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一種快速純化製備Fab片段抗體的工藝方法

2023-06-02 12:35:51 1

專利名稱:一種快速純化製備Fab片段抗體的工藝方法
技術領域:
本發明屬於生物工程技術領域的蛋白質純化技術,主要涉及原核細胞和真核細胞大規模培養生產的分泌型片段抗體,尤其是一種快速純化製備Fab片段抗體的工藝方法,該方法適用於治療用抗體類藥物的生產製備尤其適用於人源化/人-鼠嵌合片段抗體的快速製備。
背景技術:
抗體治療已成為當今生物治療腫瘤、流行性和感染性疾病的重要手段。抗體類藥物以其高度的特異性、有效性和安全性成為國際藥品市場上一大類新型治療劑。隨著新的結構設計,改進了體內藥代動力學,拓寬了免疫學範圍,並使得篩選抗非敏感性靶分子抗體和蛋白質組矩陣成為可能。新的分子演化策略增強了抗體親和力、穩定性和表達水平。
到目前為止,美國FDA共批准了24個抗體藥物上市。全球有超過200家公司正在研發治療用單抗藥物,約有335個產品正在研發中,其中100多個已進入臨床研究。抗體類藥物以其高度的特異性、有效性和安全性成為國際藥品市場上一大類新型治療劑。目前在臨床試驗中基因工程抗體約佔生物製劑的30%,其中有相當一部分的小分子抗體。與整個抗體分子相比,小抗體片段如Fab或scFv在藥代動力學上表現出更好的組織穿透能力,同時由於抗原結合界面不變,抗體片段擁有全抗體分子的結合特異性。隨著重組技術的不斷完善,使抗體分子的克隆篩選、人源化以及生產能力得到進一步的革新,以抗體為基礎的藥劑設計已成為可能。重組抗體的分子體積越來越小,可被重新構建成多價分子,或與其它分子殺傷藥物相融合,如放射性核素、毒素、酶、脂質體和病毒,形成新一代的新型抗體治療藥物。
Pichia pastoris基因表達系統是一種新型外源基因表達系統,兼有原核細胞良好的可操作性及真核表達系統的許多優點,如進行蛋白質的加工、摺疊、轉錄後修飾等,而且酵母比哺乳動物細胞和病毒表達系統操作更簡單迅速,費用也更便宜。畢赤酵母利用甲醇作為唯一的碳源,它有2個醇氧化酶基因AOX1和AOX2,該基因具有很強的啟動活性,畢赤酵母表達系統正是利用該啟動子來啟動外源蛋白的表達。表達載體通過同源重組整合入酵母基因組而隨同酵母染色體一起複製。實驗證明多拷貝整合在大多數情況下可以顯著增加外源蛋白的表達水平。
鑑於酵母表達系統及其表達產物具有類似於天然蛋白,且能保持很好的生物學活性,表達條件易於控制,易於工業化生產等優勢。我們選用甲醇營養型酵母表達系統進行了抗角蛋白單鏈抗體分泌表達。查閱國內外文獻,目前應用畢赤酵母表達ScFv的報導不多,且表達量在不同的抗體有較大的差別,如Suzuki等報導用畢赤酵母表達抗表皮生長因子ScFv的表達量達到5mg/L,而Ridder等用畢赤酵母表達抗白血病抑制因子ScFv的表達量達到100mg/L。
目前,用生物反應器大規模培養生產蛋白治療藥物已成為當今生物製藥領域的主流。申請人將特異性分泌抗角蛋白單鏈抗體的酵母細胞在5L和80L規模的生物反應器中大規模培養,通過過程參數的嚴格控制,最高細胞密度達A600nm≥200,最高片段抗體分泌量≥100mg/L。
在蛋白質類生物製品尤其是抗體藥物的生產工藝中,酵母表達系統產物的分離純化難度較大,整個工藝過程中的質量控制均顯得尤為重要,快速、經濟通常是整個過程放大工藝過程的重要評價標準。
根據申請人所進行的資料檢索,檢索到和本發明相關的有以下參考文獻[1]王剛,劉玉峰,王琰等。專利人源性重組抗角蛋白基因工程抗體及其製備方法,2002,中國發明專利CN02159427.9。
CorneliaMarty,PatrickScheidegger,KurtBallmer-Hofer,etc.Production of Functionalized Single-Chain FvAntibodyFragments Binding to the ED-B Domain of the B-isoformofFibronectin in Pichia pastoris.21,156-164(2001)。
