幹擾素－α蛋白作為Fc融合蛋白的表達和運輸的製作方法

2023-10-07 00:21:24

專利名稱：幹擾素－α蛋白作為Fc融合蛋白的表達和運輸的製作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白表達系統，該系統可提高干擾素-α類蛋白家族成員的產量。更具體地，本發明涉及Fc融合蛋白，例如免疫球蛋白Fc-幹擾素-α，在哺乳動物細胞中的高水平表達和分泌，該蛋白的各種結構形式及其應用。
背景技術：
已證明幹擾素-α(IFN-α)蛋白家族對多種疾病的治療具有應用價值。例如，幹擾素-α2a和2b(商業名稱分別為Roferon和Intron A)已應用於對慢性B型肝炎，C型肝炎和丁型肝炎(威脅生命的病毒性肝臟疾病)，尖銳溼疣(生殖器的疣)，愛滋病相關的卡波西肉瘤，毛細胞白血病，惡性黑色素瘤，基底細胞癌，多發性骨髓瘤，腎細胞癌，皰疹I和II，水痘/皰疹帶狀皰疹，蕈狀真菌病。包含幹擾素-α的治療策略對前列腺癌和慢性粒細胞性白血病狀況的功效也已有研究。
人幹擾素-α家族是最大、最複雜的幹擾素家族。幹擾素-α家族成員有相似的胺基酸序列由此將其定義為一個區別於其他幹擾素的組；也就是說，這些蛋白在典型的蛋白序列對比中典型地具有至少35％的胺基酸同一性。SwissProt資料庫包含大量的人幹擾素-α蛋白，包括替換地命名為幹擾素-δ和幹擾素-ω的蛋白。這些蛋白典型地與約23個胺基酸的引導序列一起合成，成熟蛋白典型地具有約19kD的分子量。由於這些蛋白非常相似，當由人或其他哺乳動物源獲得幹擾素-α且大致純化後，常可得到具有不同生物活性的異種混合物。[Georgiadis等，U.S.Patent No4,732,683]類似地，編碼這些蛋白的cDNA具有非常相似的大小和性質，所以可用一套方法對它們進行操作，以達到構建質粒的目的。因此，由哺乳動物源有效地生產和純化一種幹擾素-α的方法是有應用價值的。
由於其分子量相對較小，約19kD(Lawn等(1981)NATL.ACAD.SCI.U.S.A.785435)故幹擾素-α可由腎臟過濾。但是，過濾時幹擾素-α典型地由腎管狀細胞吸收且代謝，因此，通常不分泌出來。依照目前的臨床實踐，成品的幹擾素-α是通過肌肉注射來使用的，注射後幹擾素-α在血清中的水平即下降，幹擾素-α2a的半衰期為5小時，幹擾素-α2b的半衰期為2-3小時(PHYSICIANS KESK REFERENCE，50th edition，19962145-2147和2364-2373)。
而且，由於它們分子量小，需要重複頻繁注射幹擾素-α(通常每天注射或每周注射3次)，而且患者體內的幹擾素-α水平會有顯著的變化。另外，注射劑量大，範圍從針對毛細胞白血病的50微克每劑到針對愛滋病相關的卡波西肉瘤的300微克每劑。高水平的循環幹擾素可能導致顯著的副作用，包括皮膚，神經，免疫，內分泌的毒性，人們認為由於幹擾素分子量較小故可以穿過血腦屏障進入中樞神經系統，導致一些神經性的副作用，因此，提高施用幹擾素-α的患者體內幹擾素的功效和其在血清中的半衰期，同時將副作用降到最低是有應用價值的。
鑑於幹擾素-α施用劑量高，效率低，半衰期短，難於純化且有副作用，該領域需要能使這種治療劑產量增加，藥學特性提高的方法。
發明概述本發明涉及對製造和使用包含幹擾素-α的融合蛋白有用的方法和組合物。更具體地，本發明涉及編碼Fc-幹擾素-α融合蛋白的核酸，例如DNA或RNA序列，及表達上述核酸以製造所述融合蛋白的方法。該融合蛋白能使具有生物活性的幹擾素-α高水平表達。該融合蛋白在施用於哺乳動物，例如人之前，可與藥劑學上可接受的載體相結合。在特定的環境下，在配製和/或施用之前，幹擾素-α可從融合蛋白上切割下來。或者，編碼含幹擾素-α融合蛋白的核酸可與藥劑學上可接受的載體相結合併施用於哺乳動物。
本發明的一個目的在於提供新的促進幹擾素-α生產和分泌的核酸序列，例如DNAs或RNAs。更具體的，本發明提供(i)促進幹擾素-α有效生產和分泌的核酸序列；(ii)在各種哺乳動物的宿主細胞中快速高效生產和分泌幹擾素-α的核酸的構建體；和(iii)生產，分泌和收集重組幹擾素-α，或其遺傳工程化變異體，包括非天然的，生物合成的或其他人工的幹擾素-α蛋白例如經合理設計而產生的蛋白的方法。
本發明的其它目的在於提供多核苷酸序列，當其與編碼幹擾素-α的多核苷酸相融合時編碼包含幹擾素-α的融合多肽，該融合多肽可由常規試劑和技術純化。再一個目的是在分泌盒和所編碼的幹擾素-α蛋白之間插入一個蛋白水解切割位點，使分泌盒可從幹擾素-α結構域切割下來，以便幹擾素-α得以單獨純化。
由此，一方面本發明提供編碼免疫球蛋白Fc區-幹擾素-α融合蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA分子。核酸分子沿5』到3』的方向順次地編碼信號序列，免疫球蛋白Fc區，和至少一種靶蛋白，且靶蛋白中包含幹擾素-α。
在一優選實施例中，免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區，且最好包含至少一個免疫球蛋白恆定重鏈區結構域，例如免疫球蛋白恆定重鏈2(CH2)結構域，免疫球蛋白恆定重鏈3(CH3)結構域，依照用於形成Fc區的免疫球蛋白類型，可任選地為免疫球蛋白恆定重鏈4(CH4)結構域。在一更優選的實施例中，免疫球蛋白Fc區缺失至少一個免疫球蛋白恆定重鏈1(CH1)結構域。儘管免疫球蛋白Fc區可以基於任意一類免疫球蛋白，例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，但優選基於IgG的免疫球蛋白Fc區。
本發明的核酸可以可操作的方式插入到可複製的表達載體，其後將該表達載體導入感受態的哺乳動物宿主細胞以生產基於幹擾素-α的融合蛋白。所合成的基於幹擾素-α的融合蛋白可以有效地生產並從哺乳動物宿主細胞中分泌出來。所分泌的基於幹擾素-α的融合蛋白可在無需裂解哺乳動物細胞的情況下從培養基中收集。然後，可以分析所得蛋白產物的活性和/或依需求用常規試劑純化所得蛋白產物，和/或從融合配體上切割蛋白產物，以上均應用常規技術。
另一方面本發明提供包含幹擾素-α的融合蛋白。本發明的融合蛋白表現出比天然的幹擾素-α改善了的生物學特性，例如溶解性提高，血清中的半衰期延長和與其受體結合率提高了。這些特性可能顯著地提高干擾素-α的臨床效果。在一優選實施例中，該融合蛋白由N末端到C末端包括免疫球蛋白Fc區和幹擾素-α，及其它元件如蛋白水解的切割位點，可選地插入免疫球蛋白Fc區和幹擾素-α之間。上述融合蛋白優選地在正常的糖基化位點將Fc區糖基化的細胞中合成，這種情況通常存在於模板抗體。
在另一實施例中，融合蛋白可能包含一第二靶蛋白，例如成熟的全長幹擾素-α或其中的生物活性片段。在這種類型的構建體中第一及第二靶蛋白可以是相同的也可以是不同的。第一及第二靶蛋白可以或直接或由多肽接頭相互連接在一起。或者，兩靶蛋白均直接或通過多肽接頭與免疫球蛋白Fc區相連接。在後一種情況中，第一靶蛋白可以連接到免疫球蛋白Fc區的N末端，而第二靶蛋白可以連接到免疫球蛋白Fc區的C末端。
在又一實施例中，兩融合蛋白共價地，例如通過二硫鍵，多肽鍵或交聯劑，或非共價地連接，產生嵌合蛋白。在一優選實施例中，兩融合蛋白通過一個或更優選兩個由半胱氨酸殘基的鏈間二硫鍵共價連接，優選定位於排列於每條鏈上免疫球蛋白Fc區中的免疫球蛋白鉸鏈區內。
本發明的再一個目的是提供多價的和多聚體形式的幹擾素-α融合蛋白及其組合。
另一方面本發明提供製造包含免疫球蛋白Fc區和靶蛋白的融合蛋白的方法。該方法包括下述步驟(a)提供含帶有或不帶有信號序列的編碼所述融合蛋白的DNA分子的哺乳動物細胞，和(b)培養該哺乳動物細胞生產融合蛋白。其後收集所得的融合蛋白，重摺疊，若需要可用本領域技術人員所知的常規純化技術純化所得蛋白。若融合蛋白包含插在免疫球蛋白Fc區和靶蛋白之間的蛋白水解酶切割位點，則靶蛋白可以用常規的蛋白水解酶從融合蛋白上切割下來，如需要可在使用前進行純化。
