被靶向進行反義治療。
除了導向REV，RRE和TAT蛋白的RNA結合位點，REV和TAT蛋白本身的RNA編碼序列可以被靶向以阻斷蛋白質的表達。
指導結合潛在反義靶位點的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的起始篩選典型地包括測試所得RNA/DNA雙螺旋的熱穩定性。當鑑別了結合選定的RNA靶序列的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸時，進一步測試該寡核苷酸在體外對RNA功能的抑制。使用細胞培養分析系統進行這種體外分析(例如，單純皰疹病毒，Kulka等，抗病毒研究20115-130，1993；HIV-1，Li等，病毒學雜誌676882-6888，1993，Vickers等，核酸研究193359-3368，1991；在再狹窄中的冠狀平滑肌細胞增殖，Zalewski等，核酸研究151699-1715，1987；IL-2R，Grigoriev等，美國科學院院報903501-3505，1993；c-myb，Baer等，血液791319-1326，1992；c-fos，Cutry等，生物化學雜誌26419700-19705，1989；BCR/ABL，Szczylik等，科學253562-565，1991)。C.反基因應用以前已證實經三螺旋形成對基因表達的抑制(Cooney等，科學241456-459，1989；Orson等，核酸研究193435-3441，1991；Postel等，美國科學院院報888227-8231，1991)。當採用第三條鏈硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸時形成的三螺旋結構的穩定性增加提供了反基因應用如獸醫和人類治療應用的更強的工具。
靶區域的選擇基於已知序列用三螺旋形成的基本規則進行選擇(Helene和Toulme，生物化學生物物理學報104999-125，1990)。典型地，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸序列定向於雙鏈基因序列，其中一條鏈主要含有嘌呤，另一條鏈主要含有嘧啶。
用條帶移位分析測試本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與選定的雙螺旋靶序列形成三螺旋形成的能力(例如參見美國專利5,726,297，實施例4)。典型地，用高百分比聚丙烯醯胺凝膠進行條帶移位分析，並將變性條件的水平(Ausubel等，分子生物學當前方案，John Wileyand Sons，Inc.，Media Pa.；Sauer等編輯，酶學方法蛋白質/DNA相互作用，學術出版社，1991；Sambrook等，分子克隆實驗手冊，冷泉港出版社，第2卷，1989)被調節以降低任何非特異背景結合。
雙螺旋靶被標記(例如，用放射性核苷酸標記)並與第三條鏈寡核苷酸混合，以測試該寡核苷酸與靶雙螺旋形成三螺旋結構的能力。標記的雙螺旋寡核苷酸遷移率的移位指示該寡核苷酸形成三螺旋結構的能力。
在條帶移位分析中三螺旋形成以標記的三螺旋結構相對於標記的雙螺旋結構在凝膠中的降低的遷移率指示。
通過這一方法可評價許多潛在靶位點，包括選自長度和複雜性變化的全範圍DNA序列的靶位點。序列特異性硫代氨基磷酸酯類似物結合分子是用於以某種方式涉及DNA的幾乎任何疾病或症狀的潛在強治療劑。這種治療劑的舉例性靶序列包括a)參與感染因子如細菌、病毒、酵母和其它真菌的繁殖和/或保持的DNA序列，例如，破壞感染因子的代謝；和b)導致細胞基因如癌基因的不合適表達或增殖的序列，例如阻斷或降低不合適表達的細胞基因(如與某些遺傳病相關的基因)的轉錄。
基因表達或複製可以通過在所需的調控蛋白(或分子)已知結合的區域產生三螺旋結構而被阻斷(例如，HIV轉錄相關因子如啟動子起始位點和SP1結合位點，McShan等，生物化學雜誌2675712-5721，1992)。或者，基因(如癌基因)的蛋白質編碼區內的特異序列也可以被靶向。
當通過上述凝膠條帶移位遷移率分析鑑別與選定的雙螺旋靶序列測試結合的硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸時，進一步測試該類似物體外形成穩定三螺旋結構的能力。使用如美國專利5,631,135所述的細胞培養和體內分析系統。
靶位點可以在基因的控制區，例如在轉錄起始位點或調控蛋白的結合區中選擇(Helene and Toulme，1990；Birg等，1990；Postel等，1991；Cooney等，1988)。另外，可以選擇靶位點以使靶也存在於mRNA序列(即轉錄的序列)中，使得針對該位點的寡核苷酸也作為反義介導物起作用(見上述)。
另外，硫代氨基磷酸酯修飾的DNA分子可以用於與第三條鏈靶(即單鏈核酸)產生三螺旋分子。例如，具有能與選定的第三條鏈靶分子形成三螺旋結構的兩個區域的DNA分子可以被合成。典型地這兩個區域通過柔性區連接，該柔性區使得這兩個區域與第三條鏈結合形成三螺旋。
絞鏈區可包括任何柔性連鍵以保持兩個三螺旋形成區在一起並使得它們與第三條鏈結合形成三螺旋。第三條鏈靶選擇具有合適的嘌呤/嘧啶含量以使得三螺旋分子形成。
柔性連鍵可以根據靶的鹼基序列以任何選定的方向連接兩個三螺旋形成區(典型地，互補DNA鏈)。例如，兩個三螺旋形成區每個均具有5′和3′末端，這些末端可通過柔性絞鏈區以下述方向連接5′-3′，3′-5′，3′-3′，5′-5′。
另外，在每條鏈含有至少一個硫代氨基磷酸酯連鍵的雙螺旋DNA分子可用作轉錄因子或DNA結合蛋白(例如，c-myb)的引誘分子。