Leonardo M.Damasceno,Itzcoatl Pla,Hyun-Joo Chang,etc.An optimized fermentation process for high-levelproduction of a single-chain Fv antibody fragment in Pichiapastoris.Protein Expression and Purification 37(2004)18-26。
Harrie L.Glansbeek,Henk M.van Beuningen,Elly L.Vitters,etc.Expression of Recombinant Human Soluble Type IITransforming Growth Factor-b Receptor in Pichia pastoris andEscherichia coliTwo Powerful Systems to Express a PotentInhibitor of Transforming Growth Factor-B.Protein Expressionand Purification 12,201-207(1998)。
Warren Schwartz,David Judd,Michelle Wysocki,etc.Comparison of hydrophobic charge induction chromatographywith affinity chromatography on protein A for harvest andpurification of antibodies.908(2001)251-263。
Koichi Morimoto,Kuniyo Inouye.Single-step purificationof F(ab』)2fragments of mouse monoclonal antibodies(IgG1)byhydrophobic interaction high performance liquid chromatographyusing TSKgel Phent-5PW.J.Biochemistry BiophysicsMethods.1992,24107-117。
Gresham T.Weatherly,Anne Bouvier,Debra D.Lydiard,etc.Initial purification of recombinant botulinum neurotoxinfragments for pharmaceutical production using hydrophobiccharge induction chromatography.952(2002)99-110。
L.Steele,M.Heng,presented at Recovery of BiologicalProducts IX,Whistler,BC,Canada,May 1999。
L.Guerrier,P.Girot,W.Schwartz,E.Boschetti,Bioseparations 9(2000)211。
R.L.Fahrner,D.H.Whitney,M.Vanderlaan,G.S.Blank,Performance comparison of protein A affinity-chromatographysorbents for purifying recombinant monoclonal antibodies.Biotechnol.Appl.Biochem.30(1999)121。
王剛,劉玉峰,王琰等,在中國專利申請「人源性重組抗角蛋白基因工程抗體及其製備方法」(CN02159427.9)[1],其權利要求中對有關抗體回收純化的描述大腸桿菌表達產物經飽和硫酸銨鹽析,然後充分透析後用金屬鰲和親和層析分離表達,得到人源性抗角蛋白Fab抗體的基因工程產物,但沒有說明具體的實驗方法。
