一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法
2023-10-31 20:18:22
專利名稱：一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法
技術領域：
本發明提供一種人類自然殺傷細胞的增殖方法，使自然殺傷細胞經本發明方法增殖過後，可達到至少高於增殖前五百倍的細胞數目，並保持自然殺傷細胞的毒殺活性，為人類自然殺傷細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。
背景技術：
根據資料，癌症一直高居中國臺灣十大死因的第一位，癌症影響層面之廣及所耗費社會成本之巨可見一斑。目前為止人類所熟知的抗癌療法至少有五大類，包括手術切除法、化學治療及放射線治療等三種及其合併療法與民俗療法。手術療法雖然效果很好，但有些腫瘤無法以外科手術切除，且手術的後仍會有殘存的癌細胞容易造成復發或轉移，這正是癌症之所以可怕以及致人於死的主要原因。而已轉移或無法以外科手術切除的癌細胞就必須以放射線療法或化學療法來治療，甚至無法以現有的醫療方式達到治療效果。可是放射線療法或化學療法並沒有專一性，會將好的細胞以及壞的細胞同時殺死，導致嚴重的副作用，該副作用對病患本身抗癌能力最為關鍵的免疫系統的破壞也最嚴重，這是目前醫學上一直無法克服的難題之一，因此這樣的治療無論是在延長壽命或降低副作用方面都仍有大幅改善的空間。因此對於癌症治療，各界都在積極尋求能抗癌，無副作用而又能加強免疫機能的方法。自然殺傷細胞(Natural killer cells, NK cells)是人體內第一道與生俱來的免疫防線(Native immunity)成員之一，也是對抗癌細胞或病毒最強、最有效的細胞。與其它抗癌免疫細胞相比，例如毒殺性T細胞(Cytotoxic T cells)或樹突細胞(Dendritic cells)，NK細胞的毒殺性較強、較具廣譜性、不受組織兼容性抗原限制(MHC-Restriction) 且不需要致敏作用(I^rimimg)的啟動就可直接發動對癌細胞的攻擊。除此之外，NK細胞還具有調節免疫能力及和神經系統交互作用的能力。理論上NK細胞可以成為一個有效的癌症治療手段，然而這種細胞平常在體內的數量本來就不多，只約佔血液中白血球的2-6 %， 再加上受到疾病、年齡、壓力、不良生活習慣及其它環境因素等的影響，NK細胞的數量及活性常隨著年齡增長而逐漸降低，直接或間接促成癌症的發生或惡化；而臨床上也常觀察到癌症病人的NK細胞數量不足或活性下降的現象。公知技術無法在體外短時間內將NK細胞大量的增殖，且同時保有NK細胞的毒殺活性，再者，公知技術所採用的NK細胞，是取自於已經得到癌症的病患，在這狀態下取得的NK細胞對於癌細胞的毒殺能力不夠強，即便增殖後再回輸於病人體內，所能達到的癌細胞殺傷效果也不高，使得利用NK細胞來治療癌症的想法固然很有吸引力，但是實際執行上卻礙於公知技術的不足而無法真正應用於製備治療癌症的藥物。
發明內容
本發明的目的，在於提供一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其是可以從冷凍保存的周邊血液單核球細胞(Peripheral bloodmononuclear cells, PBMCs)中增殖 CD3—CD56+亞型自然殺傷細胞的方法，使自然殺傷細胞經本方法增殖過後，可達到至少高於增殖前五百倍的細胞數目，並保持自然殺傷細胞的毒殺活性，為人類自然殺傷細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。為更好的描述和理解本發明，我們將對本發明中所涉及的術語做詳盡的解釋。自然殺傷細胞(Natural killer cells, NK cells) :NK細胞是一群不同於T、B淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，分布於周邊各淋巴器官及血液循環系統，無需抗原的預先刺激與活化即可發揮細胞毒殺效應，並可分泌多種細胞因子及趨化因子。NK細胞的啟動NK細胞可表達一系列活化性受體及抑制性受體，兩者間的平衡是控制NK細胞是否被啟動的重要機制。同時，幹擾素及巨噬細胞來源的細胞介素均是NK細胞極強的活化因子。本發明中利用重組人類白血球間素(Recombinant human Interleukin, rhIL)、2(rhIL-2)、12(rhIL-12)、15(rhIL-15)、18(rhIL-18)、21(rhIL_21)及其組合的應用來活化NK細胞。