再一個方面，本發明提供通過對哺乳動物施用使用本發明的方法和/或融合結構來生產有效量的幹擾素-α，來治療由幹擾素-α或其活性變體所緩解的狀態的方法。本發明還提供治療由幹擾素-α或其活性變體所緩解的狀態的方法，該方法通過對具有該狀態的哺乳動物施用本發明的核酸，例如「裸DNA」或包含本發明DNA或RNA的載體來進行。
在優選實施例中，本發明的構建體能夠用於肝臟紊亂的治療，其中幹擾素-α通過免疫球蛋白Fc區定位於肝臟內。本發明的構建體對於治療包括但不限於病毒性疾病例如B肝，C肝或丁肝，肝癌及定位於肝臟的包含轉移瘤的其它類型的癌症的治療特別有用。
本發明的上述和其它目的，特徵和有益之處通過下面的描述，附圖和權利要求清楚地說明。
附圖簡述

圖1A-1C是非局限性的幾個依照本發明構建的融合蛋白的例子的圖解說明。
圖2是表明注射了Daudi細胞懸液後用huFc-huIFN-α處理的SCID小鼠組的存活曲線的圖表。第0天對小鼠注射Daudi細胞。第3到8天，8隻小鼠為一組分別注射PBS(鑽石形)，30μg huFc-huIFN-α(叉形)或60μg huFc-huIFN-α(三角)。
圖3是表明用huFc-huIFN-α處理的SCID小鼠中的Daudi細胞的皮下腫瘤的生長速度的圖表。在處理前約4周，小鼠經皮下注射Daudi細胞。當注射的Daudi細胞長成200-400mm3的腫瘤時，將小鼠每8隻為一組分開，分別注射PBS(鑽石形)，含30μg huFc-huIFN-α的PBS(方塊)或含60μg huFc-huIFN-α的PBS(三角)，處理6天。
發明詳述許多病症可以通過施用幹擾素-α得以緩解。例如，前面所討論的幹擾素-α2a和2b(商業名稱分別為Roferon和Intron A)已應用於對慢性B型肝炎，C型肝炎和丁型肝炎(威脅生命的病毒性肝臟疾病)，尖銳溼疣(生殖器的疣)，愛滋病相關的卡波西肉瘤，毛細胞白血病，惡性黑色素瘤，基底細胞癌，多發性骨髓瘤，腎細胞癌，皰疹I和II，水痘/皰疹帶狀皰疹和蕈狀真菌病。而且提高干擾素-α對前列腺癌和慢性粒細胞性白血病的治療效果也已有相關的研究。
對於肝炎的治療，例如具有在肝臟中濃縮的幹擾素-α的形式可能特別有用。這種方式下，幹擾素-α在其它組織中的濃度可以降到最低，從而減小副作用。肝組織是清除可溶性的免疫複合物的主要部位，且肝臟的巨噬細胞(枯否細胞(Kupffer cells))上有很多Fc受體(Benacerraf，B.etal.(1959)J.IMMUNOL.82131 Paul，W.E.(1993)FUNDAMENTALS OFIMMUNOLOGY，3rded.ch.5113-116)。因此，將幹擾素-α與免疫球蛋白Fc區融合後，該幹擾素-α分子比不帶有免疫球蛋白Fc區的相同幹擾素-α分子對肝組織有更好的定向性。IgG型的抗體中與Fc受體具有最強親和力的是IgG1。但相反地，象IgG4對Fcγ受體I的親和力要低將近10倍。(Anderson and Abraham(1980)J.IMMUNOL.1252735；Woof etal.(1986)MOL.IMMUNOL.23319)。當IgG1的FcγI置於配體的C末端時，可以介導對表達該配體受體的細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。而且，當IgG1的FcγI置於配體的C末端時，可以介導直接對表達該配體受體的細胞的C1q結合和補體結合。
相反，IgG1，IgG4不能有效地結合補體。由此有人提出將幹擾素-αN末端與IgG4的Fc區C末端相融合(Chang，T.W.et al.，U.S.PatentNo.5,723,125)。但是IgG4的Fc區C末端從Fab區分離出來後，IgG4的Fc與補體結合的同時也與IgG1的Fc區結合(Isenman，D，E.etal.，(1975)J.IMMUNOL.1141726)。根據這一結果以及IgG1和IgG4的Fc區非常相似的事實，不考慮理論上的結合，可以預見由於連接IgG4Fab和Fc區的鉸鏈區比IgG1的鉸鏈區短，所以IgG4的Fab區在空間上阻礙C1q結合和補體結合。如果IgG4的龐大的Fab區被象幹擾素-α這樣的小分子所替換，幹擾素-α與Fc區由靈活的接頭連接起來，可以預見，這樣的幹擾素-α-Fcγ4融合體與帶有幹擾素-α受體的細胞相結合時可以結合補體。
由於細胞素N末端與Fc區融合而產生的細胞毒性作用是眾所周知的。例如白細胞介素-2(IL-2)與Fc區C末端融合而產生的分子能夠結合補體，並能引起帶有IL-2受體的細胞溶解(Landolfi，N.G.，U.S.PatentNo.3,349,053)。
Fc區置於配體的N末端的融合(稱為『免疫融合』或『Fc-X』融合，其中X是配體，例如幹擾素-α)有許多突出的有益的生物學特性(Lo et al.，U.S.Patent Nos.5,726,044和5,541,087；Lo etal.(1998)PROTENIN ENGINEERING 11495)。具體說來，這種融合蛋白仍可以結合到細胞表面的相關Fc受體上。但是，當配體與細胞表面的受體相結合時，Fc區的方向改變了，介導ADCC和補體結合的序列即被阻隔起來。結果使得Fc-X分子的Fc區不能有效地介導ADCC或補體結合作用。這樣Fc-X融合體可望具有延長血液中的半衰期和提高其在肝臟中的相對濃度的作用，而僅有由ADCC和補體結合引起的微小不良效果。
本發明中的Fc-X結構的一個特點是其濃縮了靶蛋白，在這裡指肝臟中的幹擾素-α。γ1和γ3鏈的Fc區表現出與Fc配體最強的親和性，γ4鍊表現出略低的親和性，而γ2鏈與Fc配體的親和性最低。據此，γ1和γ3鏈的Fc區特別適用於本發明的Fc-X結構，因為它們與Fc受體具有最高的親和性，因而可以把幹擾素-α優先地導向肝組織。與X-Fc蛋白形成對照，例如擾素-α-Fc蛋白，其在肝臟中濃度上的潛在優勢必定是通過該蛋白能介導直接對帶有擾素-α受體的細胞的效應物功能，即ADCC和補體結合來平衡的。
由於本發明提供編碼包含免疫球蛋白Fc區和至少一種靶蛋白的融合蛋白，這裡指幹擾素-α，的核酸序列和確定上述融合蛋白的胺基酸序列。圖1A-1C描述了三個可仿效的蛋白結構的實施例，由此使本發明具體化。由於優選二聚體結構，因此全部描述為由相鄰亞單位中的半胱氨酸之間的一對二硫鍵相交聯的二聚體。在附圖中二硫鍵描述為通過每一條重鏈中的免疫球蛋白鉸鏈區使兩免疫球蛋白重鏈Fc區連接在一起，而這是這些分子的天然形式的特徵。儘管包含Fc鉸鏈區的結構是優選的而且有望作為治療劑，本發明預見到，根據需要也可以選擇在其它位置的交聯。而且，在某些條件下，在本發明的實施中有用的二聚體和多聚體可能是由非共價連接產生的，例如通過氫鍵之間的相互作用。由於同源二聚體結構是本發明的重要實施例，附圖中即介紹了這樣的結構。可以理解，異源二聚體在本發明的實施中也是有用的。
圖1A描述了依照這裡所闡述的原理生產的二聚體結構(參見，例如實施例1)。每個同源二聚體的單體包括含鉸鏈區的免疫球蛋白Fc區1，CH2結構域和CH3結構域。通過多肽鍵直接附加到Fc區C末端的是擾素-α2。應當理解Fc區可以通過多肽接頭附加到靶蛋白上(未示出)圖1B和圖1C描述了本發明的蛋白結構，其中包括靶蛋白和兩個以上擾素-α蛋白串聯排列並由接頭相連接。在圖1B中，靶蛋白包括全長的擾素-α2，由甘氨酸和絲氨酸殘基4構成的多肽接頭，和有活性的擾素-α3變異體。與圖1B中的結構不同，圖1C中多數C末端蛋白結構域包括第二個全長幹擾素-α2拷貝。儘管圖1A到1C代表Fc-X結構，其中X是靶蛋白，可以預見對本發明有用的蛋白也可以呈現為X-Fc-X的形式，其中X’s可代表相同或不相同的靶蛋白。
