癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法
2023-05-27 15:50:11
專利名稱：癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法
技術領域：
本發明屬碳納米管複合材料的製備領域，特別是涉及一種癌細胞耙向診斷聚醯胺胺/ 碳納米管複合材料的製備方法。
背景技術：
近期的納米科學與技術的研究進展顯示，碳納米管作為一個多功能的平臺，被廣泛地 應用於生物醫學領域，如蛋白和多肽的傳遞，藥物和基因的輸送，醫學成像，以及癌症的 靶向與治療等。但是，碳納米管表面能很高，且管與管之間作用力(範德華力和靜電力) 強使得碳納米管容易聚集成大的束狀，導致碳納米管的分散性差。碳納米管在生物醫學上 的應用一般以提高碳納米管的水溶性和生物相容性為前提。
目前，比較成功的常用於提高碳納米管在各種溶劑中分散性的方法主要有超聲法、表 面活性劑穩定法和共價鍵修飾法。而碳納米管化學功能化修飾法(共價鍵修飾法)由於其 能在提高碳納米管溶解度的同時，還能賦予所製備的碳納米管複合材料新的性能而成為制 備功能性碳納米管的、最具有前景的方法。適宜於和碳納米管進行共價連接的典型化學物 質主要有多肽、酸、胺基酸、聚合物、聚賴氨酸以及各種小分子等。國內外的研究者對碳 納米管的表面功能化修飾展開了大量的研究。朱靖等採用原位酯交換聚合的方法，在多壁 碳納米管表面接枝多羥基超枝化的聚(胺一酯)來對其進行表面修飾。對比多壁碳納米管 改性前後的分散性能發現，經超枝化聚(胺一酯)修飾過的多壁碳納米管要更容易分散在 多種溶劑中，且在水中可穩定分散一個月，沒有沉澱產生。KamN.W.S.等先將端基為氨基 或馬來醯亞胺的磷脂大分子聚乙二醇(PL-PEG)通過非共價鍵吸附的方式修飾在單壁碳納 米管的表面，形成SWNT-PL-PEG—SS複合納米管，再將複合碳納米管上的二硫鍵斷裂以 接枝各種生物大分子，合成功能性的碳納米管。實驗結果證實，該功能性碳納米管在溶液 中能穩定分散，具有良好的生物相容性，能夠用於DNA寡核苷酸的傳輸、釋放和轉染。 專利"一種製備聚噻吩或其衍生物一多壁碳納米管複合材料的方法"(專利公開號為CN 1923888A)將聚噻吩或其衍生物高分子包覆在碳納米管表面形成以碳納米管為核，以聚噻 吩或其衍生物為殼的核殼納米結構，其溶解性能可以通過改變噻吩環上取代基的種類進行 調節。這種材料可用在光電顯示、納米器件以及場發射器件等領域。
在目前用於對碳納米管進行功能化處理的各種聚合物高分子或生物活性分子中，樹狀 大分子以其高度支化、球形結構和低分散性的特點使得其成為納米生物醫學領域的理想載 體。聚醯胺胺(poly(amidoamine)， PAMAM)樹狀大分子由於獨特的性能使其成為結合染料、
4靶向試劑以及藥物分子的理想平臺，以用於癌細胞的多功能成像、耙向和治療。另外，還 通過各種模板、穩定化或組裝的辦法，合成樹狀大分子包裹的、穩定化的或組裝的無機納 米粒子用於生物醫學領域，特別是腫瘤的早期顯像和治療。最新的進展表明，樹狀大分子 可以共價性地修飾在碳納米管表面，為後續納米複合材料的合成、組裝或進一步的電子或 生物學應用提供中間體材料。這意味著，通過對碳納米管表面進行樹狀大分子修飾和功能 化，將有可能合成廣泛地應用於生物醫學領域的各種複合納米材料。
檢索國內外有關碳納米管功能化處理的文獻和專利結果表明，用樹狀大分子對碳納米
管進行功能化修飾，用於癌細胞靶向診斷治療的研究還未見相關報導。
本發明所要解決的技術問題是提供一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料 的製備方法，該製備方法簡單，反應條件溫和，易於操作，所用的聚合物均為環境友好的 高分子材料，具有產業化實施的前景，且該功能化碳納米管能夠長時間地分散在溶液中， 沒有團聚現象發生，且功能化的多壁碳納米管具有良好的生物相容性，能靶向地結合到癌 細胞上，可用於癌細胞的早期靶向診斷。
