生產番茄紅素的改良方法,獲得的番茄紅素的製劑和應用的製作方法

2023-06-01 02:57:56

專利名稱：生產番茄紅素的改良方法,獲得的番茄紅素的製劑和應用的製作方法
技術領域：
使用本發明所述選擇的三孢布拉黴(Blakeslea trispora)菌株的發酵方法可以實現高於當前所述那些的番茄紅素生產水平。分離，純化和配製的方法可適用於任何天然來源的番茄紅素，特別是布拉黴屬(Blakeslea)，笄黴屬(Choanephora)，須黴屬(Phycomyces)或毛黴屬(Mucor)的毛黴真菌的浸沒培養物。相對於先前所述方法，該提取方法提供回收過程的簡化和產品純度的提高。因為它們可以獲得直接應用於食物和藥品領域的穩定的番茄紅素製劑，配製方法提供了高的附加值。
背景技術：
類葫蘿蔔素廣泛分別於自然界中，其將它們的特徵顏色，從黃色到暗紅色賦予許多天然物質，如胡蘿蔔，胡椒，番茄，花或某些微生物，包括一些細菌，真菌和光合成生物。類胡蘿蔔素可以分成兩類(i)稱為胡蘿蔔素的純烴類，包括化合物如β-胡蘿蔔素，α-胡蘿蔔素，γ-胡蘿蔔素或番茄紅素，和(ii)稱為葉黃素的分子，其含有各種形式的氧(羥基，環氧基等)，包括蝦青素，玉米黃質，辣椒紅，雞油菌素(cantaxanthin)，黃體素等。兩組化合物在它們的物化性質和在有機溶劑中的溶解度方面顯示不同性質。所有這些化合物在人的飲食中起重要作用，已經深入研究它們作為抗氧化劑用於預防癌症和其它人類疾病以及作為維生素A前體的性質。最近已經在大鼠中證明番茄紅素抑制次氮基乙酸鐵對DNA的有害影響，並且防止肝臟壞死[Matos H.R.等，(2001)Arch.Biochem.Biophys.396卷]。另外，由於它們從黃色到紅色的顏色，類胡蘿蔔素作為著色劑和食品添加劑具有重要商業價值，因為它們對健康的有益效果和它們有吸引力的顏色[Ninet L.和Renaut J.(1979)在Peppler HJ.，Perlman D.(編輯)Microbial Technology，第二版，卷1，Academic Press，NY，529-544頁]。
番茄紅素(C40H56)是β-胡蘿蔔素和葉黃素生物合成途徑中的中間體。它具有536.85的分子量和下列分子式 番茄紅素番茄紅素除了作為抗氧化劑，番茄紅素還防止心血管病和某些類型的癌症，並在生長控制中起作用[Giovannucci等(1995)J.Nat.Cancer Inst.871767-1776；Stahl W.和Sies，H.(1996)Arch.Biochem.Biophys.3361-9；Clinton，SK.(1998)Nutr.Rev.5635-51]。這已經導致消費者方面增大的需求。作為高純度化合物的番茄紅素的生產在過去已經聯繫到化學合成[US5208381；US 5166445；US 4105855；US 2842599]。然而，現在存在備選的途徑，其基於天然來源的番茄紅素的來源和特殊的提取方法。
通過微生物生物合成的類胡蘿蔔素的生產是化學和生物方法之間競爭的經典實例。生物來源的番茄紅素製劑是從番茄獲得[PCT WO 97/48287，EP 608027]或通過須黴屬，布拉黴屬和笄黴屬的毛黴真菌的發酵獲得[GB1008469，US 3097146，US 3369974，JP 73016189，JP 73016190，RU2102416，WO 00/77234]。為了用三孢布拉黴獲得最大產率的類胡蘿蔔素，必須一起發酵(+)和(-)菌株[Ciegler，A.(1965)Advances in AppliedMicrobiology 71-34；Plempel，M.(1965)Planta 65225-231；Sutter，RP.和Rafelson，ME.(1968)J.Bacteriology 95426-432]。在混合培養物中類胡蘿蔔素產率的增加與一類稱為β因子或三孢酸的酸化合物的生產相關[WO00/77234，Caglioti L.等(1966)Tetrahedron Supplement 7175-187]。對於三孢酸的生物合成，由(+)和(-)菌株生產的β-胡蘿蔔素被兩者代謝成視黃醛和隨後代謝成4-二氫三孢醇。(+)菌株利用4-二氫三孢醇作為底物形成二氫三孢酸和它的甲酯(4-二氫三孢酸甲酯)。對於它的部分，(-)菌株將4-二氫三孢醇代謝成三孢醇。最後，(-)菌株將4-二氫三孢酸甲酯轉化成三孢酸，(+)菌株將三孢醇轉化成三孢酸。三孢酸生物合成的這種描述是一種簡化，因為在該過程中產生許多共代謝物(co-metabolites)，其中一些對於(+)和(-)菌株兩者是共同的，但其它對於它們之一是特異性的。這些共代謝物的相對數量根據菌株而變化。
已經在與三孢布拉黴種系發生相關的真菌如布拉克須黴(Phycomycesblakesleeanus)和卷枝毛黴(Mucor circinelloides)中描述β-胡蘿蔔素的生物合成途徑(參見流程1)[Arrach N.等，(2001)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 981687-1692；Velayos A.等(2000)EuropeanJournal of Biochemistry 2675509-5519]。所述生物合成需要至少三種酶(i)八氫番茄紅素合成酶，其將兩分子的香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate)結合形成八氫番茄紅素，(ii)八氫番茄紅素脫氫酶，其將四個雙鍵引入八氫番茄紅素分子而合成番茄紅素，和(iii)番茄紅素環化酶，其使用番茄紅素作為底物，形成位於β-胡蘿蔔素分子的兩個末端的環。基於三孢布拉黴突變株的分析得出結論，在該真菌中的β-胡蘿蔔素的生物合成途徑類似於關於布拉克須黴的描述[Metha B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Applied Microbiology and Biotechnology 42836-838]。在布拉克須黴的情形中，通過突變可以改變它菌絲體的黃色，產生菌絲體為紅色，白色或各種梯度黃色的菌株。紅色突變株累積番茄紅素，而白色突變株缺乏類胡羅卜素的生產或累積八氫番茄紅素。為了生產番茄紅素，需要擁有缺少番茄紅素環化酶活性的三孢布拉黴菌株，或備選地必須將抑制所述酶促活性的化學品加入發酵培養基。
流程1專利GB 1008469，US 3097146，US 3369974，JP 73016189，JP73016190，RU 2102416和WO 00/77234描述通過發酵如須黴屬(Phycomyces)，布拉黴屬和笄黴屬(Choanephora)的毛黴真菌生產番茄紅素。專利GB 1008469和US 3097146描述基於將pH控制在7.0和9.5的值之間的三孢布拉黴的發酵方法，在發酵7天後獲得99.7mg/l番茄紅素的產率。專利JP 73016189和JP 73016190描述基於加入叔胺用毛黴真菌生產番茄紅素的方法。專利RU 2102416描述加入氨甲基吡啶和菸草殘渣以誘導番茄紅素累積。除了在所述專利中描述的物質以外，已經公開了使用其它氮化的雜環鹼用於在番茄紅素水平上阻斷類胡蘿蔔素的合成尼古丁[JP09313167]，咪唑，吡啶，嗎啉，喹啉和一些取代的衍生物[US 3369974；Ninet L.，Renaut J.(1979)在Peppler HJ，Perlman D(編輯).MicrobialTechnology，第二版，卷1，Academic Press，NY，529-544頁]。此外，已經描述無需加入叔胺而累積番茄紅素的三孢布拉黴突變株[Mehta B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Appl.Microbiol.Biotechnol.42836-838]。
除了上述毛黴真菌以外，已經描述使用藻類生產番茄紅素[JP 09313167和JP 2000152778]，通過發酵冠黴素鏈黴菌rubescens變種(Streptomyceschrestomyceticus var.rubescens)[US 3467579]，和通過修飾黃桿菌屬物種(Flavobacterium sp.)R1534的類胡蘿蔔素的生物合成途徑[US 6124113]來生產番茄紅素。