此處所用到的術語「多肽接頭」是指將兩個在天然狀態下非自然相連的兩個蛋白連接在一起的多肽序列。多肽接頭優選地包含多種胺基酸，例如丙氨酸，甘氨酸和絲氨酸或其他胺基酸的組合。優選地，該多肽接頭包括一系列的甘氨酸和絲氨酸肽，長度約為10-15個殘基。參見，例如U.S.Patent No.5,258,698。可以預見，最佳的接頭長度和胺基酸組成取決於日常的實驗情況。
這裡所用的術語「多價的」指由兩個或多個生物活性片段合併在一起所組成的重組分子。形成多價分子的蛋白片段任選地可以通過多肽接頭相連接，該多肽接頭將各組分連接在一起並使其各自在功能上相互獨立。
這裡所用的術語「二價的」指具有Fc-X或X-Fc構型的多價重組分子，其中X使靶分子。免疫球蛋白Fc區可以通過例如鏈間二硫鍵相交聯，產生如圖1所示的結構類型。如果本發明的融合結構具有Fc-X-X的構型，所得的Fc分子如圖1C所示。兩個靶蛋白可以通過多肽接頭相連接。圖1A所示的結構類型可以提高靶分子和其受體之間的表面結合親和力。
這裡所用的術語「多聚體的」指或共價地，例如通過共價相互作用如二硫鍵，或非共價地，例如通過氫鍵相互作用穩定地相互連接的兩個或多個多肽鏈。術語多聚體既包括其中的亞基相同的同源多聚體，也包括其中的亞基不相同的異源多聚體。
這裡所用的術語「二聚體的」指特定的多聚體分子，其中的兩個多肽鏈通過共價地或非共價地相互作用穩定地連接在一起。這樣的結構在圖1A中由圖示方式示出。應當理解，包含至少一部分鉸鏈區的免疫球蛋白Fc區，CH2結構域和CH3結構域典型地形成二聚體。已知許多蛋白配體與作為二聚體其受體相結合。由於二聚體化過程是濃度依賴性的，所以，如果蛋白的配基X天然地二聚體化，Fc-X分子中的X元件將在更大程度上二聚體化。由Fc連接的兩個X元件的自然接近可導致二聚體化成為分子內過程，顯著地使平衡向著有利於二聚體的方向移動，加強其與受體的結合。
此處所用術語「幹擾素-α」不僅指全長的成熟幹擾素-α例如人幹擾素-α1(SEQ ID NO8)，人幹擾素-α2(SEQ ID NO9)，人幹擾素-α4(SEQ ID NO10)，人幹擾素-α5(SEQ ID NO11)，人幹擾素-α6(SEQ ID NO12)，人幹擾素-α7(SEQ ID NO13)，人幹擾素-α8(SEQ ID NO14)，人幹擾素-α10(SEQ ID NO15)，人幹擾素-α14(SEQ ID NO16)，人幹擾素-α16(SEQ ID NO17)，人幹擾素-α17(SEQ ID NO18)，人幹擾素-α21(SEQ ID NO19)，人幹擾素-δ1(SEQ ID NO20)，II-1(幹擾素-ω1)(SEQ ID NO21)；和小鼠幹擾素-α1(SEQ ID NO22)，小鼠幹擾素-α2(SEQ ID NO23)，小鼠幹擾素-α4(SEQ ID NO24)，小鼠幹擾素-α5(SEQ ID NO25)，小鼠幹擾素-α6(SEQ ID NO26)，小鼠幹擾素-α7(SEQ ID NO27)，小鼠幹擾素-α8(SEQ ID NO28)，小鼠幹擾素-α9(SEQ ID NO29)還包括變異體和其中的生物活性片段。已知的幹擾素-α序列可以從GenBank中找到。
術語生物活性片段是指由實施例4中的細胞增生抑制分析確定的具有SEQ ID NO2所示的模板人幹擾素-α生物活性的至少50％，優選至少70％，最優選至少90％的任何幹擾素-α蛋白片段。術語變異體包括種和等位基因變異體，及其他自然存在或非自然存在的變異體，例如由遺傳工程方法產生的，它們與在SEQ ID NO2中公開的成熟人幹擾素-α蛋白有至少70％的相似性或60％的同一性，優選至少75％的相似性或65％的同一性，最優選至少80％的相似性或70％的同一性。
為確定備選多肽與參考多肽是否具有所需的相似性或同一性百分比，需要首先將被選胺基酸序列與參考胺基酸序列用Smith和Waterman在J.MOL.BIOL.147195-197(1981)中所描述的動態程序算法，結合如圖2中所描述的BLOSUM62替換矩陣(Henikoff和Henikoff(1992)「源於蛋白封閉的胺基酸替換矩陣」PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 8910915-10919)進行對比。對本發明合適的gap插入罰分是-12，合適的gap延伸罰分是-4。應用Smith和Waterman的算法和BLOSUM62矩陣進行對比的電腦程式，例如GCG程序組(Oxford Molecular Group，Oxford，England)，是可商購的且已為本領域的技術人員所廣泛使用。
將備選序列與參考序列進行對比後，即可計算相似值的百分比。每一序列的單個胺基酸依照它們彼此之間的相似性繼續比較。如果相應於相比較的兩個胺基酸在BLOSUM62矩陣中的值為0或負數則配對方式的相似值是0；否則配對方式的相似值是1.0。相對比的胺基酸的配對方式相似值相加的總和為粗相似值。粗相似值被備選的或參考胺基酸中較小的一個的胺基酸數所除使粗相似值正常化。正常化的粗略值是百分相似值。換言之，為計算同一性百分比，每一序列相對比的胺基酸再次繼續比較。如果胺基酸是非同一的，配對方式同一值是0；否則配對方式同一值是1.0。同一性對比的胺基酸的的總和為粗同一值，粗同一值被備選的或參考序列中較小的一個的胺基酸數所除使粗同一值正常化。正常化的粗略值是百分同一值。為計算百分相似性和同一性忽略插入和缺失。據此，儘管gap創建罰分用於起始的對比中，但沒有應用於這一計算之中。
變異體也可以包括其它具有幹擾素-α樣活性的幹擾素-α突變體蛋白。種和等位基因變異體包括但並不限於人和小鼠幹擾素-α序列。人幹擾素-α變異體在SEQ ID NOS8-21中示出，小鼠的幹擾素-α變異體如SEQ ID NOS22-29所示。
而且幹擾素-α序列可以包括全部或部分如SEQ ID NO7所示的共有序列，其中的幹擾素-α具有至少50％，優選至少70％，最優選至少90％的如SEQ ID NO2所示的成熟人幹擾素-α的生物活性，此由實施例4中的細胞增生抑制分析確定。
這些蛋白具有非常相似的純化特性和其它生物學特性。具體指，DNA操作，融合蛋白表達，Fc-幹擾素-α蛋白的融合蛋白純化特性極為相似。例如人幹擾素-α2a和幹擾素-α2b僅存在一個胺基酸不同，而人幹擾素-α2a有一個賴氨酸殘基，在相同的位點上幹擾素-α2b有一個精氨酸殘基。人幹擾素-α2a和幹擾素-α2b具有非常相似的特性，對所有已知目的均可相互替換。
幹擾素-α的三維結構已由X射線晶體學研究所揭示出來(Ramaswamy et al.(1986)STRUCTURE 41453)。幹擾素-α蛋白的序列非常相似，以至於已確定的結構被視為整個蛋白家族的結構。與幹擾素-β相似，幹擾素-α的三維結構是在其二聚體界面上有一鋅離子的二聚體。但是在溶液中幹擾素-α以單體形式存在。據推測，與白細胞介素IL-6和其它蛋白配基相似，幹擾素-α在與受體結合時會發生二聚體化。(Radhakrishnan，R.et al.(1996)STRUCTURE 41453；Karpusas，M.etal.(1997)PROC.NAT.ACAD.SCI.USA 9411813)。
配基的二倍體化可以提高配基和其受體的表面結合親和力。例如如果Fc-幹擾素-α融合蛋白的一個幹擾素-α元件能以特定的親和力與細胞上的受體相結合，同一個Fc-幹擾素-α融合蛋白的第二個幹擾素-α元件可以以更高的親合性(表面親和力)結合到同一個細胞的第二個受體上。這是由於在第一個Fc-幹擾素-α元件結合上後，第二個Fc-幹擾素-α元件與受體自然接近而發生的。當抗體與抗原相結合時，表面親和力可以提高至少10×1000倍，即104。每一個蛋白亞基，即「X」有其獨立的功能，因此在多價分子中蛋白亞基的功能相疊加或相協同。這樣正常二聚體Fc分子與幹擾素-α的融合可以增強幹擾素-α的活性。由此，如圖1A所示類型的構建體可以增強幹擾素-α和其受體之間的表面結合親和力。
