捲菸煙氣導致dna氧化損傷產生8-羥基脫氧鳥苷的測定評價方法及其應用的製作方法

2023-12-06 08:09:26 1

專利名稱：捲菸煙氣導致dna氧化損傷產生8-羥基脫氧鳥苷的測定評價方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及巻煙煙氣毒理學研究領域，尤其涉及巻煙煙氣導致DNA氧化損 傷產生8-羥基脫氧鳥苷的測定評價方法和應用。
背景技術：
吸菸可產生大量的自由基、活性氧(ROS)，多環芳烴類物質，經CYP1A1 活化成親電子化合物，可攻擊DNA，形成共價的DNA加合物，引起DNA鹼基錯 配，DNA單鏈或雙鏈斷裂，導致DNA損傷，最終導致癌變(Poulsen, HE.， Oxidative DNA modifications, 7bx/co/.屍W/w/., 2005, 57, 161-169.) 。 DNA損傷與癌症、 阿爾茨海默氏症和正常衰老過程等人類一切變化均有關聯，DNA氧化損傷產物 是指由ROS損傷DNA而產生的DNA加合物。在現已發現的二十幾種DNA氧化損 傷產物中，鳥嘌呤由於擁有的分子軌道具有較高的能級，因此最容易被氧化損 傷，生成化學性質比較穩定的修飾核苷8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)。在複製過程 中，DNA鏈上8-OH-dG可以與C以外的其它鹼基配對形成點突變，被認為是氧 化應激因素致癌、致突變的主要機理之一。(徐永俊，徐順清，DNA氧化損傷 生物標誌物8-OH-dG的檢測及其在醫學中的應用，蘑,驊 資，2002， 14， 50-53)、(王雲南，呂嘉春，曾波航等，8-羥基-脫氧鳥苷在肺癌發生和人支氣管 上皮細胞癌變過程中的作用中的作用，^房^T會/廢^; 2004， 20， 100-103。)。
由於8-OH-dG在體內能穩定存在， 一旦形成不再被機體進一步代謝；而且 8-OH-dG不能由細胞內外的dG通過非DNA氧化途徑形成，組織細胞核DNA 及線粒體DNA中8-OH-dG，可反應體內DNA氧化損傷。因此，8-OH-dG可以 作為反映內源及外源因素對DNA氧化損傷的靈敏和穩定的生物標記物，能夠用 來估計癌症等多種疾病發生的危險性。各種致氧自由基形成物如Fenton型羥基
自由基系統、X射線、y射線、香菸焦油、香菸煙霧中的多環芳烴和菸草咀嚼殘 渣、石棉、氧化不飽和脂肪酸、柴油廢氣顆粒、化學致癌物如氧化物酶體系、
黃曲酶毒素B1(AFB1)、 N-亞硝基二乙胺等許多物質可經由不同的機理導致 8-OH-dG的形成。在體內/外實驗中，通過檢測上述物質處理後的細胞或動物組 織的8-OH-dG水平，可以評價這些物質的致癌性。對人體組織的研究也提示， 分析人體白細胞、器官組織和尿液等標本的8-OH-dG水平可以評價個體腫瘤發 生的危險性和研究與氧自由基有關的疾病。最新的研究熱點有襲著革等人(襲 著革，李官賢，孫詠梅等，烹調油煙霧誘導核酸氧化損傷及其標誌物8-羥基脫 氧鳥苷的形成機制，翠裙與潛蘑染志2003， 20， 259-262)研究了烹調油煙體 外染毒小牛胸腺DNA，發現油煙冷凝物和揮發性有機物均能誘導DNA氧化損 傷產生8-OH-dG;孫詠梅等人發現大氣混雜汙染物體外染毒小牛胸腺DNA，能 誘導DNA氧化損傷產生8-OH-dG; MikhailovaM等人和Hirano T等人發現鎘 離子的存在能顯著增加8-OH-dG的含量。Rusling JF研究小組發表了一系列研究 工作，利用電化學法監控8-OH-dG的水平體外評價多種化學物質的毒性；孟紫 強等人發現吸菸能誘發淋巴細胞DNA的氧化損傷，顯著增加細胞DNA中 8-OH-dG的含量，其中高敏感人群中吸菸者比不吸菸者8-OH-dG的含量可升高 5倍以上，大大增加了基因突變甚至癌變的機率。Traber等人發現補充某些營養 素能顯著抑制吸菸引起的DNA損傷。
