一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法
2023-11-01 15:32:02
專利名稱：一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離純化蛋白質的方法，具體地是涉及一種使用鹽析和透析法分 離純化貽貝粘蛋白的方法。
背景技術：
貽貝粘蛋白(Mussel adhesive protein, MAP)，也叫紫貽貝足絲蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)來自海洋貝類紫貽貝，M;^7^e^to，它有在近海耐受波浪影響的 能力，它在特殊腺體內生成和儲存一種蛋白膠，通過足絲釋放到巖石一類的固體表面 上，形成抗水的結合，從而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，蛋白膠形成了斑，從 斑延伸開，有很強的抗張強度(106-10、ewtoirmetef2)，而斑內物質包含了貽貝粘蛋 白MAP。
貽貝粘蛋白含有L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶對酪氮酸殘基 的作用形成。L-DOPA殘基由於氧化反應而相互交聯，交聯反應導致了貽貝和特殊表 面纖維內強而持久的膠接，其生物粘附的機理很有趣。貽貝粘蛋白粘附對人沒有毒性 和免疫原性，結合能力和壽命不受水的影響，作為醫用手術尤其是眼科手術膠己經引 起注意。
全世界每年進行1100萬例白內障手術，我國白內障的發病率非常高，50歲以上 人群中白內障發病率29.64%， 70歲以上人群發病率高達60%。隨著社會老齡化的加 劇，這一數字還會i:升。目前醫生可以用兩種閉和方式結束眼科手術讓傷口自行愈 合或是用尼龍線縫合切口，每種閉合方法都各有缺點自愈有感染和眼內液體洩露的 危險；縫合會有感染髮炎及血管發育異常的危險。而貽貝粘蛋白貽貝粘蛋白能在低濃 度下交聯，並形成可注射到不規則形狀部位的低粘性液體，這種溶液可凝固而填充到 指定空間，在幾分鐘內可封閉切口，少於縫合所需時間。貽貝粘蛋白還形成了一個不 可破壞的封條，在大於正常人眼壓12倍的壓力下不會使眼內液體發生洩露。貽貝粘蛋 白具有和眼角膜近似的折射率，不會干擾光線到達視網膜。另外，貽貝粘蛋白的生物降解性質使其對環境很友好，也可用於其他領域，如通 用的生化粘接試劑、醫用組織粘接及密封劑，醫用愈傷基質，牙醫粘接和密封劑，醫 用設備表面塗層試劑，水下作業設備塗層等。
鹽析和透析是利用蛋白質的物理化學性質，以非色譜的方法進行純化，設備成本 低、實驗材料成本低、耗時少、獲得的目標產品濃度高勿需濃縮。
發明內容
本發明的目的在於克服色譜方法純化貽貝粘蛋白設備和材料成本高的問題，採用 鹽析和透析的方法，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。 本發明的目的是通過如下的技術方案實現的。
本發明提供的使用鹽析和透析為核心的分離純化貽貝粘蛋白的方法，包括如下步
驟
1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻 懸浮於提取溶劑中；
2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 pm濾膜過濾去除殘渣，保留上
清；
3) 用1-6倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C F鹽析1-6 h;
4) 4°C， 10000-15000 rpm下離心3-10 min，收集沉澱，用1-3%的乙酸溶解;
5) 4。C， 10000-15000 rpm離心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶
解；
6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4 。C保存；
7) 從分子量的角度鑑定貽貝粘蛋白採用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標準蛋 白質標記，確認目標蛋白質分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(NBT)特異性染色鑑定貽貝粘蛋白採用12-20%濃度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液採用四氮唑藍-氨基
乙酸溶液(pH10)， 10-25 。C染色1-3 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；
9) 用C8反相鍵合相矽膠色譜柱或Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以 乙腈-水為流動相等度洗脫，280 nm檢測。本發明提供的使用以鹽析和透析為核心的分離純化貽貝粘蛋白的方法，提供了一 種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。
具體實施例方式
實施例l、以高氯酸提取、鹽析和透析分離貽貝粘蛋白
1) 以0.5%高氯酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300 ml提取溶劑，25°C浸提10 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻懸浮於提取溶劑中；
2) 以10000 r/min離心30 min去除殘渣，保留上清；