可以從植物產品如番茄，胡蘿蔔，胡椒，植物油等獲得番茄紅素。因此，WO 97/48287描述從番茄製備富含番茄紅素的含油樹脂的方法，其通過壓榨番茄直至獲得果肉，用有機溶劑從果肉中提取番茄紅素和隨後通過蒸發去除溶劑，產生番茄紅素含量為2-10％的含油樹脂。從植物和油中獲得富含一般類胡蘿蔔素和尤其是番茄紅素的含油樹脂的類似方法在各種專利中描述，如在US 5245095和EP 580745中，通過用鈣鹽沉澱，在US 5019668中，使用用油的反式酯化和接著蒸餾的方法，在WO 95/16363中，描述將番茄分級分離成包括富含類胡蘿蔔素的含油樹脂的各種級分，在PCT WO 90/08584中，描述通過使用超臨界狀態的流體提取番茄紅素，儘管獲得的提取物是各種類胡蘿蔔素的混合物並且由於它們的低溶解度提取率極低。
在所有這些情形中，由於番茄紅素在這些天然產物中的低濃度和該化合物在某些細胞器如葉綠體或有色體中的胞內定位，獲得的產物的提取率和純度低，獲得富含番茄紅素或脫氫的粗製產物的含油樹脂以及變化量的其它類胡蘿蔔素或非類胡蘿蔔素化合物。在大多數情形中，所述提取方法要求通過研磨或壓榨製備果實，以易於溶劑的提取和因此釋放富含番茄紅素的胞內內含物。最後，大多數在這些專利中的所述方法要求使用有機溶劑，其在獲得的含油樹脂中以痕量存在。另外，專利IL 107999描述從番茄果肉中製備極富含番茄紅素的含油樹脂，儘管如上所述，獲得的產物不是由高純度的番茄紅素晶體組成，而是由富含番茄紅素的類脂濃縮物組成。
在另一方面，專利WO 97/15554描述從胡蘿蔔和番茄中提取植物來源的類胡蘿蔔素，包括番茄紅素，其是通過分離葉綠體和有色體，接著用蛋白質水解酶如果膠和/或蛋白酶消化所述細胞器，可以釋放與各種結構蛋白質結合的番茄紅素。通過隨後鹼處理和用低分子量的醇混合物提取，可以獲得豐度和純度大於含油樹脂的番茄紅素提取物，儘管沒有獲得番茄紅素的純化晶體，但是獲得富含番茄紅素的粗提取物。類似地，在專利EP608027 A2中通過分離其中番茄紅素以晶形存在的番茄有色體，獲得番茄紅素的濃縮提取物。這些來自富含番茄紅素的番茄有色體的提取物直接用作著色劑而沒有隨後提取番茄紅素晶體，避免在提取過程中番茄紅素的顏色變化，使無需使用有機溶劑。按照該專利所述方法，不能獲得適用於食物或藥物組合物的純的晶形番茄紅素，而只能獲得脫水的，冷凍乾燥或冷凍形式的食品著色劑。
某些富含類胡蘿蔔素的杜氏藻類(Dunaliella)微藻是番茄紅素的另一重要來源。存在各種從這些生物中提取類胡蘿蔔素和特別是番茄紅素的方法，如在專利US 5378369，US 4713398和US 4680314中所反映的，其通過用有機溶劑(含氯烴，烴等)或食用油(DE 4342798)提取。在PCTWO98/08584中描述一種不同的方法，其中使用超臨界狀態的CO2獲得番茄紅素提取物，儘管如此獲得的提取物番茄紅素的純度低。
還可以通過在液體培養基中發酵從某些毛黴真菌如布拉黴屬，笄黴屬，須黴屬或毛黴屬中獲得番茄紅素，其提供作為對從植物產物或藻類中生產番茄紅素的一個優勢的該化合物增加的濃度，在一些情形中高於相對於幹生物量數量的5重量％，該濃度高於從最好的植物品種所獲得的那些，並且可以通過傳統的誘變技術或通過應用允許遺傳操作這些微生物的新的分子生物學技術，用生物技術可開發這些微生物的過量生產的菌株，增加番茄紅素的濃度和產率，消除其它結構相關的類胡蘿蔔素的生產。
如已經提及的，從天然來源製備高純度的晶體番茄紅素通常要求用有機溶劑或超臨界狀態的流體提取的步驟和然後各種附加的純化步驟如層析，吸收和洗脫的過程和沉澱或結晶的步驟，如例如在專利US 3369974，EB 818255和EP 242148中所述。在其中不使用這些隨後的純化步驟和通過蒸發溶劑直至克服溶解度來直接從提取物進行結晶的大多數情形中，獲得的產物的純度極低，隨後需要進行獲得的番茄紅素的再結晶過程，具有增加的困難即產物的低溶解度意味著必須使用大量的溶劑以完成再結晶步驟，其又導致低產率(NL 6411184，US 4439629)。
專利申請WO 96/13178描述製備穩定的晶體番茄紅素的濃縮物，其在番茄紅素不溶解的食品相容的液體介質如乙二醇，乙醇或甘油中，其是通過研磨懸浮在液體介質中的小晶體(1-3微米)番茄紅素而獲得。此外，專利申請WO 98/43620描述從含油樹脂中分離番茄紅素晶體的方法，其是通過在高溫下皂化各種甘油三酯和膦酸酯和然後用水稀釋，獲得純度為75％-95％的番茄紅素晶體。儘管還未描述它在獲得高純度的番茄紅素晶體中的應用，最近在PCT WO 98/03480中描述了類似的方法用於製備高純度的β-胡蘿蔔素晶體，其是通過用水，低分子量醇或丙酮洗滌進行。
晶形類胡蘿蔔素的不穩定性是眾所周知的，穩定它們的一種方法是製備油分散體。此外，認為分散在油中的類胡蘿蔔素更容易被身體所吸收。穩定不穩定化合物的備選方法是它們在澱粉基體中的微囊包封。因此，專利US 2876160，US 2827452，US 4276312和US 5976575描述通過將它們包裹在澱粉基體中，包括類胡蘿蔔素的各種化合物的穩定性顯著增加。
在著色劑領域中使用類胡蘿蔔素的主要困難之一是它們在水中的零溶解度，因為它們的許多應用發生在水性介質中。這個溶解度問題在文獻US 3998753中提及，並通過製備類胡蘿蔔素在揮發性有機溶劑如滷代烴中的溶液，和用十二烷基硫酸鈉水溶液將它們乳化來解決。
專利US 5364563描述製備類胡蘿蔔素粉末形式的製劑的方法，其包括在具有高沸點的油中形成類胡蘿蔔素的混懸液。用蒸汽將混懸液過熱30秒的最長時期，以便形成類胡蘿蔔素的油溶液。接下來，用膠體水溶液乳化該溶液，然後將乳劑噴霧乾燥。
發明詳述本發明描述一系列使用真菌三孢布拉黴獲得高產率的番茄紅素的方法，以及它的回收和配製的方法。本發明由以下各項組成(i)設計用於獲得和選擇三孢布拉黴突變株的方法，所述突變株是番茄紅素的過量生產者。(ii)開發改善的發酵條件，(iii)建立從菌絲體中回收番茄紅素的方法和(iv)克服現有技術中存在的、在各種介質中的穩定性和溶解性問題的製劑的完成。三孢布拉黴是對於生物技術生產番茄紅素有重要工業意義的真菌。實際上，所述方法證明與目前工業使用的合成方法存在競爭性。
為了獲得番茄紅素過量生產者的菌株，首先開發針對三孢布拉黴的(+)和(-)菌株的誘變方法，其使用誘變劑甲磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)。用於突變的孢子混懸液獲自YpSs培養基的斜面。通過加入10ml 0.1％Triton X-100溶液於各個斜面將孢子再懸浮。通過過濾通過孔徑為20μm的尼龍濾器去除菌絲體殘渣。將孢子在混懸液中的濃度調整為106個孢子/ml。使用EMS的突變方法包括將3％EMS溶液中的106個孢子/ml在0.1M磷酸鈉緩衝液pH 7.0中在室溫下溫育60分鐘，獲得約99％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗滌突變的孢子三次並在3000rpm下在15℃下離心2分鐘。用NTG的突變方法包括將在包含250μg/ml NTG和0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 5.0的溶液中的106個孢子/ml在室溫下溫育30分鐘，獲得約95％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗滌突變的孢子三次並在3000rpm下在15℃下離心2分鐘。用突變的孢子接種含有補充有0.1％Triton X-100的Sutter IV固體培養基的平皿，並在25℃下溫育4天以獲得分離的菌落。
如下是選擇過量生產番茄紅素的三孢布拉黴(-)菌株的所用策略(i)使用三孢酸和(ii)菌落的顏色強度。通過加入三孢酸選擇生產番茄紅素的突變株由將浸漬三孢酸的濾器放置在由突變的孢子獲得的菌落上組成。從三孢布拉黴的(+)和(-)菌株的混合培養物獲得三孢酸。將菌落加上濾器在25℃下溫育，觀察到生產番茄紅素的突變株要求深紅色，與橙色的β-胡蘿蔔素的生產者形成對比。將該方法應用於CMA3(-)菌株，選擇LMA1(-)菌株(流程2)。以下列方法進行作為菌落顏色強度函數的生產番茄紅素的突變株的選擇將CMA1(-)菌株(β-胡蘿蔔素的生產者；參見流程2)突變，突變的孢子在YEPDA固體培養基上生長。接下來，選擇具有比CMA1(-)親株更深的黃色-橙色的那些菌落。這樣分離2個具有深黃色-橙色的菌落(命名為CMB1(-)和CMB2(-))。