NK細胞的增殖是指NK細胞在體外培養中通過一系列的細胞分裂，而達到一定的增殖數目。本發明中所增殖的NK細胞主要是⑶3—CD56+亞群的NK細胞。細胞毒殺活性是指由細胞引起的單純的細胞殺傷事件。NK細胞的毒殺活性不單純局限於腫瘤細胞，還包括對病毒感染細胞、受損和功能異常細胞的殺傷作用。本發明中所涉及的NK細胞毒殺活性主要是指其對腫瘤細胞的殺傷作用。NK細胞毒殺活性的測定目前主要是應用對NK細胞敏感的骨髓白血病(erythroleukemia)細胞株K562和對NK細胞抗性的淋巴腫瘤細胞株Raji為靶細胞，測定NK細胞對它們的殺傷率。本發明中應用K562細胞株來測定NK細胞毒殺活性。NK細胞療法是一種利用高科技的細胞培養技術在短時間內於體外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以對抗癌細胞的NK細胞後，再將其注入病人體內，直接提高病人本身的抗癌能力，達到抗癌、治癌目標的一種醫療技術。NK細胞療法的前提是NK細胞的啟動和大量增殖，並對腫瘤細胞保持高的細胞毒殺傷活性。自體免疫細胞，尤其是NK細胞的免疫細胞治療法簡單的說，是一種利用高科技的細胞培養技術在短時間內於體外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以對抗癌細胞的NK細胞後，再將其注入病人體內，直接提高病人本身的抗癌能力。實際的做法是病人經醫師仔細評估且判定適合NK細胞療法後，從病人身上採集約30毫升的周邊血液在符合GTP/GMP規範的無塵、無菌實驗室進行連續15天的培養，在過程中以特殊的配方專門培養、增殖其中的NK細胞，使其數量增加達原先的數百倍甚至上千倍後再注入體內，直接提高NK細胞的數量進而達到治療癌症的目的。利用NK細胞療法來治療癌症有下列各種學理上的優勢一、NK細胞是人體內抗癌活性最強的細胞，可直接殺死癌細胞抑制腫瘤的生長及擴散；二、NK細胞會抑制腫瘤附近新血管的增生，故可限制腫瘤取得所需要的養份進而限制腫瘤的生長；三、NK細胞可直接改善並調節患者的免疫力及神經系統，間接提高患者的生活質量；四、NK細胞會分泌一種叫做b-endorphin的腦內啡，可減少病患的疼痛令病患有愉悅感，間接提升生活質量 』五、 副作用低或幾乎無副作用。目前一些研究已指出，周邊血液自然殺傷細胞所具有的毒殺範圍除了包括黑色素瘤、頭頸癌之外，還有肺、卵巢、子宮頸、膀胱、前列腺、肝細胞、胰臟、食道、乳房及許多合併的癌症。尤其對肺癌、淋巴癌、食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管較密集地區的癌症較有效。一般的狀況下，我們身體以部位計算，會有5到15顆的癌細胞產生，那時，只要一顆NK細胞，就可以殺光這些癌細胞。但是，一但得了癌症，每一顆癌細胞，要250顆當時體內的NK細胞，才能殺死。因此，儲存未得癌症前的戰鬥力高的NK細胞，在萬一未來得癌時， 複製成多數以協助抗癌，是目前最有效、無副作用的製備治療癌症的藥物的方法。本發明實施例提供一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其是一種自冷凍的周邊血液單核球細胞中增殖CD3—CD56+亞型自然殺傷細胞，並使增殖後的該自然殺傷細胞數目高於增殖前細胞數目至少五百倍的方法，其中該方法包含以下步驟(a)取得一周邊血液樣本；(b)由該周邊血液樣本取得一周邊血液單核球細胞；(c)冷凍保存該周邊血液單核球細胞；(d)將該周邊血液單核球細胞解凍；以及(e)於體外使用含有一重組人類白血球間素的細胞培養液來增殖該周邊血液單核球細胞中的一自然殺傷細胞；其中，該重組人類白血球間素選自以下任意一項或其組合重組人類白血球間素2號、重組人類白血球間素12號、重組人類白血球間素15 號、重組人類白血球間素18號、重組人類白血球間素21號。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，該周邊血液單核球細胞取自一人類個體。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，該人類個體為一健康人類個體或一人類腫瘤患者。