用於HPV‑相關病症的新方法、生物試驗和生物標記物與流程
2023-12-08 03:20:36 2
本申請要求2014年4月28日提交的美國臨時專利申請61/985,357的優先權，通過引用將該申請全文納入本文。
政府權利的聲明
本發明在國立癌症研究院授予的基金號U01 CA117374下由政府資助完成。政府對本發明擁有某些權利。
技術領域
本文公開的實施方式涉及患者樣品中HPV檢測的方法和材料，並且更具體地涉及用於HPV-相關病症的診斷、監測、預測和預後用途的試驗和生物標記物。
背景技術：
檢測體液免疫應答對於感染性疾病和自身免疫的診斷和預後而言是必要的，並且可也提供用於檢測癌症等病症的生物標記物。已經開發了多種蛋白組學多重化免疫試驗來促進對這些抗體的檢測。具體地，基於載片的試驗是用於抗體檢測的出色發現工具，但是需要一般常規免疫學實驗室中不常見的專門高通量設備。
人乳頭瘤病毒(HPV)是最常見的性獲得感染，估計多達75％的性生活活躍的人在其一生中的某些時間被感染。HPV的生殖器感染通常在首次性行為後不久獲得，並且在青少年和年輕成年人中流行率最高。在大多數病例中，感染是暫時並且無症狀的，並且流行率一般隨著年齡逐漸降低。頑固的生殖器感染更可能與感染後許多年(一般數十年)出現的侵入性癌症、腫瘤進展相關。
已經清楚HPV 16和18的感染與口咽癌、宮頸癌、肛門癌或其他惡性腫瘤相關。事實上，已經確定西方世界中大多數OPC與HPV感染相關並且數量在上升。
目前，還沒有針對HPV-相關病症(如OPC)的免疫情況的檢測或監測的篩選和相關方法。
發明概述
本文公開的實施方式涉及快速檢測患者樣品中HPV類型，如HPV 16和HPV 18-特異性抗體的方法。患有頭頸癌的患者具有針對衍生自HPV的多種早期基因的可檢測抗體。此外，可在各種實施方式中單獨或組合採用這些抗體作為生物標記物，針對HPV-相關病症、惡性腫瘤和癌前狀態，用於診斷和預後，並且用於評價治療和癌症復發預測的方法。
由於需要可用作HPV-相關病症，包括頭頸癌的診斷和預後檢測劑的一種或多種生物標記物，本文公開了用於篩選具有HPV癌症風險的患者，並用於早期檢測、復發、預測和預後的改善的HPV蛋白質產生方法和生物標記物。一些實施方式涉及另採用ELISA(酶聯免疫吸附試驗)的快速可編程珠試驗的構建。
除非另外定義，否則，本文中所使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。材料、方法和實施例都僅是說明性的，並不意在構成限制。本文中述及的所有出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目和其他參考文獻都通過引用全文納入本文。
從下文的詳述和附圖，以及所附權利要求中能夠很容易地了解本發明的其他特徵和優點。
附圖說明
圖1.HPV-相關OPC的患者中多種HPV16抗體的特異性檢測。HPV16蛋白表達為GST-融合蛋白並且在抗-GST包被平板上捕獲。顯示了在HPV-相關OPC血清(n＝256)和對照(n＝250)中檢測到的IgG的RLU比率(HPV抗原的RLU/GST-對照的RLU)。
圖2.接受者操作特性曲線顯示(A)2-Ab生物標記物組(E6，E7)和(B)7-Ab生物標記物組(E1，NE2，CE2，E4，E5，E6，E7)對HPV-陽性腫瘤(n＝111)和對照(n＝250)病例中OPC癌症的早期診斷的比較性能。實線：訓練組。虛線：驗證組。該組的最優操作點為90％，特異度為98％(AUC＝0.94)。
圖3.HPV-相關OPC的患者中多種HPV16抗體的特異性檢測。HPV16蛋白表達為GST-融合蛋白並且在磁珠上捕獲。顯示了在HPV-相關OPC血清中檢測到的IgG的MFI比率(HPV抗原的MFI/GST-對照的MFI)。檢測HPV-相關OPC患者與對照相比的針對E1、CE2、NE2、E4、E6、E7、和L2的HPV16-特異性抗體。
圖4.檢測來自136個HPV-OPC病例、48個參與者、和81個健康志願者的基線血清中的HPV16E6和E7抗體。顯示了血清中檢測到的針對特異性HPV蛋白質/對照GST蛋白質的IgG的RLU比率。各組中的黑線表示該組中的中值。各組的虛線表示在健康志願者平均值以上3個標準偏差(陽性截止值)。在x-軸上的各組之下列出了被認為血清陽性的各組的比例。
圖5.209名OPC患者的無進展存活。(A)對至少一種E抗體呈陽性的患者對比對所有E抗體呈陰性的患者(P＜.001)。(B)對至少一種L抗體呈陽性的患者對比對所有L抗體呈陰性的患者(P＝.657)。
圖6.114名OPC患者的無進展生存，其中可獲得腫瘤HPV DNA狀態。(A)對至少一種E抗體呈陽性的患者對比對所有E抗體陰性呈的患者(P＜.001)。(B)通過PCR的HPV16-陽性腫瘤患者對比通過PCR的HPV16-陰性腫瘤患者(P＝.016)。
圖7.96名HPV16-陽性OPC患者的無進展存活。(A)對至少一種E抗體呈陽性的患者對比對所有E抗體呈陰性的患者(P＜.001)。(B)對E1抗體呈陽性的患者對比對E1抗體呈陰性的患者(P＝.002)。(C)對NE2抗體呈陽性的患者對比對NE2抗體呈陰性的患者(P＜.001)。(D)對E6抗體呈陽性的患者對比對E6抗體呈陰性的患者(P＝.005)。
圖8.針對(A)E1抗體、(B)NE2抗體、和(C)E6抗體，HPV-陽性OPC患者隨時間的中值抗體水平對比疾病復發狀態。最後跟進的復發的所有8個HPV-陽性患者和沒有復發的隨機亞組的23個HPV-陽性患者在初始處理時、治療後6個月，和以6個月為間隔至治療後36個月時測試。
發明詳述
說明書中所引用的所有出版物，包括但不限於專利和專利申請通過引用納入本文，如同它們完全示於本申請中那樣。
在一個方面中，提供了一種檢測HPV的方法。該方法包括以下步驟：將含有來自患者的抗體的樣品與體外轉錄並翻譯的來自HPV的蛋白質接觸；並且將與蛋白質結合的HPV抗體的特徵與HPV-相關病症的對照比較。HPV-相關病症可包括頭頸癌或惡化前生長中的一種或多種。HPV-相關病症可包括口咽癌(OPC)。在一些情況中，所述蛋白質包括HPV16 E1、NE2、CE2、E4、E6、E7、和L1中的一種或多種。在一些情況中，所述蛋白質包括HPV18 E1、E2、和L1中的一種或多種。來自HPV的超過一種蛋白質可用於樣品。樣品可選自下組：血液樣品、血清樣品和口腔衝洗樣品。
