用於誘導針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應的多肽的製作方法

2023-08-13 04:55:41 5

專利名稱：用於誘導針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應的多肽的製作方法
與相關申請的交叉參考本申請要求享有2003年7月24日提交的美國臨時申請號60/489,840和2003年11月14日提交的美國臨時申請號60/520,115的利益，其內容在這裡引作參考。
背景技術：
貫穿在本申請中引用的參考文獻不能視作要求保護的發明的現有技術。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是多種疾病和狀況的病原體。由金黃色葡萄球菌造成的疾病和狀況的實例包括菌血症、感染性心內膜炎、毛囊炎、癤、癰、膿皰病、大皰性膿皰病、蜂窩組織炎、大皰性膿皰病、中毒性休克症候群、皮膚燙傷症候群、中樞神經系統感染、感染性和炎性眼病、骨髓炎和關節和骨的其它感染和呼吸道感染(The Staphylococci in Human Disease，Crossley和Archer(編)，Churchill Livingstone Inc.1997.)。
可以使用基於免疫學的策略來嘗試控制金黃色葡萄球菌感染和金黃色葡萄球菌的傳播。基於免疫學的策略包括被動免疫和主動免疫。被動免疫採用靶向金黃色葡萄球菌的免疫球蛋白。主動免疫能誘導針對金黃色葡萄球菌的免疫反應。
潛在的金黃色葡萄球菌疫苗靶向金黃色葡萄球菌多糖和多肽。使用合適的金黃色葡萄球菌多糖或多肽作為疫苗組分，可以實現靶向。潛在的多糖疫苗組分的實例包括金黃色葡萄球菌類型5和類型8莢膜多糖(Shinefield等，N.Eng.J.Med.346491-496，2002.)。可以用作可行的疫苗組分的多肽的實例包括膠原粘附素、纖維蛋白原結合蛋白和聚集因子(Mamo等，FEMS Immunology and Medical Microbiology 1047-54，1994，Nilsson等，J.Clin.Invest.1012640-2649，1998，Josefsson等，The Journal of Infectious Diseases 1841572-1580，2001.)。
已經從金黃色葡萄球菌基因組的測序，得到了涉及金黃色葡萄球菌多肽序列的信息(Kuroda等，Lancet 3571225-1240，2001，Baba等，Lancet 3591819-1827，2000，Kunsch等，1997年7月30日公開的歐洲專利公開號EP0786519)。在某種程度上，在表徵從基因組測序得到的多肽序列的努力中，已經使用了生物信息學(Kunsch等，1997年7月30日公開的歐洲專利公開號EP0786519)。
可以將包含展示技術的技術和來自感染的患者的血清用作嘗試識別能編碼潛在抗原的基因的努力的一部分(Foster等，2001年12月27日公開的國際公開號WO01/98499，Meinke等，2002年8月1日公開的國際公開號WO02/059148)。
發明概述本發明表徵了包含結構上與SEQ ID NO1相關的胺基酸序列的多肽、這樣的多肽的用途、和用於生產這樣的多肽的表達系統。SEQ ID NO1是全長金黃色葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全長多肽在本文中稱作全長「ORF0657n」。發現含有SEQ ID NO1的胺基酸序列的多肽能產生針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應。
「保護性的」免疫或免疫反應是指可檢測水平的針對金黃色葡萄球菌感染的保護。使用動物模型，例如本文所述的那些，可以評價保護的水平。
因而，本發明的第一個方面描述了多肽免疫原，其包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列的多肽，其中所述多肽不含有SEQ IDNO2的胺基酸609-645提供的羧基末端，且該多肽能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。SEQ ID NO2提供了全長ORF0657n多肽，其中胺基酸609-645提供了從LPXTG基序(在本文中稱作「細胞的良好分類信號」)開始的羧基末端結構域。
「免疫原」是指提供保護性免疫的能力。
「包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列」是指，存在SEQ ID NO1相關區，且可能存在其它的多肽區。如果存在其它的多肽區，則該多肽不具有SEQ ID NO2的胺基酸609-645提供的羧基LPXTG基序。
本發明的另一個方面描述了免疫原，其包含能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的胺基酸序列。免疫原包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列和一個或多個其它的在羧基末端或氨基末端共價連接的區域或部分，其中每個區域或部分獨立地選自具有至少一種下述性質的區域或部分能增強免疫反應、能有利於純化或能有利於多肽的穩定性。
「其它的區域或部分」是指與要在生物宿主(例如原核宿主或真核宿主)中生產的ORF0657n相關多肽不同的區域或部分。其它的區域或部分可以是，例如，其它的多肽區或非肽區。
本發明的另一個方面描述了能在患者中誘導針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的組合物。該組合物包含藥學上可接受的載體和免疫有效量的能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的免疫原。
「免疫有效量」是足以提供針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫的量。該量應當足以顯著地預防金黃色葡萄球菌感染的可能性或嚴重性。
本發明的另一個方面描述了包含能編碼多肽的重組基因的核酸，所述的多肽能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。重組基因含有能編碼多肽的重組核酸和進行適當轉錄和加工的調節元件(其可以包括翻譯和翻譯後的元件)。重組基因可以獨立於宿主基因組存在，或可以是宿主基因組的一部分。
重組核酸是由於其序列和/或形式不會天然產生的核酸。重組核酸的實例包括純化的核酸，組合到一起、提供與天然產生的不同的核酸的2個或更多個核酸區，和缺少一個或多個天然地彼此相結合的核酸區(例如，上遊或下遊區)。
本發明的另一個方面描述了重組的細胞。該細胞包含能編碼多肽的重組基因，所述的多肽能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。
本發明的另一個方面描述了製備能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的多肽的方法。該方法包括培養含有能編碼該多肽的重組核酸的重組細胞，和純化該多肽。
本發明的另一個方面描述了通過包含下述步驟的方法製備出的能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的多肽在宿主中培養含有能編碼該多肽的重組核酸的重組細胞，和純化該多肽。可以使用不同的宿主細胞。在本發明的一個實施方案中，所述宿主細胞是酵母細胞。
本發明的另一個方面描述了在患者中誘導針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應的方法。該方法包括下述步驟給患者施用免疫有效量的、能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的免疫原。
本發明的另一個方面描述了在患者中誘導回憶應答的方法。該方法包括下述步驟給患者施用有效量的免疫原，以產生回憶應答。
本發明的另一個方面描述了能編碼ORF0657n相關多肽的核酸，其被最優化成用於在酵母中表達。為了酵母中表達，最優化了一個或多個密碼子。
本發明的另一個方面描述了在重組酵母細胞中製備能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的多肽的方法。該方法包含下述步驟(a)在能表達該多肽的條件下培養重組的酵母細胞，其中重組的酵母細胞包含能編碼多肽的重組基因，且該多肽是全長ORF0657n相關的能提供針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫的多肽，或它的包含與SEQID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列的片段；和(b)純化該多肽。
除非特定的術語是相互排斥的，「或」是指一種或兩種可能性。有時，使用諸如「和/或」的短語來強調一種或兩種可能性。
諸如「包含」的開放式術語考慮到其它的因素或步驟。有時，使用諸如有或沒有開放式術語的「一個或多個」的短語來強調其它因素或步驟的可能性。
除非清楚地說明，諸如「一個(a)」或「一種(an)」的術語不限於一。例如「一個細胞」不排除「多個細胞」。有時，使用諸如「一個或多個」的短語來強調複數的存在。
從本文提供的其它描述，包括不同的實施例，可以明白本發明的其它特徵和優點。提供的實施例解釋了用於實現本發明的不同的組分和方法學。實施例不限制要求保護的發明。在公開的內容的基礎上，技術人員可以識別和使用用於實現本發明的其它組分和方法。
附圖簡述

圖1A、1B、1C和1D提供的示意圖解釋了為動物中的保護篩選的ORF0657n相關的多肽區和一些不同的ORF0657n序列。圖1A中的示意圖解釋了測試且發現有保護性的多肽(以實心矩形顯示)、測試且發現無保護性的多肽(以空心矩形顯示)和未測試的多肽(陰影框)。圖1B提供了用作圖1A的參照的全長序列(SEQ ID NO2)。圖1C解釋了SEQ ID NO28。SEQ ID NO28含有羧基「His-標記」(LEHHHHHH；SEQ ID NO64)。含有羧基His-標記的SEQ ID NO28在本文中也稱作「His-標記ORF0657n」。圖1D解釋了ORF0657nI+序列。
圖2A-2E提供了不同的ORF0657n相關序列越過ORF0657nH區的序列對比。在圖中用「ID」指示SEQ ID NO。
圖3A、3B和3C解釋了提供全長序列的ORF0657n相關多肽、ORF0657nH區和ORF0657nI區提供針對金黃色葡萄球菌Becker的保護性免疫的能力。將多肽與羥基磷酸鋁佐劑(AHP)一起使用。圖3A解釋了SEQID NO28的結果。圖3B解釋了含有羧基His-標記的SEQ ID NO4的結果。圖3C解釋了含有羧基His-標記的SEQ ID NO5的結果。「羧基His-標記」是指His-標記基團LEHHHHHH(SEQ ID NO64)存在於羧基末端。
圖4A-4H解釋了ORF0657n相關多肽提供針對不同的金黃色葡萄球菌攻擊的保護性免疫的能力。使用SEQ ID NO28的多肽作為免疫原。圖4A顯示了使用攻擊菌株CL-10(2.2×108CFU/ml)的結果。圖4B顯示了使用攻擊菌株CL-10(2.1×108CFU/ml)的結果。圖4C顯示了使用攻擊菌株CL-13(2.9×108CFU/ml)的結果。圖4D顯示了使用攻擊菌株CL-13(2.8×108CFU/ml)的結果。圖4E顯示了使用攻擊菌株CL-30(3.1×108CFU/ml)的結果。圖4F顯示了使用攻擊菌株CL-30(3.0×108CFU/ml)的結果。圖4G顯示了使用攻擊菌株CL-18(1.0×108CFU/ml)的結果。圖4H顯示了使用攻擊菌株CL-21(1.6×108CFU/ml)的結果。
圖5A和5B解釋了啤酒糖酵母(S.cerevisiae)表達質粒的質粒圖譜。圖5A提供了載體pGAL110的質粒圖譜。圖5B提供了piUC-I的質粒圖譜，其顯示了在pGAL110的GAL1啟動子控制下克隆的酵母密碼子-最優化的序列。
圖6A和6B顯示的蛋白印跡描述了具有SEQ ID NO28的胺基酸1-646的全長ORF0657n(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的細胞內表達。泳道1，分子大小標準；泳道2，純化的大腸桿菌(E.coli)生產的重組全長ORF0657n區(SEQ ID NO28)，100ng；泳道3-6含有20μg酵母細胞裂解物；泳道3和4，來自只含有載體pGAL110的1260(圖6A)和1309(圖6B)的轉化體的一式兩份發酵的細胞裂解物；泳道5和6，來自含有能表達全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的pRUnkC-pGAL110的1260(圖6A)和1309(圖6B)的轉化體的一式兩份發酵的細胞裂解物。
圖7A和7B分別顯示了SDS-PAGE凝膠和蛋白印跡的考馬斯染色，描述了能編碼SEQ ID NO3的核酸在啤酒糖酵母中的細胞內表達。泳道1，實驗組A，BSA，1.25μg；實驗組B，純化的大腸桿菌重組全長ORF0657n(SEQ ID NO28)，100ng；泳道2，來自大腸桿菌中的ORF0657nH生產者(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)的細胞裂解物；實驗組A，1.25μg，實驗組B，0.5μg。泳道3-7，實驗組A和B，分別含有1.25和0.5μg酵母細胞裂解物泳道3，只含有載體pGAL110的轉化體；泳道4，含有全長ORF0657n(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的轉化體；泳道5、6和7，轉化體1-1，其含有能表達成熟的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的piUC-S(-)；泳道7含有冷凍且隨後融化的細胞裂解物(轉化體1-1的)。泳道8含有分子大小標準。
圖8A-8U提供了能編碼ORF0657n相關多肽的不同核酸序列的實例。圖8A提供了能編碼帶有羧基His-標記的SEQ ID NO2的核酸序列(SEQID NO29)。圖8B提供了能編碼帶有羧基His-標記的SEQ ID NO4的核酸序列(SEQ ID NO30)。圖8C提供了酵母最優化的能編碼沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28的核酸序列(SEQ ID NO31)。圖8D提供了酵母最優化的能編碼SEQ ID NO3的核酸序列(SEQ ID NO32)。圖8E提供了酵母最優化的能編碼SEQ ID NO1的核酸(SEQ ID NO33)序列。圖8F-8M提供了酵母最優化的核酸序列(SEQ ID NO34、35、36、37、38、39、40和41)，其能編碼含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO7。圖8N-8U提供了酵母最優化的核酸序列(SEQ ID NO46-53)，其能編碼基於SEQ ID NO17或SEQ ID NO20的不同的ORF0657n相關多肽。
圖9顯示的蛋白印跡對比了ORF0657n相關多肽在啤酒糖酵母中的細胞內表達。泳道1和18，分子量(MW)大小標準。泳道2和3，分別50和100ng純化的在大腸桿菌中生產的ORF0657nH(帶有羧基His-標記的SEQ ID NO4)。泳道5含有500ng來自啤酒糖酵母載體對照轉化體的細胞裂解物蛋白。泳道7、8和9含有1.0、2.0和4.0μg來自能生產沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28的啤酒糖酵母轉化體的細胞裂解物蛋白。泳道11和12分別含有50和100ng蛋白，是來自能生產ORF0657nH(SEQ ID NO3)的啤酒糖酵母轉化體的細胞裂解物。泳道14和15分別含有250和500ng蛋白，是來自能生產ORF0657nG(SEQ ID NO44)的啤酒糖酵母轉化體的細胞裂解物。泳道17含有250ng來自ORF0657nG(帶有羧基His-標記的SEQ ID NO44)大腸桿菌生產者的細胞裂解物蛋白。泳道4、6、10、13和16是空白的。
圖10解釋了在大腸桿菌和酵母中生產的ORF0657n相關多肽的保護性免疫數據。「OFR0657nH(大腸桿菌)」對應著具有羧基His-標記的SEQID NO4。「OFR0657nI(大腸桿菌)」對應著具有羧基His-Tag的SEQID NO5。「OFR0657nC(大腸桿菌)」對應著SEQ ID NO28。「OFR0657nH(酵母)」對應著SEQ ID NO3。
圖11顯示了ORF0657nI在啤酒糖酵母中的細胞內表達的示例性的蛋白印跡。泳道1和25分子量大小標準。泳道2、3和24分別25、50和100ng，是純化的在大腸桿菌中生產的ORF0657nH區(帶有羧基His-標記的SEQ ID NO4)。泳道4-23含有來自酵母轉化體的蛋白細胞裂解物。泳道13-21代表著從與泳道4-12的裂解物相同的發酵樣品製備出的一式兩份細胞裂解物。泳道4和13含有200ng蛋白，其來自含有pGAL110的載體對照轉化體。泳道5和14含有100ng蛋白，其來自能生產ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的轉化體1-1。泳道6和15含有200ng來自轉化體1-1的蛋白。泳道7和16含有100ng蛋白，且泳道8和17含有200ng來自轉化體I1的蛋白。泳道9和18含有100ng蛋白，且泳道10和19含有200ng來自轉化體I2的蛋白。泳道11和20含有100ng蛋白，且泳道12和21含有200ng來自轉化體I3的蛋白。泳道22和23含有100和200ng以前從預先發酵轉化體1-1製備出的蛋白細胞裂解物。
圖12提供了獼猴免疫數據。用與或不與AHP配製的酵母生產的ORF0657n相關多肽(ORF0657nH，SEQ ID NO3)或大腸桿菌表達的ORF0657n相關多肽(全長ORF0657nC，SEQ ID NO28)免疫了獼猴。在疫苗組的猴子通過肌內的方式接受了50mcg ORF0657n相關多肽。
發明詳述使用動物模型發現，ORF0657n相關多肽(包括全長和更短長度的含有ORF0657nI區的衍生物)能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。圖1a解釋了能提供針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫的不同的ORF0657n相關多肽區和不能提供保護性免疫的區域的位置。在圖1a中，ORF0657n是指與SEQ ID NO2相對應的全長序列，ORF0657nI是指與SEQ ID NO1相對應的區域(沒有氨基末端甲硫氨酸)，且ORF0657nH是指與SEQ ID NO3相對應的區域(沒有氨基末端甲硫氨酸)。
ORF0657n「相關的」多肽含有結構上與全長ORF0657n或其片段相關的區域。ORF0657n相關多肽是與天然產生的ORF0657n的對應區域具有至少約90％序列同一性的多肽。在圖1中所述的參照ORF0657n對應著來自金黃色葡萄球菌COL的ORF0657n(SEQ ID NO2)。
通過將多肽序列與參照序列相比對，並確定相同的胺基酸的數目，可以確定與參照序列的百分比同一性。該數目除以參照序列中的胺基酸總數，然後乘以100，並四捨五入到最接近的整數。
圖1a輔助解釋了包含結構上與SEQ ID NO1相關的胺基酸序列的核心區的重要性。SEQ ID NO1包含ORF0657n COL的胺基酸42-486。SEQ ID NO1也含有氨基末端甲硫氨酸，以促進表達。由SEQ ID NO2胺基酸461-609、胺基酸82-486或胺基酸42-196組成的多肽片段不是保護性的。
在貫穿本申請中提及不同的胺基酸和核酸序列。表1總結了一些多肽序列，它們顯示了圖1區和其它的修飾。表2總結了一些核酸序列。
表1
表2
SEQ ID NO1相關的多肽結構上與SEQ ID NO1相關的多肽區含有與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸。在本文提供的指南的基礎上，可以設計含有結構上與SEQ ID NO1相關的區域的多肽，以得到針對金黃色葡萄球菌的保護性的多肽。
使用SEQ ID NO1作為參照框架，考慮不同的天然產生的ORF0657n多肽的胺基酸序列和已知的胺基酸性質，可以進行變化。變化包括一個或多個胺基酸添加、缺失和/或取代。使用本文所述的技術，可以評價不同變化的總體效果，以證實特定多肽提供保護性免疫的能力。
發現ORF0657n在病理學上和分類學上不同的金黃色葡萄球菌臨床分離物收集物中是非常保守的(見下面的實施例5)。圖2提供了含有SEQID NO1的不同序列的胺基酸序列對比。所述的序列對比是針對ORF0657nH區的。ORF0657nH區包括更小的保護性ORF0657nI區。
圖2提供了SEQ ID NO1和3-27的序列對比。該對比解釋了金黃色葡萄球菌臨床分離物之間的胺基酸差異，其可以用於指導設計金黃色葡萄球菌相關多肽(例如SEQ ID NO1和3)的潛在變化。另外，考慮已知的胺基酸性質，可以進行變化。SEQ ID NO1、3-6和8-26解釋了天然產生的從位置號3開始的序列，位置號1和2解釋了甲硫氨酸或甲硫氨酸-甘氨酸向一些序列的氨基末端的添加。從不同的臨床分離物，得到了SEQ ID NO11-26。SEQ ID NO7和27是SEQ ID NO4 ORF0657nH區的變體，該區在SEQ ID NO1核心區之外的區域中含有5個胺基酸取代。
在序列對比中可以使用其它的ORF0657n序列，以輔助指導變化。SEQID NO54-63提供了其它的金黃色葡萄球菌ORF0657nH區序列的實例，SEQ ID NO106和107提供了SEQ ID NO17和20的全長序列。
通常，在取代不同的胺基酸以保留活性時，優選地交換具有類似性質的胺基酸。在胺基酸取代時可以考慮的因素包括胺基酸大小、電荷、極性和疏水性。不同的胺基酸R-基團對胺基酸性質的影響是本領域眾所周知的(見，例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-2002，Appendix 1C.)。
在交換胺基酸以維持活性時，替換胺基酸應當具有一種或多種類似的性質，例如近似相同的電荷和/或大小和/或極性和/或疏水性。例如，用纈氨酸替換亮氨酸、用精氨酸替換賴氨酸和用天冬醯胺替換穀氨醯胺是不會造成多肽功能變化的良好候選方案。
用於實現特定目的的變化包括設計用於促進多肽的生產或功效的那些；或克隆編碼的核酸。通過適用於重組表達的起始密碼子(例如，能編碼甲硫氨酸)的應用，可以促進多肽的生產。在後期的細胞加工過程中，可以去除甲硫氨酸。通過例如限制位點的導入，其可以伴有胺基酸的添加或變化，可以促進克隆。