單鏈DNA也可用作本發明的寡核苷酸的靶核酸，使用例如含硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的髮夾結構。兩個硫代氨基磷酸酯類似物寡核苷酸可選擇用於單鏈DNA靶介導結合。兩個氨基磷酸酯類似物鏈與單鏈DNA靶的結合導致形成三螺旋。D.藥物組合物本發明包括用於反義和反基因治療的藥物組合物。該組合物包括有效量的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與藥物可接受載體的組合。一或多個N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(具有不同的鹼基序列或連鍵)可包括在任何給定的配方中。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸當用於治療應用時，可以單獨配製或添加藥物載體而配製。藥物載體可以是固體或液體。隨後該配方以治療有效劑量給予需要其的個體。
液體載體可用於製備溶液、乳液、懸液和加壓組合物。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸溶解或懸浮於藥物可接受液體賦形劑中。用於腸道外給予N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸製劑的合適的液體載體的例子包括水(部分含有添加劑，例如纖維素衍生物，優選羧甲基纖維素鈉溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，和油(例如分級分離的椰子油和花生油)。液體載體可以含有其它合適的藥物添加劑，包括但不限於下述加溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩衝劑、增稠劑、色素、粘度調節劑、防腐劑、穩定劑和滲透壓調節劑。
為了N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的腸道外給藥，載體可以是油狀酯如油酸乙酯和豆蔻酸異丙酯。無菌載體可用於無菌液體形式腸道外給藥組合物。
無菌液體藥物組合物、溶液或懸液可通過例如腹膜內注射、皮下注射、靜脈內或局部而應用。例如，抗視網膜巨細胞病毒感染的反義寡核苷酸可通過眼藥水局部給藥。N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可以血管內給予或者例如，在氣囊導管插入術期間通過用黴酚酸浸漬的血管stent給藥以在損傷後立即提供局部抗再狹窄作用。
用於加壓組合物的液體載體可以是滷代烴或其它藥物可接受推進劑。這種加壓組合物也可以壓縮為液體以經吸入輸送。對於鼻內或支氣管內吸入或吹入給藥，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可被配製成水溶液或部分水溶液，然後可以氣霧劑形式使用，例如用於治療肺部感染如Pneumocystis carnii。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以作為與含有活性化合物的藥物可接受載體配製成的溶液、膏劑或洗劑而局部給藥。例如，用於治療生殖器疣。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以在脂質體載體中給予。例如在美國專利4,897,355和美國專利4,394,448中描述了使用脂質體促進細胞吸收。許多出版物描述了脂質體配方和製劑。
用N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸進行治療的劑量要求根據所採用的特定組合物、給藥途徑、表現的症狀的嚴重性、N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的形式以及待治療的特定個體而變化。
為用作藥物製劑中的活性成分，本發明的寡核苷酸通常從製備其的混合物中存在的其它反應性或潛在免疫原性成分中純化出來。典型地，每種活性成分以至少約90％均質性、更優選95％或99％均質性提供，所述均質性百分比通過功能分析、色譜或凝膠電泳測定。隨後活性成分根據製備藥物製劑通用程序複合成藥。
本發明的藥物組合物可以作為配方以有效實現任何臨床所需結果的量給予個體。對於治療癌症，所需結果包括降低腫瘤質量(如通過觸診或成象，例如通過放射照相、CAT掃描或MRI)，降低腫瘤生長速率、降低轉移形成速率(例如通過生物活檢標本的組織化學分析)，降低生化標記(包括一般標記如ESR和腫瘤特異標記如血清PSA)，以及改善生活質量(如通過臨床評價確定，例如Kamofsky評分)。對於治療病毒感染，所需結果包括降低或消除感染、感染性顆粒形成或疾病相關症狀的解除。
實現這些效果所需的每劑寡核苷酸量和劑量數可用體外測試和動物模型而實驗確定(見實施例9)。用於測試的合適範圍可以從用分離的端粒酶或培養細胞確定的50％抑制濃度估算。分離的端粒酶的製備物可通過美國專利5,968,506獲得。典型地，對於與酶特異性靶RNA序列100％相同的12-15個核苷酸的穩定寡核苷酸而言，配方和給藥途徑將在疾病部位提供1μM-lnM之間的局部濃度。確定給藥方案的最終責任取決於主管臨床醫生。
總之，N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以提供有效結果同時不導致任何有害副作用的濃度(例如有效量)給藥。這種濃度可通過給予單一單位劑量或給予分成方便的亞單位的劑量在每日合適間隔而施用。E.診斷應用本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸也可用於診斷分析中以檢測具有給定靶序列的RNA或DNA。在一種一般應用中，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被標記(例如同位素或其它可檢測報導基團)並用作結合於固體支持物(例如尼龍膜)的DNA或RNA樣品的探針。
