一種STR分型陽性參照物的製作方法
2023-10-07 04:56:59
本發明涉及法醫學技術領域，具體涉及一種STR分型陽性參照物。
背景技術：
自20世紀90年代至今，STR分型技術作為第二代DNA分型技術已廣泛應用於法醫DNA分型實驗室，因其準確、快速、靈敏等優點，成為了當前法醫物證鑑定的主流技術。將多色螢光標記的STR複合擴增產物與等位基因分型標準物ladder比對，確定各基因座的基因分型，此分型結果是個人認定及親權關係認定的關鍵。但是，由於法醫生物學檢材來源具有多樣性，STR分型結果有時出現丟峰、一個基因座檢出多個等位基因、甚至出現ladder樣圖譜。為了排除檢測分析人員、實驗室環境DNA汙染等因素對實驗結果的影響，常用人類基因組DNA作為陽性參照物，確保檢測結果真實準確。目前我國法醫學領域常使用9947A、9948、2800M、007、K562等的基因組DNA作為陽性參照物，然而上述幾種基因組皆源自特定匿名供體的細胞所建立細胞系，需要通過基因組DNA提取及定量，最後完成定值並作為陽性參照物而使用。上述陽性參照物具有一些不足之處。一是基因型為自然人所具有，二是需進行細胞系的建立，獲取難度大，工作量大，程序複雜，成本高。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種作為STR分型陽性參照物的DNA混合物。
本發明所提供的作為STR分型陽性參照物的DNA混合物，含有DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4、DNA片段5、DNA片段6、DNA片段7、DNA片段8、DNA片段9、DNA片段10、DNA片段11、DNA片段12、DNA片段13、DNA片段14、DNA片段15、DNA片段16、DNA片段17、DNA片段18、DNA片段19、DNA片段20、DNA片段21、DNA片段22、DNA片段23、DNA片段24、DNA片段25和DNA片段26。
所述DNA片段1為DNA片段a或含有DNA片段a的DNA分子；所述DNA片段a是將人類基因組hg38Y染色體上第4402412至4403492位核苷酸所示DNA分子中的區段A替換為5』-[AGAT]15-3』得到的；所述區段A如人類基因組hg38Y染色體上第4402919至4402978位核苷酸所示。
所述DNA片段2為DNA片段b或含有DNA片段b的DNA分子；所述DNA片段b是將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區段B替換為5』-[TCTG]5[TCTA]12-3』得到的；所述區段B如人類基因組hg38Y染色體上第12500544至12500611位核苷酸所示。
所述DNA片段3為DNA片段c或含有DNA片段c的DNA分子；所述DNA片段c是將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區段C替換為5』
-[TCTG]5[TCTA]12TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA[TCTG]3[TCTA]9[TCCC]2-3』得到的；所述區段C如人類基因組hg38Y染色體上第12500440至
12500611位核苷酸所示。
所述DNA片段4為DNA片段d或含有DNA片段d的DNA分子；所述DNA片段d為人類基因組hg38Y染色體上第15162506至15163693位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段5為DNA片段e或含有DNA片段e的DNA分子；所述DNA片段e是將人類基因組hg38Y染色體上第7999327至8000423位核苷酸所示DNA分子中的區段E替換為5』-[GAAA]16-3』得到的；所述區段E如人類基因組hg38Y染色體上第7999839至7999902位核苷酸所示。
所述DNA片段6為DNA片段f或含有DNA片段f的DNA分子；所述DNA片段f是將人類基因組hg38Y染色體上第9683880至9684943位核苷酸所示DNA分子中的區段F替換為5』-[GAAA]16-3』得到的；所述區段F如人類基因組hg38Y染色體上第9684380至9684443位核苷酸所示。
所述DNA片段7為DNA片段g或含有DNA片段g的DNA分子；所述DNA片段g為人類基因組hg38Y染色體上第18639212至18640255位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段8為DNA片段h或含有DNA片段h的DNA分子；所述DNA片段h為人類基因組hg38Y染色體上第18680133至18681188位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段9為DNA片段i或含有DNA片段i的DNA分子；所述DNA片段i是將人類基因組hg38Y染色體上第3262548至3263624位核苷酸所示DNA分子中的區段I替換為5』-[AGAT]12-3』得到的；所述區段I如人類基因組hg38Y染色體上第3263111至3263158位核苷酸所示。
所述DNA片段10為DNA片段j或含有DNA片段j的DNA分子；所述DNA片段j是將人類基因組hg38Y染色體上第11981535至11982727位核苷酸所示DNA分子中的區段J替換為5』-[TCTA]11-3』得到的；所述區段J如人類基因組hg38Y染色體上第11982089至11982132位核苷酸所示。