通過表位增強，可以增強多肽誘導免疫反應的功效。使用不同的技術，例如包含改變錨定殘基來提高肽對MHC分子的親和力的那些和能增強肽-MHC複合物對T-細胞受體的親和力的那些，可以進行表位增強。(Berzofsky等，Nature Review 1209-219，2001.)在不同的實施方案中，關於SEQ ID NO1相關的多肽區，該區與SEQ ID NO1具有至少90％、至少94％或至少99％的同一性；與SEQ ID NO1存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個變化，或最多50個變化；或基本上由選自下述的OFR0657nI相關區組成，或由選自下述的OFR0657nI相關區組成SEQ ID NO11、15、16、18或54的胺基酸1-442；SEQ ID NO63的胺基酸1-443；SEQ ID NO57或59的胺基酸1-444；SEQ ID NO7、8、9、10、12、13、14、17、19、20、55、56或58的胺基酸1-445；SEQ ID NO23或24的胺基酸1-446；SEQ ID NO1或3的胺基酸1-446或2-446；SEQ ID NO25或26的胺基酸1-447；或SEQ ID NO4、5或27的胺基酸1-447、2-447或3-447；SEQ ID NO61或62的胺基酸1-449；SEQ ID NO60的胺基酸1-453；和SEQ ID NO6、21或22的胺基酸1-454。
「基本上由所示的胺基酸組成」是指存在所述胺基酸，且可以存在其它的胺基酸。其它的胺基酸可以在羧基或氨基末端。在不同的實施方案中，存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個其它的胺基酸。在優選的實施方案中，甲硫氨酸存在於氨基末端；或甲硫氨酸-甘氨酸存在於氨基末端。
在本發明的一個實施方案中，該多肽由與SEQ ID NO42或其片段具有至少90％同一性的胺基酸序列組成，所述的SEQ ID NO42或其片段包含結構上與SEQ ID NO1相關的胺基酸序列。在不同的實施方案中，關於SEQ ID NO42，該多肽與SEQ ID NO42具有至少94％或至少99％同一性；與SEQ ID NO42存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個變化，最多50個變化，或最多65個變化；由SEQ ID NO42或選自下述的OFR0657nI+相關區組成，或基本上由SEQ ID NO42或選自下述的OFR0657nI+相關區組成SEQ ID NO11、15、16、18或54的胺基酸1-477；SEQ ID NO63的胺基酸1-478；SEQ ID NO57或59的胺基酸1-479；SEQ ID NO7、8、9、10、12、13、14、17、19、20、55、56或58的胺基酸1-480；SEQ ID NO23或24的胺基酸1-481；SEQ ID NO1或3的胺基酸1-481或2-481；SEQ ID NO25或26的胺基酸1-482；SEQ ID NO4、5或27的胺基酸1-482、2-482或3-482；SEQ ID NO61或62的胺基酸1-484；SEQ ID NO60的胺基酸1-488；和SEQ ID NO6、21或22的胺基酸1-489；在本發明的另一個實施方案中，該多肽由與SEQ ID NO3或其片段具有至少90％同一性的胺基酸序列組成，所述的SEQ ID NO3或其片段包含結構上與SEQ ID NO1相關的胺基酸序列。在不同的實施方案中，關於SEQ ID NO3，該多肽與SEQ ID NO3具有至少94％或至少99％同一性；與SEQ ID NO3存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個變化，最多50個變化，或最多65個變化；由選自下述的胺基酸序列組成，或基本上由選自下述的胺基酸序列組成SEQ ID NO3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63。
在另一個實施方案中，該多肽由SEQ ID NO2的多肽組成，或基本上由SEQ ID NO2的多肽組成，其通過在起始甲硫氨酸後插入甘氨酸進行了修飾，或該多肽沒有起始甲硫氨酸。
在另一個實施方案中，該多肽是純化的多肽。「純化的多肽」存在於缺少一種或多種天然與它結合的其它多肽的環境中，和/或表示為至少約10％存在的總蛋白。在不同的實施方案中，純化的多肽代表著在樣品或製劑中的至少約50％、至少約75％或至少約95％總蛋白。
在另一個實施方案中，多肽是「基本上純化的」。基本上純化的多肽存在於缺少全部或大多數天然與該多肽結合的其它多肽的環境中。例如，基本上純化的金黃色葡萄球菌多肽存在於缺少全部或大多數其它金黃色葡萄球菌多肽的環境中。環境可以是，例如，樣品或製劑。
「純化的」或「基本上純化的」不要求對多肽進行任何的純化，且可以包括，例如，尚未純化的化學合成的多肽。
通過修飾多肽的羧基或氨基末端，可以增強多肽的穩定性。可行的修飾的實例包括氨基末端保護基團，例如乙醯基、丙基、琥珀醯基、苄基、苄氧羰基或叔丁氧羰基；和羧基末端保護基團，例如醯胺、甲基醯胺和乙基醯胺。
在本發明的一個實施方案中，保護性多肽是免疫原的一部分，所述的免疫原由多肽和一個或多個與多肽在羧基末端或氨基末端共價連接的其它區域或部分組成。每個區域或部分應當獨立地選自具有至少一種下述性質的區域或部分能增強免疫反應，能有利於純化，或能有利於多肽的穩定性。可以增強多肽的穩定性，例如，使用諸如可以存在於氨基或羧基末端的聚乙二醇的基團。
通過將基團添加到羧基或氨基末端來促進純化，可以增強多肽的純化。可以用於促進純化的基團的實例包括能提供親和標記的多肽。親和標記的實例包括六-組氨酸標記、trpE、穀胱甘肽和麥芽糖-結合蛋白。
使用一般能增強免疫反應的基團，可以增強多肽產生免疫反應的能力。可以連接到多肽上來增強針對多肽的免疫反應的基團的實例包括細胞因子例如IL-2(Buchan等，2000.Molecular Immunology 37545-552.)。
多肽生產使用標準技術，包括包含化學合成的技術和包含從能生產多肽的細胞純化的技術，可以生產出多肽。化學合成多肽的技術是本領域眾所周知的(見例如，Vincent，Peptide and Protein Drug Delivery，NewYork，N.Y.，Decker，1990.)。
在下面提供的實施例中，解釋了從細胞純化多肽的技術。純化技術的其它實例是本領域眾所周知的(見例如，Ausubel，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley，1987-2002.)。
使用重組核酸技術來生產多肽，可以促進從細胞獲得多肽。用於生產多肽的重組核酸技術包括在細胞中導入或生產能編碼多肽的重組基因和表達該多肽。
重組基因含有能編碼多肽的核酸和用於多肽表達的調節元件。重組基因可以存在於細胞基因組中，或可以是表達載體的一部分。
可以作為重組基因的一部分而存在的調節元件包括與多肽編碼序列天然結合的那些，和與多肽編碼序列不天然結合的外源調節元件。諸如外源啟動子的外源調節元件可以用於在特定宿主中表達重組基因，或提高表達水平。通常，存在於重組基因中的調節元件包括轉錄啟動子、核糖體結合位點、終止子和任選地存在的操縱基因。優選的用於在真核細胞中加工的元件是多腺苷酸化信號。
通過表達載體的應用，可以促進重組基因在細胞中的表達。優選地，除了重組基因外，表達載體還含有用於在宿主細胞中自主複製的複製起點、選擇標記、有限數目的有用的限制酶位點和高拷貝數的潛力。表達載體的實例是克隆載體、修飾的克隆載體、特別設計的質粒和病毒。
由於遺傳密碼的簡併性，可以使用大量不同的編碼核酸序列來編碼特定的多肽。遺傳密碼的簡併性的原因是，幾乎所有的胺基酸都由不同組合的核苷酸三聯體或「密碼子」編碼。由密碼子編碼的胺基酸如下A＝Ala＝丙氨酸密碼子GCA、GCC、GCG、GCUC＝Cys＝半胱氨酸密碼子UGC、UGUD＝Asp＝天冬氨酸密碼子GAC、GAUE＝Glu＝穀氨酸密碼子GAA、GAGF＝Phe＝苯丙氨酸密碼子UUC、UUUG＝Gly＝甘氨酸密碼子GGA、GGC、GGG、GGUH＝His＝組氨酸密碼子CAC、CAUI＝Ile＝異亮氨酸密碼子AUA、AUC、AUUK＝Lys＝賴氨酸密碼子AAA、AAGL＝Leu＝亮氨酸密碼子UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUUM＝Met＝甲硫氨酸密碼子AUGN＝Asn＝天冬醯胺密碼子AAC、AAUP＝Pro＝脯氨酸密碼子CCA、CCC、CCG、CCUQ＝Gln＝穀氨醯胺密碼子CAA、CAG
R＝Arg＝精氨酸密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGUS＝Ser＝絲氨酸密碼子AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCUT＝Thr＝蘇氨酸密碼子ACA、ACC、ACG、ACUV＝Val＝纈氨酸密碼子GUA、GUC、GUG、GUUW＝Trp＝色氨酸密碼子UGGY＝Tyr＝酪氨酸密碼子UAC、UAU適用於ORF0657n相關多肽的重組核酸表達的細胞是原核生物和真核生物。原核細胞的實例包括大腸桿菌；葡萄球菌屬(Staphylococcus)的成員，例如金黃色葡萄球菌；乳桿菌屬(Lactobacillus)的成員，例如植物乳桿菌(L.plantarum)；乳球菌屬(Lactococcus)的成員，例如乳酸乳球菌(L.lactis)；和芽孢桿菌屬(Bacillus)的成員，例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。真核細胞的實例包括哺乳動物細胞；昆蟲細胞；酵母細胞，例如糖酵母屬(Saccharomyces)的成員(例如，啤酒糖酵母)，畢赤氏酵母屬(Pichia)的成員(例如，巴斯德畢赤氏酵母(P.pastoris))，漢遜氏酵母屬(Hansenula)的成員(例如，多形漢遜氏酵母(H.polymorpha))，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)的成員(例如，乳克魯維氏(K.lactis)酵母或脆壁克魯維氏酵母(K.fragilis))和裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬的成員(例如，粟酒裂殖糖酵母(S.pombe))。
用於重組基因生產、導入細胞和重組基因表達的技術是本領域眾所周知的。在參考文獻中提供了這種技術的實例，例如Ausubel，CurrentProtocols in MolecuIar Biology，John Wiley，1987-2002，和Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。
如果需要，通過密碼子最優化，可以增強特定宿主中的表達。密碼子最優化包括更優選的密碼子的應用。在不同的宿主中進行密碼子最優化的技術是本領域眾所周知的。
ORF0657n相關多肽可以含有翻譯後的修飾，例如，N-連接的糖基化、O-連接的糖基化或乙醯化。「多肽」或多肽的「胺基酸」序列包括含有一個或多個胺基酸的多肽，所述的胺基酸具有宿主細胞(例如哺乳動物、昆蟲或酵母宿主細胞)翻譯後修飾的結構。
可以化學地或使用合適的宿主，產生翻譯後修飾。例如，在啤酒糖酵母中，倒數第二個胺基酸的性質似乎會決定是否去除N-末端甲硫氨酸。另外，倒數第二個胺基酸的性質還會決定是否使N-末端胺基酸Nα-乙醯化(Huang等，Biochemistry 268242-8246，1987)。另一個實例包括由於分泌前導序列(例如，信號肽)的存在而靶向分泌的多肽，其中通過N-連接的或O-連接的糖基化修飾了多肽(Kukuruzinska等，Ann.Rev.Biochem.56915-944，1987.)。
酵母表達優選地，在使用含有最優化的用於酵母表達的密碼子的編碼核酸的酵母中，表達ORF0657n相關多肽。使用能編碼ORF0657n相關多肽的重組基因和用於酵母表達的調節區，可以進行在酵母中的表達。依賴於使用的表達系統，產生的蛋白可以維持在細胞內，或者可以分泌到細胞外。
優選地，重組基因表達的啟動子是誘導型啟動子，例如來自酵母半乳糖基因簇的啟動子(GAL啟動子，例如GAL1、GAL7、GAL10、MEL1)或酸性磷酸酶PH05啟動子或醇脫氫酶II ADH2啟動子或銅-調節的金屬硫蛋白CUP1啟動子。可以使用的「組成型」啟動子的實例是GAP(TDH)、PGK或TPI啟動子(Romanos等，YEAST 8423-488，1992.)。
可以選擇或工程改造用於重組表達的酵母宿主細胞，以促進重組基因表達。突變，例如mnn9、prb1和/或pep4突變一般地是理想的。為了增強從GAL啟動子的表達，可以實現GAL4轉錄因子的超表達(Hopper等，美國專利5,068,185)。
通過用高表達水平的密碼子替換低或中等使用水平的密碼子，可以進行特定宿主的密碼子最優化。存在於編碼序列中的最佳密碼子的百分比可以變化。在不同的實施方案中，最佳密碼子(包括原始存在的密碼子和導入的密碼子)的數目佔密碼子總數的至少50％、至少75％、至少95％或100％。
可以如下進行密碼子最優化1.對於特定的密碼子，對比野生型密碼子頻率和酵母基因使用的總密碼子頻率。
2.如果該密碼子不是酵母常用密碼子之一，則將其替換為在酵母細胞中高表達的最佳密碼子。
3.對於不同的密碼子，重複步驟(1)和(2)，直到實現理想水平的密碼子最優化。
4.檢查新編碼序列的非所需的序列，例如不需要的限制酶位點、剪接位點、啟動子、不需要的迴文序列或重複序列、轉錄終止序列和高頻率的GC鹼基。使用替代密碼子，去除不需要的序列。
Lathe，J.Molec.Biol.，1831-12，1985提供了替代密碼子選擇。不同酵母宿主中的密碼子選擇是本領域眾所周知的。例如，Sharp等，Yeast 7657-678，1991描述了啤酒糖酵母中的同義密碼子選擇。
圖8C-8M提供了酵母最優化的核酸序列。圖8C提供了酵母最優化的核酸序列(SEQ ID NO31)，其能編碼沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28。圖8D提供了酵母最優化的能編碼SEQ ID NO3的核酸序列(SEQ IDNO32)。圖8E提供了酵母最優化的能編碼SEQ ID NO1的核酸(SEQ IDNO33)序列。圖8F-8M提供了酵母最優化的核酸序列(SEQ ID NO34-41)，其能編碼含有甲硫氨酸氨基末端的SEQ ID NO7。圖8N-8U提供了酵母最優化的核酸序列(SEQ ID NO46-53)，其能編碼以SEQ ID NO17或SEQ ID NO20為基礎的不同的ORF0657n相關多肽。
使用最優化的序列和未為酵母表達最優化的序列(例如，SEQ ID NO29的核苷酸1-1935或124-1458，或SEQ ID NO30的核苷酸1-1710)，可以實現酵母表達。在下面的實施例中，解釋了使用最優化的和未最優化的序列進行酵母表達的技術。
ORF0657n是一種表面蛋白，其含有帶有保守的「LPXTG」基序的36-胺基酸C-末端細胞壁分類信號(Schneedwind等1993，EMBO，124803-4811，1993)。含有細胞壁分類信號的蛋白通過轉肽酶(sortase)(一種膜結合蛋白)催化的轉肽作用機理，連接到細胞壁包膜上(Mazmanian等，Science 299906-909，2001)。為了連接，該表面蛋白還必須含有N-末端信號肽，以輸出到分泌途徑中。在分泌途徑中，去除該信號肽，且細胞壁分類信號有利於保持在分泌途徑中。然後，轉肽酶在LPXTG基序的蘇氨酸和甘氨酸之間切割，並催化蘇氨酸的羧基和肽聚糖交聯橋的氨基之間的醯胺鍵的形成。
發現去除細胞壁分類序列，可以顯著增強在酵母中的表達。在不同的實施方案中，能編碼多肽的構建體缺少功能性細胞壁分類編碼序列，且更優選地，缺少功能性細胞壁分類和信號肽編碼序列。對應的優選的ORF0657n相關多肽缺少功能性細胞壁分類序列，或細胞壁分類和信號肽序列兩者。
在不同的實施方案中，至少基本上所有的細胞壁分類序列或細胞壁分類和信號肽序列都不存在於多肽或能編碼多肽的核酸中。在不同的實施方案中，通過去除至少基本上所有的細胞壁分類序列或細胞壁分類和信號肽序列兩者，使蛋白表達提高了至少約10倍、至少約15倍、或至少約20倍。更優選地，編碼構建體還含有一個或多個為酵母(例如，啤酒糖酵母)表達最優化的密碼子。
可以相對於SEQ ID NO2，解釋ORF0657n細胞壁分類和信號肽序列的近似區域的實例。胺基酸1-42含有信號肽序列。胺基酸609-645含有細胞壁分類序列。
佐劑佐劑是能輔助免疫原產生免疫反應的物質。佐劑可以通過不同的機理起作用，例如下述的一種或多種提高抗原的生物學的或免疫學的半衰期；改善抗原向抗原呈遞細胞的遞送；改善抗原呈遞細胞的抗原加工和呈遞；和誘導免疫調製細胞因子的生成(Vogel，Clinical InfectiousDiseases 30(suppl.3)S266-270，2000.)。
可以使用許多不同類型的佐劑來輔助免疫反應的產生。具體佐劑的實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、或其它鋁鹽、磷酸鈣、DNA CpG基序、單磷醯基脂類A、霍亂毒素、大腸桿菌熱不穩定毒素、百日咳毒素、胞壁醯二肽、弗氏不完全佐劑、MF59、SAF、免疫刺激複合物、脂質體、可生物降解的微球、皂苷類、非離子型嵌段共聚物、胞壁醯肽類似物、聚磷腈、合成的多核苷酸、IFN-γ、IL-2、IL-12和ISCOMS(Vogel ClinicalInfectious Diseases 30(suppl 3)S266-270，2000，Klein等，Journal of Pharmaceutical Sciences 89311-321，2000，Rimmelzwaan等，Vaccine 191180-1187，2001，Kersten Vaccine 21915-920，2003，O′Hagen Curr.Drug Target Infect.Disord.，1273-286，2001.)。
用於誘導保護性免疫的患者「患者」是指能被金黃色葡萄球菌感染的哺乳動物。可以預防性地或治療性地處理患者。預防性的處理能提供足夠的保護性免疫，以減少金黃色葡萄球菌感染的可能性或嚴重性。可以進行治療性的處理，以減少金黃色葡萄球菌感染的嚴重性。
使用含有本文所述的免疫原的疫苗，可以進行預防性的處理。優選地，在人上進行這樣的處理。可以將疫苗施用給一般人群，或處於金黃色葡萄球菌感染的高度危險中的那些人。
具有金黃色葡萄球菌感染的高度危險的人包括健康護理工作人員；醫院患者；免疫系統虛弱的患者；接受手術的患者；接受異物(例如導管或血管裝置)植入的患者；面臨會導致弱化的免疫的治療的患者；具有燒傷或創傷的人；和從事具有燒傷或創傷高風險職業的人。(TheStaphylococci in Human Disease，Crossley and Archer(編)，Churchill Livingstone Inc.1997.)可以被金黃色葡萄球菌感染的非人患者包括母牛、豬、綿羊、山羊、兔子、馬、狗、貓和小鼠。非人患者的處理可以用於保護寵物和家畜，和用於評價特定處理的功效。
回憶應答發現ORF0657n相關多肽在單次給藥後，能在獼猴中產生迅速且有效的免疫反應(見下面的實施例17)。觀察到的反應與回憶應答相一致。
回憶應答的產生能提供了顯著的優點，例如使用單次給藥提供有效的免疫的能力，和在短時間內提供有效的免疫。在不同的實施方案中，回憶應答會使幾何平均滴度比以前存在的滴度增加至少3-倍、至少5-倍或至少6-倍；且在3、5、7、9、14或21天內產生倍數增加。
迅速產生有效的免疫反應的能力會比多劑接種疫苗節省成本，且可以用於給處於金黃色葡萄球菌感染的高度危險中的患者接種疫苗。具有金黃色葡萄球菌感染的高度危險的人包括健康護理工作人員；醫院患者；免疫系統虛弱的患者；接受手術的患者；接受異物(例如導管或血管裝置)植入的患者；面臨會導致弱化的免疫的治療的患者；具有燒傷或創傷的人；和從事具有燒傷或創傷高風險職業的人(TheStaphylococci in Human Disease，Crossley and Archer(編)，Churchill Livingstone Inc.1997.)。在不同的實施方案中，立即地，或在3、5、7、9、14或21天的醫學過程內，給患者接種疫苗。
複合疫苗可以單獨地或與其它免疫原組合地使用能提供保護性免疫的ORF0657n相關多肽，以誘導免疫反應。可以存在的其它免疫原包括一種或多種其它的金黃色葡萄球菌免疫原，例如在上面的發明背景中提及的那些；一種或多種能靶向一種或多種其它葡萄球菌屬生物(例如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)或S.lugunensis)的免疫原；和一種或多種能靶向其它感染性生物的免疫原。
動物模型系統使用了動物模型系統來評價多肽產生針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應的功效。在建立保護性動物模型時遇到的2個障礙是(1)需要非常高的攻擊劑量來克服先天免疫，和(2)死亡速度太快，以致於難以檢測保護性反應。更具體地，小鼠在細菌攻擊後24小時內就會死於感染，這不能提供足夠的時間進行特異性的免疫反應來解決感染。當降低劑量時，對照小鼠和免疫的小鼠都會倖免於感染。
使用慢動力學致死率模型，其包含適度滴定且靜脈內施用的由穩定期的細胞製備出的金黃色葡萄球菌，克服了這些障礙。該死亡的慢動力學能提供足夠的時間進行特異性的免疫防禦，以竭力避免細菌感染(例如，10天，而不是24小時)。
從生長在固體培養基上的細胞，可以得到穩定期的金黃色葡萄球菌細胞。也可以從液體得到它們，但是用生長在固體培養基上的細胞得到的結果是更有重複性的。可以方便地使細胞在固體培養基上生長過夜。例如，可以在倍增時間是約20-30分鐘的條件下，使金黃色葡萄球菌生長約18-24小時。
使用標準技術，可以從固體或液體培養基中分離出葡萄球菌，以維持葡萄球菌潛能。可以將分離的葡萄球菌保藏在例如-70℃，作為洗滌的在含有甘油的磷酸緩衝鹽水中的高密度懸浮液(＞109菌落形成單位(CFU)/mL)。
葡萄球菌攻擊應當具有在從第一天或第二天開始經約7-10天的時間段、在動物模型中提供約80-90％死亡的潛能，可以使用動物模型進行滴定實驗，以監控保藏的葡萄球菌接種物的潛能。可以在接種實驗之前約1-2周，進行滴定實驗。
滴定實驗的起始潛能可以以以前的實驗為基礎。關於動物模型株Becker，通常在5×108至8×108CFU/mL的範圍發現合適的金黃色葡萄球菌攻擊。
施用使用本文提供的指導和本領域眾所周知的技術，可以配製免疫原，並施用給患者。關於藥物施用的指南通常提供在，例如，Vaccines，Plotkin和Orehstein編，W.B.Sanders Company，1999；Remington′sPharmaceutical Sciences第20版，Gennaro編，Mack Publishing，2000；和Modern Pharmaceutics第2版，Banker和Rhodes編，Marcel Dekker，Inc.，1990，每篇都在這裡引作參考。
藥學上可接受的載體能有利於保藏和免疫原向患者的施用。藥學上可接受的載體可以含有不同的組分，例如緩衝劑、無菌注射用水、生理鹽水或磷酸緩衝鹽水、蔗糖、組氨酸、鹽和polysorbate。
