一種肝癌早期診斷試劑盒的製作方法

2023-05-27 21:59:26 1

專利名稱：一種肝癌早期診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製劑技術領域，具體說是一種肝癌早期診斷試劑盒。
背景技術：
肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，為當今世界第三位致死性腫瘤，佔我國腫瘤死亡原因的第二位，全世界約有100萬患者，每年約有30萬新增病例。在新增的病例中，45% 發生在中國，主要分布在東南及沿海流域。肝癌的發生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結果，包括外環境致癌因素(病毒、寄生蟲、細菌的感染、黃麴黴毒素的攝入、水源汙染以及吸菸、飲酒)和自身遺傳因素(癌基因的激活和抑癌基因的失活)。在眾多病因中，B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV )和黃麴黴素誘導的癌基因激活和抑癌基因失活是引起肝細胞癌變的主要原因。根據流行病學調查，我國目前約有9300萬HBV攜帶者，其中患者98萬餘人，約有4000萬HCV感染者，其中患者7萬餘人。而且近年來，隨著B型肝炎病毒的流行，我國肝癌的地域分布及發病趨勢發生明顯變化，其發病年齡高峰移向青壯年，死亡率也向小年齡組推移。這一基本現狀是造成我國肝癌發生率在今後一個較長的時期內仍處於較高水平的重要原因。諸多研究結果表明，早期發現是提高肝癌治療效果、降低病死率的有效手段。國際上對肝癌主要應用甲胎蛋白(AFP)、超聲和其他影像學相結合的診斷技術進行篩查，但是超聲檢查依賴於操作者的經驗和設備，而其他影像學手段需要高昂的費用，廣泛應用受到限制。目前市場上用的肝癌診斷試劑盒存在以下缺點1.對早期肝癌的檢出率不高，極大限制了現有肝癌治療手段的療效；2.操作手段繁瑣，檢測時必須加入標準抗原作為參照，檢測的成本較高；
1 ^ -^MSSBl (a disintegrin and metalloproteases, ADAMs) g I M 跨膜分泌型糖蛋白家族，也稱金屬蛋白酶解聚素或MDC (metalloprotease/disintegrin/ cysteinerich)，ADAM基因編碼的蛋白質通常由800-1200個胺基酸組成，包含有8個結構域，自N-端至C-端依次為信號域、前導域、類金屬蛋白酶功能域、解整合素樣功能域、富含半胱氨酸功能域、類表皮生長因子功能域、跨膜域和胞質尾域。ADAMs家族的作用廣泛，涉及膜組織融和、細胞因子和生長因子的解離脫落、細胞遷移的控制，以及一些諸如受精，肌肉發育，神經系統細胞的生長發育過程的調控等；ADAMs在調節細胞-細胞和細胞-基質的相互作用中至關重要。近年來研究發現該家族成員在炎症反應、腫瘤發生發展轉移、免疫性疾病和過敏反應疾病中有著重要作用。迄今為止，文獻報導的ADAMs家族成員共有30餘種。 ADAM7是ADAMs家族的成員之一，其編碼的蛋白ADAM7是具有擬4個胺基酸的膜蛋白，具有金屬蛋白酶活性，參與一系列與膜結合的受體、細胞因子等蛋白的水解過程。ADAM7和其他去整合素金屬蛋白酶家族成員雖然來源不同，但是基本結構均由高度保守的序列組成，含8 個結構域。RT-PCR是研究檢測特定基因表達的一個簡便、準確的方法。通過RT-PCR在mRNA 水平上檢測某個基因的表達情況，可以提高檢測的準確率。

發明內容
本發明針對現有技術存在的缺點和不足，提供一種肝癌早期診斷試劑盒。本發明試劑盒是一種體外診斷試劑，通過檢測早期肝癌患者血清中金屬蛋白酶ADAM7核心基因的相對表達量診斷早期肝癌，適用於一般PCR儀，操作簡單，特異性和敏感性好，市場前景廣闊。一種肝癌早期診斷試劑盒，採用以下技術方案
一、肝癌早期診斷試劑盒的組成
該試劑盒有RNA提取試劑，RT-PCR反應試劑，ADAM7核心基因引物和beta-act in核心基因引物，陰性質控標準品組成；以下以一個可以檢測20位病人的試劑盒為例說明本發明試劑盒各組份及其用量
1、RNA提取試劑=Trizol :10ml ；氯仿:10ml ；異丙醇:10ml ；75% 乙醇:40ml ；無 RNA 酶的無菌水2ml ；
2、RT-PCR反應試劑50μ mol/L隨機六聚體引物20 μ 1 ；10 mmol/L dNTP混合物 20 μ 1 ；40 U/μ 1 RNA酶抑制因子10μ 1 ；200 U/μ 1 AMV反轉錄酶20μ 1 ；5倍反轉錄酶反應緩衝液1ml ；10 倍PCR緩衝液1ml ；25 mmol/L MgCl2 lml; 5U/μ 1 Taq酶10 μ 1 ；
3,10 μ mol/L ADAM7 基因上遊引物100 μ 1 ； 10 μ mol/LADAM7 基因下遊引物100 μ 1 ； lOymol/Lbeta-actin 基因上遊引物100 μ 1 ；10 μ mol/L beta-actin 基因下遊引物 100μ 1 ；
ADAM7核心基因引物序列為
上遊引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3，
下遊引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3， beta-actin核心基因引物序列為
上遊引物5』 -GTGGACATCCGCAAAGAC-3，
下遊引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3， 4、陰性質控標準品正常人血清2ml ；
二、本試劑盒的檢測方法
1、RNA提取分別提取待檢測病人血清RNA和陰性質控標準品(正常人血清)RNA,提取方法如下