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，步驟(C)冷凍保存該周邊血液單核球細胞，包含以下步驟(i)製備一含有90%人類個體自體血清和10%二甲基亞碸的混合液；(ii)將由該周邊血液樣本取得的該周邊血液單核球細胞與該混合液混合；(iii)將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏1至10度之間，時間為一分鐘至三小時；(iv)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏0度至零下40度之間， 時間為十分鐘至四十八小時；(ν)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏零下50度至零下100度之間，時間為二十分鐘至四十八小時；以及(vi)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液放置於含有液態氮的一冷凍保存裝置中長期冷凍保存。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，步驟(iii)至(V)被下述步驟取代將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液放置於程控的一降溫機中，並且以每分鐘下降攝氏 0. 1度至5度的速度降溫。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，步驟(V)被省略。作為本發明實施例的一種優選方案，其中，於體外增殖該周邊血液單核球細胞中的該自然殺傷細胞，包含以下步驟
(i)將冷凍保存的該周邊血液單核球細胞解凍；(ii)以含有5%該人類個體的自體血清幹細胞的培養液培養解凍後的該周邊血液單核球細胞，並添加最終濃度為500-750U/ml的重組人類白血球間素2以及最終濃度為 10-20ng/ml 的鼠抗人 CD3 mAb ；(iii)於第六天後使用含3-5%該人類個體的自體血清的幹細胞培養液培養，並加入該重組人類白血球間繼續培養；其中，該重組人類白血球間素選自以下任意一項或其組合最終濃度為500U/ml的重組人類白血球間素2號、最終濃度為200U/ml的重組人類白血球間素12號、最終濃度為20-30ng/ml的重組人類白血球間素15號、最終濃度為100U/ml 的重組人類白血球間素18號、最終濃度為100U/ml的重組人類白血球間素21號。本發明提供的NK細胞增殖的方法，滿足NK細胞療法的條件，為製備治療癌症的藥物提供了一種切實可行的技術。本發明人等經銳意研討，發現從凍存周邊血液單核球細胞啟動、增殖NK細胞的方法。所增殖的NK細胞是具有高腫瘤細胞毒殺活性的CD3—CD56+亞群。細胞培養條件在實施例中詳細描述。根據本發明實施例結果，周邊血液單核球細胞在體外培養5天後，NK細胞開始增殖，發明人等稱之為啟動階段，在後續的1到10天過程培養中，發明人等稱之為增殖階段，NK細胞會繼續增殖至100到500倍，甚至到1000倍。根據本發明實施例結果，啟動並增殖的NK細胞與非體外增殖的NK細胞相比，細胞毒殺活性至少增加了 100%，較好的增加了 150%到200%，甚至最好的增加了 400%。本發明中非體外啟動並增殖的NK細胞是指採用CD56抗體磁珠，陽性分選的新鮮NK細胞。體外啟動並增殖NK細胞的細胞毒殺活性之所以增高可能是由於結合受體表達上調所介導的一種效應。本發明的實施例中描述了前述NK細胞啟動、增殖的具體方法。需要強調的是，在以冷凍保存的周邊血液單核球細胞啟動、增殖NK細胞的培養體之中，由於周邊血液單核球細胞是包含不同細胞群的混合物，例如⑶3TD56+亞群的NK細胞、NKT細胞(⑶3+CD56+)和 T細胞(CD3+)，所以在啟動增殖後，除了大量增殖的CD3_CD56+亞群NK細胞外，還有其它細胞類型在啟動增殖的培養體系中存在。根據本發明實施例結果，發明人等還詳細設計了 NK細胞的臨床施用方案。發明人等在一系列的NK細胞培養及其狀態的觀察過程中，發現NK細胞的最佳狀態在培養的第9 到14天。根據細胞狀態，發明人等將在第9-10天和13-14天換無血清培養基培養，48小時後換液，再經M小時其狀態達到最佳，NK細胞的數目達到10-80億之間。因此，此時為進行細胞回輸至人體的最佳時機。根據本發明中NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒殺活性，本發明包括NK細胞能與其它癌症治療手段聯合給藥或應用。例如與手術、放療和細胞毒性藥物的聯合應用。同時，本發明相關的研究結果提示體外啟動增殖的NK細胞與體內未啟動的NK細胞相比具有明顯的抗腫瘤能力。