用於dna介導基因沉默的組合物的製作方法

2023-06-28 16:35:16

專利名稱：用於dna介導基因沉默的組合物的製作方法
背景技術：
發明領域本發明總體上涉及轉錄後基因沉默，特別是涉及DNA介導的通過RNA幹擾進行的轉錄後基因沉默。
背景信息去除一個基因的表達可以提供給研究者有關該基因功能的信息。在蛋白水平這可以通過運用特異性抑制劑抑制蛋白質功能而實現或者在RNA水平通過阻止mRNA翻譯成蛋白質來完成。用於RNA水平抑制的傳統方法包括反義寡核苷酸和核酶。這些抑制基因表達的方法也提供了對人類疾病的潛在治療方法。
新近在mRNA水平沉默基因表達的方法，稱為RNA幹擾或RNAi，已經成為較以前的技術而言非常有力的備選方法。它通過大量未知然而卻比反義機制更加有效的機制起作用。雙鏈RNA(「dsRNA」)參與這種轉錄後基因沉默，轉錄後基因沉默在植物和真菌中是天然存在的現象(Cogoni和Macino，Curr.Opin.Microbiol.6657-62.1999)。當導入蠕蟲、蒼蠅、或早期小鼠胚胎時，dsRNA可誘導降解與dsRNA的一條鏈具相同序列的mRNA的細胞反應(Fire，Trends Genet.9358-363，1999)。在一些系統中，少量dsRNA拷貝能誘導靶mRNA全面降解(Fire等，Nature 6669806-811，1998)。RNAi可與mRNA中幾乎任何序列非常成功高效地作用(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-9747，2001)。
RNAi作為基因功能研究工具非常有前途，如果能夠將其成功地用於哺乳動物細胞或有機體，RNAi則是人類疾病的潛在治療方式。RNAi在大多數哺乳動物系統中基本上是不成功的，這一狀況直到最近由於與用於蠕蟲和果蠅的dsRNA相似的dsRNA的導入，通過有PKR和幹擾素參與的哺乳動物抗病毒系統誘導了基因表達的普遍阻斷而得以改變(Caplen等，Gene 1-295-105.2000；Oates等，Devel.Biol.120-8.2000)。然而，通過使用一個短的21到23個核苷酸的dsRNA，Elbashir等和其他研究者的研究表明小的幹擾RNA(siRNA)能夠降低或敲低(knock-down)特異基因的表達，而不至於引起基因表達的普遍關閉(Caplen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 179742-7.2001；Elbashir等，Nature 6836494-8.2001)。
聚合酶III啟動子的使用能夠有效地在哺乳動物細胞內產生siRNA。例如，象U6啟動子一樣，同樣是聚合酶III的III類啟動子的H 1-RNA啟動子已用於質粒載體中，以直接轉錄出一短的髮夾RNA，隨後該髮夾RNA在細胞內被加工產生siRNA(Brummelkamp等，Science 296550-553.2002)。同樣U6啟動子也用於產生短的髮夾RNA(Paddison等，Genes Devel.8948-958.2002；Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508.2002；Sui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85515-20.2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-6052.2002)，或有意和反義siRNAs(Lee等，Nat.Biotechnol.5500-505，2002；Miyagishi和Taira，Nat.Biotechnol.5497-500，2002；Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52，2002)。短的髮夾RNAs(shRNAs)能夠模擬天然存在的可能與RNAi相關的小RNA(micro-RNAs；miRNAs)。然而，當前有關設計和將此類人工shRNA加工成RNAi誘導者功能的資料仍然相互矛盾。例如，一篇報導發現髮夾環的大小(如多於7個核苷酸)和序列非常重要(Brummelkamp等，見上文，2002)，而其他人採用較短的環(1，4或6個核苷酸)也成功了(Paddison等，見上文，2002；Paul等，見上文，2002；Sui等，見上文，2002；Yu等，見上文，2002)。基因沉默的效應在一些情況下依賴於髮夾中有意鏈和反義鏈的次序和方向(Paddison等，見上文，2002)，但是在其他人看來是不重要的或不相干的(Paul等，見上文，2002)(Yu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96047-52.2002)。所有上述的研究都利用了短的III類聚合酶III啟動子和其簡單的終止子產生了高拷貝數量的短轉錄物。儘管觀察到了具有誘導非特異性表達關閉潛能的較長轉錄本，簡單的天然終止子可能不足以在預期位置終止所有轉錄(Lee等，見上文，2002)。在用水動力學轉染方法將合成的siRNA或從U6啟動子轉錄的shRNA導入成年小鼠內後能夠有效地使轉基因或病毒基因沉默(McCaffrey等，Nature 41838-39，2002)。
將長的或短的通過體外或體內轉錄分離的、在可溶性細胞提取物中加工得到的或化學合成的dsRNA分子導入細胞的方法具有嚴重的局限性。一個局限是分離的dsRNA所介導的基因沉默，也稱作基因敲低，只是暫時的，因為由RNA分子所攜帶的遺傳信息不能整合到宿主細胞的染色體上，所以dsRNA的效應只在有限次的細胞分裂過程中維持。另一個局限是RNA分子特別不穩定，易於被環境中大量存在的RNase降解。因此操作RNA分子需要格外小心。將RNA分子用於治療目的是不切實際的。經修飾的RNA，如在核苷酸上加入保護基團或改變多核苷酸鏈的骨架能夠提高穩定性，就象在許多反義研究中那樣。然而，經修飾RNA分子的幾種形式雖然較天然RNA相比能夠對RNase的降解作用具有更強的抵抗性但會出現RNAi能力的減弱或丟失，而用DNA替換dsRNA中的一條鏈根本不能誘導產生RNAi(Parish等，Mol.Cell 51077-87.2000)。此外，製備RNA分子的費用很高並且方法繁瑣而複雜。
由於存在這些局限性，能夠提供永久的導入細胞或生物體(如哺乳動物，例如小鼠或人)，和/或不依賴於使用RNA分子作為載體的用於基因沉默的材料和方法具有巨大的經濟利益。另一方面，DNA分子比RNA分子更加穩定且成本效率更高。DNA分子可以被整合到宿主細胞基因組並且在宿主細胞內具有長期的效應。DNA分子相對容易合成和操作。
發明概述本發明提供了用於靶基因表達抑制和利用DNA作為工具降解靶RNA的方法和組合物。這種方法是指「DNA介導的基因沉默」(「DMSG」「De-message」)。這樣，本發明提供了通過對靶細胞(例如，預對其中特定RNA進行降解的細胞)用RNA幹擾效應進行的諸如真核細胞或生物體內(包括哺乳動物細胞或有機體在內)基因特異的幹擾。本發明提供了不必要在靶細胞外操作RNA分子而實現RNAi的好處。可以誘導RNAi用於短暫的基因敲低，還可以用於永久的基因敲低，因為編碼RNAi的DNA分子可以插入到靶細胞內的染色體上。相應的，DMSG也可以用於產生遺傳學上修飾的動物，它是通過將DMSG摻入生殖系統，從而能夠提供根據設計組成型表達或使用誘導試劑誘導表達編碼RNAi的下一代動物。這樣，本發明的另一個優點是基因特異的沉默可以限定在一種或少數幾種細胞類型，或限定在特定時間，而不導致在機體其它細胞內產生全面的基因關閉。
本發明涉及含有編碼中間體小幹擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個核苷酸的可表達的模板核苷酸序列的分離脫氧核糖核酸(DNA)，這種幹擾核糖核酸分子能夠介導靶RNA的RNA幹擾。在一個實施方案中，中間體siRNA包含與靶RNA有意鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分和任選地包含約1-5個核苷酸的3』端部分，並且這種中間體siRNA被設計成能夠與靶RNA有意鏈進行選擇性雜交。在另一個實施方案中，中間體siRNA包含與靶RNA反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分和任選地包含約1-5個核苷酸的3』端部分，並且這種中間體siRNA被設計成能夠與靶RNA反義鏈進行選擇性雜交。在上述實施方案的一個方面，中間體siRNA包括1-5個核苷酸的3』端部分，在一個進一步的方面中，這種3』端部分不能夠分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補。
本發明還提供了DNA介導基因表達沉默(DMSG)盒(也叫做LineSilenceTM盒)，它包括可操作地連接到至少一個異源核苷酸序列上的上述分離的核酸分子。在一個實施方案中，DMSG盒包括可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動子和可表達的模板核苷酸序列和末端，或者能夠在特定核苷酸位置切開成為末端，以至於預定長度和組成的「脫落式(run-off)」中間體siRNA能夠被表達，其中可表達的模板核苷酸序列相對於聚合酶III啟動子而言是異源的，並且由能夠編碼中間體siRNA的至少約16個核苷酸組成。在另一個實施方案中，LineSilenceTM盒包括可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動子和可表達的模板核苷酸序列和至少一個聚合酶III終止子，其中可表達的模板核苷酸序列相對於聚合酶III啟動子而言是異源的，並且由能夠編碼中間體siRNA的至少約16個核苷酸組成。中間體siRNA可以包括至少約15個核苷酸的5』部分，它能夠與靶RNA的有意鏈互補，和任選地包括約1-5個核苷酸的3』端部分，其中中間體siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈進行雜交；或者中間體siRNA可以包括至少約15個核苷酸的5』部分，它能夠與靶RNA的反義鏈互補，和任選地包括約1-5個核苷酸的3』端部分，其中中間體siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈進行雜交。例如，中間體siRNA可以是長度約為21-23個核苷酸，它可包括長度約為1-4個核苷酸的3』端部分。
當本發明的DMSG盒中存在聚合酶III啟動子或聚合酶III終止子或這兩者時，它們可以是哺乳動物U6基因聚合酶III啟動子或聚合酶III終止子，例如人U6基因聚合酶III啟動子或終止子(或兩者)或小鼠U6基因聚合酶III啟動子或終止子或兩者。例如，LineSilenceTM盒可包括可操作連接的下述有意多核苷酸序列，所述序列包含SEQ ID NO1中的核苷酸6-13、SEQ ID NO1中的核苷酸19-38、SEQ ID NO1中的核苷酸66-69、模板核苷酸序列和至少一個包含TTTT四核苷酸序列的轉錄終止子；反義多核苷酸，它與上述的核苷酸序列互補；或包括可以選擇性地彼此雜交的上述有意多核苷酸和反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。當此種雙鏈DMSG編碼的中間體siRNA分子包括任選的1-5個核苷酸的3』端部分時，通過DMSG盒表達形成siRNA分子，並且所述中間體siRNA分子選擇性雜交形成在雙鏈siRNA的每一條鏈上包含1-5個核苷酸的3′突出端。
在另一個實施方案中，DMSG盒包含編碼第一中間體siRNA的可表達模板核苷酸序列，且該可表達的模板核苷酸序列進一步可操作地連接到編碼第二中間體siRNA的第二個可表達模板核苷酸序列上。在該實施方案的另一方面，第二中間體siRNA的5』部分與第一中間體siRNA的5』部分互補，於是當表達時第一中間體siRNA的5』部分選擇性地與第二中間體siRNA的5』部分雜交，從而形成髮夾結構。
當存在DMSG盒的轉錄終止子時，其可以包括天然聚合酶III終止子的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO48的人U6基因終止子或包含SEQID NO49的小鼠U6基因終止子；或可以包含設計用來在特定核苷酸處終止聚合酶III轉錄的經修飾聚合酶III終止子，例如如SEQ ID NO50或SEQ ID NO51所列的那些經修飾的聚合酶III終止子。此外，DMSG盒可進一步包括可操作連接的增強子，它可以是組成型的活化增強子或可誘導的增強子。