通過不同的途徑，例如皮下的、肌內的或黏膜的，可以施用免疫原。使用例如針或噴射注射器(jet-injector)，可以進行皮下的和肌內的施用。
優選地，考慮本領域眾所周知的因素，包括患者的年齡、體重、性別和醫學狀況，施用途徑，所需的效果，和採用的具體化合物，可以確定合適的給藥方案。可以以多劑的疫苗形式使用免疫原。可以預期，一劑由1.0μg至1.0mg總多肽組成。在本發明的不同的實施方案中，該範圍是0.01mg至1.0mg和0.1mg至1.0mg。
給藥時間選擇取決於本領域眾所周知的因素。初次施用後，如果特定的個體需要，隨後可以施用一個或多個激發劑量，以維持或加強抗體滴度。給藥方案的實例是第1天，1個月，在4、6或12個月時第3次給藥，和根據需要以較遠次數的其它激發劑量。
抗體的產生可以使用能誘導保護性免疫的ORF0657相關多肽來產生抗體和抗體片段，所述抗體和抗體片段能結合該多肽或金黃色葡萄球菌。這樣的抗體和抗體片段具有不同的用途，包括在多肽純化、金黃色葡萄球菌識別、或治療性地或預防性地處理金黃色葡萄球菌感染中的用途。
抗體可以是多克隆的或單克隆的。用於生產和使用抗體的技術是本領域眾所周知的。這樣的技術的實例記載在Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，Harlow等，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，和Kohler等，Nature 256495-497，1975。
實施例下面提供的實施例進一步解釋了本發明的不同特徵。這些實施例也解釋了有用的用於實現本發明的方法。這些實施例不限制要求保護的發明。
實施例1使用ORF0657n區來提供保護性免疫該實施例解釋了全長ORF0657n區提供保護性免疫的能力。
ORF0657n克隆和表達設計了PCR引物，以擴增能編碼ORF0657n的基因，其從第一個天冬醯胺殘基開始，且在位於末端天冬醯胺殘基的終止密碼子之前結束。這些PCR引物也具有其它的NcoI(正向引物)和XhoI(反向引物)位點，以促進向表達載體中的克隆。
設計編碼的蛋白以從具有末端His殘基和由該載體編碼的終止密碼子的pET28載體表達。另外，將甘氨酸殘基添加到甲硫氨酸起始密碼子後的蛋白中。得到的擴增的DNA序列能編碼羧基His-標記ORF0657n(SEQID NO28)。
使用已經被工程改造在PCR引物中的NcoI/XhoI位點，將PCR擴增的序列連接進pET28載體(Novagen)中，並通過熱休克導入大腸桿菌DH5α(Invitrogen)。在37℃，使轉化混合物在含有100μg/mL卡那黴素的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上生長過夜。選擇菌落，在含有30μg/mL卡那黴素的LB中生長，製備DNA minipreps(Promega)，並通過限制消化和PCR測定插入片段完整性。使用引物M13F(SEQ ID NO65)、M13R(SEQ ID NO66)、ORF0657nF(SEQ ID NO67)和ORF0657nR(SEQ ID NO68)，對4個具有正確的插入片段大小的minipreps進行了測序。選擇了與理想序列相比沒有DNA變化的克隆。
轉化了大腸桿菌HMS174(DE3)細胞(Novagen)，並在含有卡那黴素(30μg/mL)的LB平板上生長；選擇了3個菌落(UnkC-1、UnkC-2和UnkC-3)，用於表達測試。在37℃、250rpm溫育液體LB(卡那黴素)培養物，直到A600達到0.6-1.0，然後通過加入IPTG至1mM的終濃度進行誘導，然後另外溫育3小時。通過在4℃、5000xg離心5分鐘，收穫培養物。將細胞重新懸浮到500μL裂解緩衝液(Bug Buster，含有蛋白酶抑制劑，Novagen)中。加入等體積的裝載緩衝液(補加了5％終體積的β-巰基乙醇)，然後將樣品在70℃加熱5分鐘。將提取物上Novex 4-20％Tris-甘氨酸凝膠，並使蛋白可視化(考馬斯藍染色)，並在硝酸纖維素上進行印跡，用抗-HIS6抗體(Zymed)檢測。
ORF0657n純化將上面的小規模的方法直接按比例放大到50升工作體積的攪拌罐式發酵罐(75升規模)中。在含有50mL Luria-Bertani(LB)培養基(加卡那黴素)的250mL燒瓶中培養接種物，並接種1mL冷凍的種子培養物，培養3小時。使用1mL這樣的種子，接種含有500mL LB培養基(加卡那黴素)的2升燒瓶，並培養16小時。用50升LB培養基(加卡那黴素)，培養大規模發酵罐(75升規模)。發酵罐的發酵參數是壓強＝5表壓(psig)，攪拌速度＝300rpm，氣流＝15升/分鐘，且溫度＝37℃。將細胞培養至在600nm波長的光密度(OD)為0.8光密度單位，並用1mM濃度的異丙基-β-K-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。使用IPTG的誘導時間是3小時。如下收穫細胞將溫度降低至15℃，穿過500KMWCO中空纖維盒進行濃縮，在4℃、9,000倍重力離心20分鐘。傾析出上清液，並在-70℃冷凍重組大腸桿菌溼細胞沉澱。
以8mL/g細胞溼重，將重組大腸桿菌細胞(19.2g溼細胞重量)懸浮在裂解緩衝液(50mM Tris-HCl，pH8.0，0.1M NaCl，2mM MgCl2，10mM咪唑，0.1％TweenTM-80和6M鹽酸胍)。以0.05mL/g細胞漿，將與多-(組氨酸)-標記的蛋白(Sigma，P8849)一起使用的蛋白酶抑制劑混合物加入懸浮液中。另外，加入溶菌酶至1mg/mL，加入BenzonaseTM(EMInd.)至1μL/mL。通過使懸浮液在4℃穿過在14,000 PSI的微流化儀(Microfluidics Model 110S)4次，完成細胞裂解。在4℃、11,000xg沉澱細胞碎片30分鐘，保留上清液。
從上清液中純化出攜帶His-標記的蛋白。在輕度顛倒下，在4℃混合上清液與20mL Ni+-NTA瓊脂糖(Qiagen)2小時。將混合物倒入空心柱(1.5cm×20cm)中，並將未結合的級分大量收集。用洗滌緩衝液(20mMTris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl，0.1％TweenTM-80)洗滌柱子。用300mM咪唑，20mM Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl，0.1％TweenTM-80的分級梯度，洗脫His-標記的ORF0657n。
通過考馬斯染色的SDS-PAGE，檢測了含有His-標記ORF0657n(SEQID NO28)的級分，並合併。經0.2微米過濾器，過濾合併的級分，以去除顆粒材料，並應用到大小排阻柱(Sephacryl S-300 26/60柱，Amersham Biosciences)上，用10mM MOPS pH7.1，150mM NaCl，以1mL/分鐘洗脫。通過考馬斯染色的SDS-PAGE和蛋白印跡(anti-tetra HisMab，Qiagen)，檢測了含有His-標記ORF0657n的級分。通過Zeta-PlusTM生物濾器(CUNO)，過濾去除了內毒素。通過BCA(Pierce)，確定了蛋白濃度。通過考馬斯染色的凝膠的光密度測定法，測定了純度。
實施例2金黃色葡萄球菌攻擊的製備使金黃色葡萄球菌在胰腖豆腖瓊脂(TSA)(Becton Dickinson，Sparks，MD)平板上、在37℃生長過夜。通過將5mL PBS加到平板上，從TSA平板上洗滌細菌，並用無菌的塗布器輕柔地重新懸浮細菌。使用Sorvall RC-5B離心機(Dupont Instruments)，在6000rpm離心細菌懸浮液20分鐘。將沉澱重新懸浮到16％甘油中，並將等分試樣冷凍儲存在-70℃。
使用之前，融化接種物，適當稀釋，並用於感染。將每份原液滴定至少3次，以確定適用於誘導前次用於實驗的小鼠的慢死亡動力學的劑量。連續監控細菌接種物的潛能(殺死80-90％小鼠的能力)，以確定模型的重複性。在每個攻擊實驗前10天，攻擊並監控了一組10隻對照動物(只用佐劑免疫的)。
實施例3使用His-標記的ORF0657n相關多肽的保護研究通過3劑在羥基磷酸鋁佐劑(每劑450μg)上的His-標記ORF0657n(SEQ ID NO28)(每劑20μg)，免疫了25隻BALB/c小鼠。Klein等，Journal of Pharmaceutical Sciences 89，311-321，2000描述了羥基磷酸鋁佐劑(AHP)。作為在第0、7和21天的2次50μL肌內注射，進行了給藥。在第28天，抽小鼠的血，通過ELISA篩選它們的血清對His-標記ORF0657n的反應性。
在實驗的第35天，以在滴定實驗中確定的劑量(7.3×108CFU/mL)，通過靜脈內注射生長的金黃色葡萄球菌，攻擊了小鼠，以造成在約2-7天的時間段的死亡。相對於已經用AHP假免疫的對照組小鼠，評價了具有慢死亡動力學的該致死模型的存活率。經14天的時間段，監控小鼠的存活率(圖3A)。在實驗結束時，ORF0657n免疫的組中有11隻小鼠存活，與在AHP對照組中有3隻存活形成對比。
圖3B和3C解釋了使用與ORF0657nH和ORF0657nI區相對應的多肽的保護。圖3B解釋了用含有羧基His-標記的SEQ ID NO4的保護。圖3C解釋了用含有羧基His-標記的SEQ ID NO5的結果。
實施例4得到ORF0657n序列已經暗示ORF0657n在金黃色葡萄球菌鐵獲得中起作用(Andrade等，Genome Biology 3(9)47.1-47.5，2003.)。在不同的文獻中，已經為ORF0657n序列給出了不同的名稱，其中的一些是不同來源的(例如，見，Etz等，PNAS USA，996573-6578，2002(LPXTGVI)；Baba等，The Lancet 3591819-1827，2002(MW1011)；Kuroda，等，The Lancet357，1225-1240，2001(SA0976)；Andrade等，Genome Biology 3(9)47.1-47.5，2003(S_aur2)；Mazmanian等，Science 299906-909，2003(isdB)；Mazmanian等，Molecular Microbiology 401049-1057，2001(sasJ)；和Taylor等，Mol.Microbiol.431603-1614，2002(sirH)。
似乎在不同的專利公開中，提供了與ORF0657n蛋白序列相對應的多肽序列(Meinke等，2002年8月1日公開的國際公開號WO02/059148，Wang等，2002年10月3日公開的國際公開號WO02/077183，Masignani等，2002年11月28日公開的國際公開號WO02/094868，Foster等，2002年12月27日公開的國際公開號WO02/102829，和Foster等，2003年2月13日公開的國際公開號WO03/011899.)。
從不同的金黃色葡萄球菌臨床分離物，得到了基因組DNA。將臨床分離物加入到3mL Difco胰腖豆腖培養液(Becton Dickinson，Sparks，MD)中，並在37℃和150rpm溫育過夜。在1.5mL Eppendorf管中，在14,000rpm離心過夜的培養物5分鐘。傾析出培養液，將沉澱重新懸浮在500μL重新懸浮緩衝液(25％蔗糖，10mM Tris pH7.5)中。將2mg/ml溶葡萄球菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)溶液的5μL等分試樣加入每份重新懸浮的沉澱中。然後，在37℃溫育懸浮液1小時。
在溫育階段的末尾，將250μL2％SDS加入每個管中，並渦旋，直到溶液的粘度顯著降低。加入250μL苯酚-氯仿-異戊醇溶液(25∶24∶1，v/v)(Gibco/Invitrogen Corporation，Grand Island，NY)。渦旋混合物30秒，並在14,000rpm離心5分鐘。取出上面的水相，重複沉澱步驟，直到幾乎不殘留任何界面。向每個管中加入0.1體積的3M NaOAc，pH4.8，並混合。然後加入1體積異丙醇，並再次混合。將管在室溫溫育5分鐘，然後在14,000rpm離心15分鐘。傾析出上清液，並將管在組織上倒置乾燥。將沉澱重新懸浮在50μL無菌的H2O中。
將分離的DNA用作PCR的模板。使用正向引物(ORF0657nF，SEQ IDNO67)和反向引物(ORF0657nR，SEQ ID NO68)，擴增了該基因。使用標準的Big Dye方法，對PCR產物進行了測序。
實施例5來自不同的金黃色葡萄球菌分離物的ORF0657n的對比發現ORF0657n在病理學上和分類學上不同的金黃色葡萄球菌臨床分離物收集物中是非常保守的。表3總結了不同的分離物(包括臨床分離物)之間的百分比同一性。
表3
CP，莢膜類型；MLST，多基因座序列分型分類學的分組；MRSA二甲氧基苯青黴素抗性的金黃色葡萄球菌；MSSA，二甲氧基苯青黴素敏感的金黃色葡萄球菌；「CL」是指臨床分離物。「ID」是指同一性。「VISA」是指萬古黴素中間的金黃色葡萄球菌。
通過比對多肽序列和SEQ ID NO2，並確定相同的胺基酸的數目，確定了百分比同一性(％ID)。該數目除以(SEQ ID NO2的)胺基酸總數，然後乘以100，並四捨五入到最接近的整數。
實施例6針對不同的金黃色葡萄球菌臨床分離物的保護使用His-標記ORF0657n作為免疫原(SEQ ID NO28)，評價了ORF0657n作為針對不同的金黃色葡萄球菌臨床分離物的免疫原的功效。使用表3所述的分類學上不同的分離物的亞群作為攻擊接種物。在這些不同的分離物中的ORF0657n序列與採用的疫苗OFR0657n序列不同。
使用實施例2所述的技術，製備了得到的攻擊菌株。使用實施例3所述的技術，免疫和攻擊了小鼠，並監控了10天。在該模型中常規地使用的攻擊接種物遠遠超過了在人感染中一般遇到的那些。
證實了針對二甲氧基苯青黴素敏感的和抗性的菌株的保護。結果顯示在圖4A-4H中。
實施例7用於酵母表達的SEQ ID NO28的密碼子最優化為了在酵母中表達，密碼子最優化了能編碼SEQ ID NO28的胺基酸1-646的核酸序列。SEQ ID NO28的胺基酸1-646密碼子最優化的序列顯示在圖8C(SEQ ID NO31)中。
使用沒有羧基His-標記編碼區的SEQ ID NO29作為最優化的起始構建體。最優化之前的編碼序列的總密碼子選擇是28％密碼子(179)是非常罕見的，或從未被高表達的酵母基因所使用，且20％(126)是中等罕見的。
進行了能編碼SEQ ID NO28的胺基酸1-646的核酸的密碼子最優化，以將具有低或中等表達的密碼子替換為在酵母中高表達的密碼子。另外，將甘氨酸密碼子加入到第二個位置。使用軟體程序MacDNAsis ProV3.0，進行了密碼子最優化。使用的用於反向翻譯(backtranslate)蛋白的參數表指示著高表達的啤酒糖酵母密碼子。在MacDNAsis Pro中，使用的功能是「翻譯＞[蛋白--＞DNA]」。將輸出稱作「胺基酸轉變」。
在一些情況下，對於給定的胺基酸，存在不只一個高表達的密碼子。例如，絲氨酸可以由「TCT」或「TCC」編碼。在這些情況中，使用了近似相等數目的2種不同的密碼子。表4提供了高表達的啤酒糖酵母密碼子的密碼子表。
表4
將非最佳的所有密碼子都替換成了在高表達的酵母基因中出現的密碼子，只是除了將2個丙氨酸密碼子改變成在中等表達的SEQ ID NO31的基因中出現的密碼子外(GCG開始於核苷酸505和1546)。
通過設計用於編碼最終所需序列的25個寡聚物(SEQ ID NO69-93)的退火和延伸，製備了能編碼ORF0657n的全序列。該寡聚物是85-110bp對長。該寡聚物是交替的ORF0657n編碼序列。每個寡聚物與鄰接寡聚物具有25-29bp的互補重疊，且雙鏈體具有80-84℃的Tm。通過給GC鹼基對指定4℃的值，給AT鹼基對指定2℃，可以手工計算出該值。
使用3或4個鄰接的重疊寡聚物和(23-26)個核苷酸長的有義和反義PCR引物，其中雙鏈體Tm＝70-72℃，進行了幾個分開的延伸反應。在如下所述的「著地(touch down)」方法中，使用自然的Pfu DNA聚合酶(STRATAGENE，La Jolla，CA)進行了PCR反應95℃，90秒，一個循環；95℃，30秒，55℃，30秒，68℃，3分鐘，進行5個循環，然後馬上進行第二系列的反應；95℃，30秒，52℃，30秒，68℃，3分鐘，進行20個循環。通過在68℃溫育7分鐘，結束反應。作為這些PCR反應的結果，生成了的7個共線性片段(為了方便，在本文中稱作1、2、3、4、5、6和7)。
通過瓊脂糖凝膠電泳，分離了片段，並按照生產商所推薦的，使用GENE CLEAN_II方法(QBIOgene，Carlsbad，CA)，切離和純化了適當大小的產物。在隨後的PCR反應中，使用適當的引物，組合共線性片段1、2和3，共線性片段4和5，和共線性片段6和7，分別生成片段A、B和C。然後通過其它的PCR反應，其中使用遠端的有義和反義引物，組合了片段A、B和C，組裝了ORF0657n的完整基因。凝膠分離了最終的PCR產物，並按照生產商所推薦的，將其克隆進pCR_-Blunt N-TOPO_(INVITROGEN，Carlsbad，CA)。得到了幾個獨立的克隆的DNA序列，並識別了錯誤。
根據生產商的推薦，依次使用QUIK-CHANGE定點誘變試劑盒，或同時使用QUIK-CHANGE定點多重誘變試劑盒(STRATAGENE，La Jolla，CA)，在3個獨立的克隆pUC3、pUC4和pUC6的不同的片段上，校正了錯誤。通過交換來自3個克隆的修復的限制片段，得到了最終的校正的序列。用克隆pUC4的修復的1.1-kb XmnI片段交換pUC3的對應的XmnI片段，以構建pUnkC13。用pUC6的修復的456-bp AccI片段交換pUnkC13的對應片段，以構建pUnkCR1，並檢驗了DNA序列。
實施例8用於重組基因表達的啤酒糖酵母菌株的構建該實施例解釋了可以用於得到重組基因表達的啤酒糖酵母菌株的技術。下面描述了命名為1260和1309的菌株的生成。由於菌株的遺傳背景可以極大地影響菌株的異源蛋白表達的性質，所以需要構建具有不同遺傳背景的酵母菌株，其也含有幾種理想的遺傳標記(1)mnn9突變，以預防分泌的蛋白的過度糖基化，(2)prb1和/或pep4蛋白酶突變，以減少蛋白水解的問題，和(3)GAL4轉錄因子的超表達，以增強GAL啟動子的表達。
命名為1260的啤酒糖酵母菌株的構建以下述的方式，構建了原始的啤酒糖酵母菌株。使啤酒糖酵母菌株Y379-5D(MATα、cyh2、nib1、rho-、cir°)(Livingston，Genetics 8673-84，1977)與菌株DC04(MATα、ade1、adeX、leu2-04、cir°)(Broach等，Cell 21501-508，1980)雜交。使得到的二倍體菌株產生孢子，並通過標準方法，解剖四聯體。一個單倍體孢子生成菌株2150-2-3(MATα、ade1、leu2-04、cir°)。α-交配型酒糖酵母菌株LB-347-1C(MATα、mnn9)是含有mnn9突變的啤酒糖酵母菌株X2180-1B(MATα、SUC2、ma1、me1、ga12、CUP1；ATCC號204504)。通過在YEHD完全培養基瓊脂平板上混合菌株(Carty等，J.Ind.Micro 2117-121，1987)，使LB-347-1C與模式2150-2-3(MATα、leu2-04、ade1)交配。為了選擇二倍體，將交配的菌株影印鋪板到不含亮氨酸、且含有2％蔗糖作為唯一碳源的基本培養基上。分離單個的菌落後，使二倍體產生孢子，並通過標準技術解剖子囊。將KHY-107菌株分離成單個的單倍體孢子，並鑑別為ADE1、leu2和mnn9(通過Schiff染色技術)。建立了在甘油中的冷凍原種，並保藏在-70℃。
從-70℃原種生長了KHY-107(cir+)，並用酵母載體pC1/1進行了轉化，後者含有酵母LEU2-d基因，且與pJDB219相關(Beggs，Nature275104-109，1978)，只是除了pMB9 DNA被替換為pBR322 DNA。使分離的轉化體在選擇性液體培養基(缺少亮氨酸，且含有1M山梨醇)中生長，然後在豐富培養基(含有1M山梨醇)中多次傳代，以丟失pC1/1和2μDNA。通過DNA-DNA雜交，檢查了已經丟失了pC1/1的菌落(不能在缺少亮氨酸的培養基上生長)中2μDNA的存在。選擇了分離的沒有顯示出2μDNA的克隆KHY-107(cir°)-1，並建立了在甘油中的冷凍原種(-70℃)。
通過基因破壞，將KHY-107(cir°)-1製成ura3。構建了質粒，其含有被來自Tn903的Aph3′I基因的2個拷貝所破壞的啤酒糖酵母URA3基因。從載體切割了5′-URA3-Aph3′I-URA3-3′盒，並用於轉化KHY-107(cir°)-1。在5-氟-乳清酸平板上，選擇了已經整合了破壞的ura3盒的轉化體(Kaiser，C.等，Methods in Yeast Genetics-1994版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，(Cold Spring Harbor，New York；1994)第214-215頁)，並隨後顯示其不能在缺少尿嘧啶的培養基上生長。選擇了一個分離的克隆KHY-107ura3(PN2)，並建立了在甘油中的冷凍原種(-70℃)。
使KHY-107ura3(PN2)在複合培養基(含有1M山梨醇)上生長，然後鋪板到含有刀豆氨酸(而不是精氨酸)的合成培養基上，得到了刀豆氨酸-抗性的(canR)突變體。將自發的canR突變體劃線為在含有刀豆氨酸(而不是精氨酸)的固體合成培養基上分離的菌落。通過標準的遺傳互補實驗，顯示分離的菌落是can1。選擇了一個分離的can1菌落DMY10，並作為在甘油中的冷凍原種(-70℃)進行保藏。
為了超表達酵母GAL4轉錄因子，將GAL10p-GAL4融合基因整合進了DMY10的HIS3基因中。從pKHint-C切離了5′-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3′盒(Schultz等，Gene 61123-133，1987)，並用於轉化DMY10。在缺少尿嘧啶的固體合成培養基上，選擇了已經整合了該盒的轉化體，並隨後顯示其不能在缺少組氨酸的培養基上生長。通過DNA雜交，驗證了該盒僅僅在HIS3基因座的整合。選擇了一種分離的整合體DMY10int-3，並建立了在甘油中的冷凍原種(-70℃)。將該菌株命名為CF52。
用HindIII和XhoI消化了攜帶啤酒糖酵母PRB1基因的質粒FP8ΔH(Moehle等，Genetics 115255-263，1987)，並凝膠純化了攜帶PRB1基因的3.2-kbp DNA片段，通過用T4 DNA聚合酶處理，造成平端。用BamHI消化了質粒pUC18，經凝膠純化，並通過用T4 DNA聚合酶處理，造成平端。用上面的PRB1基因片段，連接得到的載體片段，以產生質粒pUC18-PRB1。用BamHI消化了含有HIS3基因的質粒YEp6(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 761035，1979)。凝膠純化了得到的攜帶功能性HIS3基因的1.7-kbp BamHI片段，然後通過用T4 DNA聚合酶處理，造成平端。用EcoRV和NcoI消化了pUC18-PRB1載體，其能剪切PRB1編碼序列，並去除蛋白酶B活性位點和側翼序列。凝膠純化了攜帶pUC18中的PRB1編碼序列的殘餘的5′和3′-部分的5.7-kbpEcoRV-NcoI片段，通過用T4 DNA聚合酶處理，造成平端，用鹼性磷酸酶去磷酸化，並與上述的平端的HIS3片段相連。得到的質粒(命名為pUC18-prb1::HIS3，原種#1245)含有功能性HIS3基因，其替代了上面已經缺失的PRB1基因的部分。