把0. Iml待測血清或正常對照血清加入裝有0. 5mlTrizol的1. 5ml離心管中立即振蕩攪拌，室溫靜置5min，於4°C，12000 g，離心10 min。小心吸取上清液轉入新的1. 5 ml離心管，向勻漿液中加入0. 5ml氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15-30°C放置3 min。 於4°C，12000 g，離心15 min。從離心機中小心地取出離心管，吸取上清至另一 1. 5 ml離心管。向上清加入0. 5ml異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15-30°C放置10 min。 於4°C，12000 g，離心10 min。棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇1 ml，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。再加入75 %乙醇Iml，在渦旋器上短暫渦旋；於4°C，SOOOg 離心10 min。小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超淨工作檯中乾燥沉澱5 min。加入無RNA酶的無菌水50 μ 1完全溶解RNA沉澱後，_80°C保存，備用；
2、取待病人血清RNA和正常人血清RNA分別進行RT-PCR反應
DRT反應a、在PCR管a中配製下列混合液 50μπιΟ1/1隨機六聚體引物1 μ 10 mmol/L dNTP 混合物 1 μ 1 待測血清RNA 3 μ 1
無RNA酶的無菌水5μ1
總體積10 μ 1
在PCR儀上進行65°C 5 min變性、退火反應，冰上急冷，得到反應液；
b、在上述PCR管a中加入反轉錄反應液
5倍反轉錄酶反應緩衝液4 μ 1
40 υ/μ 1 RNA酶抑制因子0. 5 μ 1
200 U/ μ 1 AMV 反轉錄酶1 μ 1
無RNA酶的無菌水4. 5 μ
總體積20 μ 1
在PCR儀上30°C，10 min ；42°C,30 min ；95°C 5 min進行反轉錄反應後，然後置於冰上，得到cDNA模板溶液； 2) PCR反應
在PCR管b中配置下列PCR反應液 10倍PCR緩衝液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/L dNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 μπιοΙ/L ADAM7核心基因上遊引物 0.75 μ 1 10 ymol/L ADAM7核心基因下遊引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
在PCR管c中配置下列PCR反應液 10倍PCR緩衝液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/L dNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 μπιοΙ/L beta-actin 核心基因上遊引物 0.75 μ 1 10 μ mol/L beta-actin核心基因下遊引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0· 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
將上述PCR管b、c置於PCR儀中進行PCR擴增，條件為94°C預變性3 min,然後進行 94°C變性，1 min，55°C退火1.5 min，72°C延伸1 min，進行觀個循環擴增；最後進行72°C， 10 min終延伸，擴增出ADAM7核心基因片段(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因片段(基因序列如序列表序列2)；
3、檢測結果分析取RT-PCR反應產物5 μ 1進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統照相，利用Gel Pro 4. 0軟體計算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因條帶灰度值；被檢測的ADAM7核心基因相對表達量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核酸條帶灰度值。待測血清樣本中ADAM7核心基因相對表達量是陰性質控標準品的1. 5倍以上定義為待測樣本中ADAM7核心基因的相對表達量顯著上調表達，可判斷為待測病人患肝癌；
本試劑盒的檢測依據及工作原理
1、通過對30例肝癌組織及相應的癌旁組織和5例正常肝組織運用RT-PCR方法檢測 ADAM7 mRNA的表達水平，免疫組化法對ADAM8蛋白表達進行定位和半定量分析顯示ADAM7 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中均有表達，癌組織明顯高於癌旁，在正常組織中僅有少量表達；ADAM7蛋白高表達於肝癌組織，癌旁組織也有所表達，在正常組織僅有少量表達。且其表達與患者的年齡、性別無關，但在腫瘤大小超過3cm、細胞低分化、伴門靜脈栓塞及有淋巴結轉移的肝癌組織中表達明顯升高；
2、通過在體外培養的人肝癌細胞株OfepG^與正常肝細胞株(L02)中分別加入人 ADAM7分子，來觀察ADAM7分子對正常肝細胞和肝癌細胞增殖與凋亡的影響。結果表明，加入ADAM7分子後，促進了正常肝細胞的增殖，對肝癌細胞增殖幾乎沒什麼影響；增加了肝癌細胞對TNF-α誘導凋亡的抵抗性，對TNF-α誘導正常肝細胞的凋亡無明顯影響；