所述DNA片段11為DNA片段k或含有DNA片段k的DNA分子；所述DNA片段k為人類基因組hg38Y染色體上第12403016至12404148位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段12為DNA片段l或含有DNA片段l的DNA分子；所述DNA片段l為人類基因組hg38Y染色體上第12258360至12259484位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段13為DNA片段m或含有DNA片段m的DNA分子；所述DNA片段m為人類基因組hg38Y染色體上第20471493至20472591位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段14為DNA片段n或含有DNA片段n的DNA分子；所述DNA片段n為人類基因組hg38Y染色體上第16631132至16632289位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段15為DNA片段o或含有DNA片段o的DNA分子；所述DNA片段o為人類基因組hg38Y染色體上第12345767至12346826位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段16為DNA片段p或含有DNA片段p的DNA分子；所述DNA片段p是將人類基因組hg38Y染色體上第12825368至12826501位核苷酸所示DNA分子中的區段P替換為5』-[TTTTC]12-3』得到的；所述區段P如人類基因組hg38Y染色體上第12825889至12825948位核苷酸所示。
所述DNA片段17為DNA片段q或含有DNA片段q的DNA分子；所述DNA片段q為人類基因組hg38Y染色體上第22218501至22219600位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段18為DNA片段r或含有DNA片段r的DNA分子；所述DNA片段r為人類基因組hg38Y染色體上第7546860至7548164位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段19為DNA片段s或含有DNA片段s的DNA分子；所述DNA片段s是將人類基因組hg38Y染色體上第17113629至17114936位核苷酸所示DNA分子中的區段S替換為5』-[ATAG]14-3』得到的；所述區段S如人類基因組hg38Y染色體上第17114309至17114364位核苷酸所示。
所述DNA片段20為DNA片段t或含有DNA片段t的DNA分子；所述DNA片段t是將人類基因組hg38Y染色體上第18888396至18889560位核苷酸所示DNA分子中的區段T替換為5』-[ATAG]10-3』得到的；所述區段T如人類基因組hg38Y染色體上第18888956至18888995位核苷酸所示。
所述DNA片段21為DNA片段u或含有DNA片段u的DNA分子；所述DNA片段u為人類基因組hg38Y染色體上第13166268至13167351位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段22為DNA片段v或含有DNA片段v的DNA分子；所述DNA片段v為人類基因組hg38Y染色體上第16968971至16970301位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段23為DNA片段w或含有DNA片段w的DNA分子；所述DNA片段w是將人類基因組hg38Y染色體上第23739148至23740275位核苷酸所示DNA分子中的區段W替換為5』-[GAAA]15[GGAA]7-3』得到的；所述區段W如人類基因組hg38Y染色體上第23739648至23739735位核苷酸所示。
所述DNA片段24為DNA片段x或含有DNA片段x的DNA分子；所述DNA片段x為人類基因組hg38Y染色體上第25929809至25930928位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段25為DNA片段y或含有DNA片段y的DNA分子；所述DNA片段y為人類基因組hg38X染色體上第11296467至11296999位核苷酸所示DNA分子。
所述DNA片段26為DNA片段z或含有DNA片段z的DNA分子；所述DNA片段z為人類基因組hg38Y染色體上第6869827至6870365位核苷酸所示DNA分子。
以上任一所述DNA片段1和/或DNA片段2和/或DNA片段3和/或DNA片段4和/或DNA片段5和/或DNA片段6和/或DNA片段7和/或DNA片段8和/或DNA片段9和/或DNA片段10和/或DNA片段11和/或DNA片段12和/或DNA片段13和/或DNA片段14和/或DNA片段15和/或DNA片段16和/或DNA片段17和/或DNA片段18和/或DNA片段19和/或DNA片段20和/或DNA片段21和/或DNA片段22和/或DNA片段23和/或DNA片段24和/或DNA片段25和/或DNA片段26均為雙鏈DNA分子。
所述DNA混合物具體由所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26組成。
所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26的質量比為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26的質量比具體可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。
為解決上述技術問題，本發明還提供了一種作為STR分型陽性參照物的重組質粒混合物。
本發明所提供的作為STR分型陽性參照物的重組質粒混合物，可通過如下方法製備的：
將所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26分別插入到26個載體中，得到26個重組載體；將所述26個重組載體混合，得到重組質粒混合物。
上述重組質粒混合物中，所述26個重組載體的質量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
上述重組質粒混合物中，所述26個重組載體的質量比具體可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。
上述重組質粒混合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26可以分別插入到同一個載體中，也可以分別插入到不同的載體中。進一步，可以插入到載體的相同位置，也可以分別插入載體的不同位置。