流程2使用突變和選擇的方法從三孢布拉黴VKPM F-208(-)獲得三孢布拉黴的(-)菌株的種系發生。UV紫外線；SN自然選擇；NTGN-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍；EMS甲磺酸乙酯。
通過在含有補充有0.1％咪唑的Sutter IV固體培養基的平皿中培養突變的孢子進行三孢布拉黴(+)過量生產番茄紅素的突變株的選擇。接下來，將每個菌落的一部分轉移至其中已經預先接種三孢布拉黴(-)的PDA平皿。在(+)菌株和(-)菌株的菌落的交叉區域，作為顯色強度的函數測定固體培養基中番茄紅素生產的水平。這樣選擇三孢布拉黴CPA1(+)菌株(流程3)，其在與一系列(-)菌株的混合固體培養物中產生更高產率的番茄紅素。然後在液體培養基的混合培養物中分析三孢布拉黴CPA1(+)菌株的生產水平。
用於命名選擇菌株的符號系統如下CM胡蘿蔔素負型(-)LM番茄紅素負型(-)CP胡蘿蔔素正型(+)LP番茄紅素正型(+)親代之間的關係依照字母順序A是B的親代，B是C的親代，等等。字母後的數字對應於突變株的號碼。例如，名稱CMA1(-)表示它是生產胡蘿蔔素的菌株(C)，負型(M)，CMB的親代和突變株號1。類似地，CMA1(-)，CMA2(-)，CMA3(-)和CMA4(-)對應於相同代的突變株1，2，3和4。

流程3使用突變和選擇的方法從三孢布拉黴VKPM F-117(+)獲得三孢布拉黴的(+)菌株的種系發生。UV紫外線；SN自然選擇；NTGN-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍；EMS甲磺酸乙酯。
為了測定在液體培養基和混合培養物中番茄紅素的生產水平，在搖瓶中發酵在固體培養基中選擇的三孢布拉黴的(+)和(-)菌株。為此，用菌株三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴CMB2(-)接種分開的搖瓶接種物，然後在搖瓶中進行兩種菌株的混合發酵。在發酵開始(0-50小時)，為了在番茄紅素水平上阻斷生物合成途徑，加入酶番茄紅素環化酶的抑制劑(例如濃度為0.7-0.8g/l的咪唑)。在發酵結束時(約6天)，通過渦旋攪拌裂解三孢布拉黴的菌絲體，用有機溶劑(例如丙酮)提取番茄紅素，通過HPLC測定它的濃度和純度。獲得的產率為3.0g/l。除了在這種情形中不需要加入酶番茄紅素環化酶的抑制劑以外，用菌株三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴LMA1(-)進行相同類型的發酵。在混合培養物中使用這些菌株獲得的產率為1.2g/l。
為了測定番茄紅素產率，在半工業化的發酵罐中培養CPA1(+)和CMB2(-)菌株。為此，分別在搖瓶中培養它們，分別轉移至中間培養罐和最後將它們一起發酵。在發酵25和35小時之間，加入咪唑作為酶番茄紅素環化酶的抑制劑。將發酵溫育100-140小時。在CPA1(+)和CMB2(-)菌株的一系列不同發酵中獲得的番茄紅素產率的平均值為3.4g/l。
為了測定在不加入酶番茄紅素環化酶抑制劑的情形下的番茄紅素產率，在半工業化的發酵罐中培養CPA1(+)和LMA1(-)菌株。如前所述對於CPA1(+)和CMB2(-)菌株進行發酵，但是不加入咪唑。在CPA1(+)和LMA1(-)菌株的一系列不同發酵中獲得的番茄紅素產率的平均值為1.6g/l。
通過控制三孢布拉黴菌株生長的營養期的齡期，獲得在該發酵階段中更高的產率。因此，對於(+)和(-)兩種菌株，用作接種物的培養物具有30-60小時，優選48小時的齡期，但改變接種的孢子數分別為800-1000個孢子/ml和40000-60000個孢子/ml。在約25℃下進行溫育，在初級培養期接種每個接種物的0.1％v/v。所述初級培養物的齡期在30-60小時的範圍改變，優選36-48小時，溫度為26-28℃。然後以比率1/10v/v混合(+)/(-)初期培養物並用所述時期的混合物接種發酵罐10-20％v/v。
考慮到在發酵中生物合成的類胡蘿蔔素成分的胞內特性，從如常規方法所稱而製備的培養基中回收的方法，包括第一步從培養基中分離生物量。該分離可以如下進行通過建立過濾的方法，使用濾器的常規技術，無論是帶式濾器(belt filter)，旋轉濾機，壓濾機等，其中由濾布組成的阻擋層分離生物量和允許液相而無生物量通過，或離心，其中通過利用培養基和生物量(通常密度更高)之間的密度差異，使用機器如離心分離器，潷析器等，其中重相變得濃縮並以最小可能的生物量的量從液相分離。該階段的一個目的是減少損失和優化各相的性質，以最少量的活性物質獲得最大量的生物量和最高含量的乾燥殘渣，消除大多數發酵培養基。
產生的溼菌絲體包含在發酵中生產的大於95％的類胡蘿蔔素，優選大於97％和更優選大於99％。因此在水相中的類胡蘿蔔素的含量小於5％，優選小於3％，更優選小於1％。使用該溼菌絲體，通過隨後步驟可以分離番茄紅素。然而，已經發現關於發酵，該菌絲體仍具有相對高百分比的15％-20％(脂肪酸和油)的親油成分，其導致在隨後步驟中的純化問題，因此需要在該點引入純化生物量的步驟。純化步驟包括再懸浮生物量於醇甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇，或其中番茄紅素溶解度極低的其它任何醇中至足夠的程度，以實現類脂成分的最大純化。因此，以1ml/g至10ml/g溼菌絲體的醇的量再懸浮溼菌絲體。再懸浮的溫度在0℃和醇的沸點之間，優選10-50℃之間變化。接觸時間為5分鐘至24小時。將如此製備的醇再混懸液過濾或離心，以使濾液或澄清液中的固體含量幾乎為零。得到的溼菌絲體將包含不同比例的醇和水，包含在發酵中生產的大於93％的類胡蘿蔔素，優選大於95％和更優選大於97％。
在包含培養基和醇的殘渣的上清液或濾液中，類胡蘿蔔素的含量相對於初始的培養基小於2％，優選小於1％。使用醇的這種處理使可以以根據所用培養基的特性改變的量去除許多醇溶性親油物質，進行預純化，其將使可以獲得高純度的晶體終產物。另外，通過從初始的溼菌絲體中去除不同比例的水，極大地促進隨後的乾燥步驟。通過將培養基與醇直接混合和保持最小的接觸時間，獲得相當於先前所述的純化效果，結果通過消除一步固-液分離的操作來簡化過程。培養基/醇比率可以為1/0.5至1/5，優選為1/1-1/3。混合物的溫度在室溫和混合物的沸點之間，優選在室溫和60℃之間變化。
乾燥脫水/純化的菌絲體。可以通過常規的分批或連續方法進行乾燥。乾燥溫度在室溫至150℃之間變化，優選它不應超過60℃，更優選它應當低於50℃。乾燥時間取決於所用溫度，在1小時至72小時之間變化。由於通過空氣中的氧的氧化導致這些類胡蘿蔔素的可能分解，最好在不存在氧的情形下，在氮氣氣氛下或至少在真空下進行該乾燥操作。類胡蘿蔔素產物在胞內的事實意味著需要通過乾燥加上研磨，乾燥加上分解或將生物量分解來調節純化的生物量，其促進與溶劑的混合和促進溶劑提取。為了溶劑可以很好地接觸待提取的類胡蘿蔔素，需要破裂菌絲體的預先操作以最大化接觸面積。乾燥的破裂的菌絲體的最佳顆粒大小必須小於3mm，優選小於1mm，更優選小於0.5mm。
可以藉助具有轉動或固定部件錘，篩網等的機械系統，通過彼此擠壓的旋轉柱體(壓實或擠出)，對乾燥產物進行研磨。還可以通過在噴磨機中的快速(瞬時)乾燥系統在單一步驟中進行乾燥和研磨，其中將溼產物供應給高溫循環氣流，以停留時間最小這樣的方式來汽化液體成分的內容物，隨著密度變化將產物運送至回收它的旋風分離器。在乾燥期間和在乾燥途徑中，當顆粒撞擊在壁上時還存在均化效果。