在另一個方面中，本文提供了包括至少一種體外轉錄和翻譯的來自HPV的蛋白質的底物作為針對HPV-相關病症的診斷、預後、預測或監測試驗的部分。
在另一個方面中，提供了一種檢測HPV的方法。該方法包括以下步驟：將含有來自患者的抗體的樣品與體外轉錄並翻譯的來自HPV的蛋白質接觸；和將與蛋白質結合的HPV抗體的特徵與HPV-相關病症的對照比較；並且基於相對於對照的與蛋白質結合的HPV抗體的特徵鑑定患者患有HPV-相關病症。在一些情況中，所述蛋白質包括HPV16 E1、NE2、CE2、E4、E6、E7、和L1中的一種或多種。在一些情況中，所述蛋白質包括HPV18E1、E2、和L1中的一種或多種。
以下實施例進一步描述了本發明，這些實施例並不限制權利要求書所述的本發明範圍。
實施例
本文的一些實施方式採用新的可編程珠試驗ELISA來檢測HPV16-陽性頭頸癌患者的血清樣品中的人乳頭瘤病毒16型(HPV16)蛋白質組。這些蛋白質使用體外轉錄和翻譯(IVTT)實時表達，然後結合至平板、單重或多重珠用於檢測單血清樣品中的多種抗原。患者中檢測到的HPV16抗原可用作潛在診斷和預後生物標記以及在症狀診斷前2年以70％靈敏度和90％特異度檢測疾病中的臨床用途。
從布朗大學獲得訓練組的患者血清，其具有由默克公司(Merck)開發的競爭性Luminex免疫試驗(cLIA)所確定的頭頸癌狀態和HPV16或HPV18-陽性的已知數據。對照血清也獲自相同部位並且匹配至年齡(±5歲)、停留處和性別。然後從Dana-Farber癌症研究院和約翰霍普金斯大學(Johns Hopkins University)獲得該實驗的驗證組。
這些樣品獲自治療前的頭頸癌病例，並且匹配的對照包括該情況的健康參與者。另一組獲自CDC的對照含有來自患有證明宮頸感染HPV16的女性的血清，採用羅氏原型線印跡試驗用針對剝落的宮頸細胞的HPV16DNA呈陽性來確認。所有血清樣品儲存在-80℃下直至使用。
通過巢式PCR獲得PV16和18基因E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、和L2。發現HPV16 E2弱表達並且因此片段化成N-和C-端的半截部分。用來自HPV16和HPV18純化質粒DNA的基因特異性引物來進行初始PCR。使用引物衍生PCR來添加attB用於重組克隆。然後按照生產商的推薦使用BP克隆酶(加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))將att PCR產物插入pDONR221載體並且用LR重組酶(英傑公司)轉化成pANT7GST載體。然後使用標準大量質粒提取(maxi-prep)來純化DNA，之後進行序列確認。
抗-GST抗血清被透析到PBS中以去除疊氮化鈉，並且然後用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)偶聯至SeroMAP微球(德克薩斯州奧斯汀的Luminex公司(Luminex Corporation，Austin，TX))。使用離心來從上清中分離微球。首先去除儲存微球的溶液，然後用無菌水來洗滌微球。微球然後在100mM磷酸二氫鈉，pH 6.2中重懸。然後添加50mg/ml磺基-NHS，之後是50mg/ml EDC並且在室溫(RT)下孵育20分鐘以活化微球上的羧基。
然後用50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)洗滌活化的微球2次。在用MES重懸之後，以5μg/1百萬微球添加抗-GST，並且然後在室溫下旋轉孵育2小時。然後去除上清並且偶聯的微球在PBS-BN(PBS，1％BSA，0.05％疊氮化物，pH7.4)中重懸，並在室溫下旋轉孵育30分鐘。再次去除上清並且偶聯的微球在PBS-0.05％吐溫，pH 7.4中重懸，持續總共2次洗滌。偶聯的微球在PBS-BN中在4℃下避光儲存。使用血細胞計數器來確認最終微球計數。
各HPV基因按照生產商的推薦(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(Promega Corporation，Madison，WI))使用單批次的T7網狀細胞裂解物和500ng DNA表達成GST-融合蛋白。也表達載體和p21-GST作為對照。在體外轉錄和翻譯(IVTT)之後，表達的蛋白質在PBS-1％BSA中以40微球/μl在2000個抗-GST偶聯的微球上捕獲。
然後，將蛋白質結合的微球收集到一起以形成多重試驗，然後再等分到96-孔濾板中，並使用真空過濾系統用PBS-1％BSA洗滌。微球用PBS-1％BSA中10％的來自小鼠、兔、山羊和大鼠的各普通血清；0.5％聚乙烯醇；0.8％聚乙烯吡咯烷酮；和2.5％Chemicon(麻薩諸塞州比爾裡卡的密理博公司(Millipore Corporation，Billerica，MA))在室溫下振蕩1小時來封閉。血清在相同的封閉緩衝液中以1∶80稀釋並且用微球在4℃下過夜振蕩孵育。添加4μg/ml的生物素偶聯的山羊抗人IgG抗體和4μg/ml的鏈黴親和素-R-PE。使用Luminex200IS 2.3軟體來測量中值螢光強度(MFI)。為了控制非特異性和GST-特異性自抗體背景，測量了單獨HPV-特異性抗體的MFI與對照p21-GST抗原的MFI的比率。
就結果而言，在患者血清中檢測到了針對多種HPV-衍生的早期基因的抗體應答。與健康對照樣品相比，HPV16 E1、E2、E4、E6、E7、和L1抗體水平(但不是ES或L2)在HPV16 L1 Ab+患者中升高(由默克試驗確定)。中值MFI比率為：E1 39對比2.0，p＜0.0001；E2 2.7對比1.4，p＜0.0001；E4 9.1對比1.4，p＜0.001；E6 10對比2.1，p＜0.0001；E7 3.9對比2.0，p＜0.01；和L1 10.8對比2.4，p＜0.0001。對於由默克試驗確定的具有HPV18 L1抗體的患者，僅具體檢測到針對HPV18 E1(11.9對比2.3，p＜0.001)；E2(20.7對比1.9，p＝0.0016)，和L1(9.8對比2.7，p＜0.0001)的抗體。沒有檢測到HPV16和HPV18-特異性抗體之間的交叉反應性。