所述載體為克隆載體。
所述克隆載體可為T載體。
所述T載體具體可為質粒pMD18-T。
所述重組載體具體可為將質粒pMD18-T和DNA片段(所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25或所述DNA片段26)連接，得到重組載體。
上述任一所述的DNA混合物或上述任一所述的重組質粒混合物在STR分型擴增中作為STR分型陽性參照物的應用也屬於本發明的保護範圍。
上述應用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的DNA混合物中，所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個DNA片段的質量比可為0.5pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg。
上述應用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的DNA混合物中，所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個DNA片段的質量比具體可為0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg。
上述應用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的重組質粒混合物中，含有所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個重組載體的質量比可為0.5pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg。
上述應用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的重組質粒混合物中，含有所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個重組載體的質量比具體可為0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg。
本發明根據目前法醫分子遺傳學中已發現的STR基因座位點，製備了用於STR分型陽性參照物。實驗證明，本發明提供的STR分型陽性參照物可作為多種商業試劑盒所使用的標準物質，具有重要的應用價值。
附圖說明
圖1為實施例1步驟三中1的DNA檢測圖譜。
圖2為實施例1步驟三中2的DNA檢測圖譜。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。
Nanodrop1000微量分光光度計為Applied Biosystems產品。PCR Amplification Kit為Applied Biosystems公司產品。9948人類基因組DNA為Promaga公司產品。質粒pMD18-T為TaKaRa公司產品，產品目錄號為6011。內標為Typer500內標，公安部物證鑑定中心產品。去離子甲醯胺為ABI公司產品，產品目錄號為4311320。ABI3130xl遺傳分析儀為ABI公司產品。
實施例1、STR分型陽性參照物的製備和驗證
一、重組質粒的獲得
製備表1所示的26個重組質粒，包含22個Y染色體STR基因座以及性別判定基因座Amelogenin，共26個等位基因。
根據測序結果，各重組質粒的詳細信息如下(人類基因組hg38Y染色體和人類基因組hg38X染色體的基因信息見網址：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks？chromInfoPage＝&hgsid＝500042597_ceYXRRTAWoGaTHVgpCtg3gj4PilI)：
重組質粒1：將DNA片段1和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒1；DNA片段1為將人類基因組hg38Y染色體上第4402412至4403492位核苷酸所示DNA分子中的區段A替換為5』-[AGAT]15-3』得到的；所述區段A如人類基因組hg38Y染色體上第4402919至4402978位核苷酸所示；
重組質粒2：將DNA片段2和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒2；DNA片段2為將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區段B替換為5』-[TCTG]5[TCTA]12-3』得到的；所述區段B如人類基因組hg38Y染色體上第12500544至12500611位核苷酸所示；
重組質粒3：將DNA片段3和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒3；DNA片段3為將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區段C替換為5』
-[TCTG]5[TCTA]12TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA[TCTG]3[TCTA]9[TCCC]2-3』得到的；所述區段C如人類基因組hg38Y染色體上第12500440至12500611位核苷酸所示；
重組質粒4：將DNA片段4和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒4；DNA片段4為人類基因組hg38Y染色體上第15162506至15163693位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒5：將DNA片段5和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒5；DNA片段5為將人類基因組hg38Y染色體上第7999327至8000423位核苷酸所示DNA分子中的區段E替換為5』-[GAAA]16-3』得到的；所述區段E如人類基因組hg38Y染色體上第7999839至7999902位核苷酸所示；