可以將各種有機溶劑用於從以所述方式調節的菌絲體中提取番茄紅素。本發明將是指使用被認為天然的食品級的溶劑，如醯基酯，優選乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸異丙酯，乙酸丁酯或乙酸異丁酯，其合理地結合了類胡蘿蔔素成分的高溶解度和它們作為包括在ICH的III類組中的溶劑的相容性。這些溶劑在國家和社團水平上，在藥物和食品領域都是允許的(RDL12/04/90和RDL16/10/96)。如在ICH中所要求的，基於在所有情況下的液體混合物的乾燥物質，殘餘溶劑含量必須低於5000ppm，優選低於1000ppm，更優選低於100ppm。提取溫度在室溫和溶劑的沸點之間改變，優選50℃-80℃。提取時間將最少需要1秒至1小時，優選1分鐘至15分鐘以完成溶解。所用溶劑的量取決於溫度和菌絲體的類胡蘿蔔素的含量，其在5ml/g和30ml/g生物量之間改變。提取的數量為1-3。提取的類胡蘿蔔素的量大於85％，優選大於90％，更優選大於95％。
一旦獲得，必須將富含類胡蘿蔔素的提取物濃縮至確定量。在濃縮後溶劑中類胡蘿蔔素的終濃度優選為10-50g/l。濃縮的溫度必須低於80℃，優選低於70℃和更優選低於50℃。一旦已經將提取物濃縮至所需量，需要加入類胡蘿蔔素的不溶粘料，明確地醇，更明確地甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇和其中番茄紅素的溶解度極低的其它任何醇，因此晶體番茄紅素的產率顯著提高。醇的加入還有純化作用。結晶時間在15分鐘至24小時之間改變，優選1小時至12小時，更優選3至8小時。結晶溫度必須低於25℃，優選低於5℃。
通過過濾或離心，通過用與不溶解使用的相同的醇洗滌置換其中浸沒晶體的結晶液，可以實現從結晶液分離晶體。在室溫下在真空下乾燥獲得的晶體至少1小時，直至獲得滿足前述法規設定的規範和在番茄紅素情形中規定小於0.5％的乾燥失重的殘留溶劑含量。
獲得的晶體的純度相當於大於95％的滴度，其是由分光光度測定法通過讀取在正己烷中的晶體溶液在472nm下的吸光度(E1％1cm＝3450)來測定的，其它類胡蘿蔔素的含量低於3％。順式番茄紅素的含量低於3％。
本發明的方法特別適於從微生物來源中回收晶體番茄紅素，所述微生物來源優選藻類，真菌或酵母，更優選來自Mucorales目的真菌，更優選三孢布拉黴。通過本發明方法和使用被認為是天然方式的溶劑獲得的晶體的異常純度，意味著這些晶體可以用於食品，藥物或化妝品工業。
通過本發明所述方法獲得的晶體產物可以在無氧下(惰性氣氛或真空)以防止氧化和在0-5℃的溫度下，包裝在防止產物光降解的不透明的容器中。可以「照現在的樣子(asis)」搬運和銷售適當包裝的產品。然而，明智的是通過隨後的配製或精加工(finishing)步驟，包括加入抗氧化劑增加它的穩定性，使得當適當的包裝時可以獲得貯存期限大於6個月的最終產品。
本發明另一基本目的是製備番茄紅素的方法，其包括它隨使用番茄紅素的應用特徵而變化的各種形式的製劑。第一種應用，稱為植物油中番茄紅素的微晶混懸液，由上述晶體番茄紅素和不定量的植物油的預混合組成。植物油的類型可以極其多樣，最常見但不是僅有的類型是向日葵油，橄欖油，玉米油，大豆油，棉籽油等。番茄紅素的劑量將是最終所需強度的函數，最常見的值為番茄紅素含量是5-60％，優選10-30％的混懸液。為了提高混合物的穩定性，加入常用的脂溶性的抗氧化劑，如天然生育酚，優選D，L-α-生育酚。相對於番茄紅素重量該化合物的比例在0.2-15％之間變化，優選0.5-5％。對於包含番茄紅素而具有令人滿意的生理活性的製劑，需要減小番茄紅素晶體的大小。這是使用適於液體混合物的常用研磨系統實現的。本發明的特殊目的是球磨，使用直徑為0.5-0.75mm的微球粒，其允許將晶體的大小減小到低於10微米，優選低於5微米，更優選低於2微米。然而，在各種情形下使用適當的球粒和研磨條件，晶體大小可以隨混懸液的具體應用的要求而變化。該晶體大小還將決定混合物的流變性質，特別是它的粘度，其也可以隨需要的要求而調整。這些番茄紅素在油中的微晶混懸液適合於番茄紅素在親油環境人造黃油，奶油，乳膏等中的應用。
第二種應用，稱為冷水可分散的(CWD)番茄紅素製劑，是基於將番茄紅素溶解在有機溶劑中和隨後它在改性澱粉中微囊化。因為該分子顯示高溶解性，最適於進行該溶解的溶劑是氯仿，苯，甲苯等。二氯甲烷特別適合。然而，由於後者的滷化特性，可以使用被認為天然的食品級的溶劑，如醯基酯，優選乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸異丙酯，乙酸丁酯，乙酸異丁酯和其它乙酸酯，其結合了對於類胡蘿蔔素成分的相當高的溶解度和它們作為包括在ICH的III類組中的溶劑的相容性。番茄紅素在有機溶劑中的濃度可以在1-50g/l，優選10-30g/l之間改變。溶解溫度可以在室溫和溶劑的沸點之間改變，優選20-130℃。順式番茄紅素的百分比是番茄紅素溶解在有機溶劑中的操作中的溫度/時間的比率的函數的事實，意味著如果我們想要獲得具有低含量的該異構體的產品，使用低溶解溫度，否則使用極短的溶解時間。因此，為了獲得低水平的順式番茄紅素，如果使用的溶劑是二氯甲烷，可以在20-35℃下溶解1-15分鐘。如果另一方面，溶劑是乙酸異丁酯，優選在70-130℃下進行溶解數秒鐘。然而，如果順式異構體的水平不相關，可以無限制地進行溶解，它的條件是除了達到番茄紅素在所用溶劑中在分子水平上的總溶解度以外。為了提高最終製劑的穩定性，將一種或數種抗氧化劑的混合物與番茄紅素一起溶解在有機溶劑中；優選這些抗氧化劑是諸如生育酚，棕櫚酸抗壞血酸酯等的那些，它們各自比例為相對於番茄紅素重量的1-30％，優選10-20％。為了促進番茄紅素溶解和賦予製劑另外的穩定性，還可以將植物油向日葵油，橄欖油，玉米油，豆油，棉籽油等結合到混合物中。番茄紅素/油的比率可以在10/1至1/10之間改變。
將如此獲得的番茄紅素溶液與水溶液混合和乳化，所述水溶液包含乳化劑，例如改性澱粉，更具體地衍生於澱粉的酯類，優選衍生於各種分子量的澱粉的琥珀酸辛烯酯，特別是但不是排它地，來自National Starch的Purity Gum 2000或來自Roquette的Cleargum CO 01，和微囊化劑，其例如由改性澱粉組成，所述改性澱粉更具體地為衍生於澱粉的酯類，優選衍生於各種分子量的澱粉的琥珀酸辛烯酯，特別是但不是排它地，來自National Starch的HiCap 100或Capsul。乳化劑和微囊化劑的混合比例可以為5/95至95/5，優選25/75至75/25，更優選40/60至60/40。乳化劑和微囊化劑混合物的各種成分的含水量可以變化，可以為1-30％，優選5-20％，更優選10％。將水相和有機相的混合物乳化並將獲得的乳劑均化，其如常規使用，採用Mantón Gaulin或Microfluidizer類型的壓差均化系統，優選通過切向摩擦均化，例如使用Ultraturrax類型的乳化器，乳化時間隨設備提供的能量和待乳化的混合物的體積而變化，以便獲得小於10微米，優選小於2微米和更優選0.1-1微米的平均膠束大小。
一旦乳劑已經形成，優選在低於50℃下通過真空蒸餾進行有機溶劑的蒸發。隨著溶劑蒸發進行，在澱粉基質中發生番茄紅素的微結晶。一旦溶劑已經蒸發，蒸發繼續，連續加入水直至獲得符合由法規制定的關於最大濃度的規範的殘餘溶劑含量，和適合於施用於該液體混合物的乾燥類型的幹殘渣。在微囊化番茄紅素的混懸液中的乾物質的適當的值是1-30％，優選10-20％。
依照本發明，發現通過高溫粉碎(霧化(atomization))乾燥的方法和流化床粉碎(成粒)的方法都適合於乾燥獲得的番茄紅素的水性混懸液。另一種備選是冷凍乾燥。如通過霧化乾燥的方法中所要求，乾燥空氣的適當入口溫度為100-200℃，而出口溫度為60-120℃。霧化的產品具有10-100微米的顆粒大小。為了增大顆粒大小和減小有效面積，和因此增加產品的抗氧化性，通過在所述霧化產品的流化床中粉碎配製所用的改性澱粉之一的溶液，或微囊化番茄紅素其本身的混懸液，可以附聚霧化的產品，使得可以獲得50-500微米，優選200-300微米的顆粒大小。
粒化方法包括使用流化床成粒機，其中放置種子物質(seed material)，其可以是典型的惰性物質，如糖顆粒，或在前面成粒過程中或在噴霧乾燥過程中獲得的待乾燥的實際物質的細粉。藉助空氣保持顆粒運動，床的溫度保持在30-90℃，優選50-80℃。在流化床中藉助預熱至20-140℃的空氣，以保證待塗布的顆粒不變得太溼且不成塊的速率噴霧微囊化的番茄紅素的混懸液。粒狀產品具有100-2000微米，優選100-800微米和更優選100-300微米的顆粒大小。一旦已經完成通過一種或其它方法的粉碎，可以塗布顆粒。可以用約0.5-10％乾重的各種糖或甚至一種澱粉或澱粉混合物的水溶液進行該塗布，所述澱粉組成本發明目的的製劑。