因此，已經開發了定製的多重珠試驗用於快速檢測患者血清中的HPV16和HPV18-特異性抗體。
用於檢測口咽癌的HPV16血清學生物標記物
使用了以下縮寫：CV，變異係數；HPV，人乳頭狀瘤病毒；IVTT，體外轉錄/翻譯；OPC，口咽癌；OR，讓步比；SD，標準偏差。
人乳頭狀瘤病毒(HPV)16型是大部分口咽癌(OPC)的病因。針對HPV16蛋白質組的抗體(Ab)是HPV-相關OPC(HPV-OPC)的潛在生物標記物。
使用可編程ELISA試驗來對針對HPV16抗原E1、E4、E5、E6、E7、L1、L2，以及E2的N-端和C-端(NE2，CE2)的IgG抗體進行定量。從分成訓練組和驗證組的258個診斷的OPC患者以及250個健康對照獲得血清。已知137個病例的通過PCR測量的HPV16腫瘤狀態，其中111個是HPV16陽性。確定了各抗原與對照GST蛋白質的平均發光(RLU)值的比率。通過威爾科克森秩和檢驗來計算P-值。
與健康對照相比，HPV16 E1、E2、E4、E5、E6、E7、和L1-特異性IgG水平在OPC患者中上升(p＜0.05)。使用SVM分類器建模，鑑定了用於OPC癌症的潛在診斷的7-Ab生物標記物組(E1、NE2、CE2、E4、E5、E6、E7)。對於患有已知HPV16-陽性腫瘤的患者亞組(n＝111)，98％特異度下的靈敏度為90％(AUC＝0.94)。在多變量調整之後，任意抗原的Ab陽性與OPC風險相關(OR[95％CI]，65.6[26.0-165.1])。在病例中，Ab陽性與具有HPV16陽性腫瘤(OR[95％CI]，5.3[1.3-21.2])強烈相關，並且尤其是在≤10包年(pack year)吸菸史的群體中(OR[95％CI]，22.7[2.5-208.8])。
因此，已經產生了用於早期檢測HPVOPC的HPV16 IgG Ab的新生物標記物組。
通過以下實施例，在德克薩斯州休斯頓的德克薩斯大學，M.D.Anderson癌症中心開始治療之前(n＝258)，從患者中選擇用於以下分析的血清。生物儲備庫中的樣品從參加2006年1月至2008年9月的頭頸臨床試驗的患者中收集並且與人口統計學、流行病學和臨床數據相關聯。患者使用標準化問卷提供人口統計學和接觸史，包括抽菸和飲酒，並且提供血液樣品用於生物學測試。健康對照血清獲自德克薩斯大學，M.D.Anderson癌症中心，頻率在年齡、性別和種族上匹配病例(n＝250)。病例和對照先驗隨機分配到訓練組和驗證組。所有樣品使用標準化的樣品收集方案收集並在-80℃下儲存直至使用。在機構審查委員會的批准下，獲得了所有對象的書面知情同意。
含有序列驗證的全長cDNA表達質粒(pANT7_cGST)的Gateway-相容性供體系統從亞利桑那州立大學的生物設計院的DNASU質粒儲存庫獲得，並且在dnasu.org/DNASU/上網上公開。DNA經純化並插入pANT7_cGST載體中。在pANT7_cGST載體中，各HPV16基因按照生產商的說明使用人HeLa細胞裂解液(麻薩諸塞州沃特漢姆市的熱科學公司(Thermo Scientific，Waltham，MA))表達為C-端GST-融合蛋白。HPV16E2基因表達為N-和C-端片段用於優化蛋白質表達。GST表達為陰性對照蛋白質。
進行ELISA，採用以下修飾：採用IVTT使用HeLa細胞裂解液從200ng模板cDNA表達88μ1蛋白質，並在抗-GST抗體偶聯的96孔板(新澤西州皮斯卡特維的GE醫療公司(GE Healthcare，Piscataway，NJ))上捕獲。血清以1∶100稀釋並且用10％大腸桿菌DH5a裂解液在室溫下封閉2小時，然後用表達的蛋白質孵育1小時。使用BioMek NxP實驗室自動化工作站(加利福尼亞州布瑞亞的貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter，Brea，CA))來進行封閉物、血清和抗體的添加。同時一式兩份分析病例和對照。以1∶10000添加辣根過氧化物酶(HRP)抗-人IgG抗體(賓夕法尼亞州西格魯甫的傑克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA))並且使用Supersignal ELISA Femto化學發光底物(熱科學公司)檢測。以425nm處Glomax 96微孔板光度計(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司)上的相對光單位(RLU)檢測發光。為了控制非特異性和GST-特異性抗體，測量了單獨HPV-特異性抗體的RLU與對照GST抗原的RLU的比率。
根據對用於確定腫瘤HPV狀態的診斷的組織病理學確認獲得診斷性內部石蠟包埋的組織。使用組織DNA提取試劑盒(加利福尼亞州瓦倫西亞的凱傑公司(Qiagen Inc.，Valencia，CA))來提取DNA。使用基於PCR的類型特異性試驗測試來自研究對象的腫瘤組織是否存在HPV E6或E7區，並且各對象基於這些結果分類為HPV-陽性或HPV-陰性。樣品一式三份與陽性(Siha細胞系)和陰性(TPC-1細胞系)對照一起運行，並且β-肌動蛋白作為DNA質量對照。
所有試驗一式兩份進行，並且將值繪製成平均值。為了確定截止值，RLU比率＞訓練組對照樣品的(平均+3標準偏差)(n＝125)被指定為陽性。這些水平為E1：2.66；NE2：2.29；CE2：4.35；E4：2.58；E5：1.69；E6：2.01；E7：1.99；L1：1.84；L2：3.58。使用曼-惠特尼非參數檢驗來進行比較(GraphPad Prism版本5.0c，加利福尼亞州聖地牙哥)。使用二元邏輯回歸分類器建模，我們計算了接受者操作特性曲線(ROC)下的面積作為比較所有抗體組的組合的早期診斷OPC癌症性能的基礎。