或者，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可與固體支持物(例如磁珠)結合，樣品中的同源RNA或DNA分子與樣品中的其它成分基於其與固定化氨基磷酸酯類似物的雜交而分離。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與固體支持物的結合可通過常規方法進行。結合的RNA和DNA的存在可通過標準方法檢測，例如用第二種標記的報導分子或聚合酶鏈反應(見美國專利4,683,195和4,683,202)。
診斷分析可以根據標準程序進行，需調整雜交條件以使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與靶區域雜交。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在升高的溫度結合的能力也有助於使硫代氨基磷酸酯寡核苷酸探針和診斷樣品中存在的任何相應單鏈磷酸二酯寡核苷酸對靶序列的結合的競爭最小化。
設計用於雜交分析和本文描述的其它方案中的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可以包裝成試劑盒形式。所述寡核苷酸提供在容器中，其典型地在適合長期貯存的緩衝液中存在，並任選地與用於進行反應的其它試劑、標準或對照一起提供。典型地，試劑盒也可包括將寡核苷酸用於雜交反應或診斷分析的說明書，其或者包裝在產品中，或者在配送或出售試劑盒時提供文字材料。F.其它應用在一個方面，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用於促進從樣品中分離RNA或DNA的方法中。例如，如上所述，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可固定於固體支持物上並用於分離互補核酸序列，例如，從聚A級分純化特異mRNA(Goldberg等，酶學方法68206，1979)。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸在這類應用中是有利的，因為它們可與RNA和雙螺旋DNA形成比標準磷酸二酯寡核苷酸所形成的更穩定的相互作用。
報導分子標記的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可在分子生物學中有大量應用，特別是用於檢測樣品中的RNA。硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用放射性報導分子(3H，14C，32P或35S核苷)、生物素或螢光標記而標記(Gryaznov等，核酸研究203403-3409，1992)。標記的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可用作例如RNA雜交反應的有效探針(Ausubel等，分子生物學當前方案，John Wiley and Sons，Inc.，Media，PA；Sambrook等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，第2卷，1989)。
另外，每一鏈含有至少一個硫代氨基磷酸酯連鍵的雙鏈DNA分子可用於分離DNA-雙螺旋結合蛋白。在這一實施方案中，含有硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的雙螺旋典型地固定於固體支持物上，隨後將含有懷疑的結合蛋白的樣品在促進蛋白質與其DNA靶結合的緩衝條件下通過該支持物。蛋白質典型地通過改變緩衝條件從柱中洗脫。
上述含有硫代氨基磷酸酯修飾的連鍵的三螺旋形成DNA分子還可用作診斷試劑，以例如檢測樣品中DNA分子的存在。
另外，含有具有N3′→P5′硫代氨基磷酸酯亞單位間連鍵的寡核苷酸的複合物可用於篩選有用的小分子或結合蛋白例如，具有雙螺旋DNA的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸複合物可用於篩選能進一步穩定三螺旋結構的小分子。用與單鏈DNA和RNA分子形成的N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸複合物可進行類似篩選。G.改變本發明方法所用硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的改變包括修飾以促進細胞對寡核苷酸的吸收(例如，添加膽固醇基元(Letsinger，美國專利4,958,013))；用亞單位間連鍵產生嵌合寡核苷酸(Goodchild，生物綴合物化學1165-187，1990)；用嵌入劑修飾(例如，穩定三螺旋的嵌入劑，Wilson等，生物化學3210614-10621，1993)；和使用核糖亞單位代替脫氧核糖亞單位。
進一步的修飾包括寡核苷酸5′和3′末端修飾(例如，--OH，--OR，--NHR，--NH2和膽固醇)。另外，核糖2′位置可以是許多修飾的位點，包括但不限於滷代(例如，--F)。
N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸還可以通過與被特異細胞吸收的一多肽綴合而修飾。這種有用的多肽包括肽激素、抗原和抗體，例如多肽可以選自被癌細胞特異吸收的多肽，導致N3′→P5′硫代氨基磷酸酯寡核苷酸被特異輸送至該類型細胞。所述多肽和寡核苷酸可通過本領域已知方式偶聯(參見例如PCT國際申請出版物PCT/US89/02363，WO8912110，1989年12月14日公開，Ramachandr，K.等人)。
當用於本發明方法時，這種修飾的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的性質可通過本文所述方法確定。