依照布達佩斯條約的微生物保藏按照布達佩斯條約的條款，三孢布拉黴菌株已經保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，Dorozhny Proezd 1，莫斯科113545(俄羅斯)，號碼和日期如下1979年12月21日VKPM F-117，1979年12月20日VKPM F-208，1992年11月19日VKPM F-551，1992年11月19日VKPM F-674，1997年1月21日VKPM F-726，1997年1月21日VKPM F-727，1997年10月7日VKPM F-736，1998年1月28日VKPM F-741，1998年1月28日VKPM F-744和2000年12月13日VKPM F-816。
下列實施例詳細地和不限制性地描述本發明。
實施例1三孢布拉黴(+)和(-)菌株的突變策略首先針對三孢布拉黴(+)和(-)菌株開發誘變方法，為此分析下列各項(i)各種類型的誘變劑，(ii)誘變劑的濃度，(iii)孢子的濃度，(iv)溫育pH，和(v)處理時間。這樣，選擇甲磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)作為誘變劑。
從YpSs培養基的斜面獲得待突變的孢子的混懸液，其具有下列組成酵母提取物4g/l，可溶性澱粉15g/l，K2HPO41g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l和瓊脂15g/l，最終pH為5.8。通過將10ml 0.1％Triton X-100溶液加入每個斜面再懸浮孢子。通過過濾通過孔徑為20μm的尼龍濾器去除菌絲體殘渣。混懸液中孢子的濃度約為106個孢子/ml。
使用EMS的突變方法包括將3％EMS溶液中的106個孢子/ml在0.1M磷酸鈉緩衝液pH7.0中在室溫下溫育60分鐘，獲得約99％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗滌突變的孢子三次並在3000rpm下在15℃下離心2分鐘。
用NTG的突變方法包括將在包含250μg/ml NTG和0.1M檸檬酸鈉緩衝液pH 5.0的溶液中的106個孢子/ml在室溫下溫育30分鐘，獲得約95％的死亡率。用0.1％Triton X-100洗滌突變的孢子三次並在3000rpm下在15℃下離心2分鐘。
用突變的孢子接種含有補充有0.1％Triton X-100的Sutter IV固體培養基的平皿。每升Sutter IV培養基的組成如下40g葡萄糖，4g L-天冬醯胺，10g KH2PO4，40ml 50x痕量元素的溶液，和30g瓊脂。50x痕量元素溶液由下列各項組成25g/l MgSO4·7H2O，1.82g/l CaCl2·2H2O，0.05g/l維生素B1，0.1g/l檸檬酸，0.075g/l Fe(NO3)3·9H2O，0.05g/l ZnSO4·7H2O，0.17g/l MnSO4·H2O，0.025g/l CuSO4·5H2O和0.025g/l NaMoO4·2H2O。將接種的平皿在25℃下溫育4天以獲得分離的菌實施例2選擇番茄紅素過量生產者的三孢布拉黴(-)突變株的策略本實施例描述用於選擇番茄紅素過量生產者的三孢布拉黴(-)菌株的策略，其是基於(i)三孢酸的使用和(ii)菌落的顏色強度。

圖1顯示用於本發明的三孢布拉黴(-)菌株的種系發生。
通過將浸漬三孢酸的直徑約0.6mm的無菌濾器放置在由突變的孢子獲得的菌落上進行通過加入三孢酸選擇生產番茄紅素的突變株。在將樣品酸化到pH 2以後通過用一體積的氯仿從三孢布拉黴(+)和(-)菌株的混合培養物中提取上清液獲得三孢酸。用一體積4％的碳酸氫鈉溶液提取有機級分，收集水相，其被酸化並再次用氯仿提取。接下來，將氯仿蒸發乾，將富含三孢酸的殘渣溶解在乙醇中。通過測量在325nm下的吸光度和假定70ml x mg-1x cm-1的吸光係數定量三孢酸(Sutter R.P.，Capage D.A.，Harrison T.L.，Keen W.A.1973.J.Bacteriology1141074-1082)。
將無菌濾器溫育在1.2mg/ml三孢酸乙醇溶液中和然後在無菌條件下在室溫下放置至乾燥。接下來，將濾器放置在預先在25℃下生長4天的突變株菌落上。將平皿在25℃下溫育另外3天，觀察到生產番茄紅素的突變株變深紅色，與橙色的β-胡蘿蔔素生產者形成對比。
將該方法應用於CMA3(-)菌株，獲得突變株LMA1(-)(圖1)，其可能在編碼酶番茄紅素環化酶的caRP基因中具有突變，因此在類胡蘿蔔素髮酵過程期間不生產β-胡蘿蔔素而應該累積中間體番茄紅素。因此LMA1菌株能夠生產番茄紅素而無需加入番茄紅素環化酶活性的特異性抑制劑(實施例5)。
如下進行根據菌落顏色強度選擇生產番茄紅素的突變株如實施例1所述突變CMA1菌株(β-胡蘿蔔素生產者；參見圖1)。將突變的孢子接種在YEPDA固體培養基(細菌用蛋白腖20g/l，酵母提取物10g/l，葡萄糖20g/l和瓊脂20g/l，最終pH為6.0)的平皿上，在25℃下溫育24小時和然後在20℃下溫育48-72小時。最後，選擇具有比CMA1(-)親代菌株較深黃色-橙色的那些菌落。這樣，分離2個深黃色-橙色的菌落(命名為CMB1(-)和CMB2(-))。CMB1和CMB2菌株可能是在加入番茄紅素環化酶特異性抑制劑(例如咪唑；實施例4)的混合發酵中番茄紅素的過量生產者。
實施例3番茄紅素過量生產者的三孢布拉黴(+)突變株的選擇策略使用在實施例1所述方法中的突變孢子進行番茄紅素過量生產者的三孢布拉黴(+)突變株的選擇。將這些孢子接種在包含補充有0.1％咪唑的Sutter IV固體培養基的平皿上，並在25℃下溫育7天以獲得分離的菌落。接下來，將每個菌落的一部分轉移至其上已經預先接種三孢布拉黴(-)的PDA平皿。(+)和(-)菌株的接種點之間的距離必須約為2cm。從(+)菌株和(-)菌株的菌落的交叉區域中的顏色強度評估固體培養基中番茄紅素的生產水平。這樣選擇三孢布拉黴菌株CPA1(+)，這在與一系列(-)菌株的混合固體培養物中產生更高產率的番茄紅素。然後如實施例4和5所述在液體培養基的混合培養物中分析三孢布拉黴菌株CPA1(+)的生產水平。流程3顯示本發明所用三孢布拉黴(+)菌株的種系發生。
實施例4通過加入酶番茄紅素環化酶抑制劑混合培養三孢布拉黴(+)和(-)菌株在搖瓶中生產番茄紅素的方法為了測定在液體培養基和混合培養物中番茄紅素的生產水平，在搖瓶中發酵如實施例1，2和3所述選擇的三孢布拉黴(+)和(-)菌株。為此，以下列每升組成製備接種培養基23g大豆粉，47g玉米粉，0.5gKH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素，並將pH調整至6.3。以每ml 103個孢子的比率將三孢布拉黴CPA1(+)菌株接種到包含67ml培養基的500ml搖瓶中。以每ml 104個孢子的比率將三孢布拉黴CMB2(-)菌株接種到包含100ml培養基的500ml搖瓶中。將兩種接種物在25℃和250rpm下溫育44小時。
完成溫育後，以1/10(v/v)的比率混合(+)和(-)菌株的接種物，以每個搖瓶4ml菌株混合物的比率將該混合物用於接種包含20m1發酵培養基的250ml搖瓶中。將這些搖瓶在25℃和250rpm下溫育5-6天。所用發酵培養基每升具有下列組成44g大豆粉，19玉米粉，55g KH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素，100ml植物油，並將pH調整至7.5。將培養基分配在250ml搖瓶中，用20％三孢布拉黴(+)和(-)菌株的混合物接種搖瓶。在發酵的第0和第36小時之間，為了在番茄紅素水平上阻斷生物合成途徑，加入酶番茄紅素環化酶的抑制劑(例如0.75mg/ml咪唑)。將搖瓶在25℃和250rpm下溫育6天。在發酵結束時，製備發酵培養基，玻璃珠和二氯甲烷/甲醇(1/1)的混合物。通過渦旋攪拌裂解三孢布拉黴的菌絲體，釋放胞內番茄紅素。將用二氯甲烷/甲醇混合物(比率1∶1)提取的番茄紅素稀釋在丙酮中。使用反向HPLC測定番茄紅素的濃度和純度。