本發明的反應方程式如下
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本發明的一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法，包括
(1) 將碳納米管CNT進行酸化處理2h，過濾，水洗，於60 'C真空乾燥，備用；
(2) 聚醯胺胺樹狀大分子的異硫氰酸螢光素FI和葉酸FA的修飾
a.在含有60 mg聚醯胺胺PAMAM的24 mL無水二甲基亞碸DMSO溶劑中逐滴滴加 含有4.4mgFI的24mLDMSO溶液，室溫下強磁力攪拌24小時，隨後將反應產物用纖維 素透析膜逐次在PBS緩衝溶液4LX3和超純水4LX3，透析3天，最後將純化後的產物冷 凍乾燥得到G5.NH2-FI;
或b.①在含有60 mg PAMAM的24 mL無水DMSO溶劑中逐滴滴加含有4.4 mg FI
發明內容的24mLDMSO溶液，室溫下強磁力攪拌24小時，隨後將反應產物用纖維素透析膜逐次 在PBS緩衝溶液4LX3和超純水4LX3，透析3天，最後將純化後的產物冷凍乾燥得 G5.NH2-FI;
②將3.7 mg FA和9.3 mg l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽EDC溶解在3 mLDMSO溶液中，室溫條件下磁力攪拌3小時，將反應後的溶液逐漸滴加到12mL含30 mgG5,NH2-FI的DMSO溶液中，室溫條件下強磁力攪拌3天，將反應後的產物用纖維素 透析膜逐次在PBS緩衝液4LX3和超純水4LX3，透析3天，最後將純化後的產物冷凍 乾燥得G5.NH2-FI-FA;
(3) 取16.68 mg酸化處理後的碳納米管分散於12mL超純水中，隨後將含有12.82 mg EDC的DMSO溶液2 mL滴加到碳納米管的水溶液中，強磁力攪拌，反應3小時；
(4) 將含有4.6mg步驟(2)製備的修飾PAMAM樹狀大分子的lmL水溶液滴加到 步驟(3)的所得溶液中，強磁力攪拌下反應48小時，即得CNT/G5.NH2-FI-FA或 CNT/G5.NH2-FI，並分散在超純水溶液中、離心，重複3 6次；
(5) 將步驟(4)中製備的CNT/G5.NH2-FI-FA或CNT/G5.NH2-FI複合物分散在10 mL
超純水中，與9.8-三乙胺溶液充分混合後，逐滴加入含7.2 mg醋酸酐的甲醇溶液1 mL，
強磁力攪拌下反應24小時，製得表面電荷為中性的CNT/G5.NHAc-FI-FA或 CNT/G5.NHAc-FI複合物；
(6) 將步驟(5)製備的複合物用纖維素透析膜逐次在PBS緩衝液4LX3和超純水 4LX3，透析3天，最後冷凍乾燥保存，即可。
所述步驟(1)中的碳納米管為單壁或多壁碳納米管；
所述步驟(1)中酸化處理所用的酸為濃硝酸或濃硝酸與濃硫酸的混合酸，混合酸中 HN03/H2S04-3: 1 (v/v);
所述步驟(2)和(6)中的纖維素透析膜為MWCO10000 50000纖維素透析袋，以盡 可能去除殘留在所製備產物中的溶劑、過量的反應試劑以及副產物等。
本發明以端基為氨基的第5代樹狀大分子聚醯胺胺(PAMAM)為中間體，在其表面 接枝5個異硫氰酸螢光素(FI)分子和5個葉酸分子(FA),形成G5,NH2-FI-FA化合物， 再通過EDC化學鍵合法將G5.NH2-FI-FA通過共價鍵結合到酸化處理的碳納米管 (MWCNTs)的表面，合成具有良好水溶性的多壁碳納米管/樹狀大分子納米複合物，最後 將樹狀大分子表面的剩餘端氨基通過乙醯化反應使其表面電荷呈中性，以提高生物相容性，該方法製備的多壁碳納米管/樹狀大分子納米複合物能用於癌細胞的耙向診斷。 具體涉及兩步基本反應(1)將修飾了FI和FA分子的、端基為氨基的PAMAM (G5.NH2-FI-FA)通過EDC化學鍵合法與酸化處理後的多壁碳納米管表面的羧基反應，