當DMSG盒為雙鏈DNA分子時，一條鏈能夠編碼與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA，且第二鏈能夠編碼與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA。在一個實施方案中，編碼的第一中間體siRNA和第二中間體siRNA能夠選擇性地雜交，形成能夠介導RNA幹擾的雙鏈siRNA。在另一個實施方案中，此種雙鏈siRNA在每個3′末端具有1-5個核苷酸的3′突出。也提供了包含本發明DMSG盒的載體，以及含有存在於載體中的DMSG盒的細胞。
本發明還涉及介導靶RNA的RNA幹擾的方法，通常在細胞中，通過表達至少一種中間體siRNA，並一般往往表達至少第一中間體siRNA和第二中間體siRNA，其中第一和第二siRNA的5』部分選擇性地彼此雜交。因此，本發明涉及細胞中介導靶RNA的RNA幹擾的方法，例如，通過將至少一種DMSG盒導入細胞，從而表達DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)，激發靶RNA的降解，於是介導細胞內RNA幹擾。此外，本發明還提供了敲低樣本中靶基因表達的方法，例如，通過使樣本與至少一種DMSG盒接觸，從而表達DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)，激發靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而敲低樣本中靶基因的表達。
本發明還涉及在細胞群體中，示蹤經歷DNA介導的基因沉默的特定細胞或特定細胞組群的方法。此種方法可通過以下步驟實現，例如通過將至少一種可檢測的標記DMSG盒導入特定細胞或特定細胞組群中的每個細胞；和監測可檢測的標記，從而在細胞群體中示蹤特定細胞或特定細胞組群。此外，本發明還涉及鑑定發生DNA介導的基因沉默的細胞的方法，例如，在足以將DMSG盒導入細胞的條件下，通過將至少一個細胞與至少一種可檢測的標記DMSG盒接觸；和檢測細胞中可檢測標記的存在。在一個實施方案中，該方法是通過將相同的或不同的DMSG盒的陣列在適於將DMSG盒導入細胞的條件下與細胞接觸，從而通過反向轉染將陣列的DMSG盒導入細胞。
本發明還涉及評價測試細胞中基因功能的方法。該方法可以通過以下步驟完成，例如，通過將至少一種DMSG盒導入測試細胞，和觀察當DMSG盒編碼的siRNA(包括中間體siRNA)表達時測試細胞的表型，從而測試細胞與對照細胞的表型的比較可以指示靶基因的功能，從而評價測試細胞中基因的功能。此種方法特別適合於高通量分析，例如，如可能的話，利用細胞微陣列方法檢測多種基因的功能，其中不同的DMSG盒定位於固體支持物如載玻片或矽片上的陣列上，特別是可尋址陣列，並且在適於將陣列的DMSG盒導入細胞的條件下將陣列與細胞接觸。在陣列某一位置上細胞表型變化的鑑定允許評價與點在陣列位置上的特定DMSG盒相關的基因。
此外，本發明還涉及測定一種試劑是否能作用或影響在測試細胞中某個特異基因的方法，特別是作用或影響特異基因的表達的方法。此種方法可按以下進行，例如，通過在測試細胞中表達被至少一種DMSG盒編碼的包括中間體siRNA的siRNA，其中siRNA的中間體siRNA包括與測試細胞中特異基因編碼的RNA分子互補的5′部分；將測試細胞和對照細胞與試劑接觸；和比較測試細胞與對照細胞的表型，從而評價是否該試劑能作用或影響測試細胞中的特異基因。
本發明還涉及通過導入針對介導疾病的靶RNA的RNAi來改善個體中RNA介導的疾病的方法。此種方法可按以下進行，例如，通過將表現出RNA介導的疾病個體的細胞與至少一種DMSG盒接觸，其中由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的包含一種或多種中間體siRNA分子的siRNA的表達能夠介導針對靶RNA的RNAi。個體的細胞可離體地(ex vivo)與DMSG盒相接觸，然後再回施至受試者體內，或可將DMSG施用於受試者使它在體內與含有靶RNA的細胞接觸。靶RNA可以是內源RNA，包括編碼RNA(如mRNA)或非編碼RNA(如X染色體調節子或結構RNA)，或可以是外源RNA，例如，由於個體感染而存在於細胞中的細菌或病毒RNA。
本發明還涉及一種試劑盒，它包括至少一種包含可表達的模板核苷酸序列的分離的DNA分子和/或至少一種DMSG盒。在一個實施方案中，該試劑盒包括含有，如果期望可在可尋址的位置上影印在其上的多個DMSG盒的固體支持物，其中多個DMSG盒可以是相同的或不同的或它們的組合。此外，多個DMSG盒可以是相關的多個DMSG盒，例如，代表基因相關家族如TGF-β家族成員、免疫球蛋白家族成員、生長因子或生長因子受體家族成員的DMSG盒；或代表能對特定刺激物起反應而誘導(或抑制)的基因如對生長因子、毒素或感染劑起反應而誘導的基因的DMSG盒；或代表在特殊細胞或細胞類型表達的基因如以組織特異性或發育階段特異性方式表達的基因、或在異常細胞如癌細胞中表達的基因的DMSG盒。還提供了非人類轉基因生物，它為經遺傳學修飾而在其基因組中含有DMSG盒。
本發明還提供了分離的經修飾U6基因啟動子，特別是縮短的增強子，包括DSE可操作地連接到PSE(對照天然存在的U6基因5′端上遊調節序列；SEQ ID NO36)。本發明的經修飾U6基因增強子以5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO38)和5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO39)為例，其中N(10-60)是指任意10-60個核苷酸可定位於DSE(ATTGCAT)和PSE(人，SEQ ID NO34；或小鼠，SEQ ID NO35所示)之間。此種經修飾的U6基因增強子以其中DSE和PSE由大約10個核苷酸分開的下述DSE和PSE為例闡述，-5′-ATTGCAT-N(13)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO40)；和5′-ATTGCAT-N(13)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO41)-，並且更特別地是由SEQ ID NO1的核苷酸6-46分開的DSE和PSE。在一個實施方案中，縮短的U6基因增強子可操作地連接到啟動子元件上，特別是TATA元件。在另一個實施方案中，可以可操作地連接到啟動子上的經修飾增強子包含於載體中，該載體可包括可操作連接的模板克隆位點。此外，本發明還提供了經修飾的哺乳動物U6基因聚合酶III終止子，例如，以SEQ IDNO50和51為例的經修飾聚合酶III終止子。
本發明還提供了多種分離的DNA分子，其中每種DNA分子都固定在固體支持物上，並且其中每種DNA分子都包含編碼介導靶RNA的RNA幹擾的中間小幹擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個核苷酸的可表達模板核苷酸序列，其中中間體siRNA包含含有與靶RNA的有意鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分和含有與靶RNA的有意鏈不互補的約1-5個核苷酸的3』端部分，其中siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈雜交；或者其中中間體siRNA包含含有與靶RNA的反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分和含有與靶RNA的反義鏈不互補的約1-5個核苷酸的3』端部分，其中siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈雜交。多種DNA分子中的一種或多種DNA分子可進一步包括可操作地連接到可表達的模板核苷酸序列上的異源聚合酶III啟動子，例如，哺乳動物U6基因啟動子，特別是人U6基因啟動子。
在一個實施方案中，多種DNA分子中每一DNA分子，都包含可操作連接的聚合酶III啟動子、可表達的模板核苷酸序列和至少一個聚合酶III終止子，其中可表達的模板核苷酸序列相對於聚合酶III啟動子是異源的。例如，多種DNA分子中每一DNA分子，可包括可操作連接的哺乳動物U6基因聚合酶III啟動子、可表達的模板核苷酸序列和至少一個聚合酶III終止子，並且其中可表達的模板核苷酸序列相對於聚合酶III啟動子是異源的。一方面，多種的DNA分子，都包括可操作連接的包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個含有TTTT四核苷酸序列轉錄終止子的有意多核苷酸序列。另一方面，多種的DNA分子包括與含有SEQ IDNO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個含有TTTT四核苷酸序列轉錄終止子的有意多核苷酸序列互補的反義多核苷酸。又在另一方面，多種的DNA分子包含含有如上所述的有意多核苷酸和反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。在本發明的多種DNA分子中，當存在轉錄終止子時，轉錄終止子可以包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO49，或可以包含SEQ ID NO50或SEQ ID NO51。
在另一實施方案中，多種的DNA分子的可表達模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，其中可表達模板核苷酸序列被可操作地連接到包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個核苷酸長的第二個可表達模板核苷酸序列的核苷酸序列上，並且其中第二中間體siRNA的5』部分與第一中間體siRNA的5』部分互補，因此，在表達時，第一中間體siRNA的5』部分選擇性地與第二中間體siRNA的5』部分雜交，從而形成髮夾結構。
在一個實施方案中，多種DNA分子的每一DNA分子都被固定在固體支持物上的特定位置，例如，在陣列中，並且優選地為可尋址陣列。多種的DNA分子可以被固定使它們在通常不降解DNA的條件下保持吸附於固體支持物上，或者可以被可逆固定。一方面，利用諸如明膠這樣的試劑將作為DMSG盒成分的DNA分子可逆固定於固體支持物上，其中，當與適當的溶液接觸時，DNA分子從支持物上釋放出來。
另一方面，多種DNA分子中的DNA分子(其可包含多種DMSG盒)被可操作地連接於作為膜內剪切蛋白酶底物的跨膜結構域肽上，其中所述DNA分子(或DMSG盒)可通過跨膜結構域肽固定於固體支持物上。跨膜結構域肽可以是任意此類作為膜內蛋白酶或肽酶底物的肽，包括，例如，β-澱粉狀前體蛋白質的肽、果蠅sevenless蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅torso蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅δ蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質的肽；或者作為諸如早衰因子1或早衰因子2的早衰因子的底物的肽。多種的DNA分子單獨或者與跨膜肽結構域結合後也可以包含可操作性連接的蛋白質轉導結構域，該結構域有利於DNA分子(或DMSG盒)跨細胞膜的脂雙層的轉運。此類蛋白質轉導結構域可用以下例子闡明，人免疫缺陷病毒TAT結構域、果蠅觸角足同源異型域、單純皰疹病毒VP22轉導結構域、或成纖維細胞生長因子轉導結構域。
具有如此處公開的一種或多種DNA分子(或DMSG盒)固定於其上的固體支持物提供了便利，使在移動和操作DNA分子時，其所附著的固體支持物是穩定的，並且提供了進一步的便利，當需要時可以使多種的DNA分子能夠從支持物上釋放出來，例如，通過使支持物暴露於改變了的條件或通過將支持物與細胞接觸。固體支持物可以是任意通常用於固定DNA的材料，包括，例如，矽微晶片、載玻片、或塑料珠。相應地，本發明還提供了含有此類多種的DNA分子的試劑盒，其中所述多種的DNA分子例如固定於可尋址陣列中的固體支持物上，並且特別是固定於固體支持物的多種DMSG盒，優選的是在可尋址陣列中。
本發明還涉及將DMSG盒導入細胞的方法。此種方法可按以下進行，例如，通過在足以使DMSG盒進入細胞的條件下將固定於固體支持物上的DMSG盒與細胞相接觸。優選地是，DMSG盒是多種DMSG盒之一，其中多種DMSG盒中的DMSG盒被固定於固體支持物上，例如，在陣列中，它可以是但不需要是可尋址陣列。利用諸如明膠的基質材料，或通過接頭，特別是作為膜內剪切蛋白酶或肽酶的底物的跨膜結構域，可以將DMSG盒固定於支持物上，從而僅當進入細胞膜和被膜內剪切蛋白酶接觸時才使DMSG盒從支持物上釋放出來。如果期望，DMSG盒可以進一步包括蛋白質轉導結構域，因此可以促進DMSG盒進入細胞膜的脂雙層。