實施例1 一般方法31P NMR譜在Varian 400Mhz分光計上獲得。將31P NMR譜與85％磷酸水溶液進行校準。用Dionex DX 500色譜系統使用PharmaciaBiotech Mono Q HR 5/5或10/16離子交換柱進行陰離子交換HPLC。質譜分析由Mass Consortium，San Diego，CA進行。寡核苷酸的MALDI-TOF分析用具有延遲提取的PerSpective Biosystems VoyagerElite質譜儀獲得。熱解離實驗在Cary Bio 100 UV-Vis分光計上進行。
除非另有說明，所有反應均在微波爐乾燥的玻璃器皿中於氮氣氛下進行。市售DNA合成試劑購自Glen Research(Sterling，VA)。無水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二異丙基乙胺、三乙胺、乙酐、1，2-二氯乙烷和二惡烷購自Aldrich(Milwaukee，WI)。
所有非硫代氨基磷酸酯寡核苷酸用基於亞磷醯胺的偶聯途徑標準方案(Caruthers，Acc.Chem.Res.，24278-284，1991)在ABI 392或394 DNA合成儀合成。寡核苷酸氨基磷酸酯合成的鏈組裝循環如下(i)脫三苯甲基化，3％三氯乙酸於二氯甲烷中，1分鐘；(ii)偶聯，0.1M亞磷醯胺和0.45M四唑於乙腈中，10分鐘；(iii)加帽，0.5M異丁酐於THF/二甲基吡啶中，1/1，v/v，15秒；和(iv)氧化，0.1M碘於THF/吡啶/水中，10/10/1，v/v/v，30秒。
該循環的化學步驟之後進行乙腈洗滌，並用幹態氬衝洗0.2-0.4分鐘。從支持物上裂解、除去鹼及氨基磷酸酯保護基團通過用氨水/EtOH，3/1，v/v，在55℃處理6個小時而實現。將寡核苷酸真空乾燥濃縮，之後通過用1M TBAF於THF中在25℃處理4-16小時而除去2′-叔丁基二甲基甲矽烷基團。用水稀釋反應混合物，並通過0.45尼龍acrodisc(購自Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過濾。然後經IE HPLC分析和純化寡核苷酸，並在Pharmacia NAP-5或NAP-25柱上用凝膠過濾最終脫鹽。IE HPLC的梯度條件為溶劑A(10mM NaOH)，溶劑B(10mM NaOH和1.5M NaCl)；溶劑A 3分鐘，然後線性梯度0-80％溶劑B 50分鐘。實施例2 阿拉伯糖-氟寡核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的合成寡聚-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸N3′→P5′氨基磷酸酯的固相合成基於亞磷醯胺轉移反應，採用單體構件3′-MMT-保護的-3′-氨基-2′-阿拉伯糖-氟核苷酸的5′-(O-氰乙基-N，N′-二異丙基氨基)-亞磷醯胺。所述核苷單體的製備見方案4。 糖前體1(來自Pfanstiehl)轉化成保留糖C-1構象的α-1-溴中間體2。化合物2隨後不經分離而使用，與甲矽烷化尿嘧啶和胸腺嘧啶鹼基一起進行SN2型糖基化反應，產生核苷3。糖基化反應的立體選擇性非常高，超過90％形成的核苷3具有希望的β-端基異構構象，這是由反應混合物的1H NMR分析判斷的。核苷3的純β-異構體通過從乙醇結晶而分離。隨後，3的5′-和3′-O-苯甲醯保護基團通過用甲醇化氨水處理而以近定量產量除去。得到的含有5′-，3′-羥基基團的核苷產物隨後在Mitsunobu反應條件下轉化成2，3′-無水核苷4。用疊氮化鋰處理2，3′-無水核苷得到關鍵的3′-疊氮基前體5。這一化合物通過將3′-疊氮基氫化還原成3′-氨基，隨後經3′-三苯甲基化，5′-O-脫保護和5′-O-亞磷醯基化而轉化成亞磷醯胺7t，u。胞苷亞磷醯胺7c用尿嘧啶至胞嘧啶轉化方法得自所述3′-疊氮基前體。基於起始糖前體1，亞磷醯胺7c，t，u的總產量在8-12％範圍內。單體的結構經1H，31P，19F NMR和質譜分析證實。使用2′-阿拉伯糖-氟核苷酸單體的寡核苷酸合成隨後如下所述在自動化DNA/RNA ABI 394合成儀上進行。實施例3 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的合成在ABI 394合成儀上經亞醯胺(amidite)轉移反應製備寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。完全保護的單體構件是3′-氨基三苯甲基核苷-5′-(2-氰乙基-N，N′-二異丙基)亞磷醯胺，其中核苷是3′-脫氧胸苷，2′，3′-二脫氧-N2-isobutyryl鳥苷，2′，3′-二脫氧-N6-苯甲醯腺苷或2′，3′-二脫氧-N4-苯甲醯胞苷。5′-琥珀醯基-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷與含有氨基的長鏈可控孔徑玻璃(LCAA-CPG)偶聯並用作固體支持物。合成以5′至3′方向進行。使用下述方案組裝寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯(i)去三苯甲基化，3％三氯乙酸於二氯甲烷中；(ii)偶聯，0.1M亞磷醯胺和0.45M四唑於乙腈中，25秒；(iii)加帽，異丁酐/2，6-/二甲基吡啶/THF 1/1/8 v/v/v作為帽A，和標準帽B溶液；和(iv)硫化，15％ S8於含有1％三乙胺的二硫化碳中，1分鐘。在硫化步驟之前和之後，用純二硫化碳洗柱以防止元素硫沉澱。寡核苷酸硫代氨基磷酸酯用濃氨水從固體支持物上裂解並脫保護。經HPLC分析和純化化合物。用pH12(10mM NaOH)的DIONEXDANPacTM離子交換柱使用10mM NaOH於1.5M NaCl中1％/分鐘線性梯度和1ml/min流速進行離子交換(IE)HPLC。產物在SephadexNAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)上脫鹽並真空凍幹。31P NMR實驗在氧化氘中進行以分析硫化分析程度(31P NMRδ，ppm 58，60寬信號Rp，Sp異構體)。