體外研究也表明香菸煙霧中產生的大量超氧自由基和羥自由基能與小牛 胸腺DNA反應，產生大量的加合物8-OH-dG， 8-OH-dG的水平可以作為香菸 煙霧暴露水平及其對DNA損傷的生物學標誌物，可用於環境汙染物與人類健 康危險性評價研究。Phillips等於1988年在《Nature》雜誌上提出吸菸可導致肺 組織DNA加合物水平升高。香菸煙霧在體外就可產生大量的超氧自由基((V)
和羥自由基(—OH),在分子水平上直接進攻DNA而產生大量的8_OH-dG或形 成其它的DNA損傷形式，如DNA單鏈斷裂(SSB)， DNA雙鏈斷裂(DSB)、交聯
等。8-OH-dG生成量在一定程度上反應了 DNA受損傷的程度。Pilger等研究表 明，和不吸菸的人群相比，吸菸人群尿中的8-OH-dG濃度明顯著升高。孫詠梅 等以DNA加合物8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)作為DNA氧化損傷的生物學標誌 物，研究了香菸煙霧成分對DNA生物氧化損傷。
中草藥是我國的傳統藥物，在我國經過上千年的實踐應用，具有高效、安 全等特性，特別是很多中草藥提取物在抗氧化、清除自由基保護機體免受傷害 等方面具有重要作用。它對許多疾病有良好的療效，它對許多疑難雜症的治療 效果遠遠好於西藥，因此它日益受到全世界的關注，成為新的研究熱點。通過 研究中草藥對巻煙煙氣導致的DNA氧化損傷的保護作用，開發和利用高效安全 的中草藥製劑，降低煙氣對機體DNA的氧化損傷，無疑具有十分重要的社會效 益和經濟意義。

發明內容
本發明的一個目的是建立巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定 評價方法。本發明的另外一個目的是採用上述的方法用來檢測篩選中草藥對巻 煙煙氣對DNA損傷的保護作用，研製和開發高效安全的中草藥製劑降低巻煙的 危害，為研製低危害巻煙提供理論支持。
為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案 巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評價方法，該方法包括 以下的步驟
① 共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；
② 加入巻煙煙氣或煙氣吸收液，體外染毒固定化的DNA;③磁珠分離去除煙氣或煙氣吸收液組分，保留氧化損傷的DNA;
加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；
⑤ 加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；
⑥ 加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測煙氣損傷產生的8-OH-dG。 作為優選，上述的8-OH-dG抗體為羊抗8-OH-dG，酶標第二抗體為HRP標
記兔抗羊IgG。羊抗8-OH-dG先與磁珠表面DNA氧化損傷產生的標誌物 8-OH-dG特異性結合，然後磁珠表面結合的羊抗8-OH-dG與HRP標記的兔抗羊 IgG特異性結合進行第二步免疫反應，通過HRP催化的魯米諾與過氧化氫反應 產生的發光信號強度表徵結合在磁珠表面HRP的量，間接檢測與HRP間接相連 的DNA氧化損傷產生的標誌物8-OH-dG。
作為優選，上述的步驟①為取羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液洗滌，磁座分 離，吸去上清液；將洗滌後的羧基修飾的磁珠分散在溶有EDC的咪唑溶液中， 於恆溫振蕩器中；反應後，將反應混合物平分於離心管中；然後在離心管中加 入DNA，在恆溫振蕩器中反應；取出用洗滌液和水各洗一次後，每管加入封閉 液I,恆溫振蕩器中反應；取出洗滌。
作為優選，上述的步驟②為在樣品中加入煙氣氧化6 12h;氧化後的樣品 用PBS洗滌後，用封閉液II封閉，磁座分離，吸出上清液。