使用Stata 12.0(德克薩斯州學院站的Stata公司(StataCorp，College Station，TX))作為所有統計學分析的基礎。p-值＜.05被認為是顯著的並且所有測試是雙側的。產生類別變量以描述研究對象的人口統計學、臨床和接觸(吸菸和酒精)史。如果對象在其生命中已抽吸至少100支煙，則他們被認為是常吸菸者(ever-smoker)，並且如果對象在其生命中已經每周至少一次飲用酒精飲料持續1年或更久，則他們被認為是常飲酒者(ever-drinker)。之前吸菸或飲用酒精但是其診斷前的一年沒有這樣做的對象被分別認為是前吸菸者(former-smoker)和前飲酒者(former-drinker)。
使用標準說明統計學方法來分析感興趣的人口統計學和臨床變量。對於類別變量，使用卡方檢驗或菲希爾精確(細胞頻率＜5時)檢驗，並且對於連續變量，使用斯氏t檢驗(調整不相等變量)來比較組間差異。
使用邏輯回歸模型來計算95％置信區間(CI)的讓步比(OR)，調整可能混淆的因素以確定腫瘤HPV狀態與使用HPV16的治療前抗體狀態之間的關聯。對於HPV-，HPV+＞10包年吸菸史，和HPV+≤10包年吸菸史之間的比較，使用多元邏輯回歸，使用HPV-患者作為基礎結果。
初步目標是確定：是否在新診斷患有OPC的患者中檢測到任何HPV16-特異性抗體。參與正在進行的針對頭頸癌的大型分子流行病學研究的患有新診斷的、組織病理學確認的並且之前未治療的口咽癌的患者適於該研究。在來自隨機分成訓練組和驗證組的258個OPC病例和250個年齡、性別和種族匹配的對照的血清中比較針對HPV16蛋白質和GST對照蛋白質有特異性的抗體水平。從進一步研究中略去2個病例，因為他們在診斷時有遠處轉移，留下256個病例的樣本大小。病例和對照的人口統計學示於表1。
表1.病例和對照的人口統計學、接觸和臨床特徵
a針對不相等變量調節
大部分病例衍生自扁桃體或舌根(95％)並且呈現為III/IV期(92.6％)。雖然在病例和對照之間吸菸狀態上沒有差異(表1)，對照報告了現時飲酒的更高發生率(46.5％病例對比59％對照，p＝0.025；表1)。在256個病例中，可獲得137個病例的HPV狀態(有針對E6和E7的HPV腫瘤PCR所確定)，其中111個病例是HPV16陽性(81％)。
圖1顯示了健康對照和OPC病例的合併組中針對HPV16抗原的血清IgG抗體的RAPID ELISA結果。為了控制非特異性和GST-特異性自抗體背景，測量了單獨HPV-特異性抗體的RLU與對照GST抗原的RLU的比率。在總OPC樣品(未由HPV狀態選擇)中，在OPC患者中，除了L2以外的所有HPV16抗體明顯高於健康對照(p＜0.05，圖1)。
比健康對照更高比例的OPC患者對於這些抗體各自都是血清陽性的(表2)。
表2.治療前抗體狀態與病例-對照狀態的關聯
a任意陽性對比全部陰性
b菲希爾精確檢驗
c針對年齡、吸菸和酒精狀態調整
NC，由於零細胞而不可計算
使用來自訓練組健康對照的截止值(＞平均以上3SD)，與15/250(6.0％)的健康對照相比，在213/256(84.2％)的OPC病例的血清中檢測到至少一種HPV16早期基因抗體(表2)。大部分患者是對於HPV16E1(144/256，56.3％)、NE2(104/256，40.6％)、CE2(137/256，53.5％)、E6(148/256，57.8％)、和/或E7(148/256，57.8％)的抗體是陽性的。與此相比，僅15個病例(5.9％)對L1抗體是陽性的並且沒有病例對L2抗體是陽性的。針對E1、E2、E4、E5、E6、和E7的抗體在驗證組的病例和對照之間明顯不同。
通過計算OR(95％CI)(針對年齡和性別調整)來估計OPC風險(表2)。E1、E2、E6、和E7抗體的OR範圍是31.5-335.3。雖然95％CI是寬泛的，OPC的極高風險與E2的N-端部分(OR＞300)、E6蛋白(OR＞250)、和E1蛋白(OR＞150)的血清陽性相關。對任何抗原呈血清陽性與66倍增加的OPC風險相關，同時對早期蛋白質呈血清陽性與93倍增加的OPC風險相關，並且對晚期蛋白質呈血清陽性與5倍增加的OPC風險相關。
在137個具有通過PCR測試HPV16 E6或E7DNA的腫瘤組織的病例中，111個(81.0％)確定為HPV腫瘤陽性，並且26個(19.0％)是HPV腫瘤陰性。
在HPV腫瘤陽性病例中，95/111(85.5％)對於至少一種HPV早期抗原而言是血清學陽性的。然而，16/26(61.5％)的HPV腫瘤陰性病例對於至少一種HPV早期抗原而言也是血清學陽性的。針對NE2或E6的抗體的存在也與HPV腫瘤狀態(OR[95％CI]，分別是5.8[1.8-19.4]和4.5[1.6-12.6])相關，並且這在吸菸史小於或等於10包年的人中特別如此(OR[95％CI]，分別是22.3[3.9-26.8]和8.9[2.7-28.9])。對於任意分析的蛋白質的血清陽性與吸菸史≤10包年的HPV腫瘤狀態強烈相關，但是這種相關主要針對早期蛋白質(OR[95％CI]，21.3[2.3-192.8])而不是晚期蛋白質。在吸菸者中(吸菸史＞10包年)，沒有鑑定到血清陽性和HPV腫瘤狀態之間的持續相關性。HPV16 E2、E6、和E7的血清學與HPV腫瘤狀態的相關性被抽菸隔離。
對於HPV腫瘤陽性狀態的患者亞組(n＝111)，基於他們與HPV腫瘤狀態的個體強烈相關性，我們評價了早期抗原特異性抗體的組合作為一組。使用多個截止值，與對照相比，大部分病例是E6和/或E7抗體(88/111，79.3％)陽性的。整個組的添加(至少一種HPV16早期基因抗體)與對照相比改善了對95/111(85.5％)病例的檢測的靈敏度。E1抗體與NE2抗體強相關(R2＝0.63)。
我們使用訓練組中具有已知HPV16腫瘤陽性狀態的患者(n＝111)和對照(n＝125)的亞組來構建對疾病狀態的分類器，並且比較E6/E7-特異性抗體的組合(圖2A，實線)和7種早期抗原特異性抗體的整個組(圖2B，實線)。然後，我們使用分類器來構建驗證組中病例(n＝111)和對照(n＝125)的獨立HPV16腫瘤陽性接受者操作特徵曲線。在98％特異度下，E6/E7抗體組的靈敏度為84％(AUC＝0.9276)。相比而言，7-抗體組(E1、NE2、CE2、E4、E5、E6、和E7)具有改善的98％特異度下90％的靈敏度(AUC＝0.9395，圖2，虛線)。與單獨截止值相比，使用分類器同時改善了該組的靈敏度和特異度。