寡核苷酸硫代氨基磷酸酯5′-GTTAGGGTTAG-3′(SEQ IDNO1)以下述方式合成用3′-三苯甲基氨基-2′，3′-二脫氧-N6-苯甲醯腺苷(N2-isobutyryl鳥苷和胸苷)5′-(2-氰乙基-N，N-二異丙基)亞磷醯胺的0.1M溶液起始ABI 394型合成儀。用純二硫化碳填充10號工作站的試劑瓶，並用在含1％三乙胺的二硫化碳中的15％S8溶液填充15號試劑瓶。用市售的在乙腈中的0.45M四唑溶液作為活化劑。帽A溶液(11號工作站)用四氫呋喃/異丁酐/2，6-二甲基吡啶8/1/1 v/v/v溶液替換，帽B也是市售試劑。創建一新功能以將二硫化碳從10號工作站輸送至柱中。默認的硫合成循環以下述方式修改硫化時間設為1分鐘，在硫化之前和之後將二硫化碳送至柱20秒。合成柱用1μmole固體支持物N2-isobutyryl-3′-(三苯甲基)氨基-2′，3′-二脫氧鳥苷-5′-琥珀醯加載的CPG(可控孔徑玻璃)填充。化合物的序列計劃為GATTGGGATTG(5′→3′)(SEQ ID NO11)。在合成結束時除去三苯甲基基團並用二硫化碳和乙腈手工洗柱。從柱中取出固體支持物並在一密封玻璃瓶中用1ml濃氨水在55℃處理6小時。過濾後，蒸發掉大部分氨水，並用Sephadex NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)脫鹽並真空凍幹。如上所述分析和純化產物。表2中列出的所有其它硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(SEQ ID NO2-4)用上述方法合成。實施例4 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的酸穩定性和雙螺旋形成性質寡核苷酸硫代氨基磷酸酯令人意外地證實相對於氨基磷酸酯相應物具有增加的酸穩定性。人們可能預期用硫取代核苷酸間連鎖基團的非橋氧應導致氨基磷酸酯的酸穩定性下降，因為硫對氧的電子給體性質的差異應使得3′-NH的質子化更容易。但是，與這一預期相反，發現硫代氨基磷酸酯核苷酸間連鍵比其氧-氨基磷酸酯對應物更加對酸穩定。
根據IE HPLC分析(見表1)，硫代氨基磷酸酯TAG3T2AGACA2(SEQ ID NO2)及其氨基磷酸酯對應物在40％乙酸水溶液中於室溫的半壽期分別約為6小時和0.5小時。另外，硫代氨基磷酸酯和其氨基磷酸酯對應物之間水解產物的組成是不同的。硫代氨基磷酸酯的酸水解似乎最初導致脫硫化，而非在氨基磷酸酯中發生的核苷間N-P基團的裂解。這些結果表明硫代氨基磷酸酯對酸性條件的抗性比氨基磷酸酯寡核苷酸高許多，因此說明這一類新硫代氨基磷酸酯寡核苷酸與其它氨基磷酸酯寡核苷酸相比具有開發口服寡核苷酸治療劑的增加的潛力。
表1實驗 寡聚物 類型2Tm，℃b-Tm，℃c酸穩定性d1 GTTAGGGTTAGpo 44.2-SEQ ID NO12 TAGGGTTAGACAA po 45.2-SEQ ID NO23 同實驗1np 72.1 27.94 同實驗2np 71.7 26.5 0.5hr5 同實驗1nps71.5 27.36 同實驗2nps70.0 24.8 6hrapo，np，nps分別相應於磷酸二酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯基團；b在150mM NaCl，10mM磷酸鈉緩衝液pH7.4中與互補天然RNA寡聚物形成的雙螺旋的熔解溫度Tm(±0.5℃)；c相對於天然磷酸二酯對應物的Tm的增加；d寡核苷酸在40％乙酸水溶液中於室溫的半壽期。
寡核苷酸氨基磷酸酯與互補RNA鏈形成雙螺旋的性質用熱解離實驗評價，結果見表1。數據示出寡核苷酸硫代氨基磷酸酯形成比等序列天然磷酸二酯寡聚物明顯更穩定的複合物，其中每個寡聚物Tm差異在約25-27℃。另外，雙螺旋熱穩定性的增加與在氨基磷酸酯寡聚物中觀察到的類似。這表明用硫原子取代在核苷間氨基磷酸酯基團中的非橋氧不會明顯改變這些化合物的RNA結合性質，這是用3′-氨基核苷的N-型糖摺疊及糖-磷酸骨架水合增加而確定的。實施例5 具有端粒酶活性的親和純化的提取物的製備用於篩選端粒酶抑制劑的提取物從過表達端粒酶蛋白催化亞基(hTERT)的293細胞常規製備。發現這些細胞具有比親代293細胞多2-5倍的端粒酶活性。將200ml收集細胞(從100升培養物收穫)懸浮在等體積低滲緩衝液(10mM Hepes pH7.9，1mM MgCl2，1mMDTT，20mM KCl，1mM PMSF)中並用dounce勻漿器裂解。將甘油濃度調整至10％並緩慢加入NaCl使終濃度為0.3M。攪拌裂解的細胞30分鐘，然後在100000xg沉澱1小時。向S100上清中加入固體硫酸銨直至42％飽和度。離心該物質；將沉澱重懸於1/5原始體積中並對含有50mM NaCl的緩衝液A透析。透析後，在25000xg離心提取物30分鐘。在親和層析之前，加入Triton X-100TM(0.5％)，KCl(0.3M)和tRNA(50μg/ml)。向提取物中加入親和寡聚物(5′生物素TEG-生物素TEG-生物素TEG-GTA GAC CTG TTA CCA guuagg guu ag 3′[SEQ ID NO5]；小寫字母表示2′O-甲基核糖核苷酸，大寫字母表示脫氧核苷酸)(每10ml提取物加入1nmol)。在30℃保溫10分鐘後，加入Neutravidin珠(Pierce；250μl 50％懸液)並將混合物在4℃旋轉過夜。沉澱珠並用含0.3M KCl的緩衝液B洗3次，用含有0.6M KCl的緩衝液B洗2次，用含有0.3M KCl的緩衝液B再洗2次。在含有0.3M KCl，0.15％ Triton X-100TM和2.5摩爾過量的置換寡聚物(每125μl收集的Neutravidin珠用0.5ml 5′-CTAACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3′[SEQ ID NO6])的緩衝液B中在室溫洗脫端粒酶30分鐘。進行第二次洗脫並與第一次合併。純化的提取物典型的比活為10fmol摻入的核苷酸/min/μl提取物，或200個核苷酸min/mg總蛋白。