用SacI和XbaI消化了PRB1基因破壞載體(pUC18-prb1::HIS3)，以產生線性的prb1::HIS3破壞盒，並通過乙酸鋰方法，用於轉化菌株CF52(Ito等，J Bacteriol.153163，1983)。在缺少組氨酸的合成瓊脂培養基上，選擇了His+轉化體，並在相同的培養基上重新劃線，進行克隆分離。從許多得到的His+分離物製備了基因組DNA，用EcoRI消化，然後在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。DNA印跡分析證實了需要的prb1Δ::HIS3基因破壞的存在。
選擇了一個含有需要的prb1Δ::HIS3破壞的分離物，用於其它用途，並命名為菌株#1260。製備了菌株#1260在甘油中的冷凍原種，以保藏在-70℃。得到的菌株1260的基因型如下MATα、leu2-2、112、mnn9、ura3Δ、can1、his3Δ::GAL10p-GAL4-URA3、prb1Δ::HIS3、cir°。
命名為1309的啤酒糖酵母菌株的構建以前已經描述了啤酒糖酵母菌株BJ1995(MATα、leu2、trp1、ura3-52、prb1-1122、pep4-3、ga12)(Jones，E.W.，Tackling theProtease Problem in Saccharomyces cerevisiae，Methods inEnzymology 194(1991)，第428-453頁)。使用公開的構建菌株1260的方法，分離了缺少內源性2μDNA質粒的BJ1995的cir°衍生物。將得到的cir°分離物命名為菌株91，並作為在甘油中的冷凍原種(-70℃)進行保藏。
然後，構建了菌株91的衍生物，其能過量生產GAL4轉錄因子，以增強從GAL啟動子的轉錄。用BamHI消化了質粒pKHint-C(Schultz等，Gene 61123-133，1987)，並使用得到的5′-HIS3-GAL10p-GAL4-URA3-HIS3-3′盒轉化菌株91。在缺少尿嘧啶的固體合成培養基上，選擇了已經整合了該盒的轉化體，隨後顯示其不能在缺少組氨酸的培養基上生長。使用酵母HIS3基因的探針，通過DNA印跡雜交，確認了該盒在HIS3基因座中的理想整合。選擇了一個分離的整合體BJ1995cir°int#22，並建立了在甘油中的冷凍原種(-70℃)。將該分離物命名為菌株1282。
然後，按照下面的一系列步驟，分離了含有破壞的MNN9基因的菌株1282的衍生物。為了破壞MNN9基因，必須首先從啤酒糖酵母基因組DNA克隆出MNN9基因，以製備基因破壞載體。這可以通過標準的PCR技術來實現。在公開的酵母MNN9基因的序列的基礎上(MacKay等，歐洲公開號EP0314096，國際
公開日1989年5月3日)，設計了用於全長MNN9編碼序列的PCR的5′有義引物和3′反義引物。使用了下面的含有側翼HindIII位點(標有下劃線)的寡脫氧核苷酸引物有義引物(SEQ ID NO94)5′-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3′反義引物(SEQ ID NO95)5′-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3′用粗體突出了MNN9基因的起始甲硫氨酸密碼子。
使用來自啤酒糖酵母的基因組DNA作為模板，進行了PCR。用HindIII消化了得到的攜帶MNN9基因的1.2-kbp PCR片段，進行了凝膠純化，並與HindIII-消化的、鹼性磷酸酶處理的pUC13進行連接。將得到的質粒命名為p1183。從YRp7分離了酵母TRP1基因(Struhl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761035-1039，1979)，作為0.85-kb EcoRI-BglII片段，使其產生平端，然後插入p1183的PmlI位點。PmlI位點位於MNN9編碼序列的中央，因此TRP1基因在該位點的插入會導致基因破壞。然後，用HpaI和EcoRI消化了得到的質粒pUC13-mnn9::TRP1(p11885-239-1)，並通過乙酸鋰方法，使用5′-mnn9-TRP1-mnn9-3′盒轉化了菌株1282(Ito等，J Bacteriol.153163，1983.)。
在缺少色氨酸的合成培養基瓊脂平板上，選擇了Trp+轉化體，並在相同的平板上重新劃線，進行單菌落分離。從許多得到的Trp+分離物製備了基因組DNA，用HindIII消化，然後在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳。DNA印跡分析證實了需要的mnn9::TRP1基因破壞的存在。選擇了一個含有需要的mnn9::TRP1破壞的分離物，用於其它用途，並命名為菌株1309。製備了菌株1309在甘油中的冷凍原種，保藏在-70℃。得到的菌株1309的基因型如下MATα、leu2、mnn9::TRP1、trp1、ura3-52、his3Δ::GAL10p-GAL4-URA3、prb1-1122、pep4-3、ga12、cir°。
實施例9全長ORF0657n區的表達在大腸桿菌(SEQ ID NO28；His-標記ORF0657n)和啤酒糖酵母(SEQID NO28的胺基酸1-646)中表達了全長ORF0657n，並對比了表達產物。
啤酒糖酵母表達使用下面的含有側翼BamHI限制位點的有義和反義引物，分別是UnkCY-F(SEQ ID NO；96)，5′AAC CGG TTTGGA TCCCAC AAA ACA AAATGG GTA ACA AGC AAC AAA AGG AAT TC3′和UnkCY-R(SEQ ID NO97)，5′AAC CGG TTTGGA TCCTTA GTT CTT TCT CTT TCT TGG CAA GAC3′，從最後校正的克隆pUnkCR1(實施例7)擴增了能編碼ORF0657n蛋白的DNA，其具有為酵母表達最優化的密碼子。該有義引物含有5′非翻譯序列和ATG密碼子，該反義引物含有TAA作為終止密碼子。凝膠分離了得到的1.9-kb產物，並根據生產商的說明，將其克隆進TOPO TA載體pCR2.1(INVITROGEN CORPORATION，Carlsbad，CA)，以構建質粒UnkC-B1。隨後，驗證了插入片段的DNA序列。凝膠分離了BamHI片段，並將其以適當的方向亞克隆進酵母載體(pGAL110，圖5A)中，以構建pRUnkC-pGAL110。通過DNA測序，驗證了插入片段的序列。
使用原生質球轉化方法(Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U SA，751929-33，1978)，使用來自pRUnkC-pGAL110的質粒DNA將含有leu2突變的啤酒糖酵母菌株轉化成亮氨酸原養型(Leu+)。在上面的實施例8中，提供了菌株1260和1309的構建。
在缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的合成瓊脂培養基上，選擇了轉化體。從REMEL，Lenexa，KS得到了缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的頂層和底層合成瓊脂培養基(目錄號分別是09459和92155)。通過在SD負型亮氨酸平板(KD MEDICAL，Columbia MD)上的系列生長，得到了克隆的Leu+分離物。
為了篩選多個轉化體，使5.0mL生產培養物在30℃、在緩慢旋轉的培養管中生長。隨後，在125-mL燒瓶內的25-ml培養物中，證實了選擇的轉化體的生產。對於2種情況，使5-mL種子培養物在30℃、在含有4.0％葡萄糖和0.1M山梨醇的5X負型亮氨酸培養基中生長18-24小時，至OD600為1.5-3.0/mL。5X負型亮氨酸培養基含有下面的組分(每升)沒有添加胺基酸或硫酸銨的酵母含氮鹼基，8.5g；腺嘌呤，0.40g；L-酪氨酸，0.25g；尿嘧啶，0.20g，琥珀酸，10.0g，硫酸銨，5.0g和50ml亮氨酸負型的溶液#3。亮氨酸負型的溶液#3在每升蒸餾水中含有L-精氨酸，2g；L-組氨酸，1.0g；L-異亮氨酸，6g；L-賴氨酸4.0g；L-甲硫氨酸，1.0g；L-苯丙氨酸，6.0g；L-色氨酸，4.0g。用50％氫氧化鈉，將培養基的pH調節至5.3。
為了管內的生產，將0.3mL種子培養物的等分試樣轉移到5.0mL 5X負型亮氨酸培養基(含有2％葡萄糖、4％半乳糖)或YEHDG培養基中72小時，至最終OD600為5-16.0/mL。每升YEHDG培養基含有L-Hy-大豆蛋白腖-Sheffield，10g；酵母提取物，20g；L-葡萄糖，16g；D(+)半乳糖，40g。為了燒瓶內的生產，將1.5mL種子培養物的等分試樣轉移到25-mL培養基中，並在220rpm搖動下，如上所述生長。
每個樣品收穫10 OD單位後，在0.3mL裂解緩衝液(0.1M磷酸鈉緩衝液，pH7.2，0.5M NaCl，2mM PMSF)中，用玻璃珠破碎細胞沉澱。離心回收裂解物。用0.3mL裂解緩衝液洗滌未破碎的細胞/珠子，並合併澄清的上清液。根據生產商的說明，通過BIO-RAD蛋白測定染料試劑系統(BIO-RAD，Hercules，CA)，確定了蛋白濃度。在還原和變性條件下，在1X Tris-甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中進行4-20％梯度Tris-甘氨酸凝膠(INVITROGEN，Carlsbad，CA)電泳後，通過免疫印跡分析，分析了細胞裂解物中的ORF0657n表達。樣品含有20μg總細胞蛋白。將凝膠電印跡在0.45微米硝酸纖維素膜過濾器(從Schleicher和Schuell，Keene，NH得到的Optitran)上。為了估計蛋白大小，與裂解物平行地運行了預染色的6.4至203kDa的標準(廣範圍的預染色的SDS-PAGE標準，BIO-RAD)。
大腸桿菌標準從誘導生產ORF0657n的大腸桿菌生產培養物(大腸桿菌宿主HMS174(DE3)，NOVAGEN，Madison，WI)純化了His-標記ORF0657n(SEQID NO28)，並使用細胞裂解物作為標準。用能表達His-標記ORF0657n的表達載體轉化了大腸桿菌。使大腸桿菌培養物在含有30μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中，在37℃生長過夜。次日，使用60μL過夜培養物接種6.0mL含有30μg/mL卡那黴素的LB。使培養物在37℃生長約3小時，直到OD600達到0.4-1.0。用1mM IPTG在37℃誘導表達2小時。收穫細胞，將細胞沉澱保藏在-80℃。
按照生產商的方案，使用Bugbuster蛋白提取試劑(NOVAGEN，Madison，WI)，製備了大腸桿菌裂解物。使用針對ORF0657n的鼠單克隆抗體(命名為「2H2B8」)作為第一抗體，且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶-連接的全抗體(ZYMED LABORATORIES，South SanFrancisco，CA)作為第二抗體，通過蛋白印跡，免疫檢測了蛋白。通過用純化的大腸桿菌生產的全長ORF0657n免疫小鼠，產生了Mab 2H2B8。通過ELISA選擇了Mab 2H2B8，並顯示其對ORF0657n是特異性的。使用BIO-RAD HRP綴合底物試劑盒，處理了過濾器。
來自大腸桿菌和啤酒糖酵母的表達產物從酵母轉化體的初次篩選，選擇了每種酵母菌株1260和1309的一個轉化體，作為全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的最佳生產者。在圖6A和6B中，顯示了與ORF0657n區(SEQ ID NO28)在大腸桿菌中的生產相比，在YEHDG培養基中發酵72小時後，它們生產全長ORF0657n區的實例。
通過用mAb 2H2B8進行的蛋白印跡分析檢測到的主要蛋白是約105-110-kDa，如圖6A(菌株1260)和6B(菌株1309)所示泳道5和6。約105-110-kDa蛋白在大小上對應著在大腸桿菌中生產的純化的重組ORF0657n的樣品中檢測到的最大蛋白(SEQ ID NO28；泳道2)或誘導的大腸桿菌ORF0657n-生產培養物的提取物(後者未包含在圖6所示的凝膠中)。105-110-kDa大腸桿菌和啤酒糖酵母生產的蛋白的分子量大於在我們的凝膠-電泳系統中預測的大小。應當指出，在大腸桿菌對照中檢測的優勢種類更小，約95kDa，且與少量在酵母中產生的蛋白共遷移。認為約105-110-kDa蛋白對應著全長ORF0657n，在大腸桿菌和啤酒糖酵母中表達的所述全長ORF0657n帶有大腸桿菌分泌前導序列，且認為95-kDa蛋白是降解產物。用單獨的載體pGAL110得到的對照轉化體的提取物，沒有觀察到檢測結果(泳道3和4)。
估計由1260和1309的轉化體生產的ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的量是約10微克ORF0657n/mL YEHDG培養基，其ORF0657n區包含約2％總蛋白，如通過使用100ng純化的ORF0657n(SEQ ID NO28)作為標準的半定量蛋白印跡所確定的。在2種菌株中，在72小時時的總蛋白的表達量和％ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)都大於在48小時時(未顯示數據)。1260的轉化體在5X亮氨酸培養基(含有2％葡萄糖，4％半乳糖)中生產的ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的滴度是約8.0μg/mL，且％總蛋白是2.0。
實施例10分泌的密碼於最優化的能編碼ORF0657nH區的序列的表達載體pKH4-3B(Carty等，Biotechnol.Lett.12879-884，1990)含有酵母α因子(MFα1)前分泌前導序列原。需要的蛋白與該前導序列的融合會產生翻譯產物，其首先由啤酒糖酵母的信號肽酶切割。隨後，Kex2蛋白酶會在分泌前導序列中的「Lys Arg殘基」後切割，並釋放出成熟的蛋白。使用啤酒糖酵母誘導型GAL10啟動子來驅動蛋白表達。
使用載體pKH4-3B來表達密碼子最優化的能編碼改變的SEQ ID NO3的基因。通過去除氨基末端甲硫氨酸和添加氨基末端前導序列，改變了SEQ ID NO3。SEQ ID NO32的核苷酸4-1710提供了密碼子最優化的SEQ ID NO3編碼區，且如下所述製備的載體pKH4-3B提供了前導序列編碼序列。
進行了pKH4-3B的α因子前分泌前導序列原與SEQ ID NO3的ORF0657nH區的框內融合。這通過下述的方法實現用SphI消化載體pKH4-3B，然後用T4 DNA聚合酶處理，以去除SphI-突出端，從而在5′末端生成具有適當的前導序列密碼子的平端。隨後，用BamHI消化載體，以生成3′克隆位點。該構建體需要具有與重建的ORF0657nH區(SEQ ID NO32)的第二個密碼子相對應的5′平端的PCR產物、和具有終止密碼子和BamHI限制位點的3′末端。
使用下面的有義和反義引物，分別是UCKHS2(SEQ ID NO98)，5′GCTGAAGAAACTGGTGGTACCAAC 3′和UCKHA2，(SEQ ID NO99)5′GTCACGGATCCTTAAGACTTAGCCTTGTTTTCTTGAGTGTTC 3′，從pUnkCR1(實施例7)擴增了能編碼具有為酵母表達最優化的密碼子的ORF0657nH區的DNA。有義引物的5′末端GCT能編碼丙氨酸，即預測的ORF0657nH區的N-末端。反義引物含有TAA終止密碼子和BamHI位點(標有下劃線)。凝膠分離了得到的1.7-kb PCR產物，並克隆進pKH4-3B(如上所述製備的)，以構建pUS38。驗證了插入片段的完整的DNA序列和載體的部分序列，並顯示產生了與分泌前導序列的理想融合。用Kex2p適當切割從該構建體表達的起始蛋白，會產生與缺少N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO3相對應的蛋白。
通過使用原生質球轉化方法(Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.751929-33，1978)，使用質粒pUS38將啤酒糖酵母菌株1260和1309轉化成亮氨酸原養型(Leu+)。在缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的合成瓊脂培養基上，選擇了轉化體。從REMEL，Lenexa，KS得到了缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的頂層和底層合成瓊脂培養基(目錄號分別是09459和92155)。通過在SD負型亮氨酸平板(KD MEDICAL，ColumbiaMD)上的系列生長，得到了克隆的Leu+分離物。
為了篩選多個轉化體，使5mL種子培養物在30℃、在5X負型亮氨酸培養基(含有4.0％葡萄糖和0.1M山梨醇培養基)中生長18-24小時，至OD600為1.5-3.0/mL。5X負型亮氨酸培養基含有下面的組分(每升)沒有添加胺基酸或硫酸銨的酵母含氮鹼基，8.5g；腺嘌呤，0.40g；L-酪氨酸，0.25g；尿嘧啶，0.20g，琥珀酸，10.0g，硫酸銨，5.0g和50ml亮氨酸負型的溶液#3。亮氨酸負型的溶液#3在每升蒸餾水中含有L-精氨酸，2g；L-組氨酸，1.0g；L-異亮氨酸，6g；L-賴氨酸4.0g；L-甲硫氨酸，1.0g；L-苯丙氨酸，6.0g；L-色氨酸，4.0g。用50％氫氧化鈉，將培養基的pH調節至5.3。將0.3mL等分試樣轉移到5.0mL5X負型亮氨酸培養基(含有2％葡萄糖加4％半乳糖)或YEHDG培養基中72小時，至最終OD600為10-20.0/mL。每升YEHDG培養基含有L-Hy-大豆蛋白腖-Sheffield，10g；酵母提取物，20g；L-葡萄糖，16g；D(+)半乳糖，40g。
通過去除酵母細胞，並通過SDS-PAGE凝膠的蛋白印跡分析或考馬斯染色直接分析上清液中的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的表達，收穫了發酵產物。為了進行免疫印跡分析，在還原和變性條件下，將10-25μL樣品在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIORAD，Hercules，CA)中進行4-15％梯度Tris-HCl凝膠(BIORAD，Hercules，CA)電泳。將凝膠電印跡到0.2微米PVDF膜過濾器上。使用單克隆抗體2H2B8作為第一抗體，且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶-連接的全抗體(ZYMEDLABORATORIES，South San Francisco，CA)作為第二抗體，免疫檢測了蛋白。實施例9描述了Mab 2H2B8。使用WESTERN LIGHTNINGTMChemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER，Wellesley，MA)，處理了過濾器。
為了通過SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色分析重組酵母ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的表達，在還原和變性條件下，在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中，對樣品進行了4-15％梯度Tris-HCl凝膠(BIO-RAD)電泳。按照生產商的方案(BIO-RAD)，凝膠被染上了Bio-Safe考馬斯，即一種考馬斯G250染料。
使用來自能生產ORF0657nH(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)的大腸桿菌培養物的細胞裂解物作為定性標準。預測的大腸桿菌表達的ORF0657nH區的胺基酸序列與預測的啤酒糖酵母內部表達的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的胺基酸序列一致，只是除了在大腸桿菌構建體的N-末端甲硫氨酸之後存在甘氨酸以外。
為了在大腸桿菌中生產ORF0657nH區，使生產培養物在37℃、在含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中生長過夜。使用了能編碼具有羧基His-標記的SEQ ID NO4的pET28，以得到蛋白的表達。次日，使用500μL過夜培養物接種5.0mL含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基。使培養物在37℃生長約3小時，直到OD600達到0.6。用1mMIPTG在37℃誘導表達3.5小時。收穫細胞，將細胞沉澱保藏在-80℃。按照生產商的方案，使用Bugbuster蛋白提取試劑(NOVAGEN，Madison，WI)，製備了大腸桿菌裂解物。
如下面的實施例11所述，描述和製備了來自能表達內部ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的啤酒糖酵母轉化體1-1的細胞裂解物的蛋白，並用作標準。為了估計蛋白大小，與進行考馬斯染色和蛋白評價的SDS-PAGE凝膠上的樣品平行地運行了預染色的10至250kDa的標準(BIO-RAD)。
在5X負型亮氨酸培養基(含有2％葡萄糖和4％半乳糖)中，生產了需要的種類。含有菌株1260和1309的pUS38的轉化體分泌了約80-kDa蛋白，其能與酵母內部表達的ORF0657nH區(來自能編碼SEQ ID NO3的核酸)非常接近地共遷移，且大腸桿菌表達了ORF0657nH(來自能編碼具有羧基His-標記的SEQ ID NO4的核酸)，其可以通過蛋白印跡和考馬斯染色檢測到。在一般的實驗中，對500ng這種對照裂解物和25μL培養基上清液進行了電泳。檢測是特異性的；在只含有載體的轉化體的上清液中，通過蛋白印跡或考馬斯染色沒有檢測到80-kDa蛋白。分泌的約80-kDa蛋白對應著成熟的未糖基化的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)，或者，它含有少量糖基殘基。通過抗體，檢測到了上清液中的更高分子量的種類和2種更小分子量的蛋白，它們都被考馬斯藍染色。該更高分子量的種類含有未加工的前導序列，和/或是糖基化的。小分子量的種類可能是降解產物。