根據本發明方法的一個實施方案，在含有DMSG盒的細胞中，DMSG盒的可表達核苷酸序列的表達可以降低或抑制細胞中基因的表達，因此提供了鑑定能夠敲低基因表達的DMSG盒的方法。當利用此處所述的DMSG盒陣列進行時，此種方法提供了RNAi技術的微陣列，該微陣列允許具有預期基因敲低活性的DMSG盒的鑑定，例如，對編碼轉錄因子、生長因子、生長因子受體、蛋白激酶或G蛋白的基因敲低的DMSG盒的鑑定。基因的降低表達或抑制表達可以通過測定基因表達水平的任意方法而檢測出來，包括如檢測細胞的表型改變。在一個實施方案中，該方法提供了在表現出病理性疾病的細胞中，而不是在相應的未表現出病理性疾病的細胞中鑑定基因表達的方法，通過檢測其中一種細胞而不是另外細胞的表型變化，例如在諸如乳腺癌細胞的癌細胞中而不是在相應的諸如正常乳房上皮細胞的正常細胞中。相應地，RNAi微陣列方法提供了在多種DMSG盒中鑑定能降低或抑制含有DMSG盒的細胞中基因表達的DMSG盒的方法。同樣，該方法可以進一步包括分離DMSG盒並且，所以，本發明還提供了由此種方法鑑定並分離DMSG盒，此類DMSG盒是有用的，例如，可作為治療劑。因此，本發明還進一步提供了包含用於敲低病理性疾病相關基因的表達的DMSG盒的藥物。
附圖簡述

圖1A和1B以線性形式圖示2種DMSG盒。DMSG-TM盒(圖1A)中顯示了增強子、啟動子、模板序列、2個終止序列(「Term」；「TM」)，圖1B為突然終止的脫落型盒(「RO」)。
圖2以環狀(如質粒)形式圖示DMSG盒。
圖3以組裝的線性形式圖示DMSG盒(見實施例3)。寡核苷酸被表示為形成具有切口的雙鏈(「ds」)DNA的粗線。
圖4圖表說明DMSG對lacZ表達的影響(見實施例4)。包括siRNA作為對照。僅編碼正鏈、僅編碼負鏈、或編碼正負鏈的DMSG盒被用於沉默報告基因的表達。在最後兩個實驗中將DMSG正盒與組裝的DMSG負盒共轉染，其中以合成的正義DNA(s1s2)或反義DNA(a1a2)用作這兩種寡核苷酸。每一s2和a2的3′端鹼基用異硫氰酸螢光素(FITC)標記。
圖5圖示載體pDMSG1上的DMSG盒(見實施例6)。圖的上部代表質粒，顯示了模板克隆位點周圍的序列(「TCS接頭」)。下部描述將模板序列插入克隆位點。
圖6表示第二種載體pDMSG2上的DMSG盒，該載體與pDMSG1(圖5)相似除了它含有一個可留下4個核苷酸突出端的限制性核酸內切酶識別位點(見實施例6)。圖的上部代表質粒，顯示了模板克隆位點周圍的序列(「TCS接頭」)。下部描述將模板序列插入克隆位點。
發明詳述RNA幹擾(RNAi)是dsRNA(小幹擾RNA；siRNA)誘導的轉錄後基因沉默過程，並且已經用於調節基因表達。通常，通過將細胞與雙鏈siRNA相接觸已經可以實施RNAi。然而，由於RNA易於降解，細胞外RNA操作是非常繁瑣的。通過提供編碼小幹擾RNA(siRNA)分子或含有siRNA一條鏈的中間體siRNA分子的脫氧核糖核酸(DNA)組合物，本發明免除了操作RNA的需要。因此，本發明提供了分離的DNA分子，它包括編碼中間體siRNA的至少約16個核苷酸的可表達模板核苷酸序列，其中中間體siRNA作為siRNA的組分可介導對靶RNA進行RNA幹擾(RNAi)。
在一個實施方案中，中間體siRNA是核糖核苷酸序列，它包括含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和含有不分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補的約1-5個核苷酸的3』端部分，其中與靶RNA有意鏈互補的siRNA可選擇性地與靶RNA有意鏈雜交，並且其中與靶RNA序列有意鏈互補的第一中間體siRNA和與同一靶RNA序列反義鏈互補的第二中間體siRNA可以選擇性地彼此雜交。在另一實施方案中，siRNA包括含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和任選地3』端部分，當存在3』端部分時，其可以是長度為約1-5個核苷酸，並且可以但不必分別與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補，其中與靶RNA有意鏈互補的siRNA可以選擇性地與靶RNA有意鏈雜交，並且其中與靶RNA序列有意鏈互補的第一中間體siRNA和與同一靶RNA序列反義鏈互補的第二中間體siRNA可以選擇性地彼此雜交。當這兩種siRNA分子，每一siRNA分子包含一個3』端部分，選擇性雜交形成雙鏈siRNA時，該雙鏈siRNA在每個末端都包含3′突出端。
如此處所使用，術語「模板」或「模板核苷酸序列」是指本發明DNA分子的核苷酸序列(或DMSG盒的核苷酸序列；見下)，它們編碼的核糖核苷酸序列含有與靶RNA的有意鏈或反義鏈互補的5』部分，和任選地能夠，但不必要，分別與靶核苷酸序列的有意鏈或反義鏈互補的3』端部分。照這樣，模板核苷酸序列編碼含有雙鏈siRNA中的一條鏈的中間體siRNA。
術語「中間體」，當用於指siRNA時，意思是指雙鏈siRNA中的一條鏈，或者是有意鏈或者是反義鏈或其部分。為了便於討論，術語「有意」鏈(或「正」鏈)和「反義」鏈(或「負」鏈)在此處如它們所相關的mRNA那樣使用，其中，有意(正)鏈包含編碼肽的信息並且反義(負)鏈與它們互補。應該認識到，實際上在細胞中通常不產生反義mRNA序列。然而，應進一步認識到siRNA不是必須針對mRNA分子，其可以針對任意RNA分子，包括細胞或樣本中任意內源或外源RNA。例如，siRNA可以針對結構RNA分子，例如諸如那些參與剪接複合體的核糖體RNA或小核RNA(snRNA)；已轉錄的內含子的核苷酸序列，其存在於核不均一RNA(hnRNA)；X-染色體調節物；或微小RNA；或可針對RNA病毒的核苷酸序列或DNA病毒(它含有正鏈和負鏈)RNA形式的核苷酸序列，後者包括編碼或非編碼RNA序列；或可針對能夠與帶菌的宿主共生的細菌或具有感染性的細菌特別是致病菌所表達的RNA。
中間體siRNA一般是長度為16-30個核苷酸，通常約20-25個核苷酸，特別是21、22或23個核苷酸。為了便於討論，談到了中間體siRNA的5』部分和3』端部分。術語「5』部分」是指這樣的中間體siRNA的核苷酸序列(通常長度約15-29個核苷酸，通常長度約18-25個核苷酸，特別的是20-23個核苷酸長)，該核苷酸序列與靶RNA的有意鏈或反義鏈序列互補；術語「3′端部分」是指這樣的中間體siRNA的任選核苷酸序列(當其存在時，通常長度為1-5個核苷酸，特別是2、3或4個核苷酸長)，它包括3′端核苷酸。通常，siRNA包括3′端部分，以至於當中間體siRNA與互補siRNA選擇性雜交形成siRNA時，中間體siRNA的3′端部分可以形成3′突出端。為了便於討論本發明的組合物，文中往往談到了與靶RNA相應序列不互補的、含有1-5個核苷酸的3』端部分的模板核苷酸序列。像這樣，應該認識到本發明的分離DNA分子不包含諸如天然存在的多核苷酸的任何已分離的核苷酸序列或限制性片段(如基因序列)，並且也應該認識到本發明的DMSG盒不包含連接到任何異源核苷酸序列的任一上述核苷酸序列。
本發明的分離DNA分子可以是單鏈或雙鏈。如果分離的DNA分子是單鏈，它能夠編碼有意鏈或反義鏈中間體siRNA；或者能夠編碼有意鏈和反義鏈這兩種中間體siRNA，當表達時，這兩種中間體siRNA能夠選擇性雜交以形成siRNA。如果分離的DNA分子是雙鏈時，它可以在一條鏈上編碼有意或反義的中間體siRNA；或可以在一條鏈上編碼有意和反義的中間體siRNA這兩條鏈，當表達時，這兩條鏈可以選擇性雜交以形成siRNA；或在一條鏈上編碼有意的中間體siRNA而在第二條鏈上編碼反義的中間體siRNA，當表達時，它們能夠選擇性雜交以形成siRNA。本發明的分離DNA分子能夠編碼兩種或多種中間體siRNA分子，它們中的兩種或多種分子能夠選擇性地彼此雜交以形成siRNA，或者能夠特異針對兩種或多種不同的靶RNA分子。
分離的DNA分子還可以是線性DNA分子，它具有第一個末端和第二個末端，或著是環狀的。此外，分離的DNA分子可以是例如在溶液中的游離形式，以冷凍乾燥形式，或以沉澱形式；或者包含於載體中，例如，表達載體。此類分離DNA，它可以，但不是必須，存在於載體上，它還可以存在於細胞中，例如宿主細胞、靶細胞、或經遺傳學修飾含有整合到其基因組中的該DNA分子的細胞。
本發明還提供了多種分離DNA分子。正如此處所應用的那樣，當用於指DNA分子、DMSG盒、或siRNA或中間體siRNA分子時，術語「多種」指兩種或多種(例如2、3、4、5、6、7、8種等)不同的分子，包括兩種或多種不同的此類分子群。照這樣，本發明的多種DNA分子包括至少兩種此類分離的DNA分子。例如，多種DNA分子可以包括第一種分離的DNA分子，該分子編碼包含與靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA；和至少第二種分離的本發明DNA分子(例如第二種；第二種和第三種；第二種、第三種和第四種；等)。應該認識到，術語「第一種」、「第二種」、「第三種」等等僅被用於區別本發明不同的分離DNA分子而並非指，例如順序或重要性或其他此類特性。
當本發明中的多種DNA分子包括第一種分離的DNA分子，該分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA(「第一中間體siRNA」)，並還包括，例如，至少第二種分離的DNA分子，該分子編碼包含與第一中間體siRNA所針對的靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，其中，在表達時，第一和第二中間體siRNA分子能選擇性雜交形成siRNA。作為選擇，或另外，該多種DNA分子可至少包括第二(或第三)分離的DNA分子，該分子編碼包括與第二靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA，並且還可至少包括第三(或第四)分離的DNA分子，該分子編碼包括與第二靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
多種分離的DNA分子還可包括第一分離的DNA分子，該分子編碼具有與靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA；和至少包括第二分離的DNA分子，該分子編碼具有與靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA，其中編碼的第一和第二中間體siRNA可以但非必須彼此互補，這樣在表達時，它們可以選擇性雜交形成siRNA。此外，還考慮到其它的成分組合，這些成分是諸如那些編碼針對一種或多種其它靶RNA分子或第一靶RNA其他區域的中間體siRNA的成分。
如此處所公開，本發明的DNA分子編碼可表達的模板核苷酸序列。術語「可表達的」，當用於指模板核苷酸序列時，是指模板核苷酸序列可以被轉錄成RNA分子，特別是中間體siRNA。這樣，可表達的模板核苷酸序列通常，或可以，被可操作連接於一個或多個轉錄調控元件，其中轉錄調控元件包括例如，一個或多個包含轉錄起始位點的啟動子；分別可以增強或降低可表達核苷酸序列轉錄水平的增強子或沉默子；沉默子；或含有轉錄終止位點的終止子。
相應地，本發明還提供了DNA介導的基因沉默(DMSG)盒，它包括可操作地連接到至少一個異源核苷酸序列上的本發明分離的DNA分子(其編碼中間體siRNA)。異源核苷酸序列可以是，例如，一個或多個可操作連接的轉錄調控元件如啟動子、增強子、終止子、或其組合；克隆位點如限制性核酸內切酶識別位點、重組酶識別位點、拓撲異構酶識別位點、或其組合；或一個或多個其它部分。例如，本發明的DMSG盒可以包括可操作連接的啟動子、編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列、和終止子，並且此外還可包括增強子。此種DMSG盒在此處以含有可操作連接於人U6基因增強子、啟動子和終止子元件上的模板核苷酸序列的DMSG盒為例證，它由RNA聚合酶III(pol III)直接轉錄。此外，DMSG盒也可包含於載體中，並且相同的或不同的兩個或多個DMSG盒可被可操作地連接到一起，並且可以是線性的或環狀的並且可以，但非必須，包含於載體中。
可以用於驅動有意中間體siRNA或反義中間體siRNA轉錄的啟動子和增強子可以是組成型的(例如病毒啟動子諸如巨細胞病毒啟動子或SV40啟動子)、可誘導的(例如金屬硫蛋白啟動子)、可抑制的、組織特異性的、發育階段特異性的等等。因此，例如2個不同的可誘導啟動子可以用於驅動有意中間體siRNA和反義中間體siRNA的轉錄。在此種例子中，如所預期的，啟動子活化可用於誘導有意中間體siRNA、反義中間體siRNA或兩者的產生。此外，可以選擇轉錄調控元件以至於它們可指導由真核RN A聚合酶I、II或III(pol I、II或III)轉錄或由原核RNA聚合酶，如α-pol、β-pol或γ-pol轉錄。調控元件諸如真核RNA聚合酶III啟動子、增強子和終止子，例如存在於人U6基因的這些元件，能夠在表達中間體siRNA時尤其有用，因為聚合酶III能夠產生大量的轉錄子拷貝。