3) 用2倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C下鹽析1-6 h;
4) 4'C， 10000rpm下離心3min，收集沉澱，用2%的乙酸溶解；
5) 4°C，10000 rpm離心3 min去除其中不溶成分用2%的乙酸再次溶解；
6) 用2。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 5 h， 4。C保存；
7) 從分子量的角度鑑定貽貝粘蛋白採用15%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，25。C染色2h，以高分子量標準蛋白質標 記，確認目標蛋白質分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(NBT)特異性染色鑑定貽貝粘蛋白採用15%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色-,
9) 用C8反相鍵合相矽膠色譜柱分析貽貝粘蛋白純度C8色譜柱4.6x250 mm， 5pm， 300A，以乙腈-水(10-90)為流動相等度洗脫，280nm檢測。
實施例2、以乙酸提取、鹽析和透析分離貽貝粘蛋白
1) 以10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加1000 ml提取溶劑，25°C浸提，20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻懸浮於提取溶劑中；
2) 以45pm濾膜過濾去除殘渣，保留上清；
3) 用3倍體積的10 M的氯化鈉在25 。C下鹽析6 h;
4) 4'C， 15000rpm下離心3 min，收集沉澱，用3%的乙酸溶解；
5) 4'C， 15000 rpm離心3 min去除其中不溶成分用3%的乙酸再次溶解；
6) 用3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 10 h， 4。C保存；7) 從分子量的角度鑑定貽貝粘蛋白採用12%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE),硝酸銀染色，25。C染色2h，以高分子量標準蛋白質標 記，確認目標蛋白質分子量為130kD;
8) 四氮唑藍(NBT)特異性染色鑑定貽貝粘蛋白採用12%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；
9) Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以乙腈-水(15-85)為流動相等度洗 脫，280nm檢測。
權利要求
1、一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。
2、 如權利要求1所述的使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法，包括如下的 步驟1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min,使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻 懸浮於提取溶劑中；2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 pm濾膜過濾去除殘渣，保留上清；3) 用1-6倍體積的6-12 M的氯化鈉在15-25 。C下鹽析1-6 h;4) 4°C， 10000-15000 rpm下離心3-10 min，收集沉澱，用1-3%的乙酸溶解；5) 4°C， 10000-15000 rpm離心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶解；6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4。C保存-，7) 從分子量的角度鑑定貽貝粘蛋白採用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標準蛋 白質標記，確認目標蛋白質分子量為130 kD;8) 四氮唑藍(NBT)特異性染色鑑定貽貝粘蛋白採用12-20%濃度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯醯胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液採用四氮唑藍-氨基乙酸溶液(pH10)， 10-25。C染色l-3h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色；9) 用C8反相鍵合相矽膠色譜柱或Source聚苯乙烯柱分析貽貝粘蛋白純度以 乙腈-水為流動相等度洗脫，280 nm檢測。
全文摘要
本發明涉及一種使用鹽析和透析分離純化貽貝粘蛋白的方法。鹽析和透析是利用蛋白質的物理化學性質，以非色譜的方法進行純化，克服色譜方法純化貽貝粘蛋白設備和材料成本高的問題，提供一種快速、低成本、高濃度的貽貝粘蛋白分離純化方法。採用強酸提取，以鹽析和透析進行純化，採用乙酸-尿素-聚丙烯醯胺凝膠電泳，通過四氮唑藍特異性顯色鑑別貽貝粘蛋白，以反相色譜定量純度。
文檔編號C07K14/435GK101585874SQ20091008756
公開日2009年11月25日 申請日期2009年6月30日 優先權日2009年6月30日
發明者孟桂鳳, 邢思亮 申請人:北京康銘優盛生化技術有限公司