此處所公開的靶蛋白作為與免疫球蛋白Fc區的融合蛋白表達。已知，每一免疫球蛋白重鏈恆定區包括四或五個結構域。該結構域如下順次命名為CH2-鉸鏈區-CH2-CH3(-CH4)。重鏈結構域的DNA序列在免疫球蛋白類別中有交叉的同源性，例如IgG的CH2結構域與IgA和IgD的CH2結構域，和IgM和IgE的CH3結構域同源。
此處所用到的術語「免疫球蛋白Fc區」指免疫球蛋白鏈恆定區，特別是免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端或其中的一部分。例如免疫球蛋白Fc區可能包括1)CH1結構域，CH2結構域和CH3結構域，2)CH1結構域和CH2結構域，3)CH1結構域和CH3結構域，4)CH2結構域和CH3結構域，或5)兩個或更多結構域與免疫球蛋白鉸鏈區的組合。在一優選實施例中免疫球蛋白的Fc區包括至少一個免疫球蛋白鉸鏈區，一個CH2結構域和一個CH3結構域，優選缺少CH1結構域。
目前優選的免疫球蛋白類別中其重鏈恆定區源於IgG(Igγ)(γ亞類1，2，3或4)。人Fcγ-1的核酸和胺基酸序列已在SEQ ID NOS3和4中列出。其它免疫球蛋白類別，IgA(Igα)，IgD(Igδ)，IgE(Igε)和IgM(Igμ)也可以使用。在U.S.Patent Nos.5,541,087，和5,726,044中詳細討論了對合適的免疫球蛋白重鏈恆定區的選擇問題。從特定的免疫球蛋白類別和亞類中選擇特定的免疫球蛋白重鏈恆定區序列以獲得特定的結果是在本領域技術人員所掌握的範圍之內的。編碼免疫球蛋白Fc區DNA構建體的一部分優選至少包括部分鉸鏈區結構域及優選至少包括Fcγ的CH3結構域或IgA，IgD，IgE，或IgM的任意一種的同源區域。
根據本申請，源於非人的種，例如小鼠或大鼠的恆定區基因也可以使用。一般在DNA構建體中作為融合部分的免疫球蛋白Fc區大致可以源於任何哺乳動物種。如果不希望在宿主細胞或動物中地誘導出對Fc區的免疫應答，則該Fc區可用源於與宿主細胞或動物的同種Fc區。例如，當宿主動物或細胞是人時，可用人免疫球蛋白Fc區；同樣的當宿主動物或細胞是小鼠時可用鼠免疫球蛋白Fc區。
實施本發明有用的編碼人免疫球蛋白Fc區的核酸序列和確定上述蛋白的胺基酸序列列於SEQ ID NOS3和4中。但可以預見完全可能發現對實施本發明有用的其它免疫球蛋白Fc區，例如那些由Genbank和/或EMBL資料庫中所公布的核酸序列編碼的序列，例如AF045536.1(Macaca fuscicularis)AF045537.1恆河猴(Macaca mulatta)，AB016710野貓(Felix catus)，K00752(Oryctolagus cuniculus)，U03780豚(Sus scrofa)，Z48947單駝峰(Camelus dromedarius)，X62916牛(Bos taurus)，L07789(Mustela vison)，X69797綿羊(Ovis aries)，U17166(Cricetulus migratorius)，X07189(Rattus rattus)，AF57619.1(Trichosurus vulpecula)或AF035195(Monodelphis domestica)，以上公布內容引入此處作為參考。
而且，可以預見在免疫球蛋白重鏈恆定區的內的胺基酸的替換和缺失可能對實施本發明有用。一個實施例可能包括在CH2區上遊引入替代胺基酸從而產生對Fc受體的親和力降低了的Fc變異體(Cole etal.(1997)J.IMMUNOL.1593613)。本領域的技術人員用已知的分子生物學技術能夠製備這樣的構建體。
用人Fcγ1作為Fc區序列有幾個好處。例如，如果該Fc融合蛋白用於生物製藥，Fcγ1結構域可以賦予融合蛋白效應物功能活性。所述效應物功能活性包括生物活性，例如胎盤轉移和延長血清中的半衰期。免疫球蛋白Fc區也可用於由抗Fc的酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測和通過與金黃色葡萄球菌蛋白A(「Protein A」)結合的純化。在特定的用途中，可能需要缺失源於免疫球蛋白Fc區的特定的效應物功能，例如Fc受體結合和/或補體結合功能。
本發明開發了生成對實施本發明有用的Fc融合蛋白的常規的重組DNA方法學。該Fc融合構建體優選地是在DNA水平產生的，所得的DNAs整合進表達載體，表達，產生本發明的融合蛋白。此處所用到的術語「載體」是指包括能摻入宿主細胞，經重組整合進宿主細胞基因組的核酸序列，或作為附加體自我複製的核酸序列的核酸分子。這樣的載體包括線性核酸，質粒，噬菌粒，粘粒，RNA載體，病毒載體之類。非限制性的病毒載體的例子包括反轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。這裡所用的術語「基因表達」或靶蛋白的「表達」是指DNA序列的轉錄，mRNA轉錄物的翻譯和Fc融合蛋白產物的分泌。
pdCs是有用的表達載體(Lo et al.(1988)PROTEIN ENGINEERING11495，)其中Fc-X基因的轉錄利用人巨細胞病毒的增強子/啟動子和SV40的聚腺苷酸化信號。所用的人巨細胞病毒的增強子和啟動子序列是源於Boshart et al(1985)CELL 41521中公開的序列中第-601位到+7位的核苷酸。該載體還包括突變的二氫葉酸還原酶作為選擇標記(Simosen和Levinson(1983)PROC.NAT.ACAD.SCI.USA 802495)合適的宿主細胞可用本發明的DNA序列轉化或轉染，並用於表達和/或分泌靶蛋白。目前在本發明中優選使用的宿主細胞包括無限增殖的雜交瘤細胞，NS/O骨髓瘤細胞，293細胞，中國倉鼠卵巢細胞，HELA細胞和COS細胞。
一個用於在哺乳動物細胞中生產高水平表達的融合蛋白的表達系統是一DNA構建體其由5』到3』方向編碼分泌盒，包括信號肽序列和免疫球蛋白Fc區及靶蛋白。已有幾種靶蛋白在上述系統中成功地表達，例如IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，βIG-H3，IgE受體，PSMA，和gp120。這些表達構建體由Lo et al在U.S Patent Nos 5,541,187和5,726,044中公開。
這裡所用到的術語「信號序列」是指在宿主細胞中指導幹擾素α融合蛋白分泌並在翻譯後被切除的片段。本發明的信號序列是多核苷酸，該多核苷酸編碼引發蛋白轉運穿過內質網膜的胺基酸序列。本發明中有用的信號序列包括抗體的輕鏈信號序列，例如抗體14.18(Gillieset.al.(1989)J.IMMUNOL.METH.125191)，抗體的重鏈信號序列，例如MOPCI41，抗體重鏈信號序列(Sakano et al.(1980)NATURE 2865774)，和本領域所知的任何其它信號序列。(參見例如Watson(1984)NUCLEIC ACIDS RESEARCH 125145)。
已知本領域中已深入了解的信號序列典型地包含16到30個胺基酸殘基，但也可以包含更多或更少的胺基酸殘基。典型的信號肽包含三個區鹼性的N末端區，中間的疏水區和極性較強的C末端區。中間的疏水區包含4到12個胺基酸殘基，其在新生多肽轉運過程中將信號肽錨定於脂雙層膜。起始後信號肽通常在內質網腔內由被稱為信號肽酶的細胞酶切割掉。信號肽的潛在切割位點一般遵循「(-3，-1)規則」。這樣典型的信號肽序列在-3和-1位點具有小的中性的胺基酸，並且這一區域缺少脯氨酸殘基。信號肽酶可以在-1和+1位胺基酸殘基之間切割信號肽。這樣在分泌過程中信號肽序列可以從融合蛋白的氨基末端切除。從而使包含免疫球蛋白Fc區和靶蛋白的Fc融合蛋白分泌出來。vonHeijne(1986)NUCLEIC ACIDS RES.144683對有關信號肽序列進行了詳細的討論。