得到MWCNT/G5.NH2-FI-FA複合物；(2)將功能性MWCNT/G5.NH2-FI-FA複合物表面
剩餘的樹狀大分子的端氨基與醋酸酐進行乙醯化反應，得到表面電荷呈中性的功能性複合
碳納米管MWCNT/G5.NHAc-FI-FA。
本發明使用紫外一可見光分光光度計(UV-Vis)、核磁共振譜(NMR)、透射電子顯微
鏡(TEM)、 zeta電勢測量等方法表徵本發明製備的功能化碳納米管，同時用MTT法、流
式細胞術分析和雷射共聚焦顯微鏡來檢驗功能化多壁碳納米管對人體上皮癌細胞系KB細
胞的毒性，具體測試結果如下
(1) 紫外一可見光分光光度計的測試結果
沒有經過表面修飾的MWCNT在255 nm處有一個吸收峰，對應於碳納米管的特徵吸 收峰，對於經過耙向和非靶向修飾的MWCNT，其紫外吸收光譜上均明顯顯示出螢光素(FI) 的吸收峰500nm，這就表明樹狀大分子已經成功接枝到MWCNT上，MWCNT/G5.NHAc-^1〗八在26011111處的較強吸收可能是葉酸(280nm)和MWCNT(255 nm)的吸收重疊引起 的；
相反，在相同波長260 nm下，MWCNT/G5.NHAc-FI只有很微弱的MWCNT吸收峰。 參見
書l;功能化的MWCNTs能穩定分散在水和PBS緩衝液中，4'C下保存6個 月沒有沉澱產生，參見
書2;
(2) 核磁共振譜(氫譜)測試結果
核磁共振譜的測試結果表明樹狀大分子己經成功地修飾在MWCNT表面，從樹狀大 分子修飾的多壁碳納米管的核磁共振譜圖中可以看到，在1.85ppm處，有一個明顯的質子 峰，對應著乙醯基上甲基的特徵峰，而且，乙醯化反應並沒有改變MWCNT/G5.NHAc-FI-FA 和MWCNT/G5.NHAc-FI上的FI和FA原有的信號峰，參考
書3;
(3) TEM測試結果
TEM測試結果顯示，MWCNT的形貌在樹狀大分子修飾前後沒有明顯的改變，且沒 有發現MWCNT的聚集，表明樹狀大分子均勻地修飾在碳納米管壁上，參考
書4;
(4) zeta電勢測量結果
表面電勢測定結果表明，乙醯化反應之後，MWCNT/G5.NHrFI-FA的表面電勢從+28.3 mV降到和+3.1mV， MWCNT/G5.NH2-FI電勢則從+31.6 mV降低到+4.5 mV,均呈現為電荷中性，進一步證實了乙醯化反應的成功進行；
(5) MTT細胞毒性測試結果
MTT法測試功能性多壁碳納米管對KB細胞的毒性結果表明，濃度範圍在0-100pg/mL
時，KB細胞經過MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA處理24小時後，MTT 法測試的OD值和PBS緩衝液對照組一樣，參考
書5;細胞形貌觀察結果顯示， 即使在碳納米管的濃度高達100g/mL時，所有細胞都非常健康；
(6) 流式細胞術分析結果
在本發明中，FA受體高表達和低表達的KB細胞被選用於細胞的耙向診斷研究(FA 受體高表達的細胞縮寫為KB-HFAR, FA受體低表達的細胞縮寫為KB-LFAR)。， KB-HFAR 和KB-LFAR細胞經納米複合物處理1小時後的流式細胞術分析結果顯示，將KB-HFAR 細胞用MWCNT/G5.NHAc-FI-FA處理後，細胞表現出巨大的螢光信號增強；
相反，相同的細胞經MWCNT/G5.NHAc-FI處理後，其螢光信號與PBS緩衝液的對 照組相似，這就說明KB-HFAR與MWCNT/G5.NHAc-FI沒有結合；而KB-LFAR細胞用 MWCNT/G5.NHAc-FI-FA或MWCNT/G5.NHAc-FI-FA處理後，其細胞的螢光強度都和 PBS對照組一樣；