實施例6 寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯對端粒酶的抑制用下述緩衝溶液建立3個獨立的100μl端粒酶分析50mM Tris乙酸，pH8.2，1mM DTT，1mM EGTA，1mM MgCl2，100mM乙酸鉀，500μM dATP，500μM TTP，10μM[32P]dGTP(25Ci/mmol)和100nMd(TTAGGG)3[SEQ ID NO7]。向各個反應中加入2.5、5或10微升親和純化的端粒酶(見實施例4)並將反應在37℃保溫。在45和90分鐘，從每個反應中取40微升樣品並加入160微升終止緩衝液(100mM NaCl，10mM焦磷酸鈉，0.2％SDS，2mM EDTA，100μg/mltRNA)。加入10微升三氯乙酸(TCA)(100％)，並將樣品在冰上保溫30分鐘。樣品在微離心機中沉澱(12000xg離心力)15分鐘，沉澱用1ml 95％乙醇洗並在微離心機(12000xg離心力)中再次沉澱5分鐘。將沉澱重懸於50微升蒸餾水中並轉移至含有2.5ml 5％TCA和10mM焦磷酸鈉的冰冷溶液的12×75玻璃試管中。將樣品在冰上保溫30分鐘。將樣品在真空過濾歧管上經2.5cm溼(蒸餾水)GFC膜(SS)過濾。在真空下用5ml冰冷1％TCA洗濾膜3次並用5ml 95％乙醇洗1次。乾燥濾膜並用閃爍液在閃爍計數器中計數。摻入的fmol核苷酸是用放射性追蹤劑的比活確定的。基於摻入的dNTP計算提取物的活性並表示為fmol dNTP/min/μl提取物。
端粒酶活性分析Bio-Tel FlashPlate分析提供了一種檢測和/或測量端粒酶活性的分析法，其是通過測定由端粒酶催化的反應即TTAGGG端粒重複添加至生物素化端粒酶底物引物上而進行。生物素化產物在鏈親和素包被微滴板中捕獲。用33P標記的互補於3.5個端粒重複的寡核苷酸探針被用於測量端粒酶產物，如下所述。通過洗滌除去未結合的探針並用閃爍計數確定與捕獲的端粒酶產物退火的量。方法I.硫代氨基磷酸酯寡核苷酸作為濃縮原料貯存並在PBS中溶解。II.為進行測試，在PBS中將硫代氨基磷酸酯寡核苷酸稀釋成15X工作原液，並將2微升分配於96孔微滴皿的兩個孔中(雙份分析)。III.在端粒酶稀釋緩衝液中將端粒酶提取物稀釋至比活為0.04-0.09fmol摻入的dNTP/min/μl，將18微升加至每一樣品孔中以與化合物在室溫預保溫30分鐘。IV.通過向含有端粒酶提取物和待測寡核苷酸化合物的孔中加入10微升Master Mix而起始端粒酶反應，將板密封並在37℃保溫90分鐘。V.通過加入10微升HCS終止反應。VI.將25微升反應混合物轉移至96孔鏈親和素包被的FlashPlateTM(NEN)中，並溫和振蕩於室溫保溫2小時。VII.用180微升2×SSC不經保溫洗孔3次。VIII.在閃爍計數器中檢測與生物素化端粒酶產物退火的探針量。緩衝液端粒酶稀釋緩衝液50mM Tris-乙酸，pH8.21mM DTT1mM EGTA1mM MgCl2
830nM BSAMaster Mix(MM)50mM Tris-乙酸，pH8.21mM DTT1mM EGTA1mM MgCl2150mM乙酸鉀10μM dATP20μM dGTP120μM dTTP100nM生物素化引物(5′-生物素-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)[SEQ ID NO8]5.4nM標記的探針[5′-CCCTAACCCTAACCCTAACC-(33P)A1-50-3′][SEQ ID NO9]；比活約為109cpm/μg或更高雜交捕獲溶液(HCS)12×SSC(1×＝150mM NaCl/30mM檸檬酸三鈉)40mM EDTA40mM Tris-HCl，pH7.0用上述分析，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2代表的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸示出具有低於1.0nM的端粒酶IC50值(見表2，實驗1和3)。
表2寡聚物作為端粒酶抑制劑與氨基磷酸酯的比較評價
寡核苷酸序列2(SEQ ID NO3)是實驗1所用寡核苷酸(SEQ IDNO1)的錯配對照。類似地，寡核苷酸序列4(SEQ ID NO4)是實驗3所用寡核苷酸(SEQ ID NO2)的錯配對照。
表2中的端粒酶抑制數據示出本發明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸相對於對應的氨基磷酸酯寡核苷酸其抑制端粒酶活性高約2-3倍。因此，本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸不僅在端粒酶抑制分析中比其氨基磷酸酯對應物更有活性，而且比其具有更高的抗酸性。這些特徵的組合使本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸比氨基磷酸酯多核苷酸具有重要的優越性。實施例7 硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的抗腫瘤活性來自體內(exvivo)研究a.在腫瘤細胞中降低端粒長度用標準方法和材料製備人乳腺上皮細胞的集落(自發永生化)。通過以每皿約106個細胞接種15釐米培養皿而製備集落，將培養皿保溫以使細胞集落生長至約80％鋪滿，此時將每個集落分成2組。在分組後鋪板，之後一組與亞急性劑量的預定濃度(例如約100nM-20μM之間)的硫代氨基磷酸酯多核苷酸SEQ ID NO2接觸，第二組類似地與錯配對照寡核苷酸SEQ ID NO4接觸。