作為優選，上述的步驟④加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液,恆溫振蕩器中反應; 步驟⑤洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS溶液，同樣於恆溫振蕩 器中反應，洗滌液洗滌。作為再優選，上述的步驟③羊抗8-OH-dG的稀釋倍數 為75000 150000倍；HRP標記兔抗羊IgG的稀釋倍數為10000 40000倍。
作為優選，上述的步驟②煙氣吸收液的製備方法為煙氣通過濾片後氣相部 分用吸收液吸收；粒相物收集到濾片，然後將收集粒相物的濾片放入吸收液中，
超聲，離心，取上清液後待用。作為再優選，上述的吸收液採用(1)水；(2) PBS (pH7.2-7.4， O.IM， 0.9%的NaCl) ; (3) PBS-TW(PBS中含0.05%吐溫 20); (4) PBS(K十)(pH7.4， 50mM，含K+及0.9%的NaCl); (5) PBS(K+)-TW(含 0.05%吐溫20)。最優選的吸收液採用磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液(PBS-TW)。
本發明的另外一個目的是提供上述的測定評價方法用於有效降低DNA氧化 損傷產生8-0H-dG的中草藥的篩選。
上述的篩選方法是在歩驟②加入巻煙煙氣或煙氣吸收溶液之前加入中草藥 溶液。
本發明由於採用了上述的技術方案，可以檢測巻煙煙氣對DNA的損傷，並研 究了損傷產生8-OH-dG的信號與巻煙煙氣量的關係。該方法可以用來檢測篩選中 草藥對巻煙煙氣對DNA損傷的保護作用，研製和開發高效安全的中草藥製劑降 低巻煙的危害，為研製低危害巻煙提供理論支持。


圖l為本發明的原理圖。
圖2為不同煙氣及煙焦油吸收液對檢測信號影響圖表。 圖3為煙氣吸收液濃度對DNA損傷的影響圖表。 圖4為葛根素與大黃素對煙氣引起DNA氧化損傷的影響圖表。
具體實施例方式
實施例l巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產牛8-OH-dG的測定 一、試劑與儀器
所有試劑均為分析純，實驗用水為去離子超純水。pH6.0的咪唑緩衝液；0.1M 的PBS，pI^7.2-7.4;洗滌液為含有0.1。/。的吐溫20的PBS;封閉液I為40mM甘氨 酸，P/。BSA的咪唑緩衝液；封閉液II為10n/oBSA的PBS。
N-(3-二甲基氨丙基)-N，-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購於Sigma公司；HRP 標記兔抗羊IgG購於北京博奧森生物技術有限公司；羊抗8-OH-dG購於abcam公 司；HRP化學發光試劑盒購於Mmpore公司；羧基修飾的磁性微球(1.5|am， Bangs Laboratories, Inc.) ; DNA(5，-GCC AAC AGC CAG TGG GAA ACA AAA AAA AAA-NH2-3，)，由上海英駿生物技術公司合成。煙氣由Borgwaldt Technik公司 的RM1/Plus吸菸機製得。
BPCL微弱發光測量儀(中國科學院生物物理研究所)；HZ-9211K恆溫振蕩 器(太倉市科教器材廠)。 二、檢測的方法
1、 煙氣製備
將巻煙置於溫度(22士1)。C、相對溼度(60士2)。/。的環境中平衡48h，挑選在平均 重量士0.02g和平均吸阻士49Pa範圍內的煙支為測試樣品。在溫度(22土2)。C、相對 溼度(60士5)。/。的環境中及按ISO3308標準抽吸條件用吸菸機抽吸巻煙，每60s抽吸 一次，每次抽吸持續2s，抽吸體積為35mL,。每個濾片收集5支巻煙的煙氣粒相 物。煙氣按所需量通入到PBS-TW(PBS中含0.05 /。吐溫20)煙氣吸收液中，同樣將 收集粒相物的濾片放入上述收集液中，超聲，離心，取上清液後稀釋待用。
2、 反應體系及方法
將羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液洗滌，磁座分離，吸去上清液，如此重複 三次。將其分散在溶有EDC的咪唑溶液中，於37t:的恆溫振蕩器中。反應20min 後，將反應混合物平分於12個離心管中，每管中加入lpmol的DNA，在37。C恆溫 振蕩器中反應60min。取出用洗滌液和水各洗一次後，每管加入100^iL封閉液I ， 於恆溫振蕩器中反應60min。取出用洗滌液和水各洗滌一次；在樣品中加入相應 的100pl煙氣吸收溶液，氧化9-10h。氧化後的樣品用PBS洗滌三次後，用封閉液
n封閉60min，磁座分離，吸出上清液，加入抗8-OH-dG的PBS溶液(含2。/。BSA)， 37'C恆溫振蕩器中反應60min。洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS 溶液(含2。/。BSA)，同樣於37。C恆溫振蕩器中反應60min，洗滌液洗滌三次。用 HRP化學發光試劑盒於化學發光儀檢測，發光信號由相連的工作站顯示並記錄。 實施例2煙氣吸收液的選擇
選擇煙氣吸收液涉及到氣液相溶的問題,雖有文獻報導用DMSO收集煙氣， 但DMSO濃度過大會對DNA有毒性，故本實驗選擇條件溫和的水相溶劑。為增 加煙氣中脂溶性成分在水相中的溶解性，在PBS中加入吐溫，同時吐溫的加入使 得煙氣通過吸收液時形成小的氣泡，增加了煙氣和吸收液的作用時間，使得吸 收更加充分。考察了 (1)水；(2) PBS (pH7.2-7.4， O.IM， 0.9。/。的NaCl); G)PBS-TW(PBS中含0.05o/。吐溫20); (4)PBS(K+)(pH7.4， 50mM，含K+及0.90/。 的NaCl); (5) PBS(K+)-TW(含0.05。/。吐溫20)等五種煙氣吸收液對檢測信號強度 的影響，如圖2所示，PBS溶液對焦油的溶解性能不好，導致對DNA的損傷不充 分，而加了吐溫的吸收液對DNA的損傷明顯增加，各種吸收液中以PBS-TW的吸 收液檢測信號最高，說明PBS-TW對煙氣及煙焦油有相對較強的溶解能力，吸收 效果最好。故本發明中最優選的煙氣吸收液選擇PBS-TW。 實施例3 不同煙氣吸收液濃度對DNA損傷的影響
PBS-TW煙氣吸收液在反應體系中的含量對DNA損傷產生8-OH-dG的影響。 如圖3所示，吸收液濃度越大，煙氣量越多，攜帶活性物質含量越高，對DNA損 傷越嚴重，理論上產生的8-OH-dG量也會增多，但圖中顯示煙氣量超過2ml/mL PBS-TW以後信號降低，說明過量的氧化劑使得DNA受損嚴重以致鏈斷裂，導致 產生的8-OH-dG損失增多。研究同時發現，煙焦油對DNA的氧化損傷也呈現類 似趨勢。
實施例4 將實施例l所建立的方法應用於中草藥對吸菸導致DNA氧化損傷 的保護作用研究
分別考察了幾種中草藥對煙氣引起DNA氧化損傷的影響。以葛根素與大 黃素為例(如圖4)，對照組為實施例l測得的數據，中草藥組為在加入煙氣吸 收溶液之前加入中草藥溶液。由圖4可以看出，加入葛根素與大黃素反應組，產 生的8-OH-dG均比對照組的少，說明這兩種中草藥對巻煙煙氣導致的DNA氧 化損傷有一定的保護作用。
權利要求
1. 捲菸煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評價方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟①共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；②加入捲菸煙氣或煙氣吸收液，體外染毒固定化的DNA；③磁珠分離去除煙氣或煙氣吸收液組分，保留氧化損傷的DNA；④加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；⑤加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；⑥加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測煙氣損傷產生的8-OH-dG。
2. 根據權利要求1所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評 價方法，其特徵在於8-OH-dG抗體為羊抗8-OH-dG，酶標第一抗體為HRP 標記兔抗羊IgG。