Cornelia Marty等報導利用了畢赤酵母系統表達並純化目標產物[2]。其產物純化過程是首先離心細胞培養上清以除去酵母細胞,然後採用陰離子交換層析一步純化scFv,SDS-PAGE顯示取得了比較好的效果,此方法針對於表達效果較好、翻譯以後加工比較完全的scFv,但是沒有更進一步討論翻譯後加工不完全的細胞系產品的純化問題。
Leonardo M.Damasceno等,利用畢赤酵母系統表達並純化A33ScFv[3]。其首先採用陰離子色譜初步純化,然後採用疏水色譜獲取純度高於90%的目標產物,總回收率為25%。但僅用於實驗室水平生產,而且總回收率較低,不適合進一步的放大生產。
Harrie L.Glansbeek等,用親和色譜吸附純化酵母培養產物中的TGFbsRII[4]。採用鎳柱一步純化目標產物,純度高於90%。但沒有探討其回總回收率。由於其對於產品有一定的要求(必須有His標籤),而且成本較高,因此有一定的局限性。
W.Schwartz等,比較了疏水色譜(HCIC)和親和色譜(Protein A)分離純化某些單克隆抗體的效果,結論是疏水色譜可以獲得更好的回收率,純化目標產物的純度更高[5]。
Koichi Morimoto等用疏水色譜吸附純化F(ab』)2片段抗體[6],在SDS-PAGE和膠過濾兩種方法顯示F(ab』)2在單色譜峰中有較高的均質性;Koichi Morimoto和Kuniyo Inouye用Tsk gel Phenyl-5PW疏水色譜吸附純化IgG1型F(ab』)2片段抗體,其純度達到98%,但其都在小規模實驗階段進行,尚未進入中試放大工藝生產。
Gresham T.Weatherly等,採用疏水電荷感應色譜(HCIC)從畢赤酵母培養產物中吸附純化基因同源相似性高達58%的兩種蛋白rBoNTA(Hc)和rBoNTB(Hc)[7]。報導中指出,雖然兩種蛋白基因相似性很高,可是經過計算和實驗證實兩者之間的疏水性和親水性有著比較大的區別,採用HCIC可以較好的分離兩者。L.Steele等,也採用疏水電荷感應色譜(HCIC)成功分離純化重組鹼性蛋白酶[8],L.Guerrier等採用HCIC分離純化單克隆抗體同樣取得了很好的效果[9]。其中Gresham T.Weatherly的試驗規模已經達到中試生產規模,但是上述文獻中沒有更進一步討論該方法(HCIC)的適用範圍,有一定的局限性。
在治療性抗體的純化工藝中,除考慮到產品的純度、回收率,還必需考慮的重要一點是工藝過程的質量控制,有效去除雜質包括來自宿主細胞的蛋白、DNA、抗體異構體、碎片,以及小分子和潛在的汙染物如內毒素、濾過性病毒等[10]。

發明內容
針對上述現有技術存在的缺陷或不足,申請人在以往工作的基礎上,經過長時間的摸索和大量的實驗,發明了一種快速純化製備片段抗體的工藝方法,該方法適用於原核細胞和真核細胞大規模培養物中片段抗體純化的生產,大大提高了目標產物的純度,並且工藝銜接緊密,從而保證了最短工藝周期,最大限度地保持了目的蛋白的活性,提高了生產效率,具有高效、快速、成本低、純度高、穩定、批次間結果差異小等特點。
本發明實現上述任務採用的技術方案是一種快速純化製備Fab片段抗體的工藝方法,其特徵在於,該方法採用膜過濾-疏水層析I-疏水層析II三步法純化目標產物,首先採用膜過濾分離的方式去除培養基上清中的細胞和細胞碎片,然後用分辨離率較低的疏水層析高效捕獲酵母細胞大規模培養上清液中的Fib片段抗體,並濃縮目標產物;最後用分辨離率較高的疏水層析,通過控制疏水層析的結合與分離條件,獲取純度不低於90%的Fab片段抗體。
本發明的工藝方法首次採用了參數控制,設定pH,電導,流速,壓力,溫度上/下限指標,以此標準控制各步純化,並結合AKTA層析系統配置的軟體,設置了自動操作方案,大大節省了時間、人力。本發明特別適宜真核細胞和原核細胞培養生產的基因工程產物的純化,具有穩定性好、可控性強、過程控制指標明確、可操作性強、批次間結果差異小等特點。


