一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法
2023-09-19 23:17:45 1
一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法，所述蛋白粉由乳鐵蛋白粉、乳清分離蛋白粉、維生素E和碳酸鈣按照如下比例混合而成：乳鐵蛋白粉30-60wt.％，乳清分離蛋白粉39-69wt.％，維生素E0.01-0.Swt.％，CaCO30.01-0.Swt.％。所述方法步驟如下：(1)陽離子交換層析純化；(2)體積排阻層析純化；(3)配料混合；(4)產品乾燥。本發明所得到的具有促進成骨細胞增殖活性的蛋白粉在促進成骨功能方面具有良好效果。
【專利說明】一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於食品【技術領域】，涉及一種蛋白粉及其製備方法，尤其涉及一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法。
【背景技術】
[0002]乳鐵蛋白是一種多功能的活性糖蛋白，一直備受人們的關注。乳鐵蛋白又稱乳鐵傳遞蛋白，主要存在於哺乳動物的各種外分泌物中，如乳汁、淚液或唾液等。它最初於1939年由Sorensen等人在從動物乳中分離乳清蛋白時首次發現,1953年Polis等在制各乳過氧化物酶時得到了它的粗製品，1960年由Groves用色譜法首次從人乳和牛乳中分離獲得了乳鐵蛋白的純品。多年以來，乳鐵蛋白都作為一種鐵強化劑調控鐵的生物利用率。此外，乳鐵蛋白還具有多種其他生物功能，例如抗菌、抗病毒和抗氧化作用，參與機體免疫調節，增強機體抗病能力等。與這些功能相對應，人們針對乳鐵蛋白的研究與開發也聚焦在這些功能上。
[0003]近年來，乳鐵蛋白被發現具有促骨生長的功效。諸多研究表明，乳鐵蛋白既能刺激成骨細胞增殖，促進成骨細胞增殖與分化、也能抑制破骨細胞生長與活性、誘導破骨細胞凋亡。體內研究表明，乳鐵蛋白在骨生長和代謝中起到一定的生理作用，能促進骨骼生長。乳鐵蛋白的這種功能逐漸引起人們的關注，但相關產品開發進程非常緩慢。
[0004]現有的乳鐵蛋白產品多來源於不同的原料乳如牛乳、人乳、山羊乳和駱駝乳等原料乳中，尤其在各種初乳中含量豐富。通常採用各種方法如超濾、鹽析和色譜法等方法分離乳鐵蛋白。目前乳鐵蛋白大部分是從常乳和初乳中分離純化得到的，也可以利用加工奶酪時的副產物乳清分離乳鐵蛋白。但產品得率也相對偏低，純化效率較低。另外，由於乳鐵蛋白的活性受到多種因素的影響，在純化過程中若不進行良好的控制，其活性將損失嚴重。影響乳鐵蛋白活性的因素主要有溫度、pH、鐵飽和度、鹽離子、乳清蛋白等。Ruegg等研究發現乳鐵蛋白在PH值為6.6時，溫度為65?69°C時開始失活。Abe等研究發現牛脫鐵乳鐵蛋白在PH值為4.0，溫度90°C加熱5min，乳鐵蛋白的鐵結合能力、抗原活性、抑菌性能幾乎無變化，可對其進行大批量滅菌；70°C預熱3min，然後UHT殺菌(130°C /2s)，鐵結合能力只損失了 3% ;還發現在酸性條件下乳鐵蛋白較耐熱，在中性和鹼性條件下則發生渾濁和凝膠化。而Kussendrager和Paulsson等人研究發現乳鐵蛋白在酸性條件下更敏感,Sreedhara等研究發現PH2.0-8.0乳鐵蛋白變性溫度隨pH減小而降低，在pH2.0-3.0乳鐵蛋白更容易變性，且乳鐵蛋白的變性是不可逆的。巴氏殺菌對乳鐵蛋白結構及抗菌活性基本上沒影響，而UHT殺菌會使乳鐵蛋白失去抗菌活性，但137°C /8s處理的乳鐵蛋白對單核細胞增殖作用幾乎沒發生變化。Sui和Brisson在中性pH下研究發現乳鐵蛋白熱穩定性:脫鐵乳鐵蛋白< 天然乳鐵蛋白 < 飽和乳鐵蛋白，主要是由於鐵飽和有助於乳鐵蛋白二硫化物結合在一起，防止蛋白聚合。所以對於在乳鐵蛋白的純化過程中，必須採用良好的技術，抑制或減少其活性降低，實際應用中的工序和工藝參數仍需確定。
[0005]人的骨骼的正常生長發育依賴於成骨細胞和破骨細胞功能的動態平衡，如果這種平衡被打破，成骨減少，而破骨細胞活性增強，骨骼正常發育就會被破壞，進而造成骨質疏鬆等病變。多個研究小組先後報導了乳鐵蛋白、維生素E、以及微量元素鈣等對骨健康的有益作用。
[0006]如前所述:乳鐵蛋白既能刺激成骨細胞增殖，也能抑制破骨細胞生長與活性、誘導破骨細胞凋亡。體內研究表明，乳鐵蛋白在骨生長和代謝中起到一定的生理作用，能促進骨骼生長。