估計由菌株1260和1309的轉化體分泌的80-kDa種類的量是約2μg/mL培養基。這可以通過對比在80kDa的蛋白印跡信號和含有0RF0657nH區(SEQ ID NO3)的酵母細胞裂解物樣品來確定，表明ORF0657nH區包含至少50％總蛋白。估計ORF0657n區的剩餘種類的合併滴度是約50μg/mL培養基。
實施例11ORF0657nH區(SEQ ID NO3)在啤酒糖酵母中的細胞內表達通過SEQ ID NO3在啤酒糖酵母中的細胞內表達，獲得了非常高水平的離散大小的蛋白的生產。使用酵母最優化的編碼核酸序列，實現了表達。
使用下面的含有側翼BamHI限制位點(標有下劃線)的有義和反義引物，分別是(SEQ ID NO100)5′GGGGGGATCCCACAAAACAAA ATG GCT GAAGAA ACT GGT GG3′和(SEQ ID NO101)5′GGG GGGGGATCCTTA AGA CTTAGC CTT GTT TTC TTG AGT3′，從pUnkCR1(實施例7)擴增了能編碼ORF0657n區的DNA，其具有為酵母表達最優化的密碼子(SEQ ID NO32)。該有義引物含有5′非翻譯前導序列和ATG密碼子，且該反義引物含有TAA作為終止密碼子。
凝膠分離了得到的1.7-kb產物，並根據生產商的說明，將其克隆進TOPO TA載體pCR2.1(INVITROGEN CORPORATION，Carlsbad，CA)，以構建質粒pCR_iUC-S。隨後，從2個獨立的克隆pCR_iUCS2.2和pCR_iUCS-2.4，確定了插入片段的DNA序列。在每個插入片段中，發現了單個的PCR錯誤，其位於每個質粒的不同的HindIII片段上。通過用對應的pCR_iUC-S2.4片段的正確序列交換pCR_iUC-S2.2的1.3-kbHindIII片段，得到了具有正確序列的質粒。
凝膠分離並連接了pCR_iUC-S2.2的1.3-kb片段和pCR_iUC-S2.4的4.3-kb片段。選擇了具有理想片段的克隆pCR_iUC-S，並通過DNA測序，驗證了適當的方向和核苷酸序列。隨後，將1.7-kb BamHI片段亞克隆進了pGAL110(圖5A)，以構建piUCS-S(-)。
使用原生質球轉化方法，使用來自piUC-S(-)的質粒DNA將啤酒糖酵母菌株1260和1309轉化成亮氨酸原養型(Leu+)(Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A，751929-33，1978)。在缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的合成瓊脂培養基上，選擇了轉化體。從REMEL，Lenexa，KS得到了缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的頂層和底層合成瓊脂培養基(目錄號分別是09459和92155)。通過在SD負型亮氨酸平板(KD MEDICAL，Columbia MD)上的系列生長，得到了克隆的Leu+分離物。
為使用實施例9所述的發酵條件生產ORF0657nH區，篩選了多個轉化體。通過蛋白印跡分析，或通過用考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠的分析，分析了細胞裂解物中的ORF0657nH區的生產。
對於蛋白印跡分析，在還原和變性條件下，在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中，對樣品進行了4-15％梯度Tris-HCl標準凝膠(BIO-RAD，Hercules，CA)電泳。將凝膠電印跡在0.2微米PVDF膜過濾器上。使用針對全長ORF0657n(SEQ ID NO28)的單克隆抗體2H2B8作為第一抗體，且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶-連接的全抗體(ZYMED LABORATORIES，South San Francisco，CA)作為第二抗體，通過蛋白印跡免疫檢測了蛋白。實施例9描述了Mab 2H2B8。使用WESTERN LIGHTNINGTMChemiluminesence Reagent Plus kit(PERKINELMER，Wellesley，MA)，處理了過濾器。
為了通過SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色分析重組酵母ORF0657nH(由SEQ ID NO32編碼)的表達，在還原和變性條件下，在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中，對樣品進行了4-15％梯度Tris-HCl標準凝膠(BIO-RAD)電泳。按照生產商的方案，凝膠被染上了Bio-Safe考馬斯，即一種考馬斯G250染料(BIO-RAD)。
進行電泳的酵母細胞裂解物的樣品分別含有0.5和1.25μg總細胞酵母蛋白，用於蛋白印跡和考馬斯染色。使用純化的BSA(100X，NEWENGLAND BIOLABS，Beverly，MA)作為考馬斯染色的定量標準。使用純化的大腸桿菌全長重組ORF0657n區(SEQ ID NO28)作為蛋白印跡的定量標準。在2個評價中，使用來自能生產0RF0657nH區(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)的大腸桿菌培養物的細胞裂解物作為定性標準，其可誘導生產ORF0657nH。
為了在大腸桿菌中生產ORF0657nH區(帶有羧基His-標記的SEQ IDNO4)，使生產培養物在37℃、在含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中生長過夜。次日，使用500μL過夜培養物接種5.0mL含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基。使培養物在37℃生長約3小時，直到OD600達到0.6。用1mM IPTG在37℃誘導表達3.5小時。收穫細胞，將細胞沉澱保藏在-80℃。按照生產商的方案，使用Bugbuster蛋白提取試劑(NOVAGEN，Madison，WI)，製備了大腸桿菌裂解物。為了估計蛋白大小，與裂解物平行地運行了預染色的10至250kDa的標準(BIO-RAD)。
從初次篩選，選擇了酵母菌株1260的一個轉化體(命名為1-1)作為ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的最佳生產者。在圖7A和7B中，顯示了在搖瓶內的複合培養基YEHDG中發酵72小時後，生產ORF0657nH區的實例。通過考馬斯染色(A)或通過抗體(B)檢測到的主要蛋白是約85kDa(見泳道5、6和7)，且與大腸桿菌ORF0657nH(具有羧基His-標記的SEQID NO4；泳道2)共遷移。大腸桿菌表達的ORF0657n和酵母表達的ORF0657n的分子量大於我們在凝膠電泳系統中預測的大小。約85-kDa蛋白的檢測是特異性的；在只含有載體pGAL110的轉化體的細胞裂解物中，沒有檢測到(泳道3)。將泳道5、6和7與泳道4相比較可以發現，與全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)相比，生產了明顯更多的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)。與含有ORF0657nH區(SEQID NO3)的轉化體同時，且在相同條件下，發酵了含有全長ORF0657n的轉化體。觀察到了很少降解成熟的酵母表達的ORF0657nH的證據。
為了評價蛋白穩定性，將來自已經冷凍幾天並隨後未解凍(unthaw)的轉化體1-1的細胞裂解物的樣品包含在凝膠上(圖7，泳道7)。可以看出，該樣品的完整性和量類似於新鮮樣品(泳道5和6)。使用針對全長大腸桿菌ORF0657n(SEQ ID NO28)的山羊多克隆抗體，通過蛋白印跡，確認了沒有降解和ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的穩定性(未顯示數據)。
從蛋白印跡和考馬斯凝膠估計，ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的量是約360μg/mL YEHD培養基，且估計％總蛋白是約50。在限定的培養基中生產的量是225μg/mL培養基，且％總蛋白也是約50。與全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的量相比，ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的量更高(分別是350對10μg/mL)，且％總蛋白也更高(50對2.0)。
實施例12ORF0657nG區(SEQ ID NO44)在啤酒糖酵母中的細胞內表達在下面的實施例中，使用能編碼ORF0657nG區(SEQ ID NO44)的DNA構建體，評價了ORF0657n相關多肽的細胞內表達。ORF0657n6(SEQID NO44)是截短形式的SEQ ID NO2，其缺少氨基-末端信號序列。SEQ ID NO44保留了SEQ ID NO2的N-末端甲硫氨酸和胺基酸42-645。
使用下面的含有側翼BamHI限制位點的有義和反義引物，分別是5′GGGGGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGTGG3′(SEQ ID NO102)和5′GGGGGGGATCCTTAGTTCTTTCTCTTT CTTGG 3′(SEQ ID NO103)，從pUnkCR1(實施例7)擴增了能編碼ORF0657nG區(SEQ ID NO44)的酵母最優化的DNA。該有義引物含有5′非翻譯前導序列和ATG密碼子，且該反義引物含有TAA作為終止密碼子。凝膠分離了得到的1.8-kb產物，並根據生產商的說明，將其克隆進TOPO TA載體pCR2.1(INVITROGENCORPORATION，Carlsbad，CA)，以構建質粒pCR_iUC-L4。隨後，DNA序列分析確認了在5′-末端發生的單個缺失。
通過用含有正確序列的pCR_iUC-S2.2的1.3-kb HindIII-HindIII片段交換對應的pCR_iUC-L4的片段，得到了具有正確序列的克隆(見實施例11)。凝膠分離並連接了pCR_iUC-S2.2的1.3-kb片段和pCR_iUC-L4的4.4-kb片段。選擇了具有理想片段的克隆pCR_iUC-L，並通過DNA測序，驗證了適當的方向和核苷酸序列。隨後，將1.8-kb BamHI片段亞克隆進了pGAL110，以構建piUC-L(-)，並確認了DNA序列。
如實施例9所述，使用來自piUC-L(-)的質粒DNA將啤酒糖酵母菌株1260轉化成亮氨酸原養型(Leu+)。使用如實施例11所述的發酵條件和細胞破碎，篩選了幾個用於細胞內生產ORF0657nG區(SEQ ID NO44)的酵母轉化體。通過如實施例11所述的蛋白印跡分析，分析了0.25-0.5μg細胞-裂解物蛋白中的ORF0657nG區的生產。使用純化的大腸桿菌ORF0657nH區(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)作為定量標準，並使用來自能生產ORF0657nG區(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)的大腸桿菌培養物的細胞裂解物作為定性標準，其可誘導生產ORF0657nG區。在還原和變性條件下，在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中，對樣品進行了4-15％梯度Tris-HCl標準凝膠(BIO-RAD，Hercules，CA)電泳。將凝膠電印跡在0.2微米PVDF膜過濾器上(BIO-RAD)。
使用針對純化的大腸桿菌生產的全長ORF0657n(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)的多克隆抗體作為第一抗體，且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶-連接的全抗體(ZYMED LABORATORIES，South SanFrancisco，CA)作為第二抗體，通過蛋白印跡免疫檢測了蛋白。通過用純化的大腸桿菌生產的全長ORF0657n區(SEQ ID NO28)進行免疫，生產了多克隆抗體。使用WESTERN LIGHTNINGTM Chemiluminesence ReagentPlus kit(PERKIN ELMER，Wellesley，MA)，處理了過濾器。
為了對比目的，將ORF0657nG區(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)克隆進了如實施例1所述的大腸桿菌表達載體中，並進行表達。為了在大腸桿菌中生產ORF0657nG區，使生產培養物在37℃、在含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中生長過夜。次日，使用500μL過夜培養物接種5.0mL含有50μg/mL卡那黴素的LB液體培養基。使培養物在37℃生長約3小時，直到OD600達到0.6。用1mM IPTG在37℃誘導表達3.5小時。收穫細胞，並將細胞沉澱保藏在-80℃。按照生產商的方案，使用Bugbuster蛋白提取試劑(NOVAGEN，Madison，WI)，製備了大腸桿菌裂解物。為了估計蛋白大小，與裂解物平行地運行了預染色的10至250kDa的標準(BIO-RAD)。
從初次篩選，在如實施例11所述在培養管內的複合培養基YEHDG中發酵72小時後，選擇了酵母菌株1260的一個轉化體(命名為iUC-L3)作為ORF0657nG區的良好生產者。通過考馬斯染色或通過抗體檢測到的主要蛋白是約85kDa，且與大腸桿菌表達的ORF0657nG區(具有羧基His-標記的SEQ ID NO44)共遷移。大腸桿菌表達的ORF0657nG區和酵母表達的ORF0657nG區的分子量大於我們在凝膠電泳系統中預測的大小。約85-kDa蛋白的檢測是特異性的；在只含有載體pGAL110的轉化體的細胞裂解物中，沒有檢測到。從3個蛋白印跡實驗測定的ORF0657nG的平均滴度是30μg/mL YEHDG培養基，且估計％總蛋白是10.0(見下面的實施例13)。
實施例13去除細胞壁分類信號能增強細胞內表達使用密碼子-最優化的ORF0657n基因SEQ ID NO31、32和45，檢查了單獨去除ORF0657n羧基細胞轉肽酶C-末端編碼區和組合去除N-末端信號區的影響。SEQ ID NO31能編碼全長ORF0657n區。SEQ ID NO32能編碼ORF0657nH區，其缺少N-末端信號序列和C-末端細胞壁分類區。SEQ ID NO45能編碼ORF0657nG區，其只缺少信號肽序列。
發酵了能表達全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28；轉化體rUnkC1)、ORF0657nH區(SEQ ID NO3；轉化體1-1)和ORF0657nG區(SEQ ID NO44；轉化體iUC-L3)的各一個轉化體，製備了細胞裂解物，並如實施例11所述進行了分析。圖9顯示了代表性的蛋白印跡。裝載在凝膠上的來自不同轉化體的蛋白細胞裂解物的量是不同的，以補償3個構建體編碼ORF0657n區的不同的表達水平。在每種情況下，裝載了至少2種不同量的來自各含有ORF0657n的轉化體的蛋白細胞裂解物。
在圖9中顯示了一般的結果，證實了ORF0657nH區(SEQ ID NO3)能比全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)或ORF0657nG區(SEQ ID NO44)明顯更好地表達。如泳道11和12所示，僅僅用50和100ng來自ORF0657nH區-生產者的細胞裂解物蛋白，就檢測到了相當大信號。相反地，分別使用了1.0和2.0μg全長ORF0657nC區-生產者的細胞裂解物蛋白，泳道7和8。使用更少的蛋白，檢測到了ORF0657nG區的良好信號，如泳道14和15所示，其中裝載了250和500ng蛋白。
表4對比了3個ORF中的每一個的平均滴度和從3個獨立的蛋白印跡測定的％總蛋白。為每個蛋白印跡，新製備了細胞裂解物。平均值包括從2次獨立發酵得到的結果。相對於純化的大腸桿菌ORF0657nH(帶有羧基His-標記的SEQ ID NO4)標準，確定了特異性的ORF0657n的量。
表4
如通過對比全長ORF0657n區(沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28)和ORF0657nG區(SEQ ID NO44)的表達所確定的，信號肽序列的去除，使％總蛋白和滴度增強了2.5-3倍。信號肽和細胞壁分類序列兩者的去除，使表達比僅僅去除信號肽序列增強了8-14倍(對比G和H區)，使表達比全長蛋白增強了20-42.5倍(對比C和H區)。沒有預見到細胞壁分類序列的去除使表達增強的量級。
實施例14ORF0657nI區在啤酒糖酵母中的細胞內表達使用下面的含有側翼BamHI限制位點(標有下劃線)的有義和反義引物，分別是5′CTCCGGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGT 3′(SEQ IDNO104)和5′GCTGCCGGGATCCTTATGGGGTTGGCTTAGATGGGGTAG 3′(SEQ IDNO105)，從pUnkCR1(實施例7)擴增了能編碼ORF0657nI區的DNA，其具有為酵母表達最優化的密碼子(SEQ ID NO33)。該有義引物含有5′非翻譯前導序列和ATG密碼子，且該反義引物含有TAA作為終止密碼子。凝膠分離了得到的1.3-kb產物，並將其克隆進pGAL110(圖5A)，以構建piUC-I(圖5B)，並驗證了DNA序列。
如實施例9所述，使用來自piUC-I的質粒DNA將啤酒糖酵母菌株1260轉化成亮氨酸原養型(Leu+)。使用如實施例9所述的小規模的發酵條件(5.0mL培養物)，篩選了3個Leu+轉化體的ORF0657nI區(SEQ IDNO1)的細胞內生產。
將生產與啤酒糖酵母轉化體1-1生產的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)進行了對比(見實施例11)。如實施例9所述，製備了細胞裂解物，通過如實施例11所述的半定量蛋白印跡分析，分析了100和200ng酵母細胞裂解物蛋白的ORF0657nI和ORF0657nH的生產。使用純化的大腸桿菌ORF0657nH(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)作為定量標準。在還原和變性條件下，在1X Tris甘氨酸SDS緩衝液(BIO-RAD)中，對樣品進行了10-20％梯度Tris-HCl標準凝膠(BIO-RAD，Hercules，CA)電泳。將凝膠電印跡在0.2微米PVDF膜過濾器(BIO-RAD)上。使用針對純化的大腸桿菌全長ORF0657n(SEQ ID NO28)的多克隆抗體作為第一抗體，並使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根過氧化物酶-連接的全抗體(ZYMED LABORATORIES，South San Francisco，CA)作為第二抗體，通過蛋白印跡免疫檢測了蛋白。通過用純化的大腸桿菌生產的全長ORF0657n(SEQ ID NO28)免疫，生產了多克隆抗體。使用WESTERNLIGHTNINGTMChemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER，Wellesley，MA)，處理了過濾器。為了估計蛋白大小，與裂解物平行地運行了預染色的10至250kDa的標準(BIO-RAD)。
圖11顯示了在培養管內的複合YEHDG培養基中發酵72小時得到的結果。得到了酵母表達的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的強檢測，如泳道5、6、14、15、21和22所示。還容易地檢測到了構建的用於表達ORF0657nI(SEQ ID NO1)的轉化體中的約60-kDa蛋白，如泳道7-12和16-21所示。酵母表達的ORF0657nI(SEQ ID NO1)與從大腸桿菌中表達和純化的ORF0657nI(具有羧基His-標記的SEQ ID NO5)共遷移(未顯示數據)。大腸桿菌表達的ORF0657nI區和酵母表達的ORF0657nI區的分子量大於在我們的凝膠電泳系統中預測的大小。在構建的用於表達ORF0657nI(SEQ ID NO1)的轉化體中的60-kDa蛋白是特異性的；在來自載體對照轉化體的細胞裂解物中沒有檢測到蛋白(泳道4和13)。
通過與已知量的純化的ORF0657nH(具有羧基His-標記的SEQ ID NO4)進行對比，通過半定量蛋白印跡估計了凝膠上的ORF0657nH區(SEQ IDNO3)和ORF0657nI區(SEQ ID NO1)的量。從凝膠上的含有2種不同量的蛋白的一式兩份裂解物確定的平均值，計算出了滴度和％總蛋白。從新解發酵的樣品和冷凍的細胞裂解物確定的ORF0657nH區(SEQ ID NO3)的容量滴度是可比較的，為約500和約550μg/mL培養基，且每mL培養基生產了320μg ORF0657nI區(SEQ ID NO1)(ORF0657nI區的滴度是針對轉化體I1的)。估計ORF0657nH區(SEQ ID NO3)佔總蛋白的百分比分別是78％和80％，ORF0657nI(SEQ ID NO1)佔總蛋白的45％。
因而，ORF0657nI區能在啤酒糖酵母中較好地表達，其滴度比ORF0657nH(SEQ ID NO3)低約1.5倍，且％總蛋白低約1.3倍。通過考馬斯染色含有細胞裂解物的SDS-PAGE凝膠，確認了ORF0657nI區在酵母中的良好表達。ORF0657nI區在YEDHG培養基中的表達是可放大的在125mL或2L搖瓶中的生產可以與在培養管中的小規模表達相比較。
ORF0657nI區(SEQ ID NO1)還在限定的5X負型亮氨酸培養基(實施例9所述的培養基)中較好地表達。其滴度僅僅比在複合培養基YEHDG中的滴度低約1.5倍，而在兩種培養基中的％總蛋白是可比較的。在兩種培養基中，ORF0657nI具有良好的完整性，未檢測到明顯的降解。當在搖瓶發酵中測試時，在複合的和5X負型亮氨酸培養基兩者中，在72小時時的ORF0657nI生產高於在96小時時的。