因此本發明也包括了 NK細胞對腫瘤的殺傷作用。而所說的腫瘤細胞是指自體腫瘤細胞。自體腫瘤細胞是指來源和再植入同一個體的細胞，也就是說，供體和受體是同一個人。上述的自體腫瘤細胞包含了血液腫瘤及實體腫瘤。與以往NK細胞增殖發明的方法比較，本發明包含以下幾點明顯的不同或優勢1、本發明是抽取健康人類個體的周邊血液，取出其中的周邊血液單核細胞(PBMCs)以進行NK細胞的增殖，較之公知技術可以確保NK細胞的活力、質量、與毒殺活性皆處於健康而良好有效的狀態。2、本發明在 NK 細胞增殖過程中，應用 rhIL-2、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18、 rhIL-21及其組合刺激增殖NK細胞，更有效的保證了 NK細胞具有高的細胞毒殺傷活性。3、本發明的增殖方法可以使得NK細胞在增殖後達到至少高於增殖前細胞數目五百倍的細胞數量。4、本發明在NK細胞增殖過程中，採用自體血清進行培養，使用NK細胞製造的腫瘤治療藥物更加安全。本發明中採用不同幹細胞培養基混合培養NK細胞方案，有效降低了 NK細胞增殖的成本，也為NK細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。圖1 (A)、⑶和(C)為本發明的方法中，於體外增殖周邊血液單核球細胞(PBMCs) 中的自然殺傷細胞的較佳實施例的流程圖。圖2㈧和⑶分別為根據本發明的方法增殖NK細胞，在第11和15天NK細胞比例流式細胞儀檢測圖。圖3為根據本發明的方法使用5名健康人周邊血液單核球細胞(PBMCs)培養增殖的結果。圖4為根據本發明的方法使用5名健康人的周邊血液單核球細胞(PBMCs)培養增殖過程中NK細胞比例變化的結果。圖5為根據本發明的方法使用5名健康人的周邊血液單核球細胞(PBMCs)中NK 細胞培養增殖的結果。圖6為根據本發明的方法增殖NK細胞，以K562細胞為靶細胞，進行細胞毒殺傷活性檢測的結果。
具體實施例方式下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其它實施例，都屬於本發明保護的範圍。在以下內容中，發明人將對如何從凍存周邊血液單核球細胞中啟動增殖NK細胞做詳盡說明。同時，發明人會進一步說明所啟動增殖NK細胞的細胞毒殺傷活性。這些數據為用NK細胞製造治療腫瘤的藥物提供了堅實的依據。實施例一請參照圖1 (A)、圖1 (B)、與圖1 (C)。
研究樣本來源周邊血液來自5名健康獻血者，獻血者經臨床診斷無血液系統惡性腫瘤和嚴重自身免疫性疾病。本研究獲得當地研究倫理委員會同意，同時與所有獻血者籤署知情書。周邊血液單核細胞(PBMCs)的提取、冷凍保存及復甦所有操作均嚴格遵守標準操作規程(SOP)的程序。採集20-40毫升受試者周邊血液(約含3-6 X IO7個單個核細胞)。經FicolI-Hypaque密度梯度離心分離單個核細胞，分離的單個核細胞採用90%的自體血清和10%二甲基亞碸混合液進行冷凍保存。冷凍保存細胞時，較佳的實施例為先將其置於攝氏4度2小時，再放置於攝氏零下20度過夜，最後放置於含有液態氮的冷凍保存裝置中長期保存，或者是先將含有90%的自體血清和10%二甲基亞碸以及周邊血液單核細胞(PBMCs)的混合液放置於攝氏4度10分鐘，再放置於攝氏零下20度30分鐘，接著再放置於攝氏零下80度過夜，最後再放置於含有液態氮的冷凍保存裝置中長期保存。另一種合適的降溫方法為將含有90%的自體血清和10%二甲基亞碸以及周邊血液單核細胞(PBMCs)的混合液放入使用程控的降溫機中進行降溫。冷凍保存細胞時，降溫的速度較佳應當維持在每分鐘下降攝氏1至3度，以免降溫速度過快導致細胞破裂，或者降溫速度過慢使細胞喪失活性。增殖周邊血液單核細胞(PBMCs)時，取出冷凍細胞小管，投入攝氏37至40度水浴中復溫，小管內容物全部融化後，吸出細胞以5倍體積的無血清RPMI 1640培養基稀釋，以1200rpm/min的速度離心5分鐘，丟棄上清液，洗滌兩次，再用無血清RPMI 1640培養基重新懸浮。體外啟動增殖冷凍保存的周邊血液PBMCs中NK細胞的方法將所得的PBMCs離心，重新懸浮於含5%人自體血清幹細胞培養基中，以 0. 5XlOVml細胞密度鋪入培養瓶中，加入重組人類白血球間素2號(Recombinant human Interleukin 2，rhIL-2，最終濃度為 500_750U/ml)和鼠抗人 CD3mAb (最終濃度為 10_20ng/ ml)，培養5天。