正如此處所使用的，術語「可操作地連接的」是指調控元件定位於與可表達核苷酸序列相關的位置，從而元件可以發揮它的調控作用。具有增強子活性的轉錄調控元件可以位於一定的距離，例如相鄰或相距長達數千核苷酸的距離、和位於啟動子和預轉錄核苷酸序列的上遊或下遊，並且仍能對編碼的報告分子的表達水平施加可檢測的增強效應。轉錄調控元件包括真核和原核啟動子、終止子、增強子和沉默子，這在本領域是熟知的，並且能夠化學合成、從天然存在的核酸分子得到、或從商業渠道購得。
啟動子包括，例如來源於巨細胞病毒、莫洛尼鼠白血病病毒和皰疹病毒的啟動子，還有來源於編碼金屬硫蛋白、骨骼肌動蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸甘油酸、二氫葉酸還原酶和胸苷激酶基因的啟動子，還有來源於病毒長末端重複(LTRs)如勞斯肉瘤病毒LTR的啟動子。增強子包括，例如組成型激活增強子如免疫球蛋白增強子，或可誘導增強子如SV40增強子；等等。金屬硫蛋白啟動子是組成型激活啟動子，當存在金屬離子，如銅、鎳或鎘離子時，它也可以被誘導至較高水平表達。作為比較，四環素誘導的啟動子是啟動子的一個例子，它被存在的四環素或四環素類似物誘導，否則就沒有活性。轉錄調控元件也可以是組織特異性調控元件，例如肌細胞特異性調控元件，從而使所編碼產物的表達限制於個體的肌細胞，或培養例如器官培養中的混合細胞群中的肌細胞。肌細胞特異的調控元件包括，如肌肌酸激酶啟動子(Sternberg等，Mol.Cell.Biol.82896-2909，1988，此處引用作為參考)和肌球蛋白輕鏈增強子/啟動子(Donoghue等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 885847-5851，1991，此處引用作為參考)在本領域是熟知的。其它組織特異的啟動子，還有隻在細胞或有機體特定發育階段表達的調控元件，在本領域是熟知的。
此類調控元件或者是組成型的或者是可調節的(即可誘導的或可去抑制的)。組成型啟動子的例子包括噬菌體λ的啟動子int、pBR322上β-內醯胺酶基因序列的啟動子bla、pPR325上氯黴素乙醯轉移酶基因序列的啟動子CAT、等等。可誘導的原核啟動子的例子包括噬菌體主要的右和左啟動子(PL和PR)、大腸桿菌(E.coli)trp，recA，LacZ，LacI和gal啟動子、枯草桿菌(B.subtilis)α澱粉酶(Ulmanen等，J.Bacteriol.162176-182，1985)和σ-28-特異啟動子(Gilman等，Gene 3211-20，1984)、芽孢桿菌屬噬菌體啟動子(Gryczan，The Molecular Biology of the Bacilli(AcademicPress，Inc.，NY 1982))、鏈黴菌啟動子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203468-478，1986)、等等。Glick(J Ind.Microbiol.1277-282，1987)；Cenatiempo(Biochimie 68505-516，1986)和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18415-442，1984)綜述了原核啟動子範例。
轉錄調控元件例如啟動子和增強子可以是組成型活化元件，該元件以相對穩定的活性水平維持著可操作性地連接的可表達核苷酸序列的表達，或者是可誘導的調控元件。組成型活化調控元件包括，例如肌動蛋白啟動子如肌動蛋白2啟動子，或延伸因子(EF)啟動子如EF1α啟動子，其中每一啟動子在大範圍的不同細胞類型中是活化的；或者是在一種或少數幾種細胞類型中表達的組織特異調控元件，或者是只在有機體特定發育或生長中表達的發育階段特異性調控元件。當談及調控元件特別是啟動子或增強子時，術語「組織特異性」或「發育階段特異性」時是指能夠只在一種或少數幾種細胞類型、或只在一種細胞類型或有機體生長、發育或分化的一個或少數幾個階段指導轉錄的核苷酸序列。
象此處使用的那樣，術語「可誘導的調控元件」是指這樣一種調控元件，當暴露於誘導劑時，能夠實現可操作性地連接的核苷酸序列，特別是編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列提高的轉錄水平，使其與在不存在誘導劑時的，轉錄水平相比有所提高。可誘導的調控元件可以是那些沒有基礎活性或組成型活性，並且只在暴露於誘導劑的情況下才有效轉錄的調控元件，或者是那些有基礎活性或組成型活性，但當暴露於誘導劑的情況下能提高轉錄活性的調控元件。有基礎水平或組成型水平表達的可誘導調控元件在如下情況下有特別的用途，即誘導後的轉錄水平顯著地高於基礎或組成型表達水平，例如至少提高約2倍，或至少提高約5倍。特別有用的可誘導調控元件不具有基礎或組成型表達活性，或與調控元件相關的基礎或組成型轉錄水平相比轉錄水平提高至少約10倍。
當使用術語「誘導劑」時是指通過可誘導調控元件能夠影響轉錄的化學的、生物的或物理的試劑。對暴露於誘導劑時的反應，從可誘導調控元件的轉錄通常為從頭開始轉錄或比基礎或組成型表達水平有所提高。此種誘導可用此處公開的方法進行鑑定，包括檢測編碼生物發光多肽的mRNA水平的增高。可誘導調控元件在本發明重組核酸分子中的應用提供了一種只在預定時間表達生物發光多肽的方法，因此阻止了植物細胞中無關的轉錄或翻譯活性。
用於調控特定的可誘導元件表達的誘導劑可以基於特定的可誘導調控元件進行選擇。例如，可誘導調控元件可以是金屬硫蛋白(MT)調控元件諸如MT2B調控元件，銅誘導的調控元件，或為四環素誘導的調控元件，從這些調控元件的轉錄可以通過分別對各種金屬離子、銅或四環素做出反應而實現(Furst等，Cell 55705-717，1988；Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 904567-4571，1993；Gatz等，Plant J.2397-404，1992；Roder等，Mol.Gen.Genet.24332-38，1994，每一個在此處引用作為參考)。可誘導調控元件還可以是蛻皮素調控元件或糖皮質激素調控元件，從這些調控元件的轉錄可以通過對蛻皮素或其它類固醇做出反應而實現(Christopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 896314-6318，1992；Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8810421-10425，1991，每一個在此處引用作為參考)。此外，調控元件可以是冷應答調控元件或熱休克調控元件，從這些調控元件的轉錄可以分別通過對暴露於冷或熱做出反應而實現(Takahashi等，PlantPhysiol.99383-390，1992，此處引用作為參考)。
此處使用的術語「可操作地連接」在談及諸如限制性核酸內切酶或重組酶識別的克隆位點時，在每種情況下，該術語是指這樣的克隆位點，它定位於第一核苷酸序列例如模板核苷酸序列，從而使第二核苷酸序列能夠被與其連接並實現它的與第一核苷酸序列相關的功能。例如，第一核苷酸序列，如可表達模板核苷酸序列，可以含有可操作地與其連接的克隆位點，從而使第二或更多核苷酸序列，如具有相似克隆位點的啟動子和終止子，可以通過克隆位點被連接於第一核苷酸序列，其中連接單元的每一成分都維持其功能並且兩個或多個連接單元共同起作用。同樣地，含有增強子、啟動子和終止子的表達載體可以包含位於啟動子和終止子元件之間的模板克隆位點，從而使含有合適終止的模板核苷酸序列可以可操作地插入克隆位點，也就是插入後使得模板核苷酸序列的表達由增強子、啟動子和終止子調控(見，例如圖5和6)。本發明組合物的模式特性特別適合於含有便於進行可操作連接的成分的試劑盒的生產，一個或多個不同的或組合的調控元件、檢測標記、靶向部分等的可操作連接包括插入、替代或缺失，從而使可表達模板核苷酸序列能夠在預期的一種或多種特定細胞類型中表達。
限制性核酸內切酶識別位點以及它們相應的限制性核酸內切酶在本領域中是孰知的並且是商業可得的。本發明的組合物中有用的限制性位點包括那些存在3′或5′突出端的位點，從而使得具有這些位點的兩個或多個核苷酸序列便於進行可操作性連接。例如，在模板核苷酸序列側翼加上限制位點，從而使啟動子和終止子能夠可操作地與其連接，在每一個模板的末端使用不同的限制性位點有利於將啟動子和終止子以正確的位置和方向可操作性地連接到編碼中間體siRNA的核苷酸序列上，從而使連接在單一反應混合物中完成。在本領域重組酶識別位點也是熟知的，它包括如可被Cre重組酶有效連接的lox識別位點，可被λInt和IHF蛋白質有效連接的att序列。
此處所用術語「可操作性連接」在談及含有模板核苷酸序列的DNA分子如DMSG盒和與其連接的分子時，在每種情況下，該術語是指能夠使DNA分子或DMSG盒和所述分子的功能得以維持的連接。因此，DNA分子或DMSG盒能夠可操作性地連接到可檢測標記或諸如多核苷酸、肽、模擬肽、小的有機分子等能在DNA分子或DMSG盒上賦予預期特性的其它分子。例如，DMSG可以被可操作性地連接到諸如細胞區室化結構域的部分上，它能夠靶向DMSG盒進入細胞或特定的細胞區室。在本領域細胞區室化結構域是熟知的並且包括如質膜定位結構域、核定位信號、線粒體膜定位信號、內質網膜定位信號等等，或蛋白質轉導結構域如人免疫缺陷病毒TAT蛋白質轉導結構域，它們利於與其連接的肽轉位進入細胞(見Schwarze等，Science 2851569-1572，1999；Derossi等，J.Biol.Chem.27118188，1996；Hancock等，EMBOJ.104033-4039，1991；Buss等，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；U.S.專利號5,776,689此處引用作為參考)。
使易於鑑定本發明組合物或含有該組合物的樣本或細胞的可檢測標記可以是便於檢測的肽、多肽、或化學分子或小的有機或無機分子。例如，可檢測標記可以是諸如生物素的分子，它可以用親和素或鏈親和素檢測；螢光化合物(如Cy3、Cy5、Fam、螢光素或羅丹明)；放射性核素(如硫35、鎝99、磷32、或氚)；順磁旋轉標記(如碳13)；生物發光物如蟲螢光素；酶如鹼性磷酸酶；或化學發光化合物。如果期望，螢光化合物如AAN、JOE、FAM、或TET可單獨或與淬滅劑如BHQ組合(見例如Molecular Probes，Eugene)，用於進行螢光共振能量轉移(FRET)反應，由此例如可以檢測由此處公開的DMSG盒表達的髮夾siRNA的形成。
將可檢測標記或其它分子可操作連接於核苷酸序列的方法在本領域是熟知的(見，例如，Hermanson，″Bioconjugate Techniques″(AcademicPress 1996)，此處引用作為參考)。除了提供例如檢測含有DMSG盒的細胞的方法，可檢測標記或其它分子也可用於分離此種細胞。例如，當DMSG含有螢光化合物時，通過諸如螢光激活細胞分選(FACS)方法，能夠容易地將含有DMSG盒的細胞從不含DMSG盒的細胞中分離出來。同樣的，當可檢測標記是肽標籤，如myc表位、FLAG表位等時，本身可以被標記的標籤特異的抗體或其它結合夥伴可用於分離或鑑定DMSG盒，包括例如含有該盒的細胞。
DMSG盒，或兩個或多個連接後的DMSG盒，可以是線性表達盒或環狀表達盒形式，任意一種形式都可以但非必需含有載體序列。此外，可以存在於載體中的DMSG盒還可以存在於細胞中，該細胞可以是用於維持和/或擴增DMSG盒的宿主細胞，並且DMSG盒可以是在細胞中游離存在的或整合到細胞基因組DNA中的。
本發明分離的DNA分子或DMSG盒可以包含於載體，這有利於核酸分子的操作，包括將其導入靶細胞。載體可以是克隆載體，它有利於維持DMSG盒的DNA分子，或者可以是表達載體，它含有用於表達多核苷酸的調控元件並且，根據需要，有利於連接到載體的DNA分子或DMSG盒或核苷酸序列所編碼的肽的翻譯。表達載體可以包含一些實現例如編碼中間體siRNA的可表達模板核苷酸序列持續轉錄的表達元件，或者在其被克隆進載體之前，可操作連接於模板核苷酸序列的調控元件，即通過構建DMSG盒的全部或一部分而連接。