對本領域的技術人員來說顯而易見，在分泌盒使用特定的信號肽序列是否適合是需要通過常規的實驗來確定的。這樣的實驗將包括確定指導Fc融合蛋白分泌的信號肽的能力，確定為使Fc融合蛋白有效分泌的序列理想的構型，基因組DNA或cDNA，。另外，本領域的技術人員可以參照上述von Heijne的資料來製造合成的信號肽，並通過常規的實驗來檢驗這樣合成的信號肽序列的效率。信號序列也可以指「信號肽」「引導序列」或「引導肽」。
信號序列和免疫球蛋白Fc的融合體在此處有時稱為分泌盒。沿5』到3』方向編碼免疫球蛋白輕鏈基因的信號肽序列及人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1區的多核苷酸是在實施本發明中可仿效的有用的分泌盒。人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1區優選地至少包括部分免疫球蛋白鉸鏈區和至少CH3結構域，或更優選地至少包括部分鉸鏈區結構域和CH2及CH3結構域。此處所用的術語「部分」免疫球蛋白鉸鏈區的是指免疫球蛋白鉸鏈區的一部分，其包含至少一個，優選兩個能夠形成鏈內二硫鍵的半胱氨酸殘基。編碼分泌盒的DNA可以是其基因組構型或其cDNA構型。在特定的條件下，有利於生產源於人免疫球蛋白Fcγ2重鏈序列的Fc區。儘管基於人免疫球蛋白γ1和γ2序列的Fc融合體在小鼠中起相似的作用，但基於γ2序列的Fc融合體在人體中表現出更強的藥物動力學作用。
在另一實施例中，編碼蛋白水解切割位點的DNA序列插入在分泌盒和靶蛋白之間。所編碼的融合蛋白中提供蛋白水解切割的切割位點將Fc區與靶蛋白分開。此處所用到的術語「蛋白水解切割位點」是指優選地由蛋白水解酶或其他蛋白水解切割物切割的胺基酸序列。有用的蛋白水解切割位點包括可由蛋白酶例如，胰蛋白酶，纖維蛋白溶酶，腸肽酶K所識別的胺基酸序列。許多成對的切割位點/切割物是已知的(參見例如，U.S.Patent No.5,726,044)。
而且這些恆定區構建體的替換和缺失也是有用的，其中所述恆定區結構域的一個或多個胺基酸殘基可被替換或缺失。一個實施例中在CH2區的上遊引入胺基酸的替換產生了對Fc受體親和力降低了的Fc變異體(Cole et al.(1997)J.IMMUNOL.1593613)。本領域的技術人員可以用已知的分子生物學技術來製備這樣的構建體。
在此處所公開的實施例中生產出了高水平的Fc-幹擾素-α。起始克隆可生產50μg/mL的Fc-幹擾素-α，其可由蛋白A親和層析純化到均質。通過亞克隆通常可將表達水平提高數倍。如上所述，當幹擾素-α作為Fc融合分子表達時，可獲得高表達水平，估計是由於Fc部分作為載體輔助C末端的多肽正確摺疊並高效分泌。而且，Fc區是糖基化的並在生理pH下帶有大量電荷，因此Fc區有助於溶解疏水蛋白。
除了表達水平高外，與單獨的幹擾素-α相比，幹擾素-α融合蛋白在血清中還表現出長的半衰期，這部分歸因於其較大的分子量。例如Fc-幹擾素-α在小鼠中具有19.3小時的循環半衰期(參見實施例6)相比之下，幹擾素-α的半衰期只有2-5小時(PHYSICIANS DESKREFERENCE，50thedition，19962156-2147和2364-2373)。幹擾素-α分子量約為19kD，小到足以通過腎過濾來有效地清除。相反，由於有兩個幹擾素-α元件附加到每個Fc分子上Fc-幹擾素-α的分子量約為100kD，(即Fc分子為二聚體形式因而有兩個幹擾素-α，)這樣的二聚體結構可對幹擾素-α受體表現出高結合親和力。由於幹擾素-α的活性是受體介導的，二價的幹擾素-α融合蛋白潛在地較幹擾素-α本身更為有效。
另外，已知許多蛋白配體以二聚體的形式結合到其配體上。由於幹擾素-α屬於具有弱二聚體化常數的蛋白配體類別，通過Fc與幹擾素-α結合所形成的生理上約束使得二聚體化成為一個分子內過程，使平衡向二聚體移動進而加強其與受體的結合。半胱氨酸殘基也可以通過標準的重組DNA技術引入到單體的適當位置上，通過形成二硫鍵使二聚體穩定。
本發明的融合蛋白有數項在臨床上有益的作用。在Daudi細胞中進行的生物活性檢驗和細胞病變效果分析(實施例4)的結果表明Fc-幹擾素-α的生理活性顯著高於幹擾素-α的生理活性。
本發明的另一實施例提供了具有多種結構構象的構建體，例如二價或多價的構建體，二聚體和多聚體的構建體或其組合。本發明分子的這些功能性構象使幹擾素-α和其它將在動物模型中開發的抗病毒和抗癌蛋白產生協同效應。
本發明的一個重要的方面是各種幹擾素-α蛋白的序列和特性以及編碼DNA都非常相似。在Fc-X融合蛋白的組分中幹擾素-α蛋白的特性和編碼DNA本質上是同一的，所以可用常規的技術來生產任何Fc-幹擾素-αDNA融合體，表達該融合體，純化融合蛋白，進而將融合蛋白用於治療目的。
本發明還提供生產作為Fc融合蛋白的非人種的幹擾素-α的方法。因為在施用於人體前蛋白藥物的效果和毒性研究必須要在動物模型系統中進行檢驗，所以非人的幹擾素-α蛋白可用於幹擾素-α的前臨床研究。由於蛋白可能引起免疫應答，和/或表現出不同藥物動力學性質，使檢測結果發生偏移，所以人蛋白可能在小鼠模型中不起作用。因此，小鼠蛋白等效物是在小鼠模型中進行檢測的最好的人蛋白替代物。
本發明提供通過對具有相關病症的哺乳動物施用本發明的DNA，RNA或蛋白以治療各種癌症，病毒性疾病，及具有相關的病症和病因的其它疾病的方法。相關的病症可能包括，但並不限於B型肝炎，C型肝炎和丁型肝炎，生殖器的疣，毛細胞白血病，愛滋病相關的卡波西肉瘤，黑素瘤，前列腺癌和其它形式的病毒性疾病和癌症。鑑於幹擾素-α對調節免疫應答具有廣泛的用途，本發明還提供治療可通過施用幹擾素-α來緩解的病症的方法。這些方法包括，對具有是或不是與病毒感染或癌症直接相關的病症的哺乳動物，施用有效劑量的本發明的組合物。
本領域的技術人員可以認識到，本發明的蛋白不僅可以用作治療劑而且可以用於生產有治療作用的抗體。同樣的，適當地施用所述DNA或RNA，例如在載體中或其它作上述用途的運載系統中也包括在使用本發明的方法的範圍內。
作為帶有免疫球蛋白Fc的融合蛋白，Fc-幹擾素-α有非常適宜的組織分布和為達到臨床效果稍有不同的作用方式，特別是考慮到其長血清半衰期和可施用的可溶蛋白的高劑量。具體說來，在肝臟中有高水平的Fcγ受體，其是引起乙型和丁型肝炎病毒的侵染位點。考慮到幹擾素-α由於分子量小可以穿過血腦屏障，因此可引起神經病學上的副作用。分子量大大增加的Fc-幹擾素-α可以顯著減少這一蛋白穿越血腦屏障的程度。
本發明的組合物可以通過與特定的分子相容的任意一種途徑來使用。可以預見本發明的組合物可以以任意一種合適的方式，直接地(例如局部地，通過注射，移植或對組織位點的局部處理)或系統地(非腸道地或口服地)施用於動物。通過非腸道地方式例如靜脈內的，皮下的，眼用的，腹膜內的，肌內的，口腔的，直腸的，陰道的，眼眶內的，大腦內的，顱內的，脊柱內的，心室內的，鞘內的，腦池內的，囊內的，鼻內的，或氣霧劑的方式施用本發明的組合物時，該組合物中優選地包括部分含水的，生理上可接受的液體的懸浮液或溶液。這樣，該載體或賦形劑是生理上可接受的，因此除了向患者輸送所需的組合物外，其不會對患者的電解質和/或容量平衡造成不利的影響。試劑的液體介質可以包括正常的生理鹽水。