大部分口咽癌與人乳頭瘤病毒16型(HPV16)相關。由於上升的HPV-OPC發生率，臨床上迫切需要用於這些患者的早期組檢測、診斷、預後和監測的生物標記物。之前的研究已經證明HPV-OPC的患者亞組(約64-74％)在他們的血清中有可檢測的針對HPV16E6的抗體和/或E7抗體。在先驅研究中，我們觀察到OPC患者內針對HPV16早期蛋白質的血清應答的個體特徵的顯著異質性，表明針對多種HPV16-衍生的蛋白質的IgG抗體的組可改善對HPV-OPC的檢測。在本發明的研究中，我們評價了對整個HPV16蛋白質組有特異性的抗體作為潛在生物標記物用於診斷OPC，使用大量預期收集的來自過去十年在MD Anderson癌症中心呈現OPC的頭頸臨床症狀的患者的血清。
我們證明，與年齡、性別和種族匹配的對照相比，在患者血清中特異性地檢測到針對多種HPV16早期抗原(E1、E2、E4、E5、E6、和E7)的抗體。針對HPV16早期抗原(E1、E4、E5、E6、E7、以及E2的N-和C-端片段)的整個組的抗體以98％的特異度檢測到90％的HPV16+病例。我們的數據支持以下假設，HPV16抗體特性可以是HPV-OPC的特異性且臨床有用的生物標記物，並且潛在針對其他HPV-相關惡性腫瘤。
這項研究的一個限制在於，在招募這些患者的10年中檢測腫瘤組織中HPV的標準和方法的快速發展變化。目前還沒有用於HPV的組織生物標記物的標準，雖然通過IHC檢測的p16表達通常用作替代標記物，用或不用針對HR HPV核酸的ISH。通過針對HPV16E6和E7的PCR來確定這項研究中HPV狀態分配。這些病例中只有一小亞組具有可用於針對p16免疫組織化學的組織(n＝22)。因此，我們無法用p16測試來確認組織HPV狀態。
在通過PCR鑑定組織HPV16狀態的病例亞組中(n＝137)，在85.6％的具有通過PCR測試為HPV16陽性的腫瘤的病例中檢測到針對HPV16早期抗原(E1、E2、E4、E5、E6、E7)的抗體，但是61.5％的組織HPV PCR為陰性的病例仍然是血清學陽性的。這些血清學應答在強度和抗原性特異性上與組織HPV PCR陽性病例中的應答是相似的(數據未顯示)。由於10-15％的HPV-OPC與除HPV16以外的HPV亞型相關，我們不能排除在血清陽性的PCR陰性群中血清試驗與其他亞型HPV有交叉反應。第二種可能性是用於該研究中的HPV16PCR具有優先的靈敏度(假陰性)，這無法通過該研究中的p16測試來確認。
我們的數據確認並延伸了證明在新診斷HPV-OPC的患者中檢測到E6和E7抗體的公開研究。在此，我們在79.3％的HPV-OPC患者中檢測到E6和/或E7抗體(n＝111)。我們的結果與我們在來自獨立多中心HOTSPOT研究的76.0％的HPV-OPC患者(n＝119)中E6和/或E7抗體的發現相似，這表明在對HPVOPC的血清學檢測中存在有限的區域或技術變異。
這也表明，HPV狀態定義(用於該研究中的PCR)對比HOTSPOT中的p16/ISH的差異並沒有顯著影響這些結果。使用人細胞裂解液的體外蛋白質表達的技術改善和對試驗的廣泛優化已經改善了可編程ELISA檢測的分析限同時最小化變異和背景。使用全組的早期蛋白質，在98％特異度下，檢測靈敏度改善至90％，這強烈支持了用於HPV-OPC檢測的多參數特性的使用。
從我們的數據中，值得注意的發現是這些患者中針對HPV16的血清應答的異質性，這具有未知的生物或臨床意義。大部分(79.3％)患者血清具有針對E6和/或E7的抗體，但是也特異性地檢測到針對多種其他早期基因，包括E1、E2和E4的抗體。這對於HPVOPC而言是獨特的，因為在患有侵入性宮頸癌的患者的血清中很少檢測到這些抗體。E1抗體與E2抗體強相關，並且僅在具有E7抗體的患者的亞組(25.7％)中檢測到E4抗體。5％的患者具有針對E1/E2抗原的分離抗體，而沒有E6/E7抗體。
由於通過抗原表達來誘導體液免疫，我們預測針對單獨HPV抗原的血清應答的患者間差異是腫瘤中抗原表達差異的結果。事實上，通過IHC觀察到E6和E7表達中的差異。在此時，還沒有關於OPC組織中E1、E2、E4、或E5抗原的蛋白質表達的公開數據。在充分認識其中疾病進展中的病毒發病機理的動態作用的宮頸疾病中，E2在CIN II/III中高表達，並且表達由於E6/E7的病毒整合和解除抑制而降低。因此，我們預測可在HPV-OPC發展中比E6/E7抗體更早地檢測到針對E2(和可能的E1、E4和E5)的抗體。
針對HPV早期抗原的抗體的生物學結果未知。這些抗體很少在患有HPV感染的患者的沒有異常發育的宮頸中被檢測到(如通過羅氏線性試驗測量)(CIN 0/1)，表明他們是癌症而非急性感染的生物標記物。2個研究已經顯示針對E6和/或E7蛋白質的抗體與改善的HPV-OPC臨床預後相關，但這仍需要在更大的HPV-OPC組中確認。
表3.訓練和驗證組中病例和對照的HPV16 IgG檢測的RLU比率和範圍。
RLU比率＊(範圍)
特異性HPV16抗體可能預測HPV+口咽癌中改善的預後
人乳頭狀瘤病毒16型(HPV16)導致大部分口咽癌(OPC)。如本文所述，針對特定HPV16蛋白質的抗體(Ab)是針對HPV16+OPC改善的預後的潛在生物標記物。
使用可定製編程ELISA試驗來對針對HPV16抗原E1、E4、E5、E6、E7、L1、L2，以及E2的N-端和C-端(NE2，CE2)的IgG抗體進行定量。從97個在診斷時由PCR確認的HPV16+OPC患者獲得血清。確定了各抗原與對照GST蛋白質的平均螢光強度(MFI)值的比率。通過Cox比例風險回歸來確定與臨床結果的相關性。