在咪唑存在下，在菌株三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴CMB2(-)菌株的混合發酵中獲得的產率為3g/l番茄紅素(圖1)。
實施例5在未加入酶番茄紅素環化酶抑制劑的情形下通過混合培養三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴LMA1(-)菌株在搖瓶中生產番茄紅素的方法為了測定在液體培養基和混合培養物中番茄紅素的生產水平，在搖瓶中發酵如實施例1，2和3所述選擇的三孢布拉黴LMA1(-)和CPA1(+)菌株。為此，從(+)和(-)菌株製備接種物，如實施例4所述在搖瓶中進行發酵。差異是在該情形下未加入番茄紅素環化酶活性的化學抑制劑。在發酵結束時，如實施例4所述評估番茄紅素的生產。
在缺少咪唑的情形中，通過混合發酵菌株三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴LMA1(-)而獲得的產率為1.2g/l(圖2)。
實施例6在加入酶番茄紅素環化酶抑制劑的情形下通過混合培養三孢布拉黴(+)和(-)菌株在半工業化發酵罐中生產番茄紅素的方法為了測定番茄紅素的產率，在半工業化發酵罐中培養如實施例2和3所述選擇的三孢布拉黴的CPA1(+)和CMB2(-)菌株。為此，以下列的每升組成製備接種物23g大豆粉，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素，並將它的pH調整至6.3。將(+)和(-)菌株分別接種在包含500ml培養基的2000ml搖瓶中，並在25℃和250rpm下溫育44-48小時。
將每種菌株轉移至包含每升具有下列組成的培養基的中間培養罐中29g Pharmamedia，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素和1g防泡劑，並將它的pH調整至6.0。在溫育36-48小時後，以1/10的比率混合(+)和(-)菌株，將20％的混合物用於接種發酵基本培養基，其每升具有下列組成44g大豆粉，19.25g玉米粉，0.55g KH2PO4，3.36gNa2HPO4，0.184g NaH2PO4，0.0022g鹽酸硫胺素，100g植物油和0.175g防泡劑，並將它的初始pH調整至7.5。發酵在25-28℃的溫度下以150-250rpm的攪拌和1-1.5 v/v/m的通氣下溫育100-140小時。在發酵的第25和第35小時之間，將無菌咪唑加至0.75g/l的終濃度。
如實施例4所述進行在發酵結束時番茄紅素的濃度和純度的評估。在CPA1(+)和CMB2(-)菌株的一系列不同發酵中獲得的番茄紅素產率的平均值為3.4g/l(圖2)。
實施例7在未加入酶番茄紅素環化酶抑制劑的情形下通過混合培養菌株三孢布拉黴CPA1(+)和三孢布拉黴LMA1(-)在半工業化發酵罐中生產番茄紅素的方法為了在未加入酶番茄紅素環化酶抑制劑的情形下測定番茄紅素的生產水平，在半工業化發酵罐中培養如實施例2和3所述方法選擇的三孢布拉黴的CPA1(+)和LMA1(-)菌株。為此，以下列的每升組成製備接種培養基23g大豆粉，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素，並將它的pH調整至6.3。將(+)和(-)菌株分別接種在包含500ml培養基的2000ml搖瓶中，並在25℃和250rpm下溫育44-48小時。
將每種菌株轉移至包含每升具有下列組成的培養基的中間培養罐中29g Pharmamedia，47g玉米粉，0.5g KH2PO4，0.002g鹽酸硫胺素和1g防泡劑，並將它的pH調整至6.0。在溫育36-48小時後，以1/10的比率混合(+)和(-)菌株，將20％的混合物用於接種發酵基本培養基，其每升具有下列組成44g大豆粉，19.25g玉米粉，0.55g KH2PO4，3.36gNa2HPO4，0.184g NaH2PO4，0.0022g鹽酸硫胺素，100g植物油和0.175g防泡劑，並將它的初始pH調整至7.5。發酵在25-28℃的溫度下以150-250rpm的攪拌和1-1.5 v/v/m的通氣下溫育100-140小時。
如實施例4所述進行在發酵結束時番茄紅素的濃度和純度的評估。在CPA1(+)和LMA1(-)菌株的一系列不同發酵中在未加入咪唑的情形下獲得的番茄紅素產率的平均值為1.6g/l(圖2)。
實施例8通過再懸浮生物量於醇中回收番茄紅素的方法按照其中生物合成途徑在番茄紅素水平上中斷的生物合成方法，收穫三升發酵培養基。培養基的滴定度為3g番茄紅素/升。通過用瓷漏鬥(陶瓷過濾器漏鬥，其支持作為濾板的紙盤或卡片)過濾回收該培養基的生物量，獲得750g溼生物量。將溼生物量再懸浮在5.21共沸異丙醇85/15中，並在45±5℃下攪拌30分鐘。重複使用瓷漏鬥回收純化的生物量。將該生物量在真空下在低於45±5℃的溫度下在爐中乾燥18小時，直至殘留溶劑/水的含量小於8％。獲得150g乾燥的純化的生物量，番茄紅素含量等於5.5％的分析值。將乾燥生物量在球磨和1mm的篩網中研磨，獲得具有相同百分比含量的固體，將其調整以允許溶劑提取。
通過在70±5℃下混合150g磨碎的生物量和2500ml乙酸異丁酯，繼續攪拌5分鐘來進行提取。通過在濾板上過濾從富含番茄紅素的溶劑中分離廢棄(spent)的生物量。在相同的濾器上用300ml熱的乙酸異丁酯洗滌廢棄的生物量，將洗滌溶劑與濾液混合。在真空下濃縮所有富含番茄紅素的乙酸異丁酯，保持溫度低於45±5℃，直至體積減小到300ml，因此一些番茄紅素結晶。為了完成結晶和獲得更純的番茄紅素，加入900ml異丙醇。在氮氣下和在0-5℃下繼續攪拌混合物3小時。在瓷漏鬥中過濾，在瓷漏鬥上用25ml異丙醇洗滌晶體。收集晶體，然後在真空下乾燥，獲得6.5g番茄紅素晶體，分光光度法的純度為95％。HPLC未檢測到其它類胡蘿蔔素和順式番茄紅素的存在。
實施例9在油狀混懸液中配製番茄紅素的方法用下列各項，以下列順序充滿來自Netzsch的Minizeta 003型的實驗室球磨直徑為0.5-0.75mm的微球粒，23.5g向日葵油(Koipe)，0.065gD，L-α-生育酚(Merck)和6.5g如實施例8所述獲得的晶體番茄紅素。在3000rpm下研磨混合物5分鐘，獲得25g帶深紅色-紫色的粘性液體。油狀混懸液的分光光度分析顯示21％的番茄紅素含量。HPLC未檢測到其它類胡蘿蔔素和番茄紅素順式異構體的存在。晶體小於10微米。
實施例10通過用醇直接處理髮酵培養基回收番茄紅素的方法將1500升番茄紅素髮酵培養基(番茄紅素強度2.3g/l)直接與4500升85/15異丙醇/水共沸混合物混合。在45±5℃下攪拌30分鐘以後，使用離心潷析器從液體中分離生物量。收集約250kg溼的，純化的生物量。
在真空下在轉筒式乾燥機中乾燥用水和異丙醇浸漬的這種生物量，直至殘留的溶劑/水的含量低於8％。乾燥溫度為45±5℃，在乾燥機中的平均停留時間為14小時。獲得85kg乾燥的生物量，番茄紅素含量相當於3.75％的比濃度。
在來自BEPEX的Hutt-Compacktor壓實機中擠壓乾燥的生物量，獲得具有相同比濃度的固體，調節其以允許溶劑提取。
通過混合85kg磨碎的固體和1650升乙酸異丁酯進行提取。在60±5℃下有成直線地加熱混合物，平均接觸時間約為2分鐘，使用離心潷析器從富含番茄紅素的溶劑中分離廢棄的生物量。在真空下濃縮全部的富含番茄紅素的乙酸異丁酯，保持溫度低於45±5℃，直至體積減小到100升，因此一部分番茄紅素結晶。為了完成番茄紅素的結晶，加入300ml異丙醇。在0-5℃下攪拌混合物3小時。在瓷漏鬥上過濾，收集番茄紅素的晶體，其在真空下在室溫下乾燥。獲得2kg產品，分光光度法的純度為96％。HPLC未檢測到其它類胡蘿蔔素和順式異構體的存在。