3、通過對肝癌患者和正常人血清ADAM7的表達水平的檢測，發現ADAM7在肝癌患者的血清中顯著上調表達，而在其它類型的癌症患者中，ADAM7表達無顯著差異。而且半定量RT-PCR結果顯示，肝癌患者肝組織中金屬蛋白酶ADAM7基因的相對表達量(被檢測的 ADAM7基因相對表達量=ADAM7核酸條帶灰度值/beta-actin核酸條帶灰度值)是正常對照的1. 5倍甚至兩倍以上，證明ADAM7基因的相對表達量比正常增高1. 5倍以上可以判斷為肝癌；
4、通過實驗證明ADAM7核心基因片段(序列表序列1)的相對表達量(ADAM7核心基因片段相對表達量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核心基因條帶灰度值)，是正常對照相對表達量的1. 5倍以上也可以判斷為肝癌，其中beta-actin核心基因序列如序列表序列2。通過Gel Pro 4. 0軟體分析ADAM7核心基因片段相對表達量，檢測結果準確可靠。
本發明試劑盒和現有技術相比有以下優點
1、半定量RT-PCR的檢測方法從基因水平進行檢測早期肝癌血清中高表達且不易被降解的金屬蛋白酶ADAM7來提高早期肝癌的診斷效果結果更加準確可靠；
2、本發明的試劑盒適用於一般PCR儀，操作簡便，可重複性高；
3、通過GelPro 4. 0軟體對結果進行分析快速準確，顯著提高了方法的實用性和技術水準，便於大規模推廣應用；
4、檢測成本低，特異性和敏感性好；


圖1為待測患者1、2、3、4、5和6試劑盒檢測瓊脂糖凝膠電泳圖2為待測患者1、2、3、4、5和6試劑盒檢測結果分析圖3為待測患者7、8、9、10、11和12的試劑盒檢測瓊脂糖凝膠電泳圖4為待測患者7、8、9、10、11和12的試劑盒檢測結果分析圖；圖5為待測患者13、14、15、16、17、、18的試劑盒瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖6為待測患者13、14、15、16、17、、18試劑盒檢測結果分析圖； 圖中標號C為正常對照；DC 待測患者；*和**分別代表與正常對照相比在O°<0. 05) 和(7X0.01)水平上有顯著差異；
具體實施例方式
結合下列實施例進一步闡述本發明試劑盒的檢測方法和檢測效果。本試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應試劑、ADAM7核心基因引物、 beta-actin核心基因引物和陰性質控標準品；其中RNA提取試劑由分裝的Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇和無RNA酶的無菌水組成；RT-PCR反應試劑由分裝的隨機六聚體引物、dNTP 混合物、RNA酶抑制因子、AMV反轉錄酶、5倍反轉錄酶反應緩衝液、10倍PCR緩衝液、MgCl2 和Taq酶組成；
ADAM7核心基因引物序列為 上遊引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3， 下遊引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3，； beta-actin核心基因引物序列為 上遊引物5』 -GTGGACATCCGCAAAGAC-3， 下遊引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3，； 陰性質控標準品為正常人血清。本發明試劑盒用於檢測18名待測病人是否患肝癌
1、RNA提取分別提取18名待測病人血清RNA和陰性質控標準品(正常人血清)RNA，提取方法如下
把0. Iml待測血清或正常對照血清加入裝有0. 5mlTrizol的1. 5ml離心管中立即振蕩攪拌，室溫靜置5min，於4°C，12000 g，離心10 min。小心吸取上清液轉入新的1. 5 ml離心管，向勻漿液中加入0. 5ml氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15-30°C放置3 min。 於4°C，12000 g，離心15 min。從離心機中小心地取出離心管，吸取上清至另一 1. 5 ml離心管。向上清加入0. 5ml異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15-30°C放置10 min。 於4°C，12000 g，離心10 min。棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇1 ml，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。再加入75%乙醇1ml，在渦旋器上短暫渦旋；於4°C，8000g 離心10 min。小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超淨工作檯中乾燥沉澱5 min。加入無RNA酶的無菌水50 μ 1完全溶解RNA沉澱後，即得到RNA溶液，-80°C保存，
2、取步欒1所提取的18名待測病人血清RNA和陰性質控標準品RNA分別進行RT-PCR 反應，操作方法如下 DRT反應
a、在PCR管a中配製下列混合液
50μπιΟ1/1隨機六聚體引物1 μ
10 mmol/LdNTP 混合物1 μ 1
待測血清RNA3 μ 1
無RNA酶的無菌水5μ1總體積10 μ 1
在PCR儀上進行65°C 5 min變性、退火反應，然後置於冰上，得到反應液；
b、在上述PCR管a中加入反轉錄反應液
5倍反轉錄酶反應緩衝液4 μ 1
40 υ/μ 1 RNA酶抑制因子0. 5 μ 1
200 U/ μ 1 AMV 反轉錄酶1 μ 1
無RNA酶的無菌水4. 5 μ
總體積20 μ 1
在PCR儀上30°C，10 min ；42°C,30 min ；95°C 5 min進行反轉錄反應後，然後置於冰上，得到cDNA模板溶液； 2) PCR反應