表達載體(或多核苷酸)通常含有或編碼可以提供編碼的寡核苷酸的組成型或，如果期望，可誘導或組織特異或發育階段特異表達的啟動子序列、多聚A識別序列或其它轉錄終止位點、其它轉錄調控元件如增強子(可以是組織特異性的)，並且，如果期望，還包括核糖體識別位點或內部核糖體進入位點。如果期望，載體還可以包含在原核或真核宿主系統或兩者中複製所必需的元件。此類載體包括質粒載體和病毒載體，如噬菌體、杆狀病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、痘苗病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)和腺伴隨病毒載體，是眾所周知的並且可以從商業供應(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)中買到或由本領域的技術人員構建(見，例如，Meth.Enzymol.，Vol.185，Goeddel編輯(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther 151-64，1994；Flotte，J Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每篇文獻此處引用作為參考)。
病毒表達載體，對於將一種或多種位於相同或不同載體上的DMSG盒導入細胞，特別是受試者體內的細胞，是特別有用的。這些病毒載體為它們相對高效地感染宿主細胞和感染特異細胞類型提供了便利。病毒載體也可以來源於感染目的生物的細胞的病毒，例如，諸如哺乳動物、禽類或魚類宿主細胞的脊椎動物宿主細胞。病毒載體對於將DMSG盒導入靶細胞以實踐本發明的方法是特別有用的。已經研發出用於特定宿主系統特別是哺乳動物系統的病毒載體，並且包括例如逆轉錄病毒、其它慢病毒載體如那些基於人免疫缺陷病毒(HIV)的載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等等(見Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，New Engl.J Med.3341185-1187，1996，每篇文獻此處引用作為參考)。
例如，當將逆轉錄病毒用於基因轉移時，由於在用來產生逆轉錄病毒載體的包裝細胞系中將逆轉錄病毒載體和病毒基因序列重組，從而理論上可以產生複製性逆轉錄病毒。包裝細胞系，其中通過重組複製性病毒的產生已經被降低或去除，可以被用於降低產生複製性逆轉錄病毒的可能性。用標準方法，如PCR和逆轉錄酶分析，對用於感染細胞的逆轉錄病毒載體上清進行複製性病毒篩選。逆轉錄病毒載體允許將異源基因整合入宿主細胞基因組，這就允許基因隨著細胞分裂而傳遞給子代細胞。
使用本領域熟知的各種方法中的任何一種，可以將包含於載體中的多核苷酸如DMSG盒導入細胞(Sambrook等，「Molercular CloningALabortory Manual」(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)；Ausubel等，「Current Protocols in Molecular Biology」，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995的增刊)，每篇文獻此處引用作為參考)。此類方法包括，例如，轉染、脂質轉染、微注射、電穿孔和用病毒載體的感染；還可能包括脂質體、微乳劑等的使用，此類物質能夠促進將多核苷酸導入細胞並且能保護多核苷酸在導入細胞前不被降解。具體方法的選擇依賴於，例如，欲將多核苷酸導入的細胞，以及細胞是在培養基中獨立培養，還是在培養的或原位的組織或器官中培養。
通過使用病毒載體感染將多核苷酸導入細胞是特別有利的，因為它能夠有效地在體外或體內將核酸分子導入細胞(見，例如，美國專利號5,399,346，此處引用作為參考)。而且，病毒是非常特異的並且可以根據它對一種或少數幾種特定細胞類型的感染並在其中增殖的能力而選擇用作載體。因此，它們這種天然特異性可以用於將包含於載體的核酸分子靶向進入特定細胞類型。照這樣，基於HIV的載體可以用於感染T細胞，基於腺病毒的載體可以用於如感染呼吸道上皮細胞，基於皰疹病毒的載體可以用於感染神經細胞，等等。其他載體，諸如腺伴隨病毒可以具有較廣的宿主細胞範圍並且，因此，可以用於感染多種細胞類型，雖然病毒或非病毒載體也可以用特異受體或配體進行修飾以通過受體介導事件改變靶向特異性。
本發明的DMSG盒此處以「脫落式」DMSG盒進行例證，「脫落式(run off)」DMSG盒缺乏轉錄終止子元件(見圖1B)，例如針對靶RNA正鏈(如編碼鏈)的DMSG盒序列(如SEQ ID NO1和2所示)或針對靶RNA負鏈(如非編碼鏈)的DMSG盒序列(如SEQ ID NO5和6所示；也見實施例1)。此外，本發明的DMSG盒以含有一個或多個轉錄終止子的DMSG盒序列(見圖1A)進行例證，例如針對靶RNA正鏈的DMSG盒序列(SEQ ID NO3和4)或針對靶RNA負鏈的DMSG盒序列(SEQID NO7和8；也見實施例1)。儘管作為例證的DMSG盒含有針對綠色螢光蛋白(GFP)的靶有意鏈或反義鏈的模板核苷酸序列，應該認識到，本發明包括編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列，其中所述中間體siRNA針對由任一基因或cDNA等編碼的RNA分子，或針對任一靶RNA分子。
於是，本發明還提供了例如這樣的DMSG盒，它包括可操作連接的含有SEQ ID NO1的6-13位核苷酸、SEQ ID NO1的27-46位核苷酸、SEQ ID NO1的66-69位核苷酸和編碼中間體siRNA的至少約16個核苷酸的模板核苷酸序列的有意多核苷酸序列；與上述有意多核苷酸互補的反義多核苷酸；或通過上述有意或反義多核苷酸雜交形成的雙鏈多核苷酸。此類DMSG盒可缺乏終止子(見，例如，圖1B)，或進一步在可操作連接中包括至少一個轉錄終止子，例如在有意多核苷酸中至少一個四胸腺嘧啶核苷(TTTT)或至少一個五胸腺嘧啶核苷(TTTTT)序列；或在反義多核苷酸中至少一個四腺嘌呤核苷(AAAA)或至少一個五腺嘌呤核苷(AAAAA)序列。
應該注意到人U6基因終止子的天然序列包括五胸腺嘧啶核苷序列(TTTTT)，它的最開始的兩個胸腺嘧啶核苷殘基與編碼序列(見SEQ IDNO48)的最後兩個T重疊。由於當3』端部分含有UU突出端時siRNA是非常有效的，並且pol III轉錄通常在五胸腺嘧啶核苷終止子序列的第二或第三胸腺嘧啶核苷後終止，所以如公開的那樣，DMSG盒的轉錄提供了一種產生幾乎完美的siRNA分子的方法。
在許多情況下，期望例如在一個細胞中表達兩種DMSG盒，從而使有意和反義中間體siRNA能夠選擇性雜交形成功能性雙鏈siRNA。然而，也可以構建這樣的DMSG盒，以產生有意和反義中間體siRNA這兩者，在一個實施方案中，當有意和反義中間體siRNA序列含有單一轉錄本，其中有意和反義序列能夠選擇性雜交形成可加工成功能性雙鏈siRNA的髮夾結構。此外，本發明還提供了這樣的DMSG盒，它包括編碼第一中間體siRNA的第一模板核苷酸序列，並且其中DMSG盒的異源核苷酸序列包括編碼第二中間體siRNA的至少約16個核苷酸的第二可表達模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5′部分與第一中間體siRNA的5′部分互補，從而，當表達時，第一中間體siRNA的5′部分選擇性地與第二中間體siRNA的5′部分雜交形成髮夾結構。此類DMSG盒可以進一步包括至少一個RNA聚合酶III轉錄調控元件，例如，至少一個人U6基因轉錄調控元件如啟動子、增強子、終止子、或它們的組合。
考慮到本發明所公開的內容，應該認識到本發明的組合物，特別是DMSG盒，可以被整合進入細胞基因組並且，因此，本發明的組合物對於產生遺傳修飾細胞或含有此類細胞的非人轉基因生物是有用的。此類遺傳修飾細胞和非人轉基因生物是有用的，例如，作為以基因表達降低或缺乏為特徵的疾病的動物模型，或作為鑑定試劑對影響基因表達是否有用的工具。例如，可以製備轉基因嚙齒類動物如轉基因小鼠、大鼠、或倉鼠，或者其他轉基因動物如轉基因綿羊或山羊或其他實驗動物，從而通過表達來自DMSG盒的特異於靶基因的siRNA敲低一種或多種靶基因，並且可以直接檢查非人轉基因生物以測定基因敲低產生的效果，並且檢測某種試劑的效果，其中該試劑被懷疑能夠改善生物體中基因敲低所產生的效果。儘管轉基因有機體此處是以非人轉基因動物進行例證的，但應該認識到含有一種或多種DMSG盒的轉基因植物也同樣被考慮到。
對於產生轉基因動物有多種已知的方法。在一種方法中，從雌性收穫處於前核期的胚胎(「單細胞胚胎」)並將轉基因微注射入胚胎，在這種情況下，轉基因將被染色體性整合進入生殖細胞或所得到的成熟動物的體細胞。在另一種方法中，分離胚胎幹細胞並通過電穿孔、質粒轉染或微注射將轉基因摻入幹細胞；然後將幹細胞再次導入胚胎，在那裡它們進行克隆化並形成生殖系。將多核苷酸微注射入哺乳類動物的方法被敘述於如美國專利號4,873,191中，此處引用作為參考。又在另一種方法中，用含有轉基因的逆轉錄病毒感染細胞，從而使胚胎的生殖細胞具有整合於染色體中的轉基因。
當製備轉基因的動物是禽類時，微注射入受精卵的前核存在問題，因為禽類受精卵通常在輸卵管內頭20小時進行細胞分裂並且因此前核是難以得到的。因此對於製備轉基因禽類物種，逆轉錄病毒感染方法是優選的(見美國專利號5,162,215，此處引用作為參考)。然而，如果打算將微注射用於禽類物種，可以從前次產卵大約2.5小時後的供體母雞中獲得胚胎，轉基因被微注射入胚盤的細胞質並且胚胎被培養於宿主殼內直至成熟(Love等，BioTechnology 12，1994)。當被轉基因的動物是牛或豬時，卵不透明可能妨礙微注射，因此通過常規的鑑別性幹擾-相差顯微術很難辨別細胞核。為了克服該問題，首先將卵離心以分離前核以便更好的觀察。
非人轉基因動物可以是小鼠、牛、豬、羊、禽或其它動物。可以在不同的發育階段將轉基因導入胚胎靶細胞，並且不同方法的選擇依賴於胚胎靶細胞的發育階段。對於微注射受精卵是最好的靶。受精卵用作基因轉移的靶具有的主要優點為注射的DNA能夠在第一次分裂前摻入宿主基因(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 824438-4442，1985)。作為結果，轉基因非人動物的所有細胞都攜帶所摻入的轉基因，因此有助於轉基因從起始轉基因動物向其後代有效傳遞，因為50％的生殖細胞攜有轉基因。
通過兩個嵌合動物的交配可以產生轉基因動物，其中在每一個嵌合動物的用於生殖的細胞中含有外源遺傳物質。所得後代的25％將是帶有純合子外源遺傳物質的轉基因動物，50％將是雜合子，剩餘的25％缺乏外源遺傳物質並具有野生型的表型。
在微注射方法中，消化轉基因並例如通過凝膠電泳純化，使不含任何的載體DNA。轉基因可以包括可操作連接的啟動子，它與參與轉錄的細胞蛋白質相互作用，並提供組成性表達、組織特異性表達、發育階段特異性表達等等。此類啟動子包括那些來源於巨細胞病毒(CMV)、莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)和皰疹病毒的啟動子，還包括那些來源於編碼金屬硫蛋白、骨骼肌動蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶(TK)的基因的啟動子。來源於病毒長末端重複(LTR)如勞氏肉瘤病毒LTR的啟動子也可以被應用。當用於轉基因的動物是禽類時，優選的啟動子包括那些針對雞β-珠蛋白基因、雞溶菌酶基因、和禽類造白細胞組織增生病毒的啟動子。用於對胚胎幹細胞進行質粒轉染的構建體使用了額外的調控元件，包括，例如，刺激轉錄的增強子元件、剪接受體、終止密碼子和多聚腺苷酸信號、允許翻譯的核糖體進入位點等等。
在逆轉錄病毒感染方法中，處於發育期的非人胚胎可以在體外培養至囊胚泡期。在這段時間內，卵裂球可以作為逆轉錄病毒感染的靶(Jaenich，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 731260-1264，1976)。通過酶處理去除透明帶以得到對卵裂球的有效感染(Hogan等，″Manipulating the MouseEmbryo″(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986)。用於導入轉基因的病毒載體系統一般是攜帶轉基因的複製缺陷型逆轉錄病毒(Jahner等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826927-6931，1985；Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152，1985)。通過在單層產病毒細胞上培養卵裂球實現簡單有效的轉染(Van der Putten等，supra，1985；Stewart等，EMBO J.6383-388，1987)。此外，還可以在較後的時期進行感染。可以將病毒或產病毒細胞注射進入囊胚腔(Jahner等，Nature 298623-628，1982)。大多數起始轉基因個體將是轉基因嵌合體因為摻入僅僅發生於形成轉基因非人動物的一部分細胞。而且，起始轉基因個體可含有在基因組不同位點的多種轉基因的逆轉錄病毒的插入，這些插入的轉基因通常會在子代中發生分離。此外，通過對妊娠中期胚胎進行子宮內逆轉錄病毒感染，將轉基因導入生殖系也是可能的，雖然效率較低(Jahner等，見上文，1982)。