本發明的DNA構建體(或基因構建體)也可以用作基因治療方案的一部分來輸送編碼幹擾素-α或其融合蛋白構建體的核酸。本發明的特色是用於體內轉染的表達載體和在特定的細胞類型中表達幹擾素-α或其融合蛋白構建體，以重組或增補幹擾素-α的功能。幹擾素-α的表達構建體或其融合蛋白構建體可以用於任何生物學上有效的載體，例如任何在體內可向細胞有效地輸送幹擾素-α基因或其融合蛋白構建體的製劑或組合物。方式包括將被試基因插入病毒載體或重組的細菌或真核質粒，所述病毒載體包括重組的反轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒和單純皰疹病毒-1。每次施用編碼本發明的融合蛋白的核酸的優選劑量是在1μg/m2到10mg/m2的範圍內，更優選20μg/m2到10mg/m2的範圍內，最優選在400μg/m2到4mg/m2的範圍內。可以預見本領域的技術人員用常規的實驗來確定理想的劑量和施用方式是在其能力範圍內的。
每次施用編碼本發明的融合蛋白的優選劑量是在0.1mg/m2到100mg/m2的範圍內，更優選1mg/m2到20mg/m2的範圍內，最優選在2mg/m2到6mg/m2的範圍內。可以預見理想的劑量也依賴於所治療的疾病和所存在的副作用。但可以通過常規的實驗來確定理想的劑量。使用該融合蛋白可以通過定期造影劑團注射，或通過從外部的貯存庫(例如靜脈袋)或內源(例如，從具有生物腐蝕能力的植入物中)連續在靜脈內或腹膜內施用。而且可以預見本發明的融合蛋白也可以與多數具有不同生物功能的分子一起，施用於相關的受體。可以預見本領域的技術人員用常規的實驗來確定融合蛋白和其它分子理想的結合，施用的方式和劑量是在其能力範圍內的。
通過下述實施例對本發明作進一步的描述，但這些實施例不應理解為對本發明的限制。
實施例實施例1.人Fc-人幹擾素-α(huFc-IFN-α)的表達從人外周血單核細胞製備mRNA，然後用反轉錄酶反轉錄。所得的cDNA用作多聚酶鏈式反應(PCR)的模板以克隆並使人幹擾素-αcDNA使其適宜作為人Fc-人幹擾素-α(huFc-IFN-α)融合蛋白表達。正向引物是5』C CCG GGT AAA TGT GAT CTG CCT CAG AC(SEQID NO5)其中序列C CCG GG(XmaI酶切位點)TAAA編碼免疫球蛋白重鏈的羧基端，接下來的序列(黑體)編碼幹擾素-α的N末端。反向引物是5』CTC GAG TCA ATC CTT CCT CCT TAA TC(SEQ IDNO6)編碼幹擾素α的羧基末端序列及其翻譯終止密碼子(反密碼子，TCA)，接下來是一個XhoI位點(CTC GAG)克隆了一個包含517個鹼基對的PCR產物並進行了測序。序列分析結果確證了該PCR產物編碼人幹擾素α適於表達，即在5』末端帶有XmaI酶切位點在3』末端帶有XhoI酶切位點。
表達載體pdCs-huFc-IFN-α是按下述方式構建的。包含人幹擾素αcDNA片段的XmaI和XhoI酶切片段依照Lo et al.(1998)ProteinEngineering 11495中的介紹連接到pdCs-huFc載體的XmaI和XhoI酶切片段上。huFc是人免疫球蛋白γ1的人Fc片段。所得的載體pdCs-huFc-IFN-α用於轉染哺乳動物細胞以表達huFc-IFN-α。
實施例2.蛋白的轉染和表達通過質粒DNA與磷酸鈣共沉澱(Sambrook etal.eds.(1989)」MOLECULAR CLONING-A LABORATORYMANUAL，」Cold Spring Harbor Press，NY)或依製造商的說明用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)進行脂質轉染，以瞬間轉染的方式將質粒pdCs-huFc-IFN-α引入人腎293細胞。
為了獲得穩定的轉染克隆，通過電轉化將質粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/O細胞。簡言之，NS/O細胞在經修飾的添加有10％胎牛血清，2mM穀氨醯胺和青黴素/鏈黴素的Dulbecco氏Eagle’s培養基中生長。用磷酸鹽緩衝液(PBS)將約5×106的細胞洗一次，然後懸浮於0.5mL的PBS中。在基因脈衝比色杯(0.4cm電極間隔，BioRad)中將10μg線性化的質粒DNA與上述細胞一起在冰上保溫10分鐘。用設定在0.25V和500μF的基因脈衝儀(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔。然後讓細胞在冰上復甦10分鐘，接下來將其懸浮於生長培養基中，置於兩個96孔細胞培養板中。穩定的轉染克隆選自在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下能夠生長的克隆，氨甲蝶呤是在轉染後兩天加入的。每隔3天餵細胞2到3次或更多次，抗氨甲蝶呤(MTX)克隆在2到3周內出現。用抗-Fc ELISA分析克隆的上清液(參見實施例3)以鑑定高產克隆。分離高產克隆並使其在含有100nM氨甲蝶呤(MTX)的生長培養基中繁殖。
用凝膠電泳進行常規的定性，Fc融合蛋白在條件培養基中與蛋白A瓊脂糖凝膠相結合(repligen，Cambridge，MA)然後通過含有或不含有2-巰基乙醇的標準蛋白樣品緩衝液中煮沸，將融合蛋白從蛋白A瓊脂糖凝膠上洗脫下來。在SDS聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳後，經考馬斯藍染色可見蛋白帶。由SDS-PAGE結果可知，huFc-huIFN-α的表觀分子量約為52Kd。
為了純化，用磷酸鹽緩衝液(100mM NaH2PO4，pH3，和150mMNaCl)洗脫結合在蛋白A瓊脂糖凝膠上的融合蛋白。洗脫液立即用0.1倍體積的2M Tris-鹽酸鹽pH8中和。
實施例3.ELISA操作用抗-huFcELISA對抗MTX克隆和其它樣品上清液中人的含Fc片段的蛋白產物的濃度進行了鑑定。其步驟詳細描述如下A.包被滴定板用含5μg/mL親和純化的羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)的PBS包被ELISA滴定板，在96孔板(Nunc-Immuno plate Maxisorp)上每孔加入100μL上述包被液。封閉經包被的滴定板在4℃下溫育過夜。然後用含0.05％Tween(Tween20)的PBS洗板4次，再用200μL含1％BSA/1％羊血清的PBS封閉。用封閉緩衝液在37℃下溫育2小時後，再用含0.05％Tween的PBS洗板4次後在紙巾上輕輕拍打使板乾燥。
B.供試樣品與第二抗體的溫育供試樣品用樣品緩衝液(含1％BSA/1％羊血清/0.05％Tween的PBS)適當稀釋。用濃度已知的嵌合抗體(帶有人Fc)製備標準曲線。為製備標準曲線，需在樣品緩衝液中進行一系列的稀釋使標準曲線的範圍在125ng/mL到3.9ng/mL。將稀釋的供試樣品和標準樣品以100μL/孔的量加到滴定板後，將滴定板在37℃下溫育2小時。溫育後用含0.05％Tween的PBS洗板8次。在每一孔中添加100μL第二抗體，與辣根過氧化物酶相連接的抗人IgG(Jackson Immuno Research)，在樣品緩衝液中以約1∶120,000的比例稀釋。需對每一份與辣根過氧化物酶相連接的抗人IgG進行測定來確定第二抗體的精確稀釋度。將滴定板在37℃下溫育2小時，其後用含0.05％Tween的PBS洗板8次。
C.顯色向滴定板中每孔添加100μL底物溶液。通過在含新添加了0.03％過氧化氫的15mL 0.025M的檸檬酸/0.05M Na2HPO4緩衝液，pH 5，中溶解30mgOPD(鄰苯二胺二氫氯化物)(一片)來製備底物溶液。室溫下在暗處顯色30分鐘。顯色時間依所包被滴定板批次，第二抗體等因素的不同而變化。每孔添加100μL 4N硫酸終止反應。用滴定板讀數儀讀數，讀數儀的程序設定在490nm和650nm，從490nm下的OD值中除去650nm下的OD值以消除背景。