使每組細胞繼續分裂，各組再次平均分割(接近鋪滿)。接種相同數目的細胞以繼續生長。每四天將測試硫代氨基磷酸酯寡核苷酸或對照寡核苷酸以最初輸送的相同濃度加至樣品。在一個實驗中，細胞另外根據廠商指導用FuGENE6TM(Boehringer-Mannheim)處理。FuGENE6TM促進細胞對寡核苷酸的吸收。
通過用特異於非人端粒重複T2AG3序列的序列的限制酶消化細胞樣品的DNA而確定端粒長度(TRF分析)用凝膠電泳標準技術經大小分離消化的DNA以確定端粒重複的長度，其在用端粒DNA探針探查後在凝膠上呈高分子量DNA(約2Kb-15Kb)擴散條帶。圖4和圖5示出這種實驗的樣品。
圖4的結果示出硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2是端粒酶活性的強體外抑制劑。在不存在FuGENE6TM時，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2在1-20μM範圍與HME50-5E細胞保溫時誘導端粒長度大大降低。當細胞與FuGENE6和硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2共保溫時，甚至在最低的測試濃度(100nM)端粒大小與對照細胞相比也降低。
圖5結果示出具有序列CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO10)的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是端粒酶活性的強體外抑制劑。當細胞與硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO10共保溫時，甚至在最低的測試濃度(1nM)端粒大小與對照細胞相比也降低。因此，本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸是永生化人乳腺上皮細胞中端粒酶活性的強體外抑制劑。
在另一實驗中，HME50-5E細胞與SEQ ID NO2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保溫。錯配寡核苷酸SEQ ID NO4用作對照。所有多核苷酸採用上述方案以約0.1μM-20μM濃度使用。圖6所示對細胞生長的數據表明在給予所測試的本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸後約100天，細胞進入衰老(即細胞功能停止)。
另外，用標準方法學進行的細胞的TRF分析(圖7)示出所測試的本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸可有效降低端粒長度。HME50-5E細胞與SEQ ID NO2和10的硫代氨基磷酸酯多核苷酸之一保溫。錯配寡核苷酸SEQ ID NO4用作對照。所有多核苷酸採用上述方案以約0.5μM濃度使用。在10、20、40和80天測量端粒長度。使用對照錯配寡核苷酸的細胞的端粒長度在第90天測量，這一數據點作為終點。除了上述HME50-5E細胞外，這一分析可使用任何端粒酶陽性細胞系如HeLa細胞或HEK-293細胞進行。
b.特異性通過用標準技術進行雜交試驗或酶抑制分析篩選本發明的硫代氨基磷酸酯多核苷酸抗端粒酶和其它具有RNA成分的酶的活性(IC50)。針對端粒酶的IC50值低於針對所篩選的其它酶的IC50值的寡核苷酸被認為具有端粒酶特異性。
c.胞毒性用HME50-5E、Caki-1、A431、ACHN和A549細胞類型進行胞毒性細胞死亡(XTT)分析。分析中所用的細胞系在存在和不存在脂類的條件下與約1μM-100μM濃度的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸SEQ ID NO2接觸72小時。在這一期間，在540nm測定樣品的光密度(OD)。針對各種細胞類型(如圖8所示)的IC50值通常低於1μM。因此，預計在低於約100μM濃度不能觀察到明顯胞毒性作用。應理解的是，除了對照細胞系如正常人BJ細胞外，其它腫瘤細胞系如卵巢腫瘤細胞系OVCAR-5和SK-OV-3也可用於確定胞毒性。胞毒性的其它分析法如MTT分析(參見Berridge等，生物化學414-19，1996)和alamarBlueTM(美國專利5,501,959)也可使用。
優選地，為觀察任何端粒酶抑制作用，硫代氨基磷酸酯寡核苷酸應以低於胞毒性的濃度投藥。但是，由於許多癌症化療藥的有效性衍生自其胞毒性作用，因此，本發明的範圍包括本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸以觀察到化療作用的任何劑量投藥。體內動物研究用標準技術和材料構建人腫瘤異種移植物模型，該模型中OVCAR-5腫瘤細胞被移植到裸鼠中。將小鼠分成兩組，一組用本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸經腹膜內途徑處理，另一組用對照處理，該對照包括磷酸緩衝溶液(PBS)和與端粒酶RNA互補但與端粒酶RNA的序列有至少一個鹼基錯配的寡核苷酸的混合物。異種移植後用標準方法和材料定期測定每組小鼠平均腫瘤質量。
在用本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸處理的組中，預計在初次處理後平均腫瘤質量增加一段時間，之後預計腫瘤質量保持穩定，隨後開始降低。對照組腫瘤質量預計在整個研究期間增加。因此，本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸預計顯著減慢腫瘤生長速率，並最終誘導腫瘤大小的降低和腫瘤的消除。