這些結果表明，MWCNT/G5.NHAc-FI-FA可以特異性地與KB-HFAR細胞結合，此 外，細胞對FA修飾的MWCNT的吸附依賴於其濃度，對KB-LFAR細胞來說，儘管濃度 增加到10 g/mL， MWCNT/G5.NHAc-FI-FA和MWCNT/G5.NHAc-FI都沒有顯示較大
的結合。參考
書6;
(7) 雷射共聚焦顯微鏡測試結果 雷射共聚焦顯微鏡的測試結果進一步顯示，只有FA修飾的多壁碳納米管MWCNT/G5.
NHAc-FI-FA對KB-HFAR細胞具有較強的螢光信號，證實了功能化的多壁碳納米管在細胞 中的內化和對細胞膜的結合；
相反，用MWCNT/G5.NHAc-FI處理的細胞的螢光信號與PBS緩衝液對照組的相同。 參考
書7。 有益效果
(1)本發明的功能化碳納米管能夠長時間地分散在溶液中，沒有團聚現象發生，且功能 化的多壁碳納米管具有良好的生物相容性，能靶向地結合到癌細胞上，可用於癌細胞的早 期耙向診斷；(2) 該製備方法簡單，反應條件溫和，易於操作，所用的聚合物均為環境友好的高分子 材料，具有產業化實施的前景。
圖l為本發明製備的MWCNTs， MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA的紫 外吸收光譜圖2為本發明製備的MWCNTs(l)、MWCNT/G5.NHAc-FK2)和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA
(3) 在PBS緩衝液的圖片；
圖3為本發明製備的多壁碳納米管複合物MWCNT/G5.NHAc-FI (a)和MWCNT / G5.NHAc -FI-FA(b)的核磁共振譜圖4為本發明製備的酸化後的MWCNTs (a)、 MWCNT/G5.NHAc-FI (b)、 MWCNT/G5. NHAc-FI-FA (c)的TEM圖5為MTT法測試的KB細胞經過MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(濃 度範圍在0-100 pg/mL)處理24小時後的OD值； 圖6為功能化的MWCNT和KB細胞結合的流式細胞術分析結果；
a. MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA (1 )Lig/mL)對KB-HFAR細胞的結合；
b. MWCNT/G5.NHAc國FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(l嗎/mL)對KB陽LFAR細胞的結合； l.PBS對照；2. MWCNT/G5.NHAc-FI; 3. MWCNT/G5.NHAc-FI-FA;
c. 依賴於劑量的MWCNT/G5,NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(lng/mL)對KB-HFA
細胞結合的直方d. 依賴於劑量的MWCNT/G5.NHAc-FI和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(lpg/mL)對KB-LFAR
細胞結合的直方圖7為經PBS緩衝液(a, d)、MWCNT/G5.NHAc-FI(b, e)和MWCNT/G5.NHAc-FI-FA(c, f)處 理的KB-HFAR細胞的雷射共聚焦顯微鏡圖片。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用 於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範 圍。
9實施例1
(1) 配置體積比為3: 1的濃硝酸與濃硫酸的混合液GPHN03/H2S04為vA^3:l )，對 100-200mg多壁碳納米管進行酸化處理，2小時後，過濾，水洗，最後將酸化後的多壁碳 納米管MWCNTs置於真空條件下乾燥後保存；