在PCR管b中配置下列PCR反應液 10倍PCR緩衝液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/LdNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 ymol/LADAM7核心基因上遊引物 0.75 μ 1 10 ymol/L ADAM7核心基因下遊引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
在PCR管c中配置下列PCR反應液 10倍PCR緩衝液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
lOmmol/LdNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
ΙΟμπιοΙ/L beta-actin 核心基因上遊引物 0.75 μ 1 ΙΟμπιοΙ/L beta-actin 核心基因下遊引物 0.75 μ 1 Taq 酶(5υ/μ 1)0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
將上述PCR管b、c置於PCR儀中進行PCR擴增，條件為94°C預變性3 min,然後進行 94°C變性，1 min，55°C退火1.5 min，72°C延伸1 min，進行洲個循環擴增；最後進行72°C， 10 min終延伸；擴增出的ADAM7核心基因(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因(基因序列如序列表序列2)；
3、檢測結果分析取RT-PCR反應產物5 μ 1進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統照相，利用Gel Pro 4. 0軟體計算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因條帶灰度值；被檢測的ADAM7核心基因相對表達量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核心基因灰度值。待測樣本中ADAM7核心基因相對表達量比陰性質控標準品高於1. 5倍的定義為待測樣本中ADAM7核心基因的相對表達量顯著上調表達，可判斷為待測病人患肝癌；檢測結果(如附圖1-附圖6)顯示金屬蛋白酶ADAM7在待測患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17、18的血清中的相對表達量是正常對照血清中ADAM7相對表達量的1. 5倍以上，可以判斷為肝癌。 待測患者1、2、7、8、13、14血清中ADAM7的相對表達量與正常對照相比小於1. 5倍，則不是肝癌患者。*和**分別代表和正常對照相比在0°<0.0幻和(/X0. 01)水平上有顯著差異； 4、利用CT和肝組織活檢病理分析對18名待測患者進行肝癌診斷，診斷結果如表1，患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17和18診斷為肝癌，患者1、2、7、8、13和14診斷為不是肝癌患者。此結果和試劑盒檢測結果完全一致，說明本試劑盒檢測結果準確。 表1、CT和肝組織活檢病理分析對18名待測患者肝癌診斷結果
權利要求
1. 一種肝癌早期診斷試劑盒，其特徵在於試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應試劑、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和陰性質控標準品；其中RNA提取試劑由分裝的Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇和無RNA酶的無菌水組成； RT-PCR反應試劑由分裝的隨機六聚體引物、dNTP混合物、RNA酶抑制因子、AMV反轉錄酶、 5倍反轉錄酶反應緩衝液、10倍PCR緩衝液、MgCl2和Taq酶組成； ADAM7核心基因引物序列為 上遊引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3， 下遊引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3，； beta-actin核心基因引物序列為 上遊引物5』 -GTGGACATCCGCAAAGAC-3， 下遊引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3，； 陰性質控標準品為正常人血清。
全文摘要
一種肝癌早期診斷試劑盒，該試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應試劑、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和陰性質控標準品，通過半定量RT-PCR方法從基因水平上檢測早期肝癌患者血清中高表達且不易被降解的金屬蛋白酶ADAM7進行早期肝癌的診斷，通過GelPro4.0軟體對結果進行分析，檢測結果準確可靠。該試劑盒特異性和靈敏度高，簡單容易操作，可重複性高，檢測成本低，便於大規模推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102433388SQ20121000073
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者馮書營, 馮豔銘, 席守民, 李三強, 李世朋, 楊五彪, 蒙宏葉, 馬靈筠 申請人:河南科技大學