重組質粒6：將DNA片段6和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒6；DNA片段6為將人類基因組hg38Y染色體上第9683880至9684943位核苷酸所示DNA分子中的區段F替換為5』-[GAAA]16-3』得到的；所述區段F如人類基因組hg38Y染色體上第9684380至9684443位核苷酸所示；；
重組質粒7：將DNA片段7和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒7；DNA片段7為人類基因組hg38Y染色體上第18639212至18640255位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒8：將DNA片段8和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒8；DNA片段8為人類基因組hg38Y染色體上第18680133至18681188位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒9：將DNA片段9和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒9；DNA片段9為將人類基因組hg38Y染色體上第3262548至3263624位核苷酸所示DNA分子中的區段I替換為5』-[AGAT]12-3』得到的；所述區段I如人類基因組hg38Y染色體上第3263111至3263158位核苷酸所示；
重組質粒10：將DNA片段10和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒10；DNA片段10為將人類基因組hg38Y染色體上第11981535至11982727位核苷酸所示DNA分子中的區段J替換為5』-[TCTA]11-3』得到的；所述區段J如人類基因組hg38Y染色體上第11982089至11982132位核苷酸所示；
重組質粒11：將DNA片段11和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒11；DNA片段11為人類基因組hg38Y染色體上第12403016至12404148位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒12：將DNA片段12和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒12；DNA片段12為人類基因組hg38Y染色體上第12258360至12259484位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒13：將DNA片段13和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒13；DNA片段13為人類基因組hg38Y染色體上第20471493至20472591位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒14：將DNA片段14和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒14；DNA片段14為人類基因組hg38Y染色體上第16631132至16632289位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒15：將DNA片段15和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒15；DNA片段15為人類基因組hg38Y染色體上第12345767至12346826位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒16：將DNA片段16和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒16；DNA片段16為將人類基因組hg38Y染色體上第12825368至12826501位核苷酸所示DNA分子中的區段P替換為5』-[TTTTC]12-3』得到的；所述區段P如人類基因組hg38Y染色體上第12825889至12825948位核苷酸所示；
重組質粒17：將DNA片段17和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒17；DNA片段17為人類基因組hg38Y染色體上第22218501至22219600位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒18：將DNA片段18和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒18；DNA片段18為人類基因組hg38Y染色體上第7546860至7548164位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒19：將DNA片段19和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒19；DNA片段19為將人類基因組hg38Y染色體上第17113629至17114936位核苷酸所示DNA分子中的區段S替換為5』-[ATAG]14-3』得到的；所述區段S如人類基因組hg38Y染色體上第17114309至17114364位核苷酸所示；
重組質粒20：將DNA片段20和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒20；DNA片段20為將人類基因組hg38Y染色體上第18888396至18889560位核苷酸所示DNA分子中的區段T替換為5』-[ATAG]10-3』得到的；所述區段T如人類基因組hg38Y染色體上第18888956至18888995位核苷酸所示；