(2) 在含有60mgPAMAM的24mL無水DMSO溶劑中逐滴滴加含有4.4mgFI的24 mL DMSO溶液，室溫下強磁力攪拌24小時，隨後將所反應後的產物用MWCO10000的纖維 素透析膜逐次在PBS緩衝溶液(3次，4升)和超純水(3次，4升)中透析3天，去除反 應混合物中的過量的反應試劑和反應過程中產生的副產物，最後將純化後的產物冷凍乾燥 得MG5.NH2-FI;
(3) 取16.68 mg酸化處理後的MWCNTs分散在12 mL超純水中，隨後將含有12.82 mg EDC 的DMSO溶液2 mL滴加到MWCNTs的水溶液中，強磁力攪拌，反應3小時；隨後滴加 lmL含有4.6mgG5.NH2-FI的水溶液，強磁力攪拌下反應48小時，合成MWCNT/G5.NH2-FI 複合物，將複合物分散在超純水中、離心，再次分散、離心，如此重複3次，以去除過量 的反應試劑；
(4) 將步驟(3)中製備的MWCNT/G5.NH2-FI複合物分散在10mL超純水中，與9.8^iZ
三乙胺溶液充分混合，隨後逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液lmL，強磁力攪拌下反 應24小時，合成表面電荷為中性的MWCNT/G5.NHAc-FI複合物。
經紫外可見光光譜及NMR分析，測試結果證實G5.NH2-FI己經成功修飾到多壁碳納 米管的表面，且MWCNT/G5.NH2-FI複合物能穩定地分散在PBS緩衝溶液中，6個月後沒 有沉澱產生。Zeta表面電勢測定結果表明，乙醯化反應之後，MWCNT/G5.NH2-FI的表面電 勢從+31.6mV降到和+4.5mV，基本呈電荷中性，進一步證實了乙醯化反應的成功進行。
實施例2
(1 )在含有60 mg PAMAM的24 mL無水DMSO溶劑中逐滴滴加含有4.4 mg FI的24 mL DMSO溶液，室溫下強磁力攪拌24小時，隨後將所反應產物用MWCO10000的纖維素透 析膜逐次在PBS緩衝溶液(3次，4升)和超純水(3次，4升)中透析3天，去除反應混 合物中的過量的反應試劑和反應過程中產生的副產物，最後將純化後的產物冷凍乾燥得 G5.NH2-FI;
(2)將3.7 mg FA和9.3 mg EDC溶解在3 mL DMSO溶液中，室溫條件下磁力攪拌3小時，活化FA的y-羧基，將所得反應溶液逐漸滴加到12 mL含30 mg G5.NH2-FI的DMSO
溶液中，室溫條件下強磁力攪拌，3天後，將反應後的產物用MWCOIOOOO的纖維素透析 膜逐次在PBS緩衝液(3次，4升)和超純水(3次，4升)中透析3天，去除反應混合 物中的過量的反應試劑和反應過程中產生的副產物，最後將純化後的產物冷凍乾燥得 G5.NH2-FI-FA。
實施例3
(1) 配置體積比為3: 1的濃硝酸與濃硫酸的混合液GPHN03/H2S04為v/v-3:l )，對 100-200 mg多壁碳納米管進行酸化處理，2小時後，過濾，水洗，最後將酸化後的多壁碳 納米管置於真空條件下乾燥後保存；
(2) 取16.68 mg酸化處理後的MWCNTs分散在12 mL超純水中，隨後將含有12.82 mg EDC 的DMSO溶液2 mL滴加到MWCNTs的水溶液中，強磁力攪拌，反應3小時；隨後滴加 lmL含有4.6 mg實例2中製備的G5.NH2-FI-FA的水溶液，強磁力攪拌下反應48小時， 合成MWCNT/G5.NH2-FI-FA複合物，將複合物分散在超純水中、離心，再次分散、離心， 如此重複3次，以去除過量的反應試劑；
(3) 將(2)中製備的MWCNT/G5.NH2-FI-FA複合物分散在10 mL超純水中，與9.8^iL三