HPV16 E1的存在以及NE2-特異性IgG水平都與HPV16+患者中改善的總體和無復發存活強相關(p＜0.05)。在研究期間結束時存活的那些的中值隨訪時間為49個月(針對總體存活)和46個月(針對無復發存活)。對於總體存活，當對吸菸(＞10包年吸菸史對比≤10包年吸菸史)、飲酒(常對比從不)、T類別(T3-4對比T0-2)、和亞位置(T/BOT對比其他)調整時，E1抗體陽性的危險比為0.2並且NE2抗體陽性的危險比為0.2(分別為p＝0.029和p＝0.022)。E6抗體陽性與死亡風險降低70％相關，雖然這在多變量調整之後不是統計學顯著的(HR＝0.3；p＝0.074)。對於無復發存活，對於E1抗體陽性，調整的危險比為0.2，並且對於NE2抗體陽性，調整的危險比為0.2(分別為p＝0.014和p＝0.020)。
因此，我們已經鑑定了與HPV16+OPC的改善的總體和無復發存活相關的2種HPV16-特異性抗體。
另外，我們已經鑑定了作為頭頸癌的潛在診斷生物標記物的一組HPV16抗原。我們之前已經鑑定了單獨抗原，我們現在已經用關於用於檢測這些癌症的這些抗原的最優組的大得多的資料庫提供了詳細信息。未包括在該組中的其他HPV抗原也可有益處。
目前，還沒有用於HPV+頭頸癌的早期檢測的生物標記物。針對來自HPV16的E6和E7蛋白質的抗體已經鑑定為潛在診斷性抗原。我們已經開發了針對整個HPV16蛋白質組的新試驗，並且已經證明一組這些抗原用於癌症檢測(和潛在檢測復發或監測治療)的具體應用。
我們鑑定了三種抗原作為HPV+頭頸癌的潛在預後生物標記物：針對蛋白質HPV16 E1、E2的N-端、和E6的抗體。目前，所有HPV+頭頸癌患者經過標準頭頸癌治療。然而，他們總體上有良好預後，並且可受益於更低劑量的放療和/或化療。我們已經開發了試驗並且鑑定了有特別良好預後的那些患者的亞組。
我們已經開發了一種稱為快速抗原性蛋白質原位展示(RAPID)的可定製編程的ELISA試驗用於在患者血清中檢測針對HPV抗原的抗體。RAPID ELISA採用原位蛋白質表達和捕獲用於標記的蛋白質的抗原展示，能夠高效並特異性展示HPV16的蛋白質組，以及腫瘤抗原p53，其在20％的患有p53-突變癌症的患者中是高度免疫原性的。在該研究中，我們研究了HPV16作為用於HPV+OPC診斷的生物標記物的應用。我們使用廣泛追溯收集的來自新診斷OPC患者的血清來評價HPV16蛋白質組範圍血清學、疾病狀態、年齡、吸菸和腫瘤HPV狀態之間的相關性。
在德克薩斯州休斯頓的德克薩斯大學，M.D.Anderson癌症中心開始治療之前(n＝256)，從患者中選擇用於OPC疾病分析的血清。由俄勒岡州波特蘭市的俄勒岡健康和科學大學(組1，n＝78)和德克薩斯大學M.D.Anderson癌症中心(組2，n＝50)獲得對照患者血清。所有樣品使用標準化的樣品收集方案收集並在-80℃下儲存直至使用。在機構審查委員會的批准下，獲得了所有對象的書面知情同意。
含有序列驗證的全長cDNA表達質粒(pANT7_cGST)的Gateway-相容性供體系統從亞利桑那州立大學的生物設計院的DNASU質粒儲存庫獲得，並且在dnasu.org/DNASU/上網上公開。DNA經純化並插入pANT7_cGST載體中。磁性羧酸化微球(德克薩斯州奧斯汀的Luminex公司)以5μg的抗-GST抗血清(新澤西州皮斯卡特維的GE醫療公司)的比率偶聯至一百萬的珠。使用人HeLa細胞裂解液(麻薩諸塞州沃特漢姆市的熱科學公司)和500ng DNA將各HPV基因表達為GST-融合蛋白。GST-對照載體表達為陰性對照蛋白質。HPV16 E2基因表達為N-和C-端片段用於最優蛋白質表達。
基本如本領域已知的那樣進行珠陣列ELISA，採用以下修改。使用人HeLa細胞裂解液進行體外轉錄/翻譯(IVTT)，並且產物各自在微球(Luminex)上捕獲，收集，並用稀釋到SeaBlock(伊利諾州洛克福德的熱科學公司)中的(蒙大拿州博茲曼的歐米茄生物公司(Omega Biologicals，Bozeman，MT))封閉。血清以1∶80稀釋並且與封閉緩衝液中收集的珠在4℃下過夜振蕩孵育。為了進行檢測，以1∶10000添加藻紅蛋白-標記的山羊抗-人IgG抗體(賓夕法尼亞州西格魯甫的傑克遜免疫研究實驗室公司)，並且然後檢測中值螢光強度(MFI)。為了控制非特異性和GST-特異性抗體，測量了單獨HPV-特異性抗體的MFI與對照GST抗原的MFI的比率。
基本如珠陣列ELISA那樣進行單重可編程ELISA，採用幾處關鍵修改。如上所述，使用人HeLa細胞裂解液進行體外轉錄/翻譯(IVTT)，並且產物各自在抗-GST(源)包被的96-孔板(板類型)上捕獲。血清以1∶80稀釋並且用大腸桿菌DH5a細胞的裂解液(通過超聲製備)封閉。使用山羊抗-人IgG抗體(賓夕法尼亞州西格魯甫的傑克遜免疫研究實驗室公司)和ECL來檢測結合的IgG。
如果存在E6和/或E7DNA，則病例通過腫瘤PCR確定為HPV陽性。
在多重化平臺上使用Luminex xPONENT軟體(麻薩諸塞州比爾裡卡的EMD密理博公司(EMD Millipore，Billerica，MA))，50個計數/分析來進行淨MFI測量。所有試驗一式兩份進行，並且值繪製成平均值。為了確定截止值，MFI比率＞78個對照樣品的(平均+3標準偏差)被指定為陽性。這些水平為E1：1.4；CE2：2.4；NE2：1.5；E4：2.7；E5：1.5；E6：1.7；E7：2.2；L1：1.4；L2：1.4。使用曼-惠特尼非參數檢驗來進行比較(GraphPad Prism版本5.0c，加利福尼亞州聖地牙哥)。使用二元邏輯回歸分類器建模，我們計算了接受者操作特性曲線(ROC)下的面積作為比較所有抗體組的組合的早期診斷OPC癌症性能的基礎。
患有OPC的患者被鑑定為適於該研究。從病例對象中獲得治療前的血液樣品。從258個對象中獲得HPV16的血清學。2個病例在他們顯示遠處轉移時從進一步研究中略去。在256個病例中，獲得了137個病例的通過HPV腫瘤PCR確定的HPV狀態。在22個病例上進行P16免疫染色，並且在55個病例上進行ISH。從參加俄勒岡頭頸癌篩選中的健康供體群中選擇對照(組1，n＝79)。一個對照由於扁桃體癌的病史而略去。病例和對照的人口統計學示於表1。為了控制基於年齡、性別和位置的潛在偏差，從MD Anderson癌症中心的健康供體群中選擇第二組對照樣品(組2，n＝50)。
