一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的製備方法
2023-11-01 01:26:37 2
一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，包括：（1）製備肺炎克雷伯菌的菌懸液；（2）製備固定化載體混合水溶液；（3）將上述菌懸液和固定化載體混合水溶液混合後攪拌均勻後，-5～5℃下用注射器滴加到不斷攪拌的CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交聯5～6h後用生理鹽水衝洗4～5次，即得肺炎克雷伯菌固定化小球。本發明的製備方法簡單，得到的肺炎克雷伯菌固定化小球可用於氨氮廢水處理。
【專利說明】一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物固定化【技術領域】，特別涉及一種肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的固定化小球製備方法。
【背景技術】
[0002]隨著近些年水體富營養化現象的加劇，脫氮成為廢水處理研究中的重要課題。在廢水生物處理系統中，主要是利用微生物的硝化-反硝化作用來去除廢水中氨氮對環境的汙染，其中硝化作用是由亞硝酸菌和硝酸菌來共同完成，首先亞硝化菌將氨氮轉化為亞硝態氮，然後硝酸細菌將亞硝態氮轉化為硝態氮，完成整個硝化過程。在此過程中，氨氮的去除是廢水處理中的重要一環，因此亞硝酸細菌的硝化作用是脫氮過程中決定後續反應速率的進行，控制著硝化作用的整個過程。
[0003]微生物固定化技術直接從固定化酶技術衍生而來，為完善和提高游離微生物體系性能而發展起來的。它是通過一定的技術手段將菌體固定在載體上，避免菌體流失，以提高菌體的去除效率為目的的一種處理方式。固定化微生物的製備方式一般可以分為共價結合法、交聯法、吸附法和包埋法。目前，在有關固定化硝化細菌處理廢水的研究中，一般採用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸鈉(SA)作為固定化載體材料，而採用聚乙二醇(PEG)和海藻酸鈉(SA)作為固定化載體材料卻鮮少報導。聚乙二醇無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，並與許多有機物組份有良好的相溶性。在化妝品、製藥、化纖、橡膠、塑料、造紙金屬加工及食品加工等行業中均有著廣泛的應用。海藻酸鈉是一種天然多糖，具有藥物製劑輔料所需的穩定性、溶解性、粘性和安全性。將二者混合後作為固定化複合載體材料，有利於提高固定化小球的含水率以及支架孔徑。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種肺炎克雷伯菌的固定化小球的製備方法，該方法通過用肺炎克雷伯菌製備菌懸液、以聚乙二醇和海藻酸鈉作為複合載體，製備了肺炎克雷伯菌固定化小球，該固定化小球可用於氨氮廢水處理。
[0005]本發明的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，包括:
[0006](I)菌懸液製備
[0007]將肺炎克雷伯菌接種於液體富集培養基中，搖床培養後得到對數生長期的菌體，離心後，棄去上清液，將菌體用生理鹽水洗滌，反覆離心4~5次，用生理鹽水稀釋後得到菌懸液；
[0008](2)複合載體的製備
[0009]將聚乙二醇和海藻酸鈉加入去離子水中，高溫滅菌後使其完全溶解後，冷卻到28~32°C，得到固定化載體混合水溶液，作為複合載體；
[0010](3)肺炎克雷伯菌固定化小球的製備
[0011]將上述菌懸液和固定化載體混合水溶液混合後攪拌均勻後，-5~5°C下用注射器滴加到不斷攪拌CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交聯5~6h後用生理鹽水衝洗4~5次，即得肺炎克雷伯菌固定小球，4°C低溫保存備用。
[0012]步驟(1)中所述的搖床培養的溫度為30°C，時間為24h。
[0013]步驟(1)中所述的離心為於7000r/min離心15min。
[0014]步驟(2)中所述的聚乙二醇、海藻酸鈉和去離子水的用量比為6g:4g:100mL。
[0015]步驟(2)中所述的高溫滅菌具體操作為於121°C，105~IlOkPa滅菌20min。
[0016]步驟(3)中所述的菌懸液與固定化載體混合水溶液的體積比為1:1。
[0017]步驟(3)所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球的粒徑範圍為2~3mm。
[0018]步驟(3)所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球應用於氨氮廢水處理。
[0019]本發明中，聚乙二醇和海藻酸鈉作為複合包埋材料固定化肺炎克雷伯菌，以CaCl2溶液作為交聯劑，生理鹽水作為表面處理劑來製備肺炎克雷伯菌固定化小球。
[0020]本發明的肺炎克雷伯菌固定化小球可用於氨氮廢水處理，處理條件是固定化小球在30°C，轉速150r/min搖床中，投入氨氮模擬廢水中培養7d,每隔24h取樣測定氨氮含量，經過7d的降解，氨氮含量由最初的10mg/L降解到1.55mg/L，去除率為84.5%。
[0021]本發明中所述的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)已於2013年9月13日保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N 0.8182。
[0022]有益效果:
[0023]本發明的製備方法簡單，得到的肺炎克雷伯菌固定化小球可用於氨氮廢水處理。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是含肺炎克雷伯菌的複合載體固定化小球外型照片；
[0025]圖2是含肺炎克雷伯菌的複合載體固定化小球的表面在3000倍下的電鏡照片；
[0026]圖3是含肺炎克雷伯菌的複合載體固定化小球的斷面在100倍下的電鏡照片。
[0027]圖4是含肺炎克雷伯菌的複合載體固定化小球的斷面在500倍下的電鏡照片。
[0028]圖5固定化小球處理氨氮的效果圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
[0030]實施例1
[0031]菌株的分離鑑定
[0032]從上海松江汙水處理廠的活性汙泥中，通過初篩及復篩得到一株亞硝化菌。通過16S rDNA序列測定和分析比較,該菌株與肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的同源率達98%,確定該菌株為肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。
[0033]肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae) 16S rDNA 序列如下:
[0034]GATGGGGGGCAGTCTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGC
【權利要求】
1.一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，包括: (1)將肺炎克雷伯菌接種於液體富集培養基中，搖床培養後得到對數生長期的菌體，離心後，棄去上清液，將菌體用生理鹽水洗滌，反覆離心4~5次，用生理鹽水稀釋後得到菌懸液； (2)將聚乙二醇和海藻酸鈉加入去離子水中，高溫滅菌後使其完全溶解後，冷卻到28~32°C，得到固定化載體混合水溶液； (3)將上述菌懸液和固定化載體混合水溶液混合後攪拌均勻後，-5~5°C下用注射器滴加到不斷攪拌的CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交聯5~6h後用生理鹽水衝洗4~5次，即得肺炎克雷伯菌固定化小球。
2.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所述的搖床培養的溫度為30°C，時間為24h。
3.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(I)中所述 的離心為於7000r/min離心15min。
4.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的聚乙二醇、海藻酸鈉和去離子水的用量比為6g:4g:100mL。
5.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(2)中所述的高溫滅菌具體操作為於121°C，105~IlOkPa滅菌20min。
6.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的菌懸液與固定化載體混合水溶液的體積比為1:1。
7.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(3)所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球的粒徑範圍為2~3mm。
8.根據權利要求1所述的一種肺炎克雷伯菌固定化小球的製備方法，其特徵在於:步驟(3)所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球應用於氨氮廢水處理。
【文檔編號】C12N11/10GK103525802SQ201310508287
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】趙曉祥, 南曉梅, 高瑩, 龔娟, 尹珊珊 申請人:東華大學