因此，本發明提供了用於抑制端粒酶活性和治療其中端粒酶活性有有害作用的疾病狀態特別是癌症的新的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸和方法。本發明的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸提供了對需要端粒酶活性以保持永生化的惡性細胞的高度選擇性和有效的治療法，同時不影響非惡性細胞。
儘管已描述了本發明的優選實施方案，但應理解的是可做出各種改變而不偏離本發明的實質和範圍。
權利要求
1.一種多核苷酸，其包含由至少一個是N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的亞單位間連鍵連接的核苷亞單位的非均聚序列。
2.權利要求1的多核苷酸，其中N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵由下式定義3′-[-NH-P(＝O)(-SR)-O-]-5′其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽。
3.權利要求2的多核苷酸，其中所有亞單位間連鍵均為N3′→P5′硫代氨基磷酸酯連鍵。
4.權利要求3的多核苷酸，其中核苷亞單位的確定序列長度為3-50。
5.權利要求1的多核苷酸，包括選自磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯的第二種連鍵。
6.權利要求5的多核苷酸，其長度為3-50個核苷亞單位。
7.一種多核苷酸，包括含有至少一個由下式定義的亞單位的核苷亞單位序列 其中B是嘌呤或嘧啶或其類似物；Z是OR，SR或甲基，其中R選自氫、烷基、芳基和其鹽；和R1選自氫、O-R2，S-R2和滷素，而R2是H、烷基或(CH2)nW(CH2)mH，n在1-10之間，m在0-10之間，W是O，S或NH，條件是當Z是甲基或OMe時，R1不是H。
8.權利要求7的多核苷酸，其中所有亞單位均由下式定義
9.權利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸進一步包括至少一個選自磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3′→N5′氨基磷酸酯、N3′→P5′氨基磷酸酯和硫代磷酸酯亞單位的亞單位。
10.權利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸中的每個B部分獨立地選自尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶和肌苷。
11.權利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸與靶核酸序列雜交。
12.權利要求11的多核苷酸，其中該靶核酸序列是端粒酶RNA成分的序列。
13.權利要求10的多核苷酸，其中該多核苷酸可與一RNA靶雜交。
14.權利要求7的多核苷酸，其中該多核苷酸包括一報導部分。
15.權利要求14的多核苷酸，其中該報導部分選自放射性標記、生物素標記和螢光標記。
16.一種合成寡核苷酸N3′→P5′硫代氨基磷酸酯的方法，該方法包括(a)提供附著於固相支持物的第一種5′-琥珀醯-3′-氨基三苯甲基-2′，3′-二脫氧核苷，該第一種核苷有一保護3′氨基基團；(b)脫保護3′氨基基團以形成游離3′氨基基團；(c)將該游離3′氨基基團與3′-保護氨基核苷-5′-O-氰乙基-N，N-二異丙基氨基亞磷醯胺單體反應，形成核苷間N3′→P5′亞磷醯胺連鍵；和(d)硫化所述核苷間亞磷醯胺基團形成N3′→P5′硫代氨基磷酸酯。
17.權利要求16的方法，其中反應和硫化步驟重複進行。
18.將多核苷酸與DNA或RNA靶雜交的方法，包括將權利要求1的多核苷酸與靶在使得該多核苷酸與靶形成雜交複合物的條件下接觸。
19.權利要求18的方法，其中該多核苷酸攜帶報導部分。
20.權利要求19的方法，其中報導部分選自放射性標記、生物素標記和螢光標記。
21.確定樣品中含有特異序列的核酸的方法，包括a)製備一反應混合物，該混合物包括所述樣品和能特異與所述序列雜交的權利要求1的多核苷酸；b)確定反應混合物中形成的雜交體；和c)將所形成的任何雜交體與樣品中含有該特異序列的核酸相關。
22.從樣品中分離含有特異序列的核酸的方法，包括a)將樣品與能特異與所述序列雜交的權利要求1的多核苷酸組合；b)從與所述多核苷酸形成的雜交體中回收所述核酸。
23.抑制細胞中RNA的功能的方法，包括將該細胞與能特異於所述RNA雜交的權利要求1的多核苷酸接觸。
24.權利要求23的方法，其是用於抑制mRNA的翻譯的方法，其中所述多核苷酸包括一序列，該序列含有至少10個與mRNA中所含的序列互補的鹼基。
25.權利要求23的方法，其是用於抑制細胞中端粒酶的方法，其中所述多核苷酸包括一與端粒酶RNA成分互補的序列。
26.抑制細胞中端粒酶活性的方法，包括將該細胞與有效量的權利要求1的多核苷酸接觸。
27.確定或分離樣品中含有特異序列的核酸的試劑盒，包括能與該特異序列雜交的權利要求1的多核苷酸，以及使用該多核苷酸確定或分離所述核酸的書面指示。
28.權利要求1-15任一項的多核苷酸在製備用於治療人或動物體的藥物中的應用。
29.權利要求1-15任一項的多核苷酸在製備用於治療病毒感染的藥物中的應用。
30.權利要求1-15任一項的多核苷酸在製備用於治療癌症的藥物中的應用。
31.權利要求28-30任一項的應用，其中該多核苷酸可與端粒酶RNA成分雜交。
全文摘要
本發明涉及具有新的含至少一個核苷間3′－NHP(O)(S
文檔編號C07H21/04GK1373768SQ00812729
公開日2002年10月9日 申請日期2000年9月8日 優先權日1999年9月10日
發明者謝爾蓋·格裡亞茲諾夫, 克裡斯廷納·蓬格拉茨, 特蕾西·馬特雷 申請人:傑龍公司