收集治療前的病例血清。從健康俄勒岡州波特蘭地區沒有癌症病史的健康男性和女性收集對照血清和問卷。通過MagProBE測量病例和對照血清中針對HPV16抗原的血清IgG抗體(圖3)。為了控制非特異性和GST-特異性自抗體背景，獲取了單獨HPV-特異性抗體的MFI與對照GST抗原的MFI的比率。各單獨抗原的這些值的平均和範圍示於表3。使用從對照生成的截止值，與11/78(14.1％)的健康對照相比，在225/256(87.9％)的OPC病例的血清中檢測到至少一種HPV16抗體。大部分患者對於E1、CE2、NE2、E6和/或E7抗體分別顯示69.1％(177/256)、47.3％(121/256)、77.3％(198/256)、74.6％(191/256)、和64.8％(166/256)百分比的陽性。如果存在一種或多種陽性抗體，則一個病例在血清學上被確定為HPV-陽性。
在137個通過PCR測試HPV腫瘤狀態的病例中，111(81.0％)個確定為HPV腫瘤陽性，並且26(19.0％)個是HPV腫瘤陰性。
比較了血清學和通過腫瘤PCR的HPV-狀態的結果。在HPV腫瘤陽性病例中，100/111(90.0％)對於至少一種HPV抗原而言也是血清學陽性的。18/26(69.2％)的HPV腫瘤陰性病例對於至少一種HPV抗原而言是血清學陽性的。存在針對CE2和/或NE2的抗體與HPV腫瘤炎性OPC相關(OR，5.8；95％CI)，如同存在針對E6和/或E7的抗體那樣(OR，4.1；95％CI)。當針對吸菸調整時，吸菸史小於或等於10包年且對CE2和/或NE2血清陽性的那些的與HPV-陽性OPC的關聯性的讓步增加22倍(OR，22.3；95％CI)。對E6和/或E7血清陽性的吸菸者與HPV-陽性OPC的關聯性的讓步也增加12倍(OR，11.8；95％CI)。
我們使用威爾科克森秩和檢驗比較了IPC患者和健康對照樣品中的HPV16E1、E2、E4、E6、E7、和L2抗體水平(p＜0.0001)。對於具有HPV腫瘤陽性狀態的患者亞組(n＝113)，我們鑑定了一個4-抗體生物標記物組(NE2、CE2、E6、E7)。該組的最優操作點為97％的特異度下90％(AUC＝0.96)。這種AUC對應於其中假陽性率至多2.5％的值。
用於頭頸癌預後的HPV血清學
人乳頭狀瘤病毒16型(HPV16)導致大部分口咽癌(OPC)。針對特定HPV16蛋白質的抗體(Ab)是針對HPV16+OPC改善的預後的潛在生物標記物。
最終分析中總共包括209個患者。這些患者中，114個具有亞組分析可用的腫瘤HPV16狀態；這些患者中96個有HPV16-陽性腫瘤。存活患者的中值隨訪時間是62.7個月(範圍，3.9-96.9個月)。存活的HPV16-陽性腫瘤患者的中值隨訪時間是68.9個月(範圍，4.1-92.5個月)。對於有腫瘤HPV16狀態和沒有該狀態的患者的存活而言，沒有差異(P＝.577)。
在對任意E抗體陽性的患者中，無進展存活更好(圖5A)，但是在對任意L抗體陽性的患者中沒有注意到存活優勢(圖5B)(分別為P＜.001和P＝.657)。因此，我們在後續分析中排除了L抗體狀態。
HPV16 E1的存在以及NE2-特異性IgG水平都與HPV16+患者中改善的總體和無復發存活強相關(p＜0.05)。在研究期間結束時存活的那些的中值隨訪時間為49個月(針對總體存活)和46個月(針對無復發存活)。對於總體存活，當對吸菸(＞10包年吸菸史對比＜10包年吸菸史)、飲酒(常對比從不)、T類別(T3-4對比T0-2)、和亞位置(T/BOT對比其他)調整時，E1抗體陽性的危險比為0.2並且NE2抗體陽性的危險比為0.2(分別為p＝0.029和p＝0.022)。E6抗體陽性與死亡風險降低70％相關，雖然這在多變量調整之後不是統計學顯著的(HR＝0.3；p＝0.074)。對於無復發存活，對於E1抗體陽性，調整的危險比為0.2，並且對於NE2抗體陽性，調整的危險比為0.2(分別為p＝0.014和p＝0.020)。
對任意E抗體陽性的患者比對所有E抗體陰性的患者有更好的總體和無進展存活：5年總體存活估計分別為87.4％和42.2％，並且5年無進展存活估計分別為82.9％和46.1％(兩者P＜.001)。在多變量Cox比例風險回歸中，對任意E抗體陽性的患者有降低80％的死亡(HR，0.2；95％CI，0.1-0.4)和進展(HR，0.2；95％CI，0.1-0.5)風險(表4)。NE2陽性、E1陽性、和E6陽性降低死亡風險多達80％，並且降低進展風險多達70％(表4)因為吸菸是存活的強預測指標並且具有HPV-陽性腫瘤的患者更可能是從不吸菸的人或輕度吸菸者，我們也評價了具有10包年或更少吸菸史的患者亞組。在這些患者中(n＝130)，對任意E抗體陽性也與死亡(HR，0.1；95％CI，0-0.7)和進展(HR，0.1；95％CI，0-1.0)風險的顯著降低相關(表4)。在從不吸菸的人和輕度吸菸者中，我們沒有觀察到對於整個組觀察到的與單個抗體的強相關性；無論如何，在該亞組中觀察到抗體-陽性患者中存活改善的趨勢。
為通過E抗體狀態和腫瘤HPV16 DNA狀態比較患者之間的存活差異，我們生成了卡普蘭-邁耶曲線(圖6)。圖6A顯示了E抗體狀態的無進展存活，並且圖6B顯示了腫瘤HPV16 DNA狀態的無進展存活。雖然E抗體陽性和HPV16腫瘤陽性與明顯更好的存活相關，E抗體狀態似乎是更強的預測指標(E抗體狀態的P＜.001和HPV16的P＝.016)。這在多變量Cox比例風險回歸中得到確認，其中E抗體陽性和HPV16陽性都是總體和無進展存活的強預測指標。在多變量調整之後，對E抗體陽性的患者的死亡風險降低80％(95％CI，0.1-0.5；針對年齡、吸菸和治療調整)，並且針對腫瘤HPV16炎性的患者的死亡風險也降低80％(95％CI，0.1-0.7；針對年齡、吸菸、治療和T類別調整)。類似地，E抗體狀態和HPV16狀態與無進展存活強相關(E抗體：HR，0.2；95％CI，0.1-0.5，在針對年齡、吸菸和治療調整之後，並且HPV16：HR，0.2；95％CI，0.1-0.7，在針對年齡、吸菸、T類別和亞位置調整之後)。
我們使用ROC曲線來確定用於預測全部209個患者的疾病復發的E抗體的最佳組合。NE2、E4、E6和E7的組合顯示最高的準確性；70.2％特異度下的最優操作點是71.4％(AUC＝0.71)。添加E1、CE2和E5並不改善這種效果。另外，相對於組合抗體，單獨NE2和E6的準確性良好(AUC＝0.69和AUC＝0.61；數據未顯示)。