實施例11使用乙酸異丁酯作為溶劑配製水可分散的番茄紅素的方法將3.5g如實施例10所述獲得的番茄紅素重懸浮在410ml乙酸異丁酯中並加入0.35g D，L-α-生育酚(Merck)。將混合物加熱至沸騰(114℃)5分鐘，保證番茄紅素的完全溶解。同時，將12g Hi-Cap 100(National Starch)和12g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在325ml軟化水中。使用來自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步內乳化熱的有機相5分鐘，獲得1.2微米的平均膠束大小，其用Coulter LS230分析器測量。將乳劑轉移至真空蒸餾系統，加入600ml水，以便用約700ml水蒸發410ml乙酸異丁酯。獲得203g液體製劑(12.75％乾物質)，番茄紅素含量為1.25％(基於乾物質9.8％)。使用HPLC，檢測到23.3％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。使用在入口190℃和出口90℃的氣體溫度，將該液體製劑在Büchi 190實驗室霧化器中霧化，獲得深紅色粉末，番茄紅素含量為8.4％，含水量為6.5％。使用HPLC，檢測到23％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。
實施例12使用乙酸異丁酯作為溶劑配製水可分散的番茄紅素的方法將3.5g如實施例10所述獲得的番茄紅素再懸浮在410ml乙酸異丁酯中，加入0.35g D，L-α-生育酚(Merck)，0.7g棕櫚酸抗壞血酸酯(Merck)和3.5g向日葵油(Koipe)。將混合物加熱至沸騰(114℃)5分鐘，保證番茄紅素的完全溶解。同時，將10g Hi-Cap 100(National Starch)和10g PurityGum 2000(National Starch)溶解在325ml軟化水中。使用來自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步內乳化熱的有機相5分鐘，獲得1.4微米的平均膠束大小，其用Coulter LS230分析器測量。將乳劑轉移至真空蒸餾系統，加入600ml水，以便用約700ml水蒸發410ml乙酸異丁酯。獲得195g液體製劑(13.25％乾物質)，番茄紅素含量為1.3％(基於乾物質9.8％)。使用HPLC，檢測到25％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。使用在入口190℃和出口90℃的氣體溫度，將該液體製劑在Büchi 190實驗室霧化器中霧化，獲得深紅色粉末，番茄紅素含量為8.5％，含水量為6.0％。使用HPLC，檢測到24.5％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。
實施例13使用二氯甲烷作為溶劑配製水可分散的番茄紅素的方法將7.5g如實施例10所述獲得的晶體番茄紅素再懸浮在500ml二氯甲烷中，加入0.75g D，L-α-生育酚(Merck)，在35℃下加熱混合物5分鐘。同時，將27g Hi-Cap 100(National Starch)和27g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在400ml軟化水中。使用來自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步內乳化有機相15分鐘，獲得0.4微米的平均膠束大小，其用Coulter LS230分析器測量。將乳劑轉移至真空蒸餾系統，加入600ml水，以便用約600ml水蒸發500ml二氯甲烷。獲得400g液體製劑(13.1％乾物質)，番茄紅素含量為1.5％(基於乾物質11.5％)。使用HPLC，檢測到6.5％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。使用在入口190℃和出口90℃的氣體溫度，將該液體製劑在Büchi 190實驗室霧化器中霧化，獲得深紅色粉末，番茄紅素含量為10.6％，含水量為5.3％。使用HPLC，檢測到6.4％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。
實施例14使用二氯甲烷作為溶劑配製水可分散的番茄紅素的方法將7.5g如實施例10所述獲得的晶體番茄紅素再懸浮在500ml二氯甲烷中，加入0.75g D，L-a-生育酚(Merck)，在35℃下加熱混合物5分鐘。同時，將27g Hi-Cap 100(National Starch)和27g Purity Gum 2000(National Starch)溶解在400ml軟化水中。使用來自IKA的Ultraturrax乳化器在水相上在一步內乳化有機相60分鐘，獲得0.23微米的平均膠束大小，其用Coulter LS230分析器測量。將乳劑轉移至真空蒸餾系統，加入600ml水，以便用約600ml水蒸發500ml二氯甲烷。獲得350g液體製劑(14.4％乾物質)，番茄紅素含量為1.6％(基於乾物質11.4％)。使用HPLC，檢測到20％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。在實驗室裝置中將該液體製劑冷凍乾燥24小時，獲得鬆軟的深紅色粉末，番茄紅素含量為10.7％，含水量為7.4％。使用HPLC，檢測到15％的順式番茄紅素的含量，但未檢測到其它類胡蘿蔔素。
附圖詳述圖1.通過在搖瓶中混合發酵三孢布拉黴CPA1(+)菌株和三孢布拉黴(-)的下列菌株中的每一種生產番茄紅素L25，CMA1，CMA2，CMA3，CMA4，CMB1，CMB2和LMA1。除了在CPA1(+)/LMA1(-)混合發酵中以外，加入咪唑作為酶番茄紅素環化酶的抑制劑。縱坐標用對照菌株L25(-)(VKPM F-744)的生產％。
圖2.通過在發酵罐中混合發酵三孢布拉黴CPA1(+)菌株和三孢布拉黴(-)的下列菌株中的每一種生產番茄紅素L25，CMA1，CMA2，CMA3，CMB1，CMB2和LMA1。除了在CPA1(+)/LMA1(-)混合發酵中以外，加入咪唑作為酶番茄紅素環化酶的抑制劑。縱坐標用對照菌株L25(-)(VKPM F-744)的生產％。
權利要求
1.一種從生物合成來源生產番茄紅素的方法，其特徵在於它包含下列連續步驟a.任選地，在適於生產番茄紅素的條件下混合發酵三孢布拉黴(Blakeslea trispora)的(+)和(-)菌株，b.用醇直接處理天然生物合成來源，特別是發酵培養基，和分離溼的純化的生物量，c.通過乾燥和分解或破裂調節所述溼的純化的生物量，d.用有機溶劑固-液提取包含在所述純化的生物量中的番茄紅素，e.濃縮所述富含番茄紅素的提取物，f.通過加入醇從所述濃縮的提取物中沉澱/結晶番茄紅素，g.過濾和乾燥，h.配製。
2.如權利要求1所要求的生產番茄紅素的方法，其特徵在於所述天然生物合成來源不是發酵培養基，而是包含番茄紅素的植物組織，其一旦均化後直接進行步驟b。
3.如權利要求1和2任一所要求的方法，其特徵在於獲得結晶產品，通過在472nm下在正己烷中晶體的分光光度計的吸光度(E1％ 1cm＝3450)測定，其番茄紅素含量大於95％，其它類胡蘿蔔素的含量小於3％，並且順式番茄紅素的含量也小於3％。
4.如權利要求1所要求的方法，其特徵在於在所述任選步驟a中，與(+)菌株一起，使用三孢布拉黴(-)菌株，衍生於它們的生產番茄紅素的突變株或轉化體，優選在流程2中所述的那些。
5.如權利要求1所要求的方法，其特徵在於在所述任選步驟a中，與(-)菌株一起，使用三孢布拉黴(+)菌株，衍生於它們的生產番茄紅素的突變株或轉化體，優選在流程3中所述的那些。
6.如權利要求1所要求的方法，其特徵在於所述任選步驟a在缺少番茄紅素環化酶活性的抑制劑化合物的情形下，使用三孢布拉黴(-)和(+)菌株或衍生於它們的生產番茄紅素的突變株或轉化體的混合培養物。
7.如權利要求1所要求的方法，其特徵在於所述任選步驟a在番茄紅素環化酶活性的抑制劑的化合物的存在下，使用三孢布拉黴(-)和(+)菌株或衍生於它們的生產番茄紅素的突變株或轉化體的混合培養物。
8.如權利要求7所要求的方法，其特徵在於在所述發酵過程期間加入咪唑作為番茄紅素環化酶活性的抑制劑。
9.如權利要求8所要求的方法，其特徵在於在發酵的第0和第50小時之間，優選在第25小時和第35小時之間加入咪唑。
10.如權利要求8和9所要求的方法，其特徵在於咪唑的濃度保持在0.7-0.8g/l，優選為0.75g/l。