重組質粒21：將DNA片段21和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒21；DNA片段21為人類基因組hg38Y染色體上第13166268至13167351位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒22：將DNA片段22和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒22；DNA片段22為人類基因組hg38Y染色體上第16968971至16970301位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒23：將DNA片段23和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒23；DNA片段23為將人類基因組hg38Y染色體上第23739148至23740275位核苷酸所示DNA分子中的區段W替換為5』-[GAAA]15[GGAA]7-3』得到的；所述區段W如人類基因組hg38Y染色體上第23739648至23739735位核苷酸所示；
重組質粒24：將DNA片段24和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒24；DNA片段24為人類基因組hg38Y染色體上第25929809至25930928位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒25：將DNA片段25和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒25；DNA片段25為人類基因組hg38X染色體上第11296467至11296999位核苷酸所示DNA分子；
重組質粒26：將DNA片段26和質粒pMD18-T連接，得到重組質粒26；DNA片段26為人類基因組hg38Y染色體上第6869827至6870365位核苷酸所示DNA分子。
表19948人類基因組DNA中存在的STR基因座及相應的等位基因型
二、STR分型陽性參照物的製備
1、利用Nanodrop1000微量分光光度計分別測量並稀釋步驟一中獲得的重組質粒DNA的濃度至1ng/μL，獲得各質粒的稀釋液。
2、完成步驟1後，取各質粒的稀釋液1μL進行混合，然後用超純水定容至1mL，得到STR分型陽性參照物。
STR分型陽性參照物中，步驟一中各個等位基因的DNA濃度均為1pg/μL。
三、STR分型陽性參照物的驗證
1、確定STR分型陽性參照物的最佳稀釋倍數
(1)取步驟二製備的STR分型陽性參照物，然後依次用超純水稀釋至10倍、100倍、1000倍和10000倍，分別得到稀釋液1、稀釋液2、稀釋液3和稀釋液4。
(2)取0.5μL步驟(1)得到的稀釋液1、稀釋液2、稀釋液3或稀釋液4，並以其作為DNA模板，使用PCR Amplification Kit並按其操作說明書的步驟進行PCR擴增(反應體系為12.5μL)，得到PCR擴增產物。
反應程序為：95℃預變性11min；94℃變性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環；60℃延伸80min；4℃保存備檢。
(3)完成步驟(2)後，向去離子甲醯胺中加入1μL PCR擴增產物和0.2μL內標，然後用去離子甲醯胺定容至20μL，得到混合液。
(4)完成步驟(3)後，取混合液，95℃變性5min，迅速轉移至-20℃放置5min，然後用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到相應的DNA檢測圖譜。根據DNA檢測圖譜中的檢測峰高確定STR分型陽性參照物的最佳濃度。電泳條件為：進樣電壓2kV，進樣時間為18s。
實驗結果見圖1(A為稀釋液1，B為稀釋液2，C為稀釋液3，D為稀釋液4)。結果表明：以稀釋液1作為DNA模板，多數等位基因的檢測峰出現滲透現象；以稀釋液2作為DNA模板，所有等位基因分型完整，一些基因座的等位基因檢測峰出現滲透，峰高為4000～8000；以稀釋液3作為DNA模板，所有等位基因分型完整，峰高為3000～4000；以稀釋液4作為DNA模板，由於模板量低一些基因座出現等位基因的丟失，峰高為200～600。因此，STR分型陽性參照物的最佳稀釋倍數為1000倍，也就是說，使用STR分型陽性參照物擴增時，每個等位基因的DNA濃度為0.001pg/μL。
2、STR分型陽性參照物的驗證
①取1μL步驟1得到的稀釋液3，並以其作為DNA模板，使用PCR Amplification Kit並按其操作說明書的步驟，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
②完成步驟①後，向去離子甲醯胺中加入1μL PCR擴增產物和0.2μL內標，然後用去離子甲醯胺定容至20μL，得到混合液。
③完成步驟②後，取混合液，95℃變性5min，迅速轉移至-20℃放置5min，然後用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到相應的DNA檢測圖譜。電泳條件為：進樣電壓2kV，進樣時間為18s。
按照上述步驟，將步驟①中的稀釋液3替換為9948人類基因組DNA，其它步驟均不變，得到9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜。
實驗結果見圖2(A為STR分型陽性參照物的DNA檢測圖譜，B為9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜)。結果表明，A中無滲透峰，峰高為2000～3500，基因座內各等位基因分型完整、正確，峰型尖銳清晰，無stutter峰，基因座內兩等位基因間差異較小，基因座間均衡性良好。STR分型陽性參照物的DNA檢測圖譜和9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜的檢測峰高相當，各基因座分型一致。可見，步驟二製備的STR分型陽性參照物與9948人類基因組DNA擴增檢測結果無差異，可完全替代9948人類基因組DNA進行STR分型檢測。