[0007]維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，是最主要的抗氧化劑之一，氧化應激與導致骨折風險增加的骨質疏鬆症密切相關，天然強抗氧化劑維生素E利用其抗氧化特性幫助內在抗氧化防護體系抵禦自由基的侵害及清除脂質過氧化自由基，刺激骨形成及促進骨骼健康。而且生育酚能促進性激素分泌，因此攝入維生素E補充劑有益於骨質疏鬆症的預防和治療。
[0008]鈣是人體中含量最多的礦質元素，含量約為成人體重的1.5-2%，其中90%以上是以羥磷灰石的形式構成骨鹽，存在於骨骼和牙齒中。鈣對於人體骨骼的生長發育具有重要作用。
[0009]從促進骨骼生長發育的角度來看，將乳鐵蛋白、維生素E以及鈣復配，將從成骨細胞和破骨細胞信號轉導通路調控、雌激素分泌調控、免疫調節、骨鹽形成等多個角度全方位地促進骨骼健康生長發育。
[0010]目前乳鐵蛋白產品多針對它的鐵轉運活性、抗菌活性、免疫調節活性等進行開發生產，對於它的促進成骨細胞增殖活性這方面的產品開發處於空白狀態。而且，目前市場上促進骨骼生長發育的食品或者保健品主要聚焦在鈣吸收和鈣固定兩個方面，也有些產品聚焦在雌激素分泌的調控上。然而促進骨骼生長發育是一個成骨細胞和破骨細胞動態平衡得複雜過程，針對此複雜的生物過程而開發的產品製備技術國內外處於空白狀態。
【發明內容】
[0011]本發明的目的是提供一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉及其製備方法，該產品將從成骨細胞和破骨細胞信號轉導通路調控、雌激素分泌調控、免疫調節、骨鹽形成等多個角度全方位地促進骨骼健康生長發育。
[0012]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0013]一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉，由乳鐵蛋白、乳清分離蛋白與維生素E按照如下比例混合而成:乳鐵蛋白粉30-60wt.%，乳清分離蛋白粉39-69wt.%，維生素E0.01-0.5wt.%, CaCO30.01-0.5wt.%。
[0014]新鮮牛乳經過脫脂、除酪蛋白後得到乳清蛋白液，或者直接應用乳清蛋白粉為原料；然後通過SP Sepharose Big Bead離子交換層析和Superdex200凝膠過濾層析,超濾濃縮；添加其他功能型輔料，混合溶解均勻後，經真空冷凍乾燥或低噴霧乾燥等方法製備得到具有促進骨骼生長活性的蛋白粉。具體步驟如下:
[0015](I)陽離子交換層析純化:將乳清蛋白液首先經強陽離子交換層析SP SepharoseBig Bead進行純化，純化過程中，預先用緩衝溶液A平衡2_4倍柱體積直至基線平衡，然後採用兩段式分步洗脫，首先採用含有15-30vol.%緩衝溶液B的混合溶液洗脫2-6倍柱體積，再用100%緩衝溶液B洗脫1-4倍柱體積，洗脫流速l_5mL/min ；[0016](2)體積排阻層析純化:將步驟(1)得到的洗脫液進行超濾濃縮，經0.22μπι膜過濾並採用SuperdeX200進一步純化，得到純化乳鐵蛋白；所述的純化過程為:凝膠柱先用緩衝液10-20mmol/L、pH值為7.0-8.的磷酸鹽緩衝溶液進行平衡至基線穩定後進行洗脫，流速為0.l_2mL/min, 280nm下檢測蛋白；
[0017](3)配料混合:將步驟(2)製備的乳鐵蛋白、乳清分離蛋白、維生素E和CaCO3進行混合；
[0018](4)產品乾燥:將上述混合進行乾燥，得到具有促進成骨細胞增殖活性的蛋白粉，所述蛋白粉中含有乳鐵蛋白粉30-60wt.%、乳清分離蛋白粉39-69wt.%、維生素E0.01-0.5wt.%、CaCO30.01-0.5wt.%。
[0019]本發明所得到的具有促進成骨細胞增殖活性的蛋白粉在促進成骨功能方面具有良好效果，以乳清蛋白為對照組的實驗方法和實驗結果如下:
[0020]實驗方法(I):MTT法測定成骨細胞增殖情況
[0021]MTT是一種黃色染料。外源性MTT可被活細胞線粒體內膜上的琥珀酸脫氫酶還原成水不溶性藍紫色結晶甲臌，然而死細胞卻無此功能。加入能溶解細胞中的甲臌的DMS0，用酶標儀在490nm下測定吸光值，可檢測細胞增殖率、間接反映活細胞數量。
[0022]本實驗採用MTT法，步驟如下:
[0023](I)用0.25%胰蛋白酶消化細胞後，用a-MEM培養液(含10%胎牛血清、I %青鏈黴素)製成單細胞懸液，並稀釋到一定細胞濃度接種於96孔培養板。每孔含細胞懸液95 μ L，置於含5% CO2的37°C細胞培養箱中培養。
[0024](2)待細胞貼壁後,每孔加入5 μ L樣品溶液。
