一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法
2023-12-08 08:03:21 1
一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法
【專利摘要】本發明涉及一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法，以用於腎臟毒性研究。在利用斑馬魚胚胎模型進行化合物腎臟毒性作用的研究中，通過對胚胎組織中的肌酐成分進行提取，並利用液相色譜串聯質譜方法測定其含量，作為評價胚胎腎臟功能的檢測指標，從而建立一種快速、準確、特異性強的化合物腎臟毒性評價體系。
【專利說明】一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的 方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物腎臟毒性的方法，屬於 毒理學檢測領域。
【背景技術】
[0002] 腎臟是機體的重要器官，能排出體內代謝產物及某些廢物、毒物，調節機體水、電 解質平衡，保證機體內環境的穩定。作為機體的主要排洩器官，腎臟極易受到體內各種代謝 廢物、毒物的影響，這些物質往往具有潛在的腎臟毒性。隨著社會發展，金屬、冶煉業、化工 企業增多，加之醫藥及各種農藥的濫用，環境汙染日益加重，人群接觸腎毒性物質的機會增 力口，中毒性腎病的發病率大幅增長。臨床上腎毒物質導致的腎臟損傷，常表現為急性腎功能 衰竭（acute renal failure, ARF)，約佔急性腎衰的5?25%。急性腎衰起病兇險，死亡率 高，患者多需要終身進行透析治療甚至換腎，給患者及其家庭帶來巨大的痛苦和沉重的經 濟負擔。因此，確立快速、有效的評價體系或評價方法來檢測化合物的腎臟毒性作用，對中 毒性腎臟損害的早期預防具有顯著意義。
[0003] 目前已有的關於化合物腎臟毒性方面的研究多以大鼠、小鼠、家兔等哺乳動物為 模型進行，腎臟功能的檢測手段主要有血、尿生化指標測定，以及腎臟組織病理學觀察，這 些動物體格較大，飼養和實驗成本高，所需周期長，很難實現化合物毒性的高通量檢測。利 用培養細胞系進行體外毒性分析是早期毒性評價的重要替代方法，可快速產生大量的初步 結果，由於體外細胞脫離了腎臟所處的複雜的機體內環境，不能真實反映體內各器官相互 作用下腎臟功能的變化，所獲得的結果需要到活體動物模型上進一步驗證，因此，評價模型 的選擇成為實現化合物毒性快速檢測的瓶頸。
[0004] 斑馬魚是一種小型熱帶淡水魚，屬鯉科。其成魚僅約3-4釐米長，產卵量大，胚胎 透明而且體外發育，非常便於操作和觀察。其胚胎發育周期短，許多研究在胚胎期即可進 行。斑馬魚基因組序列與人類基因組高度相似，包括心血管系統、神經系統在內的多個重要 組織器官在形態結構、生理功能及病理反應上與人類相仿，使其作為一種理想的脊椎模式 生物，在發育生物學、化合物毒性評價和人類疾病模型研究等領域迅速得到廣泛應用。
[0005] 斑馬魚胚胎受精後 14h(14hpf，14hours post-fertilization)腎臟開始發育， 72hpf時腎臟發育完成。最早在48hpf可以觀察到腎小球濾過現象。斑馬魚腎臟分為幼魚 期的前腎和成魚期的中腎，前腎由一對腎單位組成，腎小球在背主動脈腹側的胚胎正中線 處融合，腎小管分居兩偵彳。前腎的解剖結構比成魚的中腎及哺乳動物的後腎簡單，但在細胞 組成及分子水平上與哺乳動物的腎臟相似，並已具備同樣複雜的生物功能。斑馬魚發育第 一周內，由於鰓還未發育完全，主要依賴腎臟排出體內多餘的水分和代謝廢物，加之此階段 仔魚不必餵食即可存活，幹擾因素少，非常有利於開展腎臟毒性相關的研究。斑馬魚胚胎作 為整體動物模型，能夠真實反映腎臟在心血管系統、免疫細胞等內環境作用下的病理變化， 具備了活體動物實驗結果可靠性高的優點。
[0006] 目前，在利用斑馬魚胚胎進行化合物腎臟毒性研究中，對腎臟損傷的檢測主要包 括表型改變、腎臟病理和腎小球濾過率估測等幾方面。其中，腎小球濾過率是直接反映腎 髒功能狀態的重要量化指標，在斑馬魚胚胎是通過計算體內菊粉等類似物質的清除速率測 得，需要將顯色標記的菊粉經胚胎心靜脈竇注入循環血液內，由於胚胎較小，此方法對儀器 和技術要求比較高，操作難度大。疾病導致機體病理生理發生變化，必然引起組織中代謝組 分含量的變化，對這些組分，尤其是一些與器官功能狀態密切相關的生物標誌物含量的檢 測，是診斷疾病發生、發展的重要依據。肌酐是肌肉的代謝產物，由前體化合物磷酸肌酸轉 化而成，主要由腎臟排出體外。腎功能受損時，肌酐在體內蓄積成為有害毒素。在臨床上， 檢測血、尿肌酐值是了解腎臟功能的重要指標。斑馬魚胚胎體積小，難以獲取血液或尿液樣 本，目前，有關斑馬魚胚胎體內肌酐含量的數據資料及腎功能受損後肌酐水平變化方面的 研究尚屬空白。鑑於肌酐在腎功檢測中的重要意義，在利用斑馬魚胚胎進行化合物腎臟毒 性研究時，有必要通過一種準確、可靠的方法對此指標進行考察，以進一步補充完善腎臟功 能評價體系。