實施例15能生產ORF0657nH(SEO ID NO3)的酵母菌株的大規模發酵使用冷凍的酵母菌株1-1(用質粒piUC-S(-)轉化的菌株1260；如實施例11所述)的種子原種進大規模發酵，並進行純化。解凍一瓶種子原種，並用1.0mL接種裝有50mL含有4％葡萄糖、無亮氨酸的選擇培養基(5X Leu-培養基，Bayne等，Gene 66(2)235-44，1988)的250-mL錐形瓶。在28℃，在250rpm旋轉振蕩器上溫育燒瓶。24小時後(殘餘葡萄糖23.5g/L)，將13mL培養體積加入裝有877mL相同培養基的2-L燒瓶中。再次在28℃，在250rpm攪拌下，溫育燒瓶。24小時後(殘餘葡萄糖4.04g/L)，使用2-L燒瓶的內容物接種20-L反應器，後者裝有為使用的菌株最優化的化學上限定的培養基(Oura，Biotechnol.Bioengineer.161197，1974)。該培養基含有20g/L葡萄糖，隨後為25g/L半乳糖以進行誘導。在28℃，4.7L/分鐘，15表壓和300rpm，運行反應器。在這些條件下，溶解氧水平維持在高於30％飽和。通過葡萄糖消耗、光密度(A600nm，1-cm比色皿)、幹細胞重量、半乳糖利用和乙醇生產，監控細胞生長。培養持續90小時，達到33.9的A600和17.5g/L的幹細胞重量。
使用AMICON DC-10收穫墊架(MILLIPORE，Billerica，MA)，經中空纖維切向流過濾(AMICON H5MP01-43筒)，收穫培養物。拋棄滲透物，濃縮細胞，用PBS進行滲濾，並使用Sorvall Evolution RC(SLA-3000轉子)，在8000rpm，4℃離心20分鐘進行收集。將細胞保藏在-70℃。
為了評價菌株1-1在大規模發酵中對ORF0657nH的生產，從10 OD600單位的收穫的培養物製備了細胞裂解物，並如實施例11所述進行了評價(未顯示結果)。還評價了從搖瓶發酵(72小時，複合YEHDG培養基)生產ORF0657nH。蛋白印跡分析(如實施例11所述進行)的結果證實了，大規模發酵生產的蛋白能與在搖瓶發酵中生產的ORF0657nH共遷移(未顯示結果)。估計大規模(20-L)發酵生產的ORF0657nH的滴度是739μg/mL，且估計％總蛋白是55％，與搖瓶發酵(使用實施例11所述的半定量蛋白印跡方法)的732μg/mL和58％總蛋白相比。這些結果證實了，可以按比例放大ORF0657n在酵母中的生產。
實施例16在酵母中生產的ORF0657n相關多肽的保護性免疫通過在酵母中表達SEQ ID NO3的多肽，評價了酵母生產的ORF0657n相關多肽提供保護性免疫的能力。使用單獨的大腸桿菌表達的全長ORF0657nC(SEQ ID NO28)、ORF0657nH(具有羧基-末端His-標記的SEQ ID NO4)、ORF0657nI(具有羧基-末端His-標記的SEQ ID NO5)和佐劑作為對照。
從酵母中得到了SEQ ID N03的ORF0657n相關多肽，並用於動物模型，以提供保護性免疫。如實施例11所述，表達了SEQ ID NO3的多肽。
以5mL/g溼細胞重，將冷凍的能表達ORF657nH(SEQ ID NO3)的重組啤酒糖酵母細胞重新懸浮在0.2M MOPS，pH7.0中，後者含有蛋白酶抑制劑(無EDTA)。通過穿過14,000磅/英寸2的微流化儀(Microfluidics Model 110S)4次，製備了裂解物。如下所述澄清了裂解物離心(10,000Xg，20分鐘，2-8℃)，然後粗濾(玻璃纖維預過濾器，Millipore)和細濾(0.2μm醋酸纖維素，Whatman)。
在尺寸排阻色譜(SEC)柱(Pharmacia HiPrep 26/60 SephacrylS-300HR，流動相0.2M MOPS，pH7.0)上，對澄清的裂解物進行了分級分離。通過含有考馬斯檢測的SDS-PAGE和使用對抗血清(針對全長ORF0657n，SEQ ID NO28)特異性的ORF0657n蛋白的蛋白印跡，分析了級分。合併含有產物的級分。
在無菌條件下，使SEC產物經0.2μm醋酸纖維素無菌過濾。經SDS-PAGE和蛋白印跡，無菌過濾產物的純度是≥或高於94％。以0.2mg/ml，用AHP和硫柳汞配製了無菌過濾產物。
圖10解釋了在酵母中生產的ORF0657n相關多肽提供保護性免疫的能力。酵母表達的ORF0657nH(SEQ ID NO3)提供了與大腸桿菌表達的多肽相當的保護性免疫。
實施例17在非人靈長類動物中的回憶應答使用用或不用AHP配製的酵母生產的ORF0657n相關多肽(ORF0657nH，SEQ ID NO3)或大腸桿菌表達的ORF0657相關多肽(全長ORF0657n，SEQID NO28)，免疫了3組獼猴。疫苗組的猴子通過肌內的方式，接受了50mcg ORF0657n相關多肽。
如圖12所示，單次給藥後，疫苗組動物以比適度的已有滴度增強約3至6倍的幾何平均滴度進行反應，暗示著回憶應答。相反地，對照組中的動物的幾何平均滴度保持相同(在抗體測定的變動範圍內)。第二次施用疫苗後，疫苗組和對照組的第一次給藥後的幾何平均滴度與給藥後的滴度相比有非常小的變化。
為了觀察僅僅一次給藥後的抗體反應的發展，對接受酵母表達的ORF0657H區(SEQ ID NO3)的組進行了3個月(測試的最後時間點)。抗體滴度持續升高，9天後，達到即使施用疫苗2或3次也不能超過的水平。
這些結果表明，一次施用疫苗，可以在自然地引發免疫系統後、引起相當大的且持久的抗體反應，這可能是由於環境地暴露於金黃色葡萄球菌。對人體中的已有抗體滴度的測量，證實了在所有測試的樣品中都存在針對ORF0657n的適度抗體滴度(未顯示數據)。
其它實施方案包含在下面的權利要求書中。儘管已經證實和描述了幾個實施方案，但可以進行不同的修改，而不背離本發明的精神和範圍。
序列表110MerckCo.，Inc.
120用於誘導針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應的多肽13021569Y PCT15060/489,8401512003-07-2415060/520,1151512003-11-14160107170FastSEQ for Windows Version4.02101211446212PRT213人工序列220
223具有氨基末端甲硫氨酸的ORF0657n4001Met Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr1 5 10 15Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr20 25 30Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala35 40 45Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala50 55 60Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn65 70 75 80Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro85 90 95Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp100 105 110Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala115 120 125Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu
130 135 140Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val145 150 155 160Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr165 170 175Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys180 185 190Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys195 200 205Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala210 215 220Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala225 230 235 240Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn245 250 255Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys260 265 270Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala275 280 285Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp290 295 300Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu305 310 315 320Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu325 330 335Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp340 345 350Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp355 360 365Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys370 375 380Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr385 390 395 400Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys405 410 415Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala420 425 430Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro435 440 4452102211645212PRT
213金黃色葡萄球菌(S.aureus)4002Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys1 5 10 15Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu20 25 30Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr35 40 45Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr50 55 60Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser65 70 75 80Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala85 90 95Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys100 105 110Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu115 120 125Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser130 135 140Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly145 150 155 160Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val165 170 175Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly180 185 190Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro195 200 205Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg210 215 220Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr225 230 235 240His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe245 250 255Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp260 265 270Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu275 280 285Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu290 295 300Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala305 310 315 320Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln
325 330 335Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val340 345 350Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys355 360 365His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met370 375 380Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln385 390 395 400Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile405 410 415Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys420 425 430Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile435 440 445Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys450 455 460Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr465 470 475 480Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln485 490 495Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu500 505 510Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys515 520 525Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val530 535 540Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys545 550 555 560Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys565 570 575Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly580 585 590His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys595 600 605Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro610 615 620Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro625 630 635 640Arg Lys Arg Lys Asn6452103
211569212PRT213人工序列220
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223SEQ ID NO2修飾成含有氨基末端甲硫氨酸之後的甘氨酸和羧基His-標記40028Met Gly Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg1 5 10 15Lys Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu20 25 30Leu Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly35 40 45Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr50 55 60Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val65 70 75 80Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu85 90 95Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val100 105 110
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actcaacagt tttatcatta tgcaagttct gttaaacctg ctagagttat tttcactgat 540tcaaaaccag aaattgaatt aggattacaa tcaggtcaat tttggagaaa atttgaagtt 600tatgaaggtg acaaaaagtt gccaattaaa ttagtatcat acgatactgt taaagattat 660gcttacattc gcttctctgt atcaaacgga acaaaagctg ttaaaattgt tagttcaaca 720cacttcaata acaaagaaga aaaatacgat tacacattaa tggaattcgc acaaccaatt 780tataacagtg cagataaatt caaaactgaa gaagattata aagctgaaaa attattagcg 840ccatataaaa aagcgaaaac actagaaaga caagtttatg aattaaataa aattcaagat 900aaacttcctg aaaaattaaa ggctgagtac aagaagaaat tagaggatac aaagaaagct 960ttagatgagc aagtgaaatc agctattact gaattccaaa atgtacaacc aacaaatgaa 1020aaaatgactg atttacaaga tacaaaatat gttgtttatg aaagtgttga gaataacgaa 1080tctatgatgg atacttttgt taaacaccct attaaaacag gtatgcttaa cggcaaaaaa 1140tatatggtca tggaaactac taatgacgat tactggaaag atttcatggt tgaaggtcaa 1200cgtgttagaa ctataagcaa agatgctaaa aataatacta gaacaattat tttcccatat 1260gttgaaggta aaactctata tgatgctatc gttaaagttc acgtaaaaac gattgattat 1320gatggacaat accatgtcag aatcgttgat aaagaagcat ttacaaaagc caataccgat 1380aaatctaaca aaaaagaaca acaagataac tcagctaaga aggaagctac tccagctacg 1440cctagcaaac caacaccatc acctgttgaa aaagaatcac aaaaacaaga cagccaaaaa 1500gatgacaata aacaattacc aagtgttgaa aaagaaaatg acgcatctag tgagtcaggt 1560aaagacaaaa cgcctgctac aaaaccaact aaaggtgaag tagaatcaag tagtacaact 1620ccaactaagg tagtatctac gactcaaaat gttgcaaaac caacaactgc ttcatcaaaa 1680acaacaaaag atgttgttca aacttcagca ggttctagcg aagcaaaaga tagtgctcca 1740ttacaaaaag caaacattaa aaacacaaat gatggacaca ctcaaagcca aaacaataaa 1800aatacacaag aaaataaagc aaaatcatta ccacaaactg gtgaagaatc aaataaagat 1860atgacattac cattaatggc attattagct ttaagtagca tcgttgcatt cgtattacct 1920agaaaacgta aaaacctcga gcaccaccac caccaccact ga1962210302111737212DNA213人工序列220
223ORF0657nH+羧基His-標記40030atgaacgctg aagaaacagg tggtacaaat acagaagcac aaccaaaaac tgaagcagtt 60gcaagtccaa caacaacatc tgaaaaagct ccagaaacta aaccagtagc taatgctgtc 120tcagtatcta ataaagaagt tgaggcccct acttctgaaa caaaagaagc taaagaagtt 180aaagaagtta aagcccctaa ggaaacaaaa gaagttaaac cagcagcaaa agccactaac 240aatacatatc ctattttgaa tcaggaactt agagaagcga ttaaaaaccc tgcaataaaa 300gacaaagatc atagcgcacc aaactctcgt ccaattgatt ttgaaatgaa aaagaaagat 360ggaactcaac agttttatca ttatgcaagt tctgttaaac ctgctagagt tattttcact 420gattcaaaac cagaaattga attaggatta caatcaggtc aattttggag aaaatttgaa 480gtttatgaag gtgacaaaaa gttgccaatt aaattagtat catacgatac tgttaaagat 540