實施例4.生物分析huFc-huIFN-α與其中的人幹擾素α((hu-IFN-α)人白細胞幹擾素，Sigma，St.Louis，MO)的生物活性用兩種不同的方法進行了比較。第一種分析確證了Daudi人成淋巴細胞瘤疹B細胞系(ATCC CCL 213)增殖的抑制作用。第二種分析測定了人肺癌A549細胞系(ATCC CCL185)上的腦心肌炎病毒(EMCV)的細胞病變效果的抑制作用。
幹擾素-α抑制Daudi(人伯基特淋巴瘤)細胞。Daudi細胞用無血清的RPMI1640洗兩次，懸浮於包含RPMI1640和20％熱滅活(56℃)胎牛血清的生長培養基中。細胞以1×105cells/mL/孔塗於存在不同濃度的αIFH(2.1×106國際單位/mg)和huFc-huIFN-α的24孔滴定板上。3到4天後，可以發現以huFc-huIFN-α形式存在的50pg/mL IFN-α與750pg/mL的huIFN-α等效地對Daudi細胞具有50-100％的抑制作用。以100ng/mL的IFN-γ(Pharmingen，San Diego，CA)作為對照，其在該分析中不表現活性。這說明上述抑制是幹擾素-α特異性的。
實施例5.抗病毒活性的測定在細胞培養過程中病毒的複製常常造成細胞毒性，一種已知的致細胞病變效應(CPE)，幹擾素能誘導細胞培養物的抗病毒狀態，使細胞不受CPE的影響。抗病毒活性的IFN-α可通過如由M.Clemens，A.G.orris和A.J.H.Gearing，I.R.L.編寫，牛津出版社1987出版的「淋巴因子和幹擾素實用方法」中所描述的致細胞病變效應還原作用CPER分析來定量。用人肺癌細胞系A549(ATCC CCL 185)和腦心肌炎病毒(ATCC VR 129B)依照上述參考文獻中描述的CPER方法來比較了huFc-huIFN-α和huIFN-α的抗病毒活性。提供50％CPER(即50％的保護)的有效劑量為570pg/mL的huFc-huIFN-α(基於幹擾素α的量)和570pg/mL的huIFN-α。據此huFc-huIFN-α和huIFN-α基本上具有等效的抗病毒活性。
實施例6.藥物動力學以4隻Balb/c小鼠為一組對huFc-huIFN-α的藥物動力學進行了鑑定。將25mg的huFc-huIFN-α注射到每隻小鼠的尾靜脈。在注射後立即(即t＝0時刻)，和在注射後0.5，1，2，4，8和24小時通過眶後放血來採血。血樣收集在含肝素的管子裡以防凝血。在Eppendorf高速微量離心機中離心4分鐘去除細胞。用抗-huFc抗體通過抗-huFc ELISA和Western blot測定血漿中huFc-huIFN-α的濃度，結果同時顯示huFc-huIFN-α完整地存在於循環中(huFc-huIFN-α的52kD帶)。未檢測到降解產物(huFc的32kD帶)。據測定huFc-huIFN-α的循環半衰期為19.3小時，這顯著長於已報導的人IFN-α2到5小時的循環半衰期(PHYSICIANS DESK REFERENCE，50thedition，19962145-2147和2364-2373)。
實施例7.在SCID小鼠中對人伯基特淋巴瘤的彌散性生長的治療Daudi細胞(人伯基特淋巴瘤)作為彌散性的腫瘤在C.B-17SCID(嚴重的結合免疫缺陷)小鼠中生長(Ghetie et al.(1990)INT.J.CANCER45481)。在一份0.2mLPBSB單細胞懸浮液中約5×106的Daudi細胞以靜脈內的方式注射6到8周大的SCID小鼠。三天後，將這些小鼠以8隻為一組，隨機地分成三組，每天接受腹膜內注射0.2mL的PBS，含30μg huFc-huIFN-α(包含約12μg的幹擾素α)或含60μghuFc-huIFN-α的PBS。每天監測小鼠。所得結果列於圖2中。
在Daudi細胞注射28天後，在作為對照的PBS組(鑽石形)發展為後腿癱瘓。在這一PBS對照組中的小鼠在第38天時開始表現垂死狀態到第61天全部死亡。相比之下，在治療組中的小鼠存活的時間要長得多，且是以劑量依賴的方式。在接受了30μg huFc-huIFN-α(十叉)的組中，第一隻小鼠死亡出現在第70天，在第134天所有的小鼠才都死亡。在接受了60μg huFc-huIFN-α(三角)的組中，直到第126天才有一隻小鼠死亡，另有四隻在第153天死亡，其餘的小鼠呈病態被處以安樂死。
實施例8.在SCID小鼠中對人伯基特淋巴瘤的定位性生長的治療在這一模型中，Daudi細胞(人伯基特淋巴瘤)作為皮下腫瘤在C.B-17SCID小鼠中生長(Ghetie et al.(1990)INT.J.CANCER45481)。在一份0.1mLPBS單細胞懸浮液中的約6×106的Daudi細胞通過皮下注射於6到8周大的SCID小鼠。當腫瘤長到200-400mm3時開始實施治療，這大約需要4周時間。將這些小鼠以8隻為一組隨機地分成三組，每天接受腹膜內注射0.2mL的PBS，含30μg huFc-huIFN-α(包含約12μg的幹擾素α)或含60μg huFc-huIFN-α的PBS。所得結果列於圖3中。每周測量兩次腫瘤的大小。
在對照組的小鼠中，第35天腫瘤已迅速生長到平均體積為5602mm3(4343-6566mm3)，此後該組中所有的小鼠均被處以安樂死。相比之下，在治療組中的小鼠的腫瘤以劑量依賴的方式受到抑制。在第35天時，接受了30μg huFc-huIFN-α和60μg huFc-huIFN-α的小鼠的腫瘤的平均體積分別為214和170mm3，小於治療前的268和267mm3。事實上，8隻接受了30μg huFc-huIFN-α小鼠中的5隻和8隻接受了60μghuFc-huIFN-α小鼠中的4隻的皮下腫瘤已經完全萎縮了。在沒有進一步治療的情況下，一些腫瘤出現復甦並生長。但是，在本實驗結束時，即直到第205天仍有兩隻小鼠保持沒有腫瘤。
實施例9.用Fc-IFN-α治療肝臟疾病可以預見Fc-IFN-α比IFN-α或IFN-α-Fc對治療肝臟疾病例如，肝炎或肝臟轉移瘤更為有效。
例如可以預見Fc-IFN-α對治療腫瘤細胞轉移到肝臟的小鼠模型有效。在手術前約5分鐘通過腹膜內注射0.2mL含80mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪的PBS使小鼠麻醉。接下來進行的步驟通過層流覆蓋以保證無菌狀態。用聚維酮碘和乙醇清洗每一隻小鼠的皮膚。用27號針在脾臟囊下向腫瘤細胞，例如Daudi細胞，在約一分鐘的時間裡，注射100μl無添加物的RPMI1640培養基。兩分鐘後脾蒂與4.0絲縫相連接，脾臟被清除了。
有些細胞從注射位點運送到肝臟，在那裡它們可以形成轉移瘤。用Fc-IFN-α治療帶有轉移的肝臟腫瘤的小鼠。可以預見相對於IFN-α或IFN-α-Fc融合蛋白，用等摩爾量的Fc-IFN-α治療的小鼠腫瘤生長明顯降低。
而且，可以預見Fc-IFN-α對治療肝臟疾病的特異效果比治療定位於其它組織的疾病的效果更加顯著，在其他組織中Fc-IFN-α不集中。
等價物在不背離本發明的精神或其中的基本特徵的情況下，本發明可以包括其它特定的形式。因此以上實施例在各個方面僅僅是對本發明的闡述而非對本發明的限制。本發明的保護範圍由所提交的權利要求所界定，而非通過上述描述限定，在不超出本發明權利要求的意義和範圍的所有改變均視為已包括在此。
引入參考文獻上文所公開的每一篇科學文章和專利文獻均在此引入作為參考。