[0025](3)測定前 4h，每孔加入 10 μ L0.5mg/mLMTT (ρΗ7.20.01mol/LPBS 配製)，置於細胞
培養箱中孵育4h。
[0026](4)孵育後，小心棄去培養液，每孔加入150 μ L DMS0,振蕩lOmin，使結晶溶解。於酶標儀中490nm下測定吸光度。
[0027]對應的實驗結果見表1。
[0028]表1不同樣品對成骨細胞增殖活性的影響
【權利要求】
1.一種具有促進骨骼生長功能的蛋白粉，其特徵在於所述蛋白粉由乳鐵蛋白粉、乳清分離蛋白粉、維生素E和碳酸鈣按照如下比例混合而成:乳鐵蛋白粉30-60wt.%，乳清分離蛋白粉 39-69wt.%，維生素 E0.01-0.5wt.%, CaCO30.01-0.5wt.V0o
2.根據權利要求1所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉，其特徵在於所述蛋白粉中含有乳鐵蛋白粉40wt.%、乳清分離蛋白粉59.9wt.%、維生素E0.05wt.%、CaCO30.05wt.%。
3.根據權利要求1所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉，其特徵在於所述蛋白粉中含有乳鐵蛋白粉50wt.%、乳清分離蛋白粉49.8wt.%、維生素E0.01wt.%、CaCO30.01wt.%。
4.根據權利要求1所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉，其特徵在於所述蛋白粉中含有乳鐵蛋白粉58.96wt.%、乳清分離蛋白粉41wt.%、維生素E0.02wt.CaCO30.02wt.%。
5.一種權利要求1-4任一權利要求所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於所述方法步驟如下: (1)陽離子交換層析純化:將乳清蛋白液首先經強陽離子交換層析SPSepharose BigBead進行純化，純化過程中，預先用緩衝溶液A平衡2_4倍柱體積直至基線平衡，然後採用兩段式分步洗脫，首先採用含有15-30vol.%緩衝溶液B的混合溶液洗脫2-6倍柱體積，再用100%緩衝溶液B洗脫1-4倍柱體積，洗脫流速l_5mL/min ； (2)體積排阻層析純化:將步驟(1)得到的洗脫液進行超濾濃縮，經0.22 μ m膜過濾並採用Superdex200進一步純化,所述的純化過程為:凝膠柱先用緩衝液10_20mmol/L、pH值為7.0-8.的磷酸鹽緩衝溶液進行平衡至基線穩定後進行洗脫，流速為0.l-2mL/min，得到純化乳鐵蛋白； (3)配料混合:將步驟(2)製備的乳鐵蛋白、乳清分離蛋白、維生素E和CaCO3進行混合； (4)產品乾燥:將上述混合進行乾燥，得到權利要求1-4任一權利要求所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉。
6.根據權利要求5所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於所述乳清蛋白液按照如下方法獲得:將新鮮牛乳於5000-1OOOOrpm離心15_30min脫脂，將脫脂乳用酸調PH值至4.3-4.8，靜置10-30min後4000_8000r/min離心l_30min，收集離心後的上清液進行過濾，得到乳清蛋白液。
7.根據權利要求5所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於所述乳清蛋白液以乳清蛋白粉為原料，使用前將其配置成蛋白濃度為5-10g/L的溶液。
8.根據權利要求5所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於所述緩衝溶液A為30-50mmol/L、pH值為6.5-7.5的磷酸鹽緩衝溶液，所述緩衝溶液B為含有0.1-lmol/L NaCl 的緩衝溶液 A。
9.根據權利要求5所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於純化後乳鐵蛋白純度為85-95%。
10.根據權利要求5所述的具有促進骨骼生長功能的蛋白粉的製備方法，其特徵在於乾燥前固形物含量為10-40wt.%。
【文檔編號】A23L1/302GK103892282SQ201410160964
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】杜明, 王聰, 劉猛, 樊鳳嬌, 宋微, 徐偉麗, 韓冰 申請人:哈爾濱工業大學