胚胎幹細胞(ES)也可以作為導入轉基因的靶細胞。ES細胞可以從體外培養的植入前胚胎得到並且與胚胎進行融合(Evans等，Nature 292154-156，1981；Bradley等，Nature 309255-258，1984；Gossler等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 839065-9069，1986；Robertson等，Nature 322445-448，1986)。通過DNA轉染或逆轉錄病毒介導的轉導可以將轉基因有效地導入ES細胞。此類轉化了的ES細胞此後可以與來源於非人動物的胚囊胚泡結合。此後，ES細胞克隆化形成胚胎並且有助於所得到的嵌合動物的生殖系形成(見Jaenisch，Science 2401468-1474，1988)。
本發明還提供了多種DMSG盒，其包括至少兩種本發明的DMSG盒。其中第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列可以編碼含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA。在多種DMSG盒中，此種第一DMSG盒含有至少第二DMSG，其中第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼例如含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。在一個實施方案中，第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼的第一中間體siRNA的5』部分可以與第二中間體siRNA的5』部分互補，其中第一和第二中間體siRNA分子選擇性雜交形成活性siRNA，它能夠介導RNAi。
在另一個實施方案中，多種DMSG盒中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA有意鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。在進一步的實施方案中，多種DMSG盒中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，由此第一和第二經編碼的中間體siRNA分子能夠選擇性雜交形成功能雙鏈siRNA。
還提供了這樣的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA，並且其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分的siRNA。在另一個進一步的實施方案中，本發明提供了這樣的多種DMSG盒，其中，第一DMSG盒編碼的siRNA的5』部分與第二DMSG盒編碼的siRNA的5』部分互補。在另一個進一步的實施方案中，在多種DMSG盒中，至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA的反義鏈互補的5』部分的siRNA，並且至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼含有與第二靶RNA的有意鏈互補的5』部分的siRNA。
在另一個實施方案中，提供了這樣的多種DMSG盒，其中DMSG盒被印刷在、固定在、或者以其他方式放置在固體支持物上。固體支持物可以是一般用作核酸分子支持物的任一材料，包括，例如，微晶片如矽片；載玻片；或珠子。多種的DMSG盒可以被放置在固體支持物上從而使多種DMSG盒的單一群體(即編碼相同siRNA)基本上彼此分開。此外，通常將樣本排列成陣列或其它可重複的模式，從而使每個樣本都被賦予一個地址(即陣列上的位置)，因此通過鑑定特定位置上的信號、表型等等，允許使用常規的方法鑑定DMSG盒。將多種DMSG盒點印在陣列特別是可尋址陣列上的另一個優點是自動系統可用於在不同的時間點從一個或多個位置上添加或去除試劑，或用於將不同的試劑添加在特定位置上。除了便於在同一時間檢測多樣本，此類高通量測定法提供了一種這樣的方法，該方法用於檢測兩份、三份或多份的單一樣本，從而增加所得到的結果的可靠性，並且該方法用於在與測試樣本相同的條件下檢測對照樣本，從而提供了內部標準以比較來源於不同分析方法的結果。
如此處所公開，DMSG盒的微陣列可以用於反向轉染細胞，從而提供了一種鑑定能夠通過RNAi多樣化地影響細胞表型的DMSG盒的方法。此種方法在此處稱為「RNAi的微陣列」(MAR)，此類方法是基於使本發明方法和組合物適用於細胞微陣列(反向轉染)方法(Ziauddin和Sabatini，Nature 411107-110，2001；美國專利申請號US 2002/0006664 A1，2002年1月17日，每篇文獻此處引用作為參考)，其中將核酸分子置於固體支持物上，在允許核酸分子進入細胞的條件下，將細胞與支持物上含有該核酸分子的位置相接觸(見實施例8)。如此處所公開，使用多種DMSG盒可以實施MAR，其中，當細胞與含有DMSG盒的支持物相接觸時，對於表型的改變可以通過檢測細胞的一種或多種表型。當檢測到表型改變了的細胞(即表型不同於與支持物/DMSG盒接觸之前細胞的表型)時，就可得知在該位點的DMSG盒，從而鑑定出該DMSG盒影響參與該表型的基因的表達。
能夠根據MAR方法檢測的細胞的表型可以是任意表型，並且可以是基於敲低參與該表型的基因的表達的由DMSG盒編碼的siRNA。照這樣，多種的DMSG盒可以代表多種基因中的任意一種基因，包括，例如，基因家族如生長因子或生長因子受體基因家族，或G蛋白基因家族；具有共同功能的一組基因如編碼蛋白激酶的一組基因(例如蛋白激酶A基因、蛋白激酶C基因、鈣-鈣調蛋白依賴的蛋白激酶基因等等，還有此類基因的組合)，或編碼轉錄因子的一組基因；以特殊方式被調控的一組基因，如以組織特異方式或發育階段特異方式被調控的基因，或當細胞與刺激物如毒素(例如有毒金屬離子或化學治療試劑)接觸時，或受到環境條件刺激時(例如熱、紫外線或電離輻射)所誘導的一組基因。
DMSG盒的陣列可以在固體支持物上的兩個或多個位點上包括相同或不同的DMSG盒。當在兩個或多個位點上的DMSG盒相同時(即編碼相同的siRNA)，每一個位點可以與不同的細胞類型接觸或與具有不同表型的相似細胞類型接觸，從而允許該方法用於鑑定不同細胞中RNAi的不同效應。例如，在含有相同DMSG盒的陣列的兩個或多個位點上所接觸的細胞可以是正常細胞(即從健康個體如人來源的細胞)和相應的異常細胞(即與正常細胞為相同類型的細胞，但是是來自患有病理性疾病的個體的細胞如癌細胞、病毒或細菌感染細胞、來自患有先天性疾病、自身免疫疾病的個體的細胞等等)，其中該方法允許鑑定能夠差異影響異常細胞而不是相應的正常細胞(或反之亦然)表型的DMSG盒，此種具有這種潛能的DMSG盒可用作治療劑。相比較而言，當在兩個或多個位點上DMSG盒不同(即編碼不同的siRNA分子)時，每個位點可能，但非必需，與相同細胞類型接觸，細胞可以是上面例舉的正常或異常細胞，因此提供了鑑定沉默一個或多個目的基因的DMSG盒的方法。
相應地，本發明提供了含有點印於固體支持物優選地是在陣列中，特別是在可尋址陣列中的多種DMSG盒的組合物，其中多種的DMSG盒可以是相同的或不同的或它們的組合(即它們的一些，但不是全部，是一樣的)，並且其中不同的多種DMSG盒可以是隨機的(即編碼任意序列的siRNA-例如利用所有四種脫氧核糖核苷酸通過組合方法而產生的序列)、偏性的(即編碼具有優選序列的siRNA-例如僅利用三種脫氧核糖核苷酸通過組合方法而產生的序列)、或富於變化的(即編碼基於已知siRNA序列，但在一個或幾個特定位點上變化了的siRNA；見，例如美國專利號5,571,698；美國專利號5,998,142，每個專利此處引用作為參考)。在一個實施方案中，多種的DMSG盒被點印在微晶片或載玻片上，優選的是在可尋址陣列上。在一方面，此種微陣列中的多種DMSG盒被點印，從而，當與適當的試劑(例如轉染試劑)和細胞相接觸時，DMSG盒能夠穿過細胞膜進入細胞，從而允許反向轉染。另一方面，提供了含有此種微陣列的試劑盒。
如此處所公開的，本發明的組合物被用於通過靶向一種或多種RNA分子介導RNAi，其中所述RNA分子可以是核糖體RNA分子、mRNA分子、病毒RNA分子等等。相應地，本發明提供了在細胞內介導靶RNA的RNA幹擾(RNAi)的方法。通過將至少一種DMSG盒導入細胞可以實現此種方法，由於含有被該至少一種DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達引發靶RNA的降解，從而在所述細胞內介導RNA幹擾。在一個實施方案中，該至少一種DMSG盒編碼與靶RNA有意鏈互補的中間體siRNA。在另一個實施方案中，至少兩種DMSG盒被導入細胞，其中該至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，並且其中該至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。在進一步的實施方案中，與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA的5』部分與與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA的5』部分互補，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
如此處所公開，靶RNA可以是存在於樣本或細胞中的任意RNA分子，包括內源或外源RNA和編碼或非編碼RNA。例如，當RNA病毒已經感染細胞時，可以設計siRNA使其靶向RNA病毒的編碼或非編碼部分，從而介導病毒RNA的RNAi。靶RNA也可以是snRNA、hnRNA或mRNA分子，由此siRNA能夠敲低編碼hnRNA和mRNA的靶基因的表達，或阻止hnRNA到mRNA的加工。照這樣，應該認識到本發明的方法能夠用於介導細胞中內源基因表達的RNA分子或外源RNA分子的RNAi。相應地，本發明還提供了通過RNAi在樣本或細胞中敲低靶基因表達的方法。如此處所應用，當談及RNAi對於基因表達的效果時，術語「敲低」是指基因表達的水平被抑制、或降低至低於通常在基本上相同但缺乏RNAi的條件下檢測時所觀察到的水平。
例如將樣本與至少一種本發明的DMSG盒接觸，可以進行敲低基因表達的方法，其中表達含有由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA引發靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而敲低樣本中靶基因的表達。靶基因可以是內源基因或者可以是被導入細胞並在細胞中瞬時或穩定存在的外源基因。
用於實踐此種方法的樣本可以是反應混合物，其中RNAi是利用基本上純化的試劑如純化的靶RNA分子和酶以及需要的話還有為中間體siRNA分子表達所需的其它因子在體外進行的，其中所述靶RNA分子可以是分離的天然存在的RNA分子(如細胞提取物中的RNA分子)，或者可以是化學合成的或重組產生的RNA分子，其中所述酶包括例如適當的RNA聚合酶。例如，反應混合物可以是體外偶聯的轉錄/翻譯反應，其中含有由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA能夠減少所產生的翻譯產物的量。樣本也可以是細胞樣本，它可以是分離的細胞如培養基中的細胞或生物組織或器官樣本中的細胞，或者是生物體中原位的細胞。當樣本含有一個細胞時，可以將DMSG盒與該細胞相接觸從而將DMSG盒導入細胞，從而表達所編碼的中間體siRNA。當細胞在生物體原位時，例如可以通過將含有DMSG盒的組合物施用於細胞的位點或給該細胞群提供循環的血管內將該DMSG盒靶向特定細胞或細胞群。