11.如權利要求7至10所要求的方法，其特徵在於在半工業化或中試發酵罐中在5-6天生產至少3.4g/l番茄紅素。
12.如權利要求6所要求的方法，其特徵在於在半工業化或中試發酵罐中在5-6天生產至少1.6g/l番茄紅素。
13.如權利要求4至12任一項所要求的方法，其特徵在於控制三孢布拉黴菌株生長營養階段的齡期。
14.如權利要求13所要求的方法，其特徵在於用作接種物的培養物的齡期為30-60小時，優選48小時。
15.如權利要求13所要求的方法，其特徵在於初級營養培養物的齡期為30-60小時，優選為36-48小時。
16.如權利要求13至15中任何一項所要求的方法，其特徵在於i)將三孢布拉黴(+)菌株的接種物以800-1000個孢子/ml接種，ii)將三孢布拉黴(-)菌株的接種物以10 000-60 000個孢子/ml接種，iii)在25℃下培養三孢布拉黴(+)和(-)菌株的接種物至少48小時，iv)用至少0.1％(v/v)接種期接種三孢布拉黴(+)菌株的各期初級培養物，v)用至少0.1％(v/v)接種期接種三孢布拉黴(-)菌株的各期初級培養物，vi)在26℃下培養初期三孢布拉黴(+)菌株36-48小時，vii)在28℃下培養初期三孢布拉黴(-)菌株36-48小時，viii)以1(+)/10(-)(v/v)的比例混合初期三孢布拉黴(+)和(-)菌株，ix)用10-20％(v/v)的在段落viii中描述的三孢布拉黴(+)和(-)菌株的混合物接種每個發酵罐，x)將混合培養物在26℃下溫育5-6天。
17.如權利要求16所要求的方法，其特徵在於在5-6天生產至少3.6g/l番茄紅素。
18.如權利要求17所要求的方法，其特徵在於在5-6天每克乾重的菌絲體生產至少30mg番茄紅素。
19.如權利要求1至18中任何一項所要求的方法，其特徵在於通過以約為1ml/g至10ml/g的醇/生物量比率再懸浮生物量於醇中來在步驟b中進行純化。
20.如權利要求1至19中任何一項所要求的方法，其特徵在於在步驟b中，在0℃和對應於它的沸點之間的溫度，優選10℃至50℃下使用醇。
21.如權利要求1和4至18中要求的方法，其特徵在於在步驟b中直接通過混合發酵培養基和醇進行純化，所述發酵培養基/醇比率為1/0.5至1/5，優選1/1至1/3，溫度為室溫和所述混合物的沸點之間，優選在室溫和60℃之間。
22.如權利要求1至21中任何一項所要求的方法，其特徵在於在固體-液體提取的步驟d中使用酯類型的溶劑，優選乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸異丙酯，乙酸正丁酯或乙酸異丁酯。
23.如權利要求22所要求的方法，其特徵在於每克生物量使用約5-30ml的量的溶劑。
24.如權利要求22和23所要求的方法，其特徵在於所述溶劑在接近它的沸點範圍下，優選在50-80℃下使用。
25.如權利要求22和23所要求的方法，其特徵在於以與所述番茄紅素接觸的時間小於15分鐘這樣的方式使用所述溶劑。
26.如權利要求1至25中任何一項所要求的方法，其特徵在於在步驟f中，通過加入其中番茄紅素具有低溶解度的溶劑進行提取後濃縮產品的沉澱，所述溶劑如甲醇，乙醇，丙醇或異丙醇，其確保伴隨番茄紅素的親油特性的物質保持溶解。
27.如權利要求1至26中任何一項所要求的方法，如所要求的其中獲得的產品是穩定的並可以「照現在的樣子」以晶體形式搬運和銷售。
28.如權利要求1至27中任何一項所要求的方法，其中所述配製階段h由通過以適當比例預混合番茄紅素，抗氧化劑和油來配製番茄紅素的微晶混懸液，接著研磨組成。
29.如權利要求28所要求的方法，其中所用的油是來源於植物，優選來自向日葵，橄欖，玉米，棉籽或大豆。
30.如權利要求28和29所要求的方法，其特徵在於研磨是在球磨中進行的。
31.如權利要求28至30所要求的方法，其特徵在於使用脂溶性的抗氧化劑，優選天然生育酚，比例為相對於所述混合物中番茄紅素重量的0.2-15％，優選0.5-5％。
32.如權利要求28至31中任何一項所要求的方法，其特徵在於獲得番茄紅素在油中的微晶混懸液，晶體大小小於10微米，優選小於5微米，更優選小於2微米。
33.如權利要求1至27中任何一項所要求的方法，其中配製步驟h包含通過包含下列步驟的方法製備冷水可分散的(CWD)番茄紅素I.將伴有抗氧化劑化合物的晶體番茄紅素溶解在有機溶劑中，II.在改性澱粉的水溶液中乳化或微囊化上述有機相，III.通過蒸發消除所述溶劑和一些水，獲得液體製劑，IV.乾燥和修整。
34.如權利要求33所要求的方法，其特徵在於在步驟I中將二氯甲烷用作溶解番茄紅素的溶劑。
35.如權利要求33所要求的方法，其特徵在於在溶解番茄紅素的步驟I中將醯基酯用作溶劑，所述醯基酯特別是乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸異丙酯，乙酸正丁酯或乙酸異丁酯。
36.如權利要求33至35所要求的方法，其特徵在於在溶解番茄紅素的步驟I中使用一種抗氧化劑或抗氧化劑的混合物，優選生育酚或棕櫚酸抗壞血酸酯類型的抗氧化劑，比例為相對於所述番茄紅素重量的1-30％，優選10-20％。
37.如權利要求33至36所要求的方法，其特徵在於在溶解番茄紅素於有機溶劑的步驟I中另外使用植物油。
38.如權利要求33至37所要求的方法，其特徵在於在步驟II中將改性澱粉，優選酯類的形式和更優選琥珀酸辛烯酯，用作乳化劑或微囊化劑。
39.如權利要求33至38所要求的方法，其特徵在於獲得乳劑，其平均膠束大小小於10微米，優選小於2微米和更優選0.1-1微米。
40.如權利要求33至39所要求的方法，其特徵在於通過選自以下各項的方法進行乾燥液體製劑的步驟IV高溫粉碎(霧化)，在相對低的溫度下在流化床上粉碎(粒化)，或冷凍乾燥。
41.如權利要求33至40所要求的方法，其特徵在於在步驟IV中，修整由以0.5-10％的比例用糖或改性澱粉的水溶液塗布顆粒組成。
42.如在權利要求33至41中任何一項的方法所要求可以獲得的製劑，其特徵在於它由番茄紅素在油中的微晶混懸液組成，晶體小於10微米，優選小於5微米和更優選小於2微米。
43.如在權利要求33至41中任何一項的方法所要求可以獲得的製劑，其特徵在於它由番茄紅素微晶的顆粒組成，平均顆粒大小為100-2000微米，優選100-800微米和更優選100-300微米。
44.如在權利要求33至41中任何一項的方法所要求可以獲得的製劑，其特徵在於它由霧化的番茄紅素微晶組成，平均顆粒大小為10-100微米。
45.如在權利要求33至41中任何一項的方法所要求可以獲得的製劑，其特徵在於它由霧化的番茄紅素微晶的附聚物組成，平均顆粒大小為50-500微米，優選200-300微米。
46.如權利要求43至45中任何一項要求的製劑，其特徵在於它用0.5-10％乾重的糖或改性澱粉的水溶液塗布。
47.權利要求42的製劑作為著色劑的應用，特別是在食品，藥物和化妝品領域中。
48.權利要求42的製劑作為食品添加劑的應用。
49.權利要求43至46的製劑的任何一種作為著色劑的應用，特別是在食品，藥物和化妝品領域中。
50.權利要求43至46製劑的任何一種作為食品添加劑的應用。
全文摘要
使用選擇的本發明所述三孢布拉黴菌株的發酵方法可以實現高於當前所述那些的番茄紅素產率。分離，純化和配製的方法可適用於任何天然來源的番茄紅素，特別是布拉黴屬，笄黴屬，須黴屬或毛黴屬的毛黴真菌的浸沒培養物。相對於先前所述方法，該提取方法可以簡化回收步驟和提高產品的純度。因為它們可以獲得直接應用於食物和藥物領域的穩定的番茄紅素製劑，該配製方法提供了高的附加值。
文檔編號A23L1/275GK1617934SQ02826536
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月20日 優先權日2001年12月31日
發明者安娜特雷莎·馬科斯羅德裡格斯, 安東尼奧·埃斯特雷利亞德卡斯楚, 哈維爾·科斯塔佩雷斯, 曼努埃爾安東尼奧·奧利弗魯伊斯, 涅韋斯·弗賴萊耶科拉, 胡安路易斯·德拉富恩特莫雷諾, 馬爾塔·羅德裡格斯賽斯, 布魯諾·迭斯加西亞, 恩裡克·佩羅塞松, 安赫爾·穆尼奧斯魯伊斯, 瓦爾特·卡布裡, 胡安弗朗西斯科·洛佩斯奧爾蒂斯, 何塞路易斯·巴雷多富恩特 申請人:維塔特內有限公司