[0007] 本發明利用液相色譜串聯質譜的方法，對斑馬魚胚胎組織中的肌酐含量進行測 定，並與正常斑馬魚胚胎組織的肌酐含量值比較，用於快速、可靠的檢測化合物的腎臟毒性 作用。
【發明內容】
[0008] 本發明針對現有技術的不足，提供一種通過檢測斑馬魚組織肌酐含量評價化合物 腎臟毒性的方法。
[0009] 本發明的目的是提供一種以組織中肌酐含量為指標的腎臟毒性評價方法，以用於 腎臟毒性研究，在利用斑馬魚胚胎模型進行化合物腎毒性作用的研究中，通過對胚胎組織 中的肌酐成分進行提取，並利用液相色譜串聯質譜方法測定其含量，可以以胚胎組織中的 肌酐含量變化作為檢測腎臟功能的指標，建立一種快速、準確、特異性強的化合物腎臟毒性 的評價體系。
[0010] 本發明技術方案如下：
[0011] 一種通過測定組織中肌酐的含量變化檢測化合物腎臟毒性的方法，步驟如下：
[0012] (1)將發育3?6天的斑馬魚胚胎移入含有待測化合物的培養水中，在28°C，14h 光照/l〇h黑暗條件下培養24?72h，作為測試組，然後去除死亡胚胎，用純水洗淨胚胎表面 殘留液後，獲得培育後胚胎，所述培育後胚胎距受精時間不超過7天；
[0013] 發明人通過研究發現，受精時間超過7天後的胚胎，由於受到多種幹擾因素影響， 會導致檢測準確率降低。
[0014] 在相同條件下用培養水培養作為正常胚胎組；
[0015] (2)向培育後胚胎加入內標溶液，經勻漿、分層提取其中的極性組分，提取樣品經 氮吹乾後，加入純水溶解，然後過〇. 45 μ m聚醚碸水相濾膜，將濾液注入LC-MS/MS，進行分 離分析；然後分別將肌酐標準品溶液及內標標準品溶液注入LC-MS/MS，在相同條件下進行 檢測；
[0016] (3)根據如下公式：
[0017]
【權利要求】
1. 一種通過測定組織中肌酐的含量變化檢測化合物腎臟毒性的方法，其特徵在於，步 驟如下： (1) 將發育3?6天的斑馬魚胚胎移入含有待測化合物的培養水中，在28°C，14h光照 /l〇h黑暗條件下培養24?72h，做為測試組，去除死亡胚胎，經純水洗淨胚胎表面殘留液 後，獲得培育後胚胎，所述培育後胚胎距受精時間不超過7天； 在相同條件下用培養水培養作為正常胚胎組； (2) 向培育後胚胎加入內標溶液，經勻漿、分層提取其中的極性組分，提取樣品經氮吹 幹後，加入純水溶解，然後過0. 45 μ m聚醚碸水相濾膜，將濾液注入LC-MS/MS，進行分離分 析；然後分別將肌酐標準品溶液及內標標準品溶液注入LC-MS/MS，在相同條件下進行檢 測； (3) 根據如下公式：
式中：C為提取樣品濃度，AA為色譜峰面積； 計算待測樣品中的肌酐及內標含量，再根據內標提取率計算各組胚胎樣品中的肌酐含 量； (4) 胚胎組織中肌酐含量以均值土標準差表示，採用獨立樣本t檢驗法分析比較組 間差異的顯著性，當測試組胚胎組織中肌酐含量高於正常胚胎組胚胎組織中的肌酐含量 (P〈0. 05)，並超過相應發育齡胚胎組織肌酐含量的正常界值範圍，說明胚胎腎臟功能受到 損害，受試化合物具有腎臟毒性； 上述各發育齡胚胎組織中肌酐含量的正常界值範圍為： 受精後4d斑馬魚組織中的肌酐水平為30. 91?49. 09ng/50個胚胎；受精後5d斑馬魚 組織中的肌酐水平為36. 56?56. 32ng/50個胚胎；受精後6d斑馬魚組織中的肌酐水平為 58. 38?82. 06ng/50個胚胎；受精後7d斑馬魚組織中的肌酐水平為84. 47?124. 81ng/50 個胚胎。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，所用的斑馬魚為野生型或 AB系斑馬魚胚胎。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，上述胚胎為受精3天以上，腎臟已完成發育 的野生型或AB系斑馬魚胚胎。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，含有待測化合物的培養水 為在培養水中加入待測化合物或待測化合物與助溶劑的混合。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，上述培養水組分為： NaC15mmol/L, KC10. 17mmol/L, CaCl20. 4mmol/L, MgS040. 16mmol/L，去離子水配製。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟（1)中，培養期間每24h更換3/4 體積的含有待測化合物的培養水。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟⑵中，胚胎樣品中加入的內標物 質為西咪替丁標準品溶液。
【文檔編號】G01N30/88GK104122355SQ201410334259
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】王雪, 劉可春, 韓利文, 陳錫強, 何秋霞, 彭維兵, 王希敏, 侯海榮, 張雲, 孫晨, 楚傑 申請人:山東省科學院生物研究所