例如通過將至少兩種DMSG盒與樣本相接觸，如導入含有靶基因的細胞，可以實施敲低靶基因表達的方法，其中至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼含有與靶RNA(由靶基因編碼)有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，並且其中至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。在另一個實施方案中，與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA的5』部分與與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA的5』部分互補，從而第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
本發明還涉及在個體內通過誘導針對介導疾病的靶RNA的RNAi改善RNA介導的疾病的方法。如此處所使用，「RNA介導的疾病」是指以存在參與這種疾病相關的跡象或症狀的RNA分子為特點的病理性疾病。通過舉例的方式，RNA介導的疾病可以是遺傳性疾病，其中內源基因的突變或其他變化導致編碼異常多肽的mRNA的產生。通過細菌感染例舉RNA介導的疾病，其中從感染性細菌表達的RNA編碼對被感染個體具有有害作用的多肽。本發明的方法能夠通過分別降低或抑制異常多肽或細菌多肽的表達改善此類RNA介導的疾病。進一步通過病毒感染例舉RNA介導的疾病，其中病毒表達的RNA編碼病毒複製和/或感染所需的多肽。本發明的方法能夠通過降低或抑制病毒的複製和/或擴散改善由於此種感染性病毒引起的RNA介導的疾病。由這些例子應該認識到根據本發明的方法可以改善多種疾病。
例如通過將表現出(或敏感於)RNA介導的疾病的個體細胞與至少一種DMSG盒相接觸，可以實施改善RNA介導的疾病的方法，其中含有由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的一種或多種中間體siRNA分子的siRNA的表達能夠介導針對靶RNA的RNAi。個體可以是患有此類疾病的任意一種生物，包括脊椎動物有機體，例如哺乳動物，諸如寵物的家養動物或諸如牛、馬、豬或綿羊的商業重要動物，並且特別是人。
可以離體(ex vivo)將個體細胞與DMSG盒相接觸，然後回施至受試者體內。此種方法可能是有用的，例如，對於雜合型疾病如鐮狀細胞性貧血，其中疾病是由於一個或兩個血紅蛋白基因突變引起的，並且其中患有疾病的個體雜合型表達一種正常血紅蛋白和一種缺陷型血紅蛋白。通過從此種雜合子個體獲得骨髓細胞，將細胞與編碼針對突變RNA序列的siRNA的DMSG盒離體接觸，並且將細胞返回性重新導入病人，其中異常血紅蛋白分子的表達將被敲低。如果期望，可以將DMSG盒可操作連接於螢光化合物，從而可以選擇含有DMSG盒的骨髓細胞。此種方法的一個優點是，當骨髓細胞群體中的白細胞前體細胞和紅細胞前體細胞是經遺傳修飾而含有DMSG盒時，編碼的siRNA的任一表達如果對來源於經此種經遺傳修飾的白細胞前體細胞的成熟白細胞中有影響的話，影響也是很小的，因為白細胞不表達血紅蛋白基因。
還可以通過將DMSG盒施與受試者從而在體內使它接觸到含有靶RNA的細胞的方式，將個體細胞與DMSG盒接觸。靶RNA可以是內源RNA，包括編碼RNA(如hnRNA或mRNA)或非編碼RNA(如X-染色體調節子，或其它結構或功能RNA如snRNA)，或者靶RNA可以是外源RNA，例如，由於個體的感染而存在於細胞中的細菌或病毒RNA。本發明的體內基因治療的方法的優點是靶向異常RNA或個體細胞中非正常表達的RNA，並且因此沒必要考慮如DMSG盒進入正常(健康)細胞並在其中表達的影響，因為含有DMSG編碼的中間體siRNA的siRNA在缺乏靶RNA的細胞中是沒有效果的。
為了施用於個體，通常將DMSG盒製劑為適於施用於個體的組合物。因此本發明還提供了含有至少一種DMSG盒並適合施用於活的個體的組合物。照這樣，DMSG盒可用作治療患有RNA介導疾病的受試者的藥物。
用於製備施用於個體的組合物的可藥用載體是熟知的，並且包括，例如，水溶液如水或生理性緩衝鹽水，或其它溶劑或介質如乙二醇、甘油、油如橄欖油或可注射的有機酯類。可藥用載體可以包括生理可接受化合物，它們具有如穩定或增加DMSG盒的吸收的作用。此類生理可接受化合物包括，例如糖類(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)，抗氧化劑如抗壞血酸或穀胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質或其它穩定劑或賦形劑。應該認識到可藥用載體包括生理可接受化合物的選擇依賴於，例如，組合物的施用方式，它可以是諸如口服的或腸胃外施用如靜脈內注射，和注射、插管、體表塗藥或本領域已知的其它此類方法。含有該DMSG盒，或多種DMSG盒的組合物也可含有第二種試劑，如診斷試劑、營養物質、毒素或治療劑，例如，當DMSG盒被施用用於治療癌症時第二種試劑為癌症化療劑(例如，DSMG盒通過敲低癌基因如Ras或p53的表達)。
可以將DMSG盒摻入包封材料中，如摻入水包油乳劑、微乳劑、微膠粒、混合微膠粒、脂質體、微球體或其它多聚體基質(見，例如，Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，Boca Raton，FL 1984)；Fraley等，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每篇文獻此處引用作為參考)。例如，脂質體由磷脂或其它脂類組成，是無毒的，對於製造和施用者而言脂質體是相對簡單的生理可接受並可代謝的載體。「隱形(stealth)」脂質體(見，例如，美國專利號5,882,679；5,395,619和5,225,212，每一專利此處引用作為參考)是此類包封材料的例子，特別是用於製備實踐本發明方法的組合物，並且其它「masked」脂質體同樣可以被使用，此類脂質體延長了DMSG盒在循環中存留的時間。例如，還可以用特異受體或配體對陽離子脂質體進行修飾(Morishita等，J.Clin.Invest.，912580-2585，1993，此處引用作為參考)。此外，利用如腺病毒-多聚賴氨酸DNA複合物，可以將DMSG盒導入細胞(見，例如，Michael等，J.Biol.Chem.2686866-6869，1993，此處引用作為參考)。
此處公開的組合物可以分別通過多種途徑施用於個體，包括例如口服或腸胃外施用，如靜脈內施用、肌肉內施用、皮下施用、眼內施用、囊內施用、腹腔內施用、直腸內施用、池內施用，或通過被動的易於通過皮膚吸收的方式施用，如皮膚貼片或經皮離子電滲。此外，組合物還可以通過注射、插管、口服或體表途徑被施用，其中後者可以是被動的，例如通過軟膏直接施用，或者是主動的，例如使用鼻噴霧器或吸入器，其中組合物中的一種成份是適當的推進劑。藥物組合物也可以施用於RNA介導的疾病部位，例如，靜脈內或動脈內施用入供給腫瘤的血管。
在進行本發明方法時施用的DMSG盒的總量可以作為單一劑量、或作為大丸劑或通過輸液在相對短的時間內施用於受試者，或者應用分步治療法施用，其中在延長的時間期間施用多劑量。應該認識到用於治療個體中RNA介導的疾病的藥物組合物的量依賴於多種因素，包括受試者的年齡和總體健康情況以及施用途徑和被施用的治療次數。考慮到這些因素，熟練的技術人員將調整所需的特定劑量。一般而言，最初是利用一期和二期臨床試驗來確定組合物的劑型和施用的途徑和頻率。
組合物可以製成口服製劑的形式，如片劑，或溶液或懸液形式；或者組合物可以包含與適於腸道或非腸道應用的有機或無機載體或賦形劑的混合物，並且組合物可以與如通常無毒的、可藥用的載體混合製成片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液、乳劑、懸液或其它可使用形式。除了上述的載體外，載體還包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯樹膠、明膠、D-甘露醇、澱粉糊、三矽酸鎂、滑石、玉米澱粉、角蛋白、膠體矽、馬鈴薯澱粉、脲、中等鏈長甘油三酯、葡聚糖，以及其它適合用於生產固體、半固體或液體形式製品的載體。此外可使用輔劑、穩定劑、增稠劑或著色劑以及香料，例如穩定乾燥劑如triulose(見，例如，美國專利號5,314,695)。
本發明還提供在細胞群中示蹤經歷DNA介導的基因沉默的特異細胞或特異細胞群。此種方法可通過如下進行，例如通過將含有可檢測標記的至少一種DMSG盒導入特異細胞(或特異細胞群中的每一個細胞)，並且檢測可檢測標記，從而在細胞群體中示蹤經歷DNA介導基因沉默的特異細胞或特異細胞群。在一個實施方案中，將第一DMSG盒和第二DMSG盒導入特異細胞或特異細胞群，其中第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，並且其中第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。
本發明還提供了鑑定經歷DNA介導的基因沉默的細胞的方法。此種方法可通過如下進行，例如在足以將DMSG盒導入細胞的條件下將至少一個細胞與至少一個可操作連接到可檢測標記上面的DMSG盒接觸，並且檢測細胞中至少一個DMSG盒的可檢測標記。在一個實施方案中，該方法包括將至少一個細胞與第一DMSG盒和第二DMSG盒接觸，其中第一DMSG盒編碼含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，並且其中第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。在本發明方法的另一個實施方案中，第一DMSG盒的可檢測標記不同於第二DMSG盒的可檢測標記，並且檢測步驟包括監測第一DMSG盒的可檢測標記和/或第二DMSG盒的可檢測標記。當在單個細胞中鑑定出第一和第二可檢測標記時，該細胞被鑑定為經歷DNA介導基因沉默的細胞。示蹤和/或鑑定包含含有可檢測標記的DMSG盒的細胞的方法提供了選擇含有一種或多種DMSG盒的細胞，或鑑定當施用DMSG盒(或細胞)於受試者後含有一種或多種DMSG盒的細胞的一種手段。
本發明還提供了評價測試細胞中基因功能的方法。此種方法可通過如下進行，例如將至少一個DMSG盒導入測試細胞，並且觀察當由DMSG盒編碼的siRNA表達時測試細胞的表型，由此將測試細胞與對照細胞的表型進行比較而指示靶基因的功能，從而評估測試細胞中靶基因的功能。測試細胞可以是能夠預期表達siRNA以確定通過siRNA介導的RNAi如何影響基因表達的任何細胞。所檢測的表型一般是靶基因介導的表型，通常是由基因編碼的RNA介導的表型，並且特別是由基因編碼的多肽所介導的表型。照這樣，應該認識到待檢測的表型將依賴於特定靶基因。在一個實施方案中，該方法提供了鑑定靶基因賦予的表型的一種手段。
本發明還提供了鑑定一種試劑是否有效應或影響測試細胞中特異基因的方法。用於此處的術語「影響」和「效應」是指由試劑引起的作用(「效應」)和此種作用的結果(「影響」)。雖然在此處一般是指由於試劑引起的效應，還應該認識到確定為「效應物」試劑的試劑影響靶基因的表達。確定一種試劑是否對細胞中特異基因有效應的方法可以按如下方法進行，例如，通過在測試細胞中表達含有由本發明的至少一個DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA，其中中間體siRNA含有與測試細胞中特異基因編碼的RNA分子互補的5』部分，將測試細胞和對照細胞與試劑相接觸，並且比較測試細胞的表型和對照細胞的表型，從而評價該試劑是否對測試細胞中的特異基因有效應。在一個實施方案中，該方法包括在細胞內表達第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA和第二DMSG盒編碼的第二中間體siRNA，其中第一中間體siRNA含有與靶RNA有意鏈互補的5』部分，其中第二中間體siRNA含有與靶RNA反義鏈互補的5』部分，並且其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。與對照細胞的表型相比測試細胞表型的變化可鑑定該試劑是否能作為影響特異基因的試劑。