第6天計數細胞，Hanks液洗滌1_2次後，加入含3_5%人自體血清的幹細胞培養基，這些幹細胞培養基可含有rhIL-2 (最終濃度為500U/ml)、rhIL-12 (最終濃度為 200U/ml)、rhIL-15(最終濃度為 20-30ng/ml)、rhIL_18 (最終濃度為 100U/ml)、rhIL_21 (最終濃度為100U/ml)中的一種或其組合，隨後重新懸浮細胞，使細胞密度維持在0. 5 XlOVml 左右。較佳的實施例為，在0、10-11、14-15天計數細胞、用流式細胞儀檢測細胞比例並詳細記錄細胞增殖數目(圖幻，根據細胞的增殖情況酌情補加含3-5%人自體血清的幹細胞培養基，這些幹細胞培養基可為rhIL-2 (最終濃度為500U/ml)、rhIL-12 (最終濃度為200U/ ml)、rhIL-15 (最終濃度為 20_30ng/ml)、rhIL_18 (最終濃度為 100U/ml)、rhIL_21 (最終濃度為100U/ml)中的一種或其組合，使細胞密度維持在0. 5 XlOVml左右。以本發明的方法增殖而得的自然殺傷細胞，可以連同適當體積的該人類自體血清與適當體積的生理食鹽水，運用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合的範疇。其所製備的藥物可利用靜脈注射的方式回輸至該人類個體體內。為了驗證NK細胞啟動增殖的效率，發明人等在5名獻血者的冷凍保存的周邊血液 PBMCs中，進行了 NK細胞的增殖實驗。在5名健康供血者的PBMCs細胞中，啟動增殖前經流式細胞儀分析，確認⑶3_CD56+亞群NK細胞為總細胞的9. 7% 士2. 1 %，⑶3+細胞，主要是 T細胞為總數的61% 士8%。在經過15天的啟動增殖後，細胞總數增殖了 135士 11倍(圖 3)。而NK細胞的比例由增殖前的9. 7% 士 2. 增長為62% 士 3.6% (圖4)，由於NK細胞比例的增高，發明人等計算得出NK細胞的增殖倍數為888士 165(圖5)倍。以上結果均證實發明人等可有效的從凍存周邊血液PBMCs啟動增殖NK細胞，而且所增殖的NK細胞主要是⑶3TD56+亞群細胞。根據體外增殖NK細胞的實際製作，在細胞培養第9-16天即可通過靜脈注射，施打於個案身上，其中較佳的實施態樣為細胞培養第10-11天與第14-15天，預計個案體內可看到NK細胞的大量持續增殖。實施例二 NK細胞毒殺活性檢測方法收集對數生長期K562細胞、培養第5、15天啟動增殖NK細胞及體外利用細胞磁珠陽性分選的NK細胞。以K562細胞為靶細胞，調整細胞濃度為1 XlO5Ail。以NK細胞為效應細胞，根據不同的效靶比分別調整細胞濃度為1 X 105/ml、1. 5 X 105/ml、1 X 106/ml。按不同效靶比(1 1、5 UlO 1)將效應細胞和靶細胞混合，同時設相應的靶細胞孔、效應細胞孔和培養基空白對照孔。每組均設3個平行孔。置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養12小時後，每孔加入IOul的CellCounting kit_8(日本同仁化工)，混勻，於37°C、 5% CO2、飽和溼度培養箱中繼續培養4小時後用酶標儀測定每孔450nm波長處OD值。細胞毒殺活性計算方法求出平行孔的平均值，按以下方法計算各組NK細胞毒殺活性，以殺傷率％表示。細胞毒殺活性=[1_(靶細胞孔OD值-效應細胞孔OD值)/靶細胞孔OD值]X100%本發明人等為檢測比較所啟動增殖NK細胞的細胞毒殺傷活性，以K562細胞為靶細胞，對比了體外利用細胞磁珠陽性分選的NK細胞和應用本發明增殖5及15天的NK細胞的細胞毒殺傷活性。在靶效比為1 10時，經15天啟動增殖的NK細胞毒殺傷活性為65% 士 10%，經5天啟動增殖的NK細胞毒殺傷活性為51 % 士6. 3%，而細胞磁珠陽性分選的NK 細胞毒殺傷活性僅為9% 士3.2%。在靶效比為1 5時，三者的細胞毒殺傷活性分別為 51% 士8. 2%、39% 士5. 1%、7% 士2. 4%。在靶效比為1 1時，三者的細胞毒殺傷活性分別為31% 士5. 6^^22% 士3. 7^^4% 士 1.4% (圖6)。以上結果揭示本發明所啟動增殖的 NK細胞，對腫瘤細胞具有高的殺傷活性。以上所述，僅為本發明的具體實施方式
，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應以所述權利要求的保護範圍為準。
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權利要求