tatgcttaca ttcgcttctc tgtatcaaac ggaacaaaag ctgttaaaat tgttagttca 600acacacttca ataacaaaga agaaaaatac gattacacat taatggaatt cgcacaacca 660atttataaca gtgcagataa attcaaaact gaagaagatt ataaagctga aaaattatta 720gcgccatata aaaaagcgaa aacactagaa agacaagttt atgaattaaa taaaattcaa 780gataaacttc ctgaaaaatt aaaggctgag tacaagaaga aattagagga tacaaagaaa 840gctttagatg agcaagtgaa atcagctatt actgaattcc aaaatgtaca accaacaaat 900gaaaaaatga ctgatttaca agatacaaaa tatgttgttt atgaaagtgt tgagaataac 960gaatctatga tggatacttt tgttaaacac cctattaaaa caggtatgct taacggcaaa 1020aaatatatgg tcatggaaac tactaatgac gattactgga aagatttcat ggttgaaggt 1080caacgtgtta gaactataag caaagatgct aaaaataata ctagaacaat tattttccca 1140tatgttgaag gtaaaactct atatgatgct atcgttaaag ttcacgtaaa aacgattgat 1200tatgatggac aataccatgt cagaatcgtt gataaagaag catttacaaa agccaatacc 1260gataaatcta acaaaaaaga acaacaagat aactcagcta agaaggaagc tactccagct 1320acgcctagca aaccaacacc atcacctgtt gaaaaagaat cacaaaaaca agacagccaa 1380aaagatgaca ataaacaatt accaagtgtt gaaaaagaaa atgacgcatc tagtgagtca 1440ggtaaagaca aaacgcctgc tacaaaacca actaaaggtg aagtagaatc aagtagtaca 1500actccaacta aggtagtatc tacgactcaa aatgttgcaa aaccaacaac tgcttcatca 1560aaaacaacaa aagatgttgt tcaaacttca gcaggttcta gcgaagcaaa agatagtgct 1620ccattacaaa aagcaaacat taaaaacaca aatgatggac acactcaaag ccaaaacaat 1680aaaaatacac aagaaaataa agcaaaatca ctcgagcacc accaccacca ccactga1737210312111941212DNA213人工序列220
223編碼沒有羧基His-標記的SEQ ID NO28且是密碼子最優化的以用於酵母表達40031atgggtaaca agcaacaaaa ggaattcaag tctttctact ccattagaaa gtcttccttg 60ggtgttgctt ctgtcgctat ctccaccttg ttgttgttga tgtctaacgg tgaagctcaa 120gctgctgctg aagaaactgg tggtaccaac actgaagctc aaccaaagac cgaagctgtc 180gcttccccaa ccactacctc tgaaaaggct ccagaaacta agccagttgc taacgctgtc 240tccgtttcta acaaggaagt cgaagctcca acctccgaaa ctaaggaagc taaggaagtt 300aaggaagtca aggctccaaa ggaaactaag gaagtcaagc cagctgctaa ggctaccaac 360aacacttacc caattttgaa ccaagaattg agagaagcta ttaagaaccc agctatcaag 420gacaaggacc actccgctcc aaactctaga ccaatcgact tcgaaatgaa gaagaaggac 480ggtacccaac aattctacca ctacgcgtcc tctgtcaagc cagctagagt tattttcacc 540gactctaagc cagaaatcga attgggtttg caatccggtc aattctggag aaagttcgaa 600gtctacgaag gtgacaagaa gttgccaatt aagttggttt cctacgacac cgtcaaggac 660tacgcttaca tcagattctc cgtttctaac ggtactaagg ctgtcaagat tgtctcttcc 720acccacttca acaacaagga agaaaagtac gactacactt tgatggaatt cgctcaacca 780atttacaact ctgctgacaa gttcaagacc gaagaagact acaaggctga aaagttgttg 840
gctccataca agaaggctaa gactttggaa agacaagttt acgaattgaa caagatccaa 900gacaagttgc cagaaaagtt gaaggctgaa tacaagaaga agttggaaga caccaagaag 960gctttggacg aacaagtcaa gtccgctatc accgaattcc aaaacgttca accaactaac 1020gaaaagatga ctgacttgca agacactaag tacgtcgtct acgaatccgt cgaaaacaac 1080gaatccatga tggacacctt cgttaagcac ccaattaaga ctggtatgtt gaacggtaag 1140aagtacatgg tcatggaaac cactaacgac gactactgga aggacttcat ggttgaaggt 1200caaagagtca gaaccatctc caaggacgct aagaacaaca ctagaaccat tatcttccca 1260tacgttgaag gtaagacttt gtacgacgct atcgtcaagg ttcacgtcaa gactattgac 1320tacgacggtc aataccacgt tagaattgtt gacaaggaag ctttcaccaa ggctaacacc 1380gacaagtcca acaagaagga acaacaagac aactctgcta agaaggaagc taccccagct 1440accccatcta agccaacccc atctccagtt gaaaaggaat ctcaaaagca agactcccaa 1500aaggacgaca acaagcaatt gccatccgtc gaaaaggaaa acgacgcgtc ttctgaatcc 1560ggtaaggaca agactccagc taccaagcca actaagggtg aagttgaatc ttcctctact 1620actccaacca aggttgtctc cactacccaa aacgtcgcta agccaactac cgcttcttcc 1680aagactacca aggacgttgt ccaaacttct gctggttcct ctgaagctaa ggactctgct 1740ccattgcaaa aggctaacat caagaacacc aacgacggtc acacccaatc ccaaaacaac 1800aagaacactc aagaaaacaa ggctaagtct ttgccacaaa ccggtgaaga atccaacaag 1860gacatgacct tgccattgat ggctttgttg gctttgtctt ccatcgttgc tttcgtcttg 1920ccaagaaaga gaaagaacta a 1941210322111710212DNA213人工序列220
223編碼SEQ ID NO3且是密碼子最優化的以用於酵母表達40032atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggaa gtcaagccag ctgctaaggc taccaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa gaaggacggt 360acccaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900
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tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440aagggtgtta ctttagctac caagccaact aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1500ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgg ttcttccaag 1560actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1620ttgcaaaagg ctaacatcaa gcacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1680aacactcaag aaaacaaggc taagtcttaa 1710210412111710212DNA213人工序列220
223編碼含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO7且是密碼子最優化的以用於酵母表達40041atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggaa gtcaagccag ctgctaaggc taccaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa gaaggacggt 360acccaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320
ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440aagggtgtta ctttggctac caagccaact aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1500ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgg ctcttccaag 1560actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1620ttgcaaaagg ctaacatcaa gcacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1680aacactcaag aaaacaaggc taagtcttaa 171021042211481212PRT213人工序列220
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223編碼SEQ ID NO42且是密碼子最優化的以用於酵母表達
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223編碼含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO44且是密碼子最優化的以用於酵母表達40045atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggaa gtcaagccag ctgctaaggc taccaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa gaaggacggt 360acccaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660
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223編碼含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO17且是密碼子最優化的以用於酵母表達40046atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 60tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840
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223編碼SEQ ID NO17I+區，是密碼子最優化的以用於酵母表達，且編碼甲硫氨酸起始密碼子40047atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 60tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080
agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440aagtaa1446210482111341212DNA213人工序列220
223編碼SEQ ID NO17I區，是密碼子最優化的以用於酵母表達，且編碼甲硫氨酸起始密碼子40048atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 60tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320ccatctaagc caaccccata a 1341210492111938
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223編碼含有SEQ ID NO17的全長ORF0657n，其修飾成含有氨基末端甲硫氨酸之後的甘氨酸，且是密碼子最優化的以用於酵母表達40049atgggtaaca agcaacaaaa ggaattcaag tctttctact ccattagaaa gtcttccttg 60ggtgttgctt ctgtcgctat ctccaccttg ttgttgttga tgtctaacgg tgaagctcaa 120gctgctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 180tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 240gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 300gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 360acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 420aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 480gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 540tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 600tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 660gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 720cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 780tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 840ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 900aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 960ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 1020aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 1080tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1140tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1200agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1260gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1320gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1380aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1440ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1500gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1560aaggacaaga ctccagctac caagccagct aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1620ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgc ttcttccaag 1680actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1740ttgcaaaagg ctaacatcaa gaacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1800aacactcaag aaaacaaggc taagtctttg ccacaaaccg gtgaagaatc caacaaggac 1860atgaccttgc cattgatggc tttgttggct ttgtcttcca tcgttgcttt cgtcttgcca 1920agaaagagaa agaactaa 1938210502111710
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223編碼SEQ ID NO20，是密碼子最優化的以用於酵母表達，且編碼甲硫氨酸起始密碼子40050atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctactaaggc tgacaacaac 240acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440aaggacaaga ctccagctac caagccagct aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1500ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgc ttcttccaag 1560actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1620ttgcaaaagg ctaacatcaa gaacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1680aacactcaag aaaacaaggc taagtcttaa 1710210512111446212DNA213人工序列220
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acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320ccatctaagc caaccccata a 1341210532111938212DNA213人工序列220
223編碼含有SEQ ID NO20的全長ORF0657n，其修飾成含有氨基末端甲硫氨酸之後的甘氨酸，且是密碼子最優化的以用於酵母表達40053atgggtaaca agcaacaaaa ggaattcaag tctttctact ccattagaaa gtcttccttg 60ggtgttgctt ctgtcgctat ctccaccttg ttgttgttga tgtctaacgg tgaagctcaa 120gctgctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 180tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 240gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 300gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctactaaggc tgacaacaac 360acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 420aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 480gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 540tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 600tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 660gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 720cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 780tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 840
ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 900aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 960ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 1020aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 1080tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1140tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1200agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1260gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1320gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1380aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1440ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1500gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1560aaggacaaga ctccagctac caagccagct aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1620ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgc ttcttccaag 1680actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1740ttgcaaaagg ctaacatcaa gaacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1800aacactcaag aaaacaaggc taagtctttg ccacaaaccg gtgaagaatc caacaaggac 1860atgaccttgc cattgatggc tttgttggct ttgtcttcca tcgttgcttt cgtcttgcca 1920agaaagagaa agaactaa 193821054211565212PRT213人工序列220
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223引物
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223引物40067aaccggtttt ccatggggaa caaacagcaa aaagaattt 392106821138212DNA213人工序列220
223引物40068accggtttct cgaggttttt acgttttcta ggtaatac 3821069211109212DNA213人工序列220
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223ORF0657n寡聚體40070gttggggaag cgacagcttc ggtctttggt tgagcttcag tgttggtacc accagtttct 60tcagcagcag cttgagcttc accgttagac atcaacaaca acaaggtgga11021071211110212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40071agaccgaagc tgtcgcttcc ccaaccacta cctctgaaaa ggctccagaa actaagccag 60ttgctaacgc tgtctccgtt tctaacaagg aagtcgaagc tccaacctcc11021072211109212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40072tggtagcctt agcagctggc ttgacttcct tagtttcctt tggagccttg acttccttaa 60cttccttagc ttccttagtt tcggaggttg gagcttcgac ttccttgtt 10921073211108212DNA213人工序列220
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223ORF0657n寡聚體40077caccgtcaag gactacgctt acatcagatt ctccgtttct aacggtacta aggctgtcaa 60
gattgtctct tccacccact tcaacaacaa ggaagaaaag tacgactac 10921078211109212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40078aacttttcag ccttgtagtc ttcttcggtc ttgaacttgt cagcagagtt gtaaattggt 60tgagcgaatt ccatcaaagt gtagtcgtac ttttcttcct tgttgttga 10921079211106212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40079ccgaagaaga ctacaaggct gaaaagttgt tggctccata caagaaggct aagactttgg 60aaagacaagt ttacgaattg aacaagatcc aagacaagtt gccaga10621080211109212DNA213人工序列220
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223ORF0657n寡聚體40081cgaacaagtc aagtccgcta tcaccgaatt ccaaaacgtt caaccaacta acgaaaagat 60gactgacttg caagacacta agtacgtcgt ctacgaatcc gtcgaaaac 10921082211109212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40082tttccatgac catgtacttc ttaccgttca acataccagt cttaattggg tgcttaacga 60aggtgtccat catggattcg ttgttttcga cggattcgta gacgacgta 10921083211109212DNA213人工序列220
223ORF0657n寡聚體40083gaacggtaag aagtacatgg tcatggaaac cactaacgac gactactgga aggacttcat 60ggttgaaggt caaagagtca gaaccatctc caaggacgct aagaacaac 10921084211101212DNA213人工序列220
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tcgacggatg gcaattgctt gttgtcgtcc ttttgggagt 10021089211101212DNA213人工序列220
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223ORF0657n寡聚體40093gtgaagaatc caacaaggac atgaccttgc cattgatggc tttgttggct ttgtcttcca 60tcgttgcttt cgtcttgcca agaaagagaa agaactaa 982109421131212DNA213人工序列220
223引物40094cttaaagctt atgtcacttt ctcttgtatc g312109521130212DNA213人工序列220
223引物40095tgataagctt gctcaatggt tctcttcctc 302109621153212DNA213人工序列
220
223引物40096aaccggtttg gatcccacaa aacaaaatgg gtaacaagca acaaaaggaa ttc 532109721142212DNA213人工序列220
223引物40097aaccggtttg gatccttagt tctttctctt tcttggcaag ac 422109821124212DNA213人工序列220223引物40098gctgaagaaa ctggtggtac caac 242109921142212DNA213人工序列220
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220
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223引物400105gctgccggga tccttatggg gttggcttag atggggta 38210106211644212PRT213金黃色葡萄球菌(S.aureus)400106Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys1 5 10 15Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu20 25 30Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn35 40 45Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Leu Ala Ser Pro Thr Thr Thr50 55 60Thr Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val65 70 75 80Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys85 90 95Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro100 105 110Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu115 120 125Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala130 135 140Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu145 150 155 160Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile
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515 520 525Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val530 535 540Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr545 550 555 560Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp565 570 575Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His580 585 590Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser595 600 605Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu610 615 620Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg625 630 635 640Lys Arg Lys Asn210107211644212PRT213金黃色葡萄球菌(S.aureus)400107Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys1 5 10 15Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu20 25 30Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn35 40 45Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr50 55 60Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val65 70 75 80Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys85 90 95Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro100 105 110Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu115 120 125Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala130 135 140Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu145 150 155 160
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Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro515 520 525Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val530 535 540Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr545 550 555 560Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp565 570 575Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His580 585 590Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser595 600 605Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu610 615 620Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg625 630 635 640Lys Arg Lys Asn
權利要求
1.多肽免疫原，其包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列，其中所述的多肽能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫，且其中如果存在一個或多個其它的多肽區，則所述的其它區不能提供含有SEQ ID NO2的胺基酸609-645的羧基末端。
2.權利要求1的多肽，其中所述的多肽由與SEQ ID NO3具有至少90％同一性的胺基酸序列或其片段組成，所述的片段包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列。
3.權利要求2的多肽，其中所述的多肽由與SEQ ID NO3具有至少94％同一性的胺基酸序列或其片段組成，所述的片段包含與SEQ ID NO1具有至少94％同一性的胺基酸序列。
4.權利要求3的多肽，其中所述的多肽由與SEQ ID NO1、SEQ IDNO3或SEQ ID NO42具有至少94％同一性的胺基酸序列組成。
5.權利要求1的多肽，其中所述的多肽基本上由SEQ ID NO 1、3、7、17、20或42的胺基酸序列組成。
6.權利要求5的多肽，其中所述的多肽由SEQ ID NO 1、3、7、17、20或42的胺基酸序列組成。
7.免疫原，其包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列，其中所述的免疫原由所述胺基酸序列和一個或多個在羧基末端或氨基末端共價連接到所述序列上的其它區域部分組成，其中每個區域或部分獨立地選自具有至少一種下述性質的區域或部分能增強免疫反應、能有利於純化或能有利於多肽的穩定性。
8.能在患者中誘導保護性免疫反應的組合物，其包含免疫有效量的權利要求1-7中的任一項的免疫原和藥學上可接受的載體。
9.權利要求8的組合物，其中所述的組合物還包含佐劑。
10.包含重組基因的核酸，所述的重組基因包含能編碼權利要求1-6中的任一項的多肽免疫原的核苷酸序列。
11.權利要求10的核酸，其中所述的重組基因至少缺少基本上所有的信號肽編碼序列和細胞壁分類信號序列。
12.權利要求10的核酸，其中所述的重組基因含有一個或多個為酵母表達最優化的密碼子。
13.權利要求12的核酸，其中所述的核苷酸序列是至少50％為酵母表達密碼子最優化的。
14.權利要求10的核酸，其中所述的核酸是表達載體。
15.權利要求10的核酸，其中所述的核苷酸序列選自SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、SEQID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO46、SEQ IDNO47、SEQ ID NO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO52和SEQ ID NO53。
16.權利要求15的核酸，其中所述的核酸是表達載體。
17.重組細胞，其包含權利要求10-16中的任一項的核酸。
18.製備能提供保護性免疫的金黃色葡萄球菌多肽的方法，其包含下述步驟(a)在能表達多肽的條件下，培養權利要求17的重組細胞；和(b)純化所述的多肽。
19.權利要求19的方法，其中所述的重組細胞是啤酒糖酵母。
20.在患者中誘導保護性免疫反應的方法，其包含下述步驟給所述的患者施用免疫有效量的包含多肽的免疫原，其中所述的多肽包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列，且能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。
21.權利要求19的方法，其中所述免疫原是權利要求1-7中的任一項的免疫原。
22.權利要求21的方法，其中所述的患者是人。
23.權利要求22的方法，其中針對金黃色葡萄球菌感染預防性地治療所述的患者。
24.在患者中誘導保護性免疫反應的方法，其包含下述步驟給所述的患者施用免疫有效量的由權利要求18的方法製備出的多肽。
25.在患者中誘導回憶應答的方法，其包含下述步驟給所述的患者施用有效量的包含多肽的免疫原，其中所述的多肽包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列，並能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫。
26.權利要求25的方法，其中所述的回憶應答能在3天內產生比已有滴度增加至少3倍的幾何滴度。
27.酵母最優化的核酸序列，其能編碼能提供針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫的ORF0657n相關多肽，或它的包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列的片段。
28.權利要求27的酵母最優化的核酸，其中所述的核酸序列不能編碼ORF0657n信號肽或細胞壁分類信號序列。
29.製備能提供針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫的多肽的方法，其包含下述步驟(a)在能表達所述多肽的條件下，培養重組酵母細胞，其中所述的重組酵母細胞包含能編碼所述多肽的重組基因，且所述多肽是能提供針對金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫的全長ORF0657n相關多肽，或它的包含與SEQ ID NO1具有至少90％同一性的胺基酸序列的片段；和(b)純化所述的多肽。
30.權利要求29的方法，其中所述的重組基因不能編碼功能性ORF0657n細胞壁分類信號序列。
31.權利要求29的方法，其中所述的重組基因不能編碼功能性ORF0657n細胞壁分類信號序列或信號肽序列。
32.權利要求29的方法，其中所述的重組酵母細胞是啤酒糖酵母，且所述的核苷酸序列能編碼SEQ ID NO1、3、7、17或20的多肽。
全文摘要
本發明表徵了包含結構上與SEQ ID NO1有關的胺基酸序列的多肽、這樣的多肽的用途、和用於生產這樣的多肽的表達系統。SEQ IDNO1是全長金黃色葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全長多肽在本文中稱作全長"ORF0657n"。發現含有SEQ ID NO1的胺基酸序列的多肽能產生針對金黃色葡萄球菌的保護性免疫反應。
文檔編號C07K14/31GK1980692SQ200480021391
公開日2007年6月13日 申請日期2004年7月22日 優先權日2003年7月24日
發明者A·S·安德森, K·U·揚森, R·凱利, L·D·舒爾茨, D·L·蒙特戈梅裡, W·L·麥克萊門茨 申請人:麥克公司