3. 根據權利要求1或2所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測 定評價方法，其特徵在於步驟①為取羧基修飾的磁珠用咪唑緩衝液洗滌， 磁座分離，吸去上清液；將洗滌後的羧基修飾的磁珠分散在溶有EDC的咪 唑溶液中，於恆溫振蕩器中；反應後，將反應混合物平分於離心管中；然後 在離心管中加入DNA，在恆溫振蕩器中反應;取出用洗滌液和水各洗一次後， 每管加入封閉液I,恆溫振蕩器中反應；取出洗滌。
4. 根據權利要求1或2所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測 定評價方法，其特徵在於步驟②為在樣品中加入煙氣或煙氣吸收液氧化6 12h;氧化後的樣品用PBS洗滌後，用封閉液II封閉，磁座分離，吸出上清 液。
5. 根據權利要求2所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評 價方法，其特徵在於步驟④加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液,恆溫振蕩器中 反應；步驟(D洗滌液洗滌，再加入HRP標記兔抗羊IgG的PBS溶液，同樣 於恆溫振蕩器中反應，洗滌液洗滌。
6. 根據權利要求2或5所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測 定評價方法，其特徵在於羊抗8-OH-dG的稀釋倍數為75000 150000倍； HRP標記兔抗羊IgG的稀釋倍數為10000 40000倍。
7. 根據權利要求1或2所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測 定評價方法，其特徵在於步驟②煙氣吸收液的製備方法為煙氣通過濾片後 氣相部分用吸收液吸收；粒相物收集到濾片，然後將收集粒相物的濾片放入 吸收液中，超聲，離心，取上清液後待用。
8. 根據權利要求7所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評 價方法，其特徵在於吸收液採用磷酸鹽緩衝液-吐溫溶液。
9. 根據權利要求1或2所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測 定評價方法用於有效降低DNA氧化損傷產生8-OH-dG的中藥的篩選。
10. 根據權利要求9所述的巻煙煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評 價方法用於有效降低DNA氧化損傷產生8-OH-dG的中藥的篩選，其特徵在 於在步驟②加入巻煙煙氣或煙氣吸收溶液之前加入中草藥溶液。
全文摘要
本發明涉及捲菸煙氣毒理學研究領域，尤其涉及捲菸煙氣導致DNA氧化損傷產生8-羥基脫氧鳥苷的測定評價方法和應用。捲菸煙氣導致DNA氧化損傷產生8-OH-dG的測定評價方法，該方法包括以下的步驟共價鍵固定DNA在磁珠微球表面；加入捲菸煙氣或煙氣吸收液，體外染毒固定化的DNA；磁珠分離去除煙氣或煙氣吸收液組分，保留氧化損傷的DNA；加入8-OH-dG抗體，與氧化損傷產生的8-OH-dG發生免疫反應；加入酶標第二抗體，與上述得到的產物反應；加入發光底物，高靈敏度化學發光法檢測煙氣損傷產生的8-OH-dG。本發明可以檢測捲菸煙氣對DNA的損傷，可以用來檢測篩選中草藥對捲菸煙氣對DNA損傷的保護作用，研製和開發高效安全的中草藥製劑降低捲菸的危害，為研製低危害捲菸提供理論支持。
文檔編號G01N33/543GK101382544SQ200810121850
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月30日 優先權日2008年10月30日
發明者儲國海, 盧建忠, 周國俊, 陳紅君, 黃芳芳 申請人:浙江中煙工業有限責任公司