序列表110勞健明(Lo，Kin-Ming)孫亞萍(Sun，Yaping)S.D.吉利斯(Gillies，Stephen D.)利思進藥品公司(Lexigen Pharmaceuticals Corp.)120幹擾素-α蛋白作為Fc融合蛋白的表達和運輸130LEX-009 PC140141150US 60/134,8951511999-05-1916029170PatentIn Ver.2.02101211498212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(1)..(498)223人IFNαDNA序列4001tgt gat ctg cct cag acc cac agc ctg ggt aat agg agg gcc ttg ata 48Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1 5 10 15ctc ctg gca caa atg gga aga atc tct cct ttc tcc tgc ctg aag gac 96Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30aga cat gac ttt gga ttc ccc cag gag gag ttt gat ggc aac cag ttc 144Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe35 40 45cag aag gct caa gcc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag acc 192Gln Lys Ala Gln Ala Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr50 55 60ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct act tgg gaa cag agc 240Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65 70 75 80ctc cta gaa aaa ttt tcc act gaa ctt 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Leu Leu Asn Asp Leu85 90 95Gln Gly Cys Leu Met Gln Leu Val Gly Met Lys Glu Leu Pro Leu Thr100 105 110Gln Glu Asp Ser Gln Leu Ala Met Lys Lys Tyr Phe His Arg Ile Thr115 120 125Val Tyr Leu Arg Glu Lys Lys His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val130 135 140Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Val Asn Leu Leu Ala145 150 155 160Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu16權利要求
1.一種編碼融合蛋白的核酸分子，包括(a)信號序列；(b)免疫球蛋白Fc區；和(c)包含幹擾素-α的靶蛋白序列，其中信號序列，免疫球蛋白Fc區和靶蛋白序列沿5』到3』方向順次編碼。
2.如權利要求1所述的核酸，其中免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白的鉸鏈區。
3.如權利要求1所述的核酸，其中免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白的鉸鏈區和免疫球蛋白重鏈恆定區結構域。
4.如權利要求1所述的核酸，其中免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白的鉸鏈區和免疫球蛋白CH3結構域。
5.如權利要求1所述的核酸，其中免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白的鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域。
6.如權利要求5所述的核酸，其中免疫球蛋白Fc區包含部分免疫球蛋白γ序列。
7.如權利要求6所述的核酸，其中免疫球蛋白γ是人免疫球蛋白γ1。
8.一種用於轉染哺乳動物細胞的可複製表達載體，所述載體包含如權利要求1所述的核酸。
9.如權利要求8所述的表達載體，其中所述載體為病毒載體。
10.一種哺乳動物細胞，其中包含權利要求1所述的核酸。
11.一種融合蛋白，從氨基端到羧基端包括免疫球蛋白Fc區和包含幹擾素-α的靶蛋白。
12.如權利要求11所述的融合蛋白，其中的幹擾素-α包含在SEQID NO2，7或8-21所示的胺基酸序列或其種或等位基因變異體。
13.如權利要求11所述的融合蛋白，其中的靶蛋白包括至少兩個由多肽接頭連接的幹擾素-α分子。
14.如權利要求13所述的融合蛋白，其中該蛋白進一步包括將免疫球蛋白Fc區連接到靶蛋白上的多肽接頭。
15.如權利要求11所述的融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白鉸鏈區和免疫球蛋白重鏈恆定區結構域。
16.如權利要求15所述融合蛋白，其中所述的重鏈恆定區結構域包含CH3結構域。
17.如權利要求11所述的融合蛋白，其中所述的免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白的鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域。
18.一種多聚體蛋白，包括至少兩個權利要求11所述的通過共價鍵連接的融合蛋白。
19.如權利要求18所述的蛋白，其中所述共價鍵是二硫鍵。
20.一種生產融合蛋白的方法，包括下述步驟(a)提供如權利要求10所述的哺乳動物細胞；和(b)培養哺乳動物細胞以生產融合蛋白。
21.如權利要求20所述的方法，包括收集融合蛋白的附加步驟。
22.如權利要求20所述的方法，包括純化融合蛋白的附加步驟。
23.如權利要求20所述的方法，包括用蛋白水解酶在位於免疫球蛋白Fc區和靶蛋白之間的蛋白水解酶切割位點將免疫球蛋白Fc區從靶蛋白上切割下來的附加步驟。
24.治療可通過施用幹擾素-α來緩解的疾病的方法，該方法包括將權利要求1所述的核酸施用於具有所述病症的哺乳動物的步驟。
25.治療可通過施用幹擾素-α來緩解的疾病的方法，該方法包括將如權利要求8所述的載體施用於具有所述病症的哺乳動物的步驟。
26.治療可通過施用幹擾素-α來緩解的疾病的方法，該方法包括將如權利要求11所述的融合蛋白施用於具有所述病症的哺乳動物的步驟。
27.治療可通過施用幹擾素-α來緩解的疾病的方法，該方法包括將如權利要求18所述的蛋白施用於具有所述病症的哺乳動物的步驟。
28.如權利要求26所述的方法，其中所述病症為肝臟疾病。
29.如權利要求26所述的方法，其中所述肝臟疾病為肝炎。
全文摘要
本發明公開了編碼免疫球蛋白Fc－IFN－α融合蛋白的核酸序列,例如DNA或RNA序列。所述核酸序列可插入合適的表達載體在哺乳動物細胞中表達。本發明還公開了通過表達上述核酸序列來生產的免疫球蛋白Fc－IFN－α融合蛋白家族。本發明還公開了用上述核酸和/或融合蛋白來治療可通過施用幹擾素－α來緩解的疾病,例如肝炎的方法。
文檔編號A61K35/76GK1361793SQ00810671
公開日2002年7月31日 申請日期2000年5月19日 優先權日1999年5月19日
發明者勞健明, 孫亞萍, S·D·吉利斯 申請人:利思進藥品公司