圖1是Fab片段抗體生產的工藝流程圖;圖2是疏水層析I色譜圖;圖3是疏水層析I電泳圖,圖中1表示酵母細胞培養上清,2表示疏水層析I洗脫峰,3為Mark,4表示疏水層析I穿過峰;圖4是疏水層析II色譜圖;圖5是疏水層析II電泳圖,圖中1為Mark,2表示疏水層析I洗脫峰,3表示疏水層析II穿過峰,4表示疏水層析II洗脫峰1,5表示疏水層析II洗脫峰2;
圖6是Fab片段抗體SEC-HPLC圖。
以下結合附圖和發明人給出的具體實施方式
對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
依照本發明的技術方案,申請人在抗人肝癌Fab片段抗體製備工藝中採用膜過濾-疏水層析I-疏水層析II三步法純化目標產物。
其中膜過濾是去除培養基上清中的細胞和細胞碎片,疏水層析I是用分辨離率較低的疏水層析高效捕獲酵母細胞大規模培養上清液中的Fib片段抗體,並濃縮目標產物;疏水層析II是用分辨離率較高的疏水層析,通過控制疏水層析的結合與分離條件,獲取純度不低於90%的Fab片段抗體。
膜過濾採用分離的方式去除培養基上清中的細胞和細胞碎片等有形物質。相比較去除有形物的其他方法(如離心法),更易於有效、嚴格地進行過程控制,以達到治療用產品的要求。
本發明考慮到原核和真核細胞培養上清中鹽濃度較高的特點,整個純化工藝的選擇疏水層析,從而替代了處理複雜、要求較高的離子交換層析和效率相對低下、過程不易放大的凝膠過濾層析。
用分辨離率較低的疏水層析高效捕獲大規模細胞培養上清液中的片段抗體,以快速濃縮目標產品;然後用分辨離率較高的疏水層析通過控制疏水層析的結合與分離條件,獲取高純度的基因工程片段抗體,最終獲取的片段抗體純度不低於90%,整個純化過程在12小時內即可完成。
整個純化工藝採用同一緩衝系統,通過改變鹽濃度的方法進行洗脫,減少了工藝過程緩衝系統置換的步驟,過程銜接緊密,節約了時間並簡化了樣品處理。整個工藝過程中,申請人就工藝過程的關鍵參數進行比較分析,如產品回收率與條件,工藝銜接與方法選擇,終產品純度與活性保持,以及工藝過程的放大,選擇最佳的參數標準等,以建立高效、快速的Fab抗體純化工藝。
具體步驟如下1)在澄清細胞培養懸液工藝中,採用膜分離,採用孔徑為0.8-1.2μm的囊式濾器進行預過濾,此步驟可除去全部的細胞及細胞碎片等固形物。
2)層析分離前的樣品加入硫酸銨調節後,再採用0.22μm孔徑的膜進行終過濾,以除去100%的雜質和細菌;3)採用疏水層析獲取目標產物。採用兩步層析,第一步採用分辨離率較低的疏水介質進行初步純化分離,第二步採用分離率較高的疏水介質進行進一步精細純化分離,獲取高純度目標產物。
4)最後採用冷凍乾燥保存目標產物。
上述每個步驟具體參數如下I預過濾流速1-2L/min,壓力0-1bar,溫度20-25℃,膜孔徑為0.8-1.2μm。
II終過濾流速1-2L/min,壓力0-1bar,溫度20-25℃,膜孔徑為0.22μm。
III樣品加入的硫酸銨濃度為0.4-0.8M,電導率50-150ms/cm,如高於此值,用平衡磷酸鹽溶液稀釋之,如低於此值,用硫酸銨調節之。
IV樣品加入硫酸銨時,必須及時攪拌混勻,加入速度控制在5-10g/min;V疏水層析流速5-20ml/min,壓力0.2-0.6,溫度20-25℃。
VI以上層析過程中緩衝系統(A)為無機酸緩衝系統+硫酸銨,其中無機酸緩衝系統濃度為0.01-0.05M,硫酸銨濃度為0-1M,pH7.0-8.0。
以下申請人給出對畢赤酵母細胞分泌的基因工程片段抗體Fab進行製備的具體實施例,需要說明的是,該實施例只是一個較優的例子,本發明不限於該實施例。
參見圖1,首先,復甦穩定高分泌外源基因的巴氏畢赤酵母菌株。(人源性重組抗角蛋白基因工程抗體及其製備方法CN02159427.9)。
其次,採用分步法誘導表達的方式來培養、誘導表達目標產物,具體方式為①菌體生長階段工程菌株在添加甘油等碳源的簡單培養基中分批培養以積累生物量;②分批流加的過渡階段此階段中,向培養基中流加甘油作為生長抑制因子來進一步積累生物量,為誘導表達作準備;③誘導階段向培養基中緩慢添加甲醇,使酵母在適應甲醇濃度變化的過程中啟動外源蛋白的合成。從而獲取基因工程片段抗體Fab。其中菌體生長階段在三角燒瓶中進行,然後將細菌無菌接種到5L生物反應器中開始誘導表達,過程中嚴格控制溫度、pH、甘油濃度、甲醇濃度等參數,最高細胞密度達A600nm≥200,最高片段抗體分泌量≥100mg/L。