在HPV16-陰性腫瘤患者中，E抗體陽性對於總體或無進展粗活都沒有可證明的預測價值(數據未顯示)。然而，當分析局限於HPV16-陽性腫瘤(通過PCR)的患者時，與對E抗體血清陰性的患者相比，對E抗體血清陽性的患者保持存活優勢。這種相關性在多變量調整之後保持顯著(對於總體存活，HR，0.3；95％CI，0.1-0.9，而對於無進展存活，HR，0.3；95％CI，0.1-0.8)。具體地，針對NE2、E1、和E6的抗體仍然是總體和無進展存活的強預測指標。
圖8顯示了根據復發狀態，對於HPV-陽性OPC患者，隨時間變化的E1、NE2和E6的中值抗體水平。隨機選擇的23個沒有復發的患者亞組比8個復發的患者有更高的中值抗體水平，雖然由於樣本大小太小，我們不能在統計學上檢驗組間的顯著差異。
討論
我們發現E1、NE2、和E6 HPV16抗體陽性都與整個組和具有已知HPV16-陽性腫瘤的患者中改善的總體和無進展存活強相關(P＜.05)。我們也發現，針對包被蛋白L的抗體血清陽性無法預測存活。因此，我們已經鑑定了與HPV16+OPC的改善的總體和無復發存活相關的3種HPV16-特異性抗體。該證據表明，針對參與HPV-介導的癌發生的抗原的血清應答，而不是針對感染過程(L蛋白質)而言重要的抗原的血清應答，可區別預測癌癥結果。我們的發現支持了以下結論，即癌癥結果部分取決於免疫應答，並且E抗體可以是致癌變化和預後的生物標記物。
除了評價針對E6和E7的血清應答以外(這是大多數研究的焦點)，我們評價了針對可用作存活標記物的HPV16蛋白質的更廣泛陣列的血清應答。我們之前顯示E6和E7陰性的HPV16-陽性腫瘤的患者的一小亞組對E1和NE2抗體陽性，這表明需要在HPV16血清學研究和診斷(23)中包括多種標記物。最近，我們在一項包括256個病例和250個對照的研究(數據未顯示)中顯示了E抗體陽性的個體中急劇增加的OPC風險。我們發現，對任意E抗體呈陽性的那些患者的OPC風險是對所有E抗體呈陰性的那些患者的244倍。此外，具有HPV16 DNA陽性的腫瘤的患者對任意E抗體呈陽性的可能性是具有HPV16 DNA陰性的腫瘤的患者的4倍，並且這種相關性在具有HPV16-陽性腫瘤的從未吸菸的人或輕度吸菸者的患者中特別強。
表4.治療前抗體狀態與總體和無進展存活的相關性的Cox比例風險回歸
a全部患者：針對年齡、吸菸、和治療調整；吸菸史≤10包年的患者：針對年齡和治療調整；HPV-陽性患者：針對年齡、吸菸、和T類別調整。
b全部患者：針對年齡、吸菸、和治療調整；吸菸史≤10包年的患者：針對年齡、N類別、和治療調整；HPV-陽性患者：針對年齡、吸菸、和T類別調整。
NC：由於零細胞而不可計算。
口腔人乳頭瘤病毒(HPV)
如前所述，使用PGMY 09/11引物和線印跡雜交測試了口腔衝洗樣品的36種類型的HPV DNA。簡言之，使用基於磁珠的自動化平臺(QIAsymphony SP，凱傑公司(Qiagen))從口腔剝落細胞純化DNA並且然後採用PGMY09/11PCR引物集和針對β-球蛋白的引物，之後是與RocheTM線性陣列的反向線印跡雜交來分析36種不同的HPV DNA基因型。使用相同的方法和實驗室在NHANES 2009-2010中生成口腔HPV感染數據。所有的口腔衝洗測試結果顯示β-球蛋白陽性。
如前所述，也在ABI的7300實時PCR系統(加利福尼亞州福斯特城的應用生物系統公司(Applied Biosystems，Foster City，CA))中使用TaqMan定量實時-PCR(qPCR)來評價基線口腔衝洗樣品的HPV16病毒載量。檢測口腔脫落的細胞中的HPV DNA無法區分感染性病毒顆粒與胞內DNA；即，其是否是能夠被傳播的活性HPV感染，或其是否是從DNA已經整合且無感染性的腫瘤細胞脫落的HPV DNA。
在96孔板中，通過在Anderson實驗室修改為單重試驗的可編程ELISA集中測試血液樣品(1∶100)的HPV16 L1、E6、和E7IgG抗體。蛋白質使用人HeLa細胞裂解液轉錄/翻譯(IVTT)系統(熱科學公司)表達並且用10％的通過超聲製備的大腸桿菌DH5a裂解液封閉。發光度量為與GST-抗原對照的比率的相對光單位(RLU)。陽性血清的截止值定義為健康志願者(n＝81)中觀察的RLU比率的平均+3標準偏差。
164個HPV-OPC病例基於HPV16的原位雜交(ISH)的集中測試、機構致癌HPV ISH測試(n＝66)、或機構p16免疫組化(n＝43；其中的25個已經機構PCR測試，其中88％[22/25]為HPV16-陽性)分類為HPV-陽性，考慮到ISH和p16目前在臨床條件中用於鑑定HPV-OPC。16個其他病例及其參與者基於HPV16的陰性集中測試(n＝8)或陰性局部p16(n＝8)結果從分析中排除。
使用對類別的卡方檢驗和對連續變量中值的檢驗比較有和沒有招募的參與者的病例的特徵。病例和參與者中的口腔HPV流行率與來自2009-10NHANES數據的基於群的樣品中的加權流行率相比較，限於45-65年齡的個體，以與研究參與者相容。
如果在線印跡上檢測到評價的36種HPV類型中的任一種，則口腔衝洗樣品被認為對「任意口腔HPV」是HPV陽性。「任意致癌HPV」的流行率定義為檢測到以下中的任何一種：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、或73。也使用定量PCR(qPCR)來評價HPV16陽性，其陽性使用通用實驗室截止值(2μ1的測試口腔衝洗樣品中拷貝數＞3個拷貝)定義；由於關於可能的低水平傳播的口腔HPV DNA的研究假設，也顯示當拷貝數＞0時的結果。
圖4顯示了檢測來自136個HPV-OPC病例、48個參與者、和81個健康志願者的基線血清中的HPV16 E6和E7抗體。顯示了血清中檢測到的針對特異性HPV蛋白質/對照GST蛋白質的IgG的RLU比率。
應理解雖然本發明已結合其詳述進行描述，但以上描述意在說明而不是限制本發明的範圍，該範圍由所附權利要求的範圍限定。其他方面、優勢和修改在以下權利要求的範圍內。