乙胺溶液充分混合，隨後逐滴加入含7.2mg醋酸酐的甲醇溶液lmL，強磁力攪拌下反應 24小時，合成表面電荷為中性的MWCNT/G5.NHAc-FI-FA複合物。
經紫外可見光光譜及NMR分析，測試結果證實G5.NH2-FI-FA已經成功修飾到多壁碳 納米管的表面，且MWCNT/G5.NH2-FI-FA複合物能穩定地分散在PBS緩衝溶液中，6個 月後沒有沉澱產生。Zeta表面電勢測定結果表明，乙醯化反應之後，MWCNT/G5.NH2-FI-FA 的表面電勢從+28.3mV降到和+3.1mV，基本呈電荷中性，進一步證實了乙醯化反應的成 功進行。
實施例4
以KB系細胞為模型細胞來檢驗樹狀大分子修飾後的多壁碳納米管的生物毒性。將模 型細胞分別在滴加有MWCNT/G5.NHAc-FI-FA、 MWCNT/G5.NHAc-FI的培養液中培養24 小時後，用MTT法來測試模型細胞在不同條件下的存活情況。統計分析表明，在濃度範 圍為0—100微克/毫升時，分別在MWCNT/G5.NHAc-FI-FA、 MWCNT/G5.NHAc-FI的培養液中培養的KB細胞的存活率和PBS緩衝液對照組相比沒有明顯的變化，且從細胞的相 差顯微鏡照片上可以看出，添加有MWCNT/G5.NHAc-FI-FA和MWCNT/G5.NHAc-FI的培 養液中培養的KB細胞與未處理的細胞的形貌相似，細胞仍能健康地生長，而且雷射共聚 焦顯微鏡結果顯示，經過MWCNT/G5.NHAc-FI-FA處理的含有較高葉酸受體表達的KB細 胞表現出很強的螢光信號。表明MWCNT/G5.NHAC-FI-FA功能性碳納米管在具有良好的生 物相容性的同時，還具有癌細胞靶向診斷的功能。
權利要求
1. 一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法，包括(1)將碳納米管CNT進行酸化處理2h，過濾，水洗，於60℃真空乾燥，備用；(2)聚醯胺胺樹狀大分子的異硫氰酸螢光素FI和葉酸FA的修飾
2.根據權利要1所述的一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法，其 特徵在於所述步驟(1)中的碳納米管為單壁或多壁碳納米管。
3. 根據權利要l所述的一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法，其 特徵在於所述步驟(1)中酸化處理所用的酸為濃硝酸或濃硝酸與濃硫酸的混合酸，混 合酸中HN03/H2S04-3: 1 (v/v)，碳納米管與酸的重量比為1: 5。
4. 根據權利要l所述的一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺/碳納米管複合材料的製備方法，其 特徵在於所述步驟(2)和(6)中的纖維素透析膜為MWCO10000 50000纖維素透析袋。
全文摘要
本發明涉及一種癌細胞靶向診斷聚醯胺胺樹狀大分子/碳納米管複合材料的製備方法，包括碳納米管CNT進行酸化處理；聚醯胺胺樹狀大分子的異硫氰酸螢光素FI和葉酸FA的修飾；通過EDC化學鍵合法與酸化處理後的多壁碳納米管表面的羧基反應，得到CNT複合物；將複合物表面剩餘的樹狀大分子的端氨基與醋酸酐進行乙醯化反應，得到表面電荷呈中性的功能性複合碳納米管。該功能化碳納米管能夠長時間地分散在溶液中，沒有團聚現象發生，且功能化的多壁碳納米管具有良好的生物相容性，能靶向地結合到癌細胞上，可用於癌細胞的早期靶向診斷；且製備方法簡單，反應條件溫和，易於操作，所用的聚合物均為環境友好的高分子材料，具有產業化實施的前景。
文檔編號C08K3/26GK101531800SQ200910049270
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月14日 優先權日2009年4月14日
發明者史向陽, 沈明武, 肖仕麗 申請人:東華大學