1.一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其是一種自冷凍的周邊血液單核球細胞中增殖CD3—CD56+亞型自然殺傷細胞，並使增殖後的該自然殺傷細胞數目高於增殖前細胞數目至少五百倍的方法，其中該方法包含以下步驟(a)取得一周邊血液樣本；(b)由該周邊血液樣本取得一周邊血液單核球細胞；(c)冷凍保存該周邊血液單核球細胞；(d)將該周邊血液單核球細胞解凍；以及(e)於體外使用含有一重組人類白血球間素的細胞培養液來增殖該周邊血液單核球細胞中的一自然殺傷細胞；其中，該重組人類白血球間素選自以下任意一項或其組合重組人類白血球間素2號、重組人類白血球間素12號、重組人類白血球間素15號、重組人類白血球間素18號、重組人類白血球間素21號。
2.根據權利要求1所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，該周邊血液單核球細胞取自一人類個體。
3.根據權利要求2所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，該人類個體為一健康人類個體或一人類腫瘤患者。
4.根據權利要求1所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，步驟(c)冷凍保存該周邊血液單核球細胞，包含以下步驟(i)製備一含有90%人類個體自體血清和10%二甲基亞碸的混合液；( )將由該周邊血液樣本取得的該周邊血液單核球細胞與該混合液混合；(iii)將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏1至10度之間，時間為一分鐘至三小時；(iv)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏0度至零下40度之間，時間為十分鐘至四十八小時；(ν)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液置於攝氏零下50度至零下100度之間，時間為二十分鐘至四十Λ小時；以及(vi)再將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液放置於含有液態氮的一冷凍保存裝置中長期冷凍保存。
5.根據權利要求4所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，步驟(iii)至(ν) 被下述步驟取代將含有該周邊血液單核球細胞的該混合液放置於程控的一降溫機中，並且以每分鐘下降攝氏0. 1度至5度的速度降溫。
6.根據權利要求4所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，步驟(ν)被省略。
7.根據權利要求1所述的人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其中，於體外增殖該周邊血液單核球細胞中的該自然殺傷細胞，包含以下步驟(i)將冷凍保存的該周邊血液單核球細胞解凍；( )以含有5%該人類個體的自體血清幹細胞的培養液培養解凍後的該周邊血液單核球細胞，並添加最終濃度為500-750U/ml的重組人類白血球間素2以及最終濃度為 10-20ng/ml 的鼠抗人 CD3 mAb ；(iii)於第六天後使用含3-5%該人類個體的自體血清的幹細胞培養液培養，並加入該重組人類白血球間繼續培養；其中，該重組人類白血球間素選自以下任意一項或其組合最終濃度為500U/ml的重組人類白血球間素2號、最終濃度為200U/ml的重組人類白血球間素12號、最終濃度為20-30ng/ml的重組人類白血球間素15號、最終濃度為100U/ml的重組人類白血球間素18號、最終濃度為100U/ml的重組人類白血球間素21號。
全文摘要
本發明提供一種人類自然殺傷細胞的體外增殖方法，其從健康人類個體的周邊血液單核細胞(PBMCs)中培養自然殺傷細胞，並且使自然殺傷細胞經本發明方法增殖過後，可達到至少高於增殖前五百倍的細胞數目，而且還能保持自然殺傷細胞的毒殺活性，為人類自然殺傷細胞在用於製備腫瘤疫苗等醫療藥物組合時提供一種切實可行的方法。
文檔編號C12N5/0786GK102533648SQ20111003639
公開日2012年7月4日 申請日期2011年2月11日 優先權日2010年12月31日
發明者李光輝 申請人:李光輝