培養結束後,採用膜過濾-疏水層析I-疏水層析II三步法純化目標產物。首先膜過濾分離的方式去除培養基上清中的細胞和細胞碎片等有形物質,然後控制疏水層析的結合與分離條件,從而獲取高純度的基因工程片段抗體Fab。
本發明的工藝用連續純化過程獲取Fab片段抗體,其工藝過程主要分以下幾步1.膜過濾分離去除100%的細胞及細胞碎片等有形物。
2.疏水層析I濃縮目標產物,初步純化。
3.疏水層析II獲取高純度、無菌、無熱源、高活性Fab片段抗體。
4.產品鑑定包括無菌試驗、熱源質實驗、回收率計算、純度分析等。
以下進一步給出詳細的工藝過程一、膜過濾分離(1)過濾分離系統10英寸濾殼,0.8μm-1.2μm囊式濾芯(sartorius公司);蠕動泵YZ35,矽膠管(保定蘭格泵有限公司)。
(2)以1-2L/min的流速過濾酵母細胞培養上清,除去細胞及細胞碎片,過濾分離系統進口壓力控制0-1bar,出口壓力控制0-0.5bar;溫度10-25℃。
二、疏水層析I(1)過濾後的培養上清中,加入固體硫酸銨0.5-0.8M,加入速度控制在5-10g/min。調節電導率為50-150ms/cm。如低於此值,則用硫酸銨調節之。
(2)採用囊式濾芯0.22μm(sartorius公司),其餘材料同上述,過濾處理後的樣品,流速1-2L/min,壓力0-1bar,溫度20-25℃。
(3)純化系統AKTA purifier-100(GE Healthcare公司);色譜柱XK26/20(GE Healthcare公司);層析介質Phenyl SepharoseHigh Performance(GE Healthcare公司)。
(4)A液0.4-0.8M硫酸銨,10-50mmol/l磷酸鹽緩衝液pH7.0-8.0;B液10-50mmol/l磷酸鹽緩衝液pH 7.0-8.0。
(5)溫度10-25℃。以平衡A液充分平衡疏水柱,待280nm的紫外吸收回到基線和電導、pH保持穩定時開始上樣,上樣完畢後再以平衡A液衝洗去未結合蛋白,待280nm的紫外吸收回到基線和電導、pH保持穩定後,用B液直接洗脫,收集洗脫峰。
三、疏水層析II(1)疏水層析I洗脫液中加入固體硫酸銨0.5-0.8M,加入速度控制在5-10g/min。調節電導率為50-150ms/cm。如低於此值,則用硫酸銨調節之,並用0.22μm微孔濾器(sartorius公司)過濾之,溫度20-25℃。
(2)純化系統AKTA purifier-100(GE Healthcare公司);色譜柱XK26/20(GE Healthcare公司);層析介質PPG 600(TOSOHBioscience公司)。
(3)A液0.4-0.8M硫酸銨,10-50mmol/l磷酸鹽緩衝液pH7.0-8.0;B液10-50mmol/l磷酸鹽緩衝液pH 7.0-8.0。
(4)溫度10-25℃。以平衡A液充分平衡疏水柱,待280nm的紫外吸收回到基線和電導、pH保持穩定時開始上樣,上樣完畢後再以平衡A液衝洗去未結合蛋白,待280nm的紫外吸收回到基線和電導、pH保持穩定後,用40%-70%B液直接洗脫,收集洗脫峰1,用100%B液直接洗脫,收集洗脫峰2,洗脫峰1即為Fab片段。
四、產品鑑定a.Fab片段無菌試驗、熱原質檢測純化的Fab用RPMI-1640培養液〔含150ml/L小牛血清〕培養72h,倒置顯微鏡觀察有無細菌生長,熱原質檢測採用鱟試劑法。
b.回收率測定ELISA法測定層析前後目標蛋白濃度。依下式計算回收率 c.Fab片段純度測定純化的Fab,採用SDS-PAGE,在非還原條件下進行電泳,電泳結果經考馬斯亮藍R-250染色後,用上海復日圖像分析系統掃描,並採用SmartView軟體分析,據Fab片段佔所有區帶總面積的百分比計算Fab片段的純度。
五、結果1.疏水層析I濃縮初純結果a.由圖2、3知,通過疏水層析I雜蛋白和培養基成分在穿過峰中,基本沒有目標蛋白損失,目標蛋白(Fab片段抗體)均在洗脫峰中而且被明顯濃縮(經計算可濃縮20倍)和初步純化。
b.此步回收率為90%-99%。
2.疏水層析II濃縮精純結果a.由圖4、5知,通過疏水層析II少量殘留雜蛋白在穿過峰中,目標蛋白(Fab片段抗體)在洗脫峰中被明顯分離純化,電泳純度達到90%。並且被再次濃縮(經計算可濃縮10倍以上)。
b.由圖6知,通過疏水層析II得到了Fab片段抗體,SEC-HPLC純度達90%。
c.此步回收率為80%-90%。
d.兩步純化總回收率達70%以上。
3.Fab片段抗體細菌及熱原質檢測結果按本發明的方法製備的Fab片段抗體培養72h,鏡下未見細菌生長,鱟試劑法檢測熱原質為陰性。
權利要求
1.一種快速純化製備Fab片段抗體的工藝方法,其特徵在於,該方法採用膜過濾-疏水層析I-疏水層析II三步法純化目標產物,首先採用膜過濾分離的方式去除培養基上清中的細胞和細胞碎片,然後用分辨離率較低的疏水層析高效捕獲酵母細胞大規模培養上清液中的Fib片段抗體,並濃縮目標產物;最後用分辨離率較高的疏水層析,通過控制疏水層析的結合與分離條件,獲取純度不低於90%的Fab片段抗體。
2.如權利要求1所述的方法,其特徵在於,具體包括以下步驟(1)膜過濾分離採用過濾分離系統去除全部的細胞及細胞碎片,以1L/min~5L/min的流速過濾酵母細胞培養上清,除去細胞及細胞碎片,膜孔徑為0.45-1.2μm;過濾分離系統進口壓力為0-1bar,出口壓力為0-0.5bar;溫度10-25℃;(2)疏水層析I將目標產物濃縮後置入純化系統進行初步純化,初步純化的過程參數為a.樣品處理過濾後液體中加入固體硫酸銨0.4-1M,加入速度控制在5-20g/min之間,調節電導率為50-150ms/cm,以0.22μm孔徑膜過濾;b.吸附條件用緩衝系統A充分平衡層析柱後直接上樣,流速1-30ml/min,壓力0-6bar,溫度10-25℃;上述緩衝系統A為無機酸緩衝系統+硫酸銨,其中無機酸緩衝系統濃度為0.01-0.05M,硫酸銨濃度為0-1M,pH 7.0-8.0;c.解吸附條件用緩衝系統A直接洗脫,收集洗脫峰,流速1-30ml/min,壓力0-6bar,溫度10℃-25℃;(3)疏水層析II獲取高純度、無菌、無熱源、高活性Fab片段抗體,其過程參數為a.樣品處理疏水層析I收集的洗脫峰中加入固體硫酸銨0.4-1M,調節電導率為50-150ms/cm,0.22μm膜過濾澄清;b.吸附條件用緩衝系統A充分平衡層析柱後直接上樣,流速0-30ml/min,壓力0-6bar,溫度10℃-25℃;c.解吸附條件用緩衝系統A等度洗脫,收集洗脫峰,流速1-30ml/min,壓力0-6bar,溫度10℃-25℃;(4)經冷凍乾燥保存目標產物,即可得到純度不低於90%的Fab片段抗體。
全文摘要
本發明公開了一種快速純化製備片段抗體的工藝方法,該方法採用膜過濾-疏水層析I-疏水層析II三步法純化目標產物,首先採用膜過濾分離的方式去除培養基上清中的細胞和細胞碎片,然後用分辨離率較低的疏水層析高效捕獲酵母細胞大規模培養上清液中的片段抗體,並高度濃縮目標產物;最後用分辨離率較高的疏水層析,通過控制疏水層析的結合與分離條件,獲取純度不低於90%的片段抗體,整個純化過程在12小時內即可完成。特別適宜真核細胞和原核細胞培養生產的基因工程產物的純化,具有穩定性好、可控性強、過程控制指標明確、可操作性強、批次間結果差異小等特點。
文檔編號C07K16/18GK1908006SQ200610104480
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月7日 優先權日2006年8月7日
發明者米力, 唐浩, 申小梅 申請人:陳志南

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專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