本發明的篩選方法提供了下述優點，即它能夠用於高通量分析並且，因此，可被用於篩選測試製劑的組合文庫以鑑定那些對靶基因表達有效應的試劑。製備用於預期活性測定的分子的組合文庫的方法在本領域是已知的並且包括，例如，製備肽的噬菌體展示文庫的方法，其中所述肽可以是限制肽(見，例如，美國專利號5,622,699和5,206,347；Scott和Smith，Science 249386-390，1992；Markland等，Gene 10913-19，1991；每篇文獻此處引用作為參考)；肽文庫(美國專利號5,264,563，此處引用作為參考)；肽模擬物文庫(Blondelle等，Trends Anal.Chem.1483-92，1995)；核酸文庫(O′Connell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 935883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science 249505-510，1990；Gold等，Ann.Rev.Biochem.64763-797，1995；每篇文獻此處引用作為參考)；寡糖文庫(York等，Carb.Res.28599-128，1996；Liang等，Science 2741520-1522，1996；Ding等，Adv.Expt.Med.Biol.376261-269，1995；每篇文獻此處引用作為參考)；脂蛋白文庫(de Kruif等，FEBS Lett.399232-236，1996，此處引用作為參考)；糖蛋白和糖脂文庫(Karaoglu等，J.Cell Biol.130567-577，1995，此處引用作為參考)；或包括例如藥物或其它藥用試劑的化學文庫(Gordon等，J.Med.Chem.371385-1401，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13351-360，1995，每篇文獻此處引用作為參考)。多核苷酸作為能夠影響基因表達的試劑是特別有用的，因為核酸分子對細胞內的靶具有結合特異性，其中所述細胞內的靶包括天然存在的細胞多肽，並且因為具有此種特異性的合成分子能夠容易地製備和鑑定(見，例如美國專利號5,750,342，此處引用作為參考)。
本發明還提供了試劑盒，它們含有至少一個本發明分離的DNA分子、至少一個本發明的DMSG盒、或者它們的組合。本發明的試劑盒還可以含有，例如，用於將此種核酸分子導入細胞的試劑，例如，轉染輔助劑，或者可以含有對於擴增核酸分子或將核酸分子(例如，一種或多種DMSG盒)導入特定細胞類型有用的一個或供選擇的不同載體。當試劑盒含有至少一個這樣的DMSG盒時，所述DMSG盒包括含有限制性核酸內切酶識別位點或重組酶識別位點或它們的組合的異源核苷酸序列，該試劑盒可進一步包括至少一個啟動子或終止子，或它們的組合，其中啟動子或終止子含有足以可操作連接至編碼中間體siRNA的核苷酸序列上的末端。照這樣，本發明的一種試劑盒可以包含多種不同的啟動子、增強子等等，例如，允許在細胞內或特定細胞類型、或在特定條件下如暴露於誘導劑時，以預期水平表達編碼的中間體siRNA的啟動子和增強子等。
在另一個進一步的實施方案中，該試劑盒含有DMSG盒，其中異源核苷酸序列包括至少一個啟動子、至少一個終止子、或它們的組合。在一個實施方案中，異源核苷酸序列包含人U6基因啟動子或RNA聚合酶III啟動子。在另一個實施方案中，異源核苷酸序列包含至少一個增強子元件。
在一個實施方案中，試劑盒含有至少兩種本發明的DNA分子或DMSG盒，其中由兩種核酸分子編碼的中間體siRNA分子能夠選擇性雜交形成功能雙鏈siRNA分子。照這樣，該試劑盒可以含有用於介導RNAi的試劑。
在本發明公開之前，由於化學合成RNA的高成本和低穩定性，RNA介導的基因沉默曾經是困難的並且是昂貴的。本發明通過提供DNA介導的基因沉默克服了以前RNA介導的基因沉默的局限，其中如此處所公開的DNA分子被用作運載工具以攜帶用於RNAi的序列信息，並且DNA分子還作為介導子被導入細胞用於特異基因的沉默。包括dsDNA分子在內的DNA分子提供了另外一個優點，即它們能夠整合入宿主細胞的染色體，從而產生穩定的並且基本上永久的效應。此種特性允許產生具有永久RNAi效應的轉基因生物，包括植物和動物，因此提供了這樣的模型系統，它允許研究例如基因或基因組合的功能，並且它能夠模擬病理性疾病，特別是與基因或基因產物的功能異常缺乏相關的疾病。DNA分子比RNA易於產生和操作並且是廉價的。儘管對RNA的修飾冒喪失RNAi功能的危險，但對DNA的修飾，如用螢光標記物標記或在末端或不改變DNA分子功能的其它位點連接用於靶向遞送的多肽，不改變編碼的中間體RNA分子或，因此，不改變介導RNAi的能力。此類修飾使得可選擇已經接受RNAi處理的細胞而與沒有接受RNAi處理的細胞分開，或者使得可靶向生物體中的特定細胞類型。
如此處所公開，編碼靶RNA分子有意鏈和相應的反義鏈的DNA分子，如DMSG盒，可介導基因沉默(見實施例)。通常，編碼的siRNA分子具有短於約30個核苷酸的長度，因此使非特異性抑制被活化的可能性降到最低，並且通常是長度約為20-25個核苷酸，特別是約21個核苷酸，它能夠有效地誘導RNAi(Elbashir等，EMBO J.，236877-88，2001)。同樣，siRNA鏈和靶RNA鏈之間的錯配通常被最小化，從而使選擇性最大化；通常，在RNAi的兩條RNA鏈之間或反義鏈與靶mRNA之間沒有錯配。
含有增強子元件、啟動子、編碼有意或反義RNA鏈的模板序列、和兩個轉錄終止子的DMSG盒示例於圖1A。根據設計為能夠在靶細胞內從DMSG盒轉錄出短RNA的RNA聚合酶(在該例子中為pol III)的需求設計這些元件。通過利用強或弱的增強子和啟動子元件、多重增強子元件、或其它能夠調節RNA聚合酶活性的元件能夠達到預期的表達水平。在如圖1所描述的例子中，選擇人RNA聚合酶III用於從DMSG盒轉錄短RNA，並且使用人U6基因啟動子。當天然位於距離U6基因啟動子的轉錄起始位點約224個核苷酸的位置時可通過聚合酶III刺激轉錄的增強子即人遠側序列元件(「DSE」；ATTGCAT)在作為例子的DMSG盒中定位於轉錄起始位點上遊大約79核苷酸處。在人U6基因中DSE下遊是近側序列元件(「PSE」；CTTACCGTAACTTGAAAGTA；SEQ ID NO34；比較小鼠PSE；CTCACCCTAACTGTAAAGTA；SEQ ID NO35，它也可用於DMSG盒)和如在U6基因中那樣的TATA盒(也見，SEQ ID NO36，人U6基因上遊調控序列，包括DSE、PSE和TATA調控元件)。U6基因啟動子的一個優點是它完全處於編碼中間體siRNA的模板核苷酸序列的外部，並且使用聚合酶III系統的優點在於聚合酶III能夠從基因的僅僅幾個拷貝轉錄出大約100,000個RNA拷貝(Weinberg和Penman，J.Mol.Biol.3289-304，1968)。
如此處所公開，中間體siRNA可以通過下面方法由DMSG盒產生，可以通過將終止子序列包含於盒中從而使中間體siRNA具有合適的長度並且含有預期的3′突出端，或者通過構建使轉錄本從模板上「脫落」的DMSG盒而產生。可以通過下述「脫落式」機制終止轉錄，例如，通過將DMSG盒構建成線性表達盒(見圖1B)，其中該盒在模板序列的最後一個核苷酸處終止。同樣地，通過將限制性核酸內切酶識別位點引入盒中的預期的位置並且，用適當的限制性酶剪切包含DMSG盒的核酸分子(例如含有所述盒的環狀載體)能夠實現脫落。以這樣的方式，正在進行轉錄的RNA聚合酶在到達模板末端之後將脫離模板，因此產生預期的中間體siRNA轉錄本。此類方法與使用如噬菌體RNA聚合酶如T7、T3或Sp6 RNA聚合酶或細菌RNA聚合酶如大腸桿菌RNA聚合酶進行體外轉錄的標準方法相似。
含有位於模板序列之後的終止子元件的DMSG盒圖示於圖1A。U6基因的聚合酶III終止子元件是一段可以在一個胸腺嘧啶(「T」)鹼基處有效終止轉錄的短序列。與利用這種終止元件相關的是，可以選擇用於基因沉默的RNA序列以至於最後幾個鹼基是與終止子重疊的尿嘧啶(「U」)。為了防止滲漏終止事件發生而得到長的RNA，第二個終止子可以位於第一個終止子之後(下遊)(圖1A)。含有終止子元件的DMSG盒可以方便地串聯放置在線性或環狀核酸分子如載體上(見圖2)。
含有三到五個連續胸腺嘧啶核苷殘基的核苷酸序列可以作為RNA聚合酶III轉錄的終止子。例如，人U6基因RNA聚合酶III(polIII)終止子包括核苷酸序列TTTTTACATCA(SEQ ID NO48)，儘管終止子的末端還沒有清楚的定義，並且含有非T的序列可以影響終止。同樣地，小鼠U6基因聚合酶III終止子含有核苷酸序列TTTTgTTcc(SEQ ID NO49)。如以上所討論，畢竟這些天然存在的終止子可能被滲漏，以至於終止不總是在特定鹼基處發生。如此處所公開，已經設計出經修飾的聚合酶III終止子以更加有效地終止聚合酶III轉錄，以至於在終止子區域內終止事件發生的百分率更高。具體而言，從天然存在的人U6基因終止子設計的經修飾聚合酶III終止子具有核苷酸序列TTTTTacagTTTTTg(SEQ IDNO50；也見，實施例1，和SEQ ID NO3)，並且從天然存在的小鼠U6基因終止子設計的經修飾聚合酶III終止子具有核苷酸序列TTTTGTTcgTTTTTg(SEQ ID NO51；也見，實施例4，和SEQ ID NO18)。
為了廣泛應用，期望將DMSG盒的所有元件以與那些用於基因轉移例如轉染和感染相似的方式放置在一個載體上。在一個實施方案中，DMSG盒被設計於具有一個或多個下面特性的載體骨架上。載體可有模板克隆位點以至於對應於特定靶基因的模板序列的dsDNA寡核苷酸常規地被插入到載體中而不幹擾盒的整體功能。可以設計限制性位點從而使，當消化時，不從啟動子或終止子添加或刪除額外的核苷酸。此外，在使用聚合酶III啟動子的情況下，第一個鹼基是鳥嘌呤(「G」)或腺嘌呤(「A」)，酶需要它作為起始核苷酸(Goomer和Kunkel，Nucleic Acids Res.，184903-4912，1992)。在本發明的一個實施方案中，BsmI限制性核酸內切酶識別位點在啟動子和終止子之間被串聯使用，並且是以相反方向串聯(圖3和實施例6)。在另一個實施方案中，啟動子和/或終止子兩側是限制性核酸內切酶識別位點以至於不同的啟動子/終止子可被插入，從而代替例舉的啟動子/終止子。當用限制酶消化時，用於插入模板序列、啟動子、終止子等等的選擇性設計的粘性末端保持完整。通過這種設計，如果鳥嘌呤和胞嘧啶被分別選擇作為模板序列的第一個和最後一個鹼基，可避免「額外鹼基」並達到最大的RNAi效應。
使用其它限制酶位點也可以實現相似的設計。啟動子和終止子可以是任意天然或人工的序列，它攜帶能被任意天然或人工設計的聚合酶轉錄的預期特徵。載體可以是任意可商業獲得的載體或特別設計的質粒、病毒、噬菌體、噬菌粒、線性表達載體、或任意其它類型的用於轉移遺傳信息的運載工具。
DMSG盒可以通過轉染技術遞送，轉染技術包括但不限於鈣沉澱、電穿孔、陽離子脂質體複合物、DEAE-葡聚糖複合物、多聚季胺(polybrene)試劑等等。使用機械方法如通過微注射或使用生物彈道射擊顆粒，也可以將DMSG盒導入細胞。通過病毒感染可以將攜帶於病毒載體上的DMSG盒導入細胞。通過連接DNA分子於轉導進入細胞的信號肽上也能遞送DMSG盒。例如，可以將DMSG分子偶聯到指導DNA進入細胞的HIVTAT轉導結構域或細胞滲透肽上(Becker-Hapak等，Methods 3247-256，2001；Gallouzi和Steitz，Science 55481895-1901，2001)。
DNA分子可以被修飾而不影響基因沉默的介導RNA。一些應用可以來源於此類修飾，其包括但不限於鑑定和選擇已經獲得了一個或多個基因沉默信號的細胞、將DMSG試劑靶向特定細胞群、與DMSG分子一起遞送其它信號或效應分子等等。
通過將DNA分子直接與有顏色的標記物進行標記，如螢光素(FITC)、藻紅蛋白、Cy3、Cy5、德克薩斯紅、或其它可得的標記物，或間接與能夠通過偶聯其它有色標記物進行標記的標記試劑如生物素或地高辛配基進行標記，以實現對DMSG處理細胞群的選擇。直接標記適合用螢光輔助的細胞分選(FACS)或螢光顯微鏡的方法追蹤活細胞。間接標記則要求在第二次標記之前對細胞或組織進行固定。在一個實施方案中，編碼有意或反義RNA分子的dsDNA的單鏈或雙鏈的3′末端在合成時用FITC進行標記。當將此類DNA分子導入細胞時，可以通過螢光跟蹤那些接收DMSG分子並且經受基因沉默效應的細胞。這使得能夠選擇特異細胞群、組織、或有機體以進行基因功能研究，而可以避免通過混合的細胞群產生的假象並因此得到可靠的數據。DNA分子的修飾可以在雙鏈核DNA分子3′末端、5′末端、或兩者、和任意一條鏈上，或者可以使用此處公開的或本領域已知的方法在任何一個或多個內部核苷酸上進行修飾。
用不同的標記物標記不同的DMSG盒而不影響它們的RNA編碼能力的潛能和導入多種DMSG盒的便利可以用於產生多基因敲低。基因經常在多基因產物參與的途徑和網絡中起作用。一個基因的敲低僅能夠揭示部分或有限的基因功能，而相關基因網絡的敲低能夠導致對基因功能和關係的更系統的理解。多基因敲低也被用於治療的實際應用中。
DMSG分子可以用於靶向特異細胞類型。這種細胞特異的靶向可以通過將DMSG分子偶聯到能夠指導轉導入或內吞入特異細胞群的肽或多肽或其它靶向分子而實現。
用於偶聯的DNA分子的簡單性和可進入性也使將DMSG分子與一個或多個效應分子連接成為可能，所述效應分子如能夠在細胞內引起效應的放射性同位素、化學試劑、肽或多肽、其它多核苷酸分子等等。這些與DMSG共遞送的分子的效應可以獲得並且與一個細胞中的基因沉默聯合進行研究。
本發明提供了研究真核系統特別是哺乳動物細胞或生物體中一個或多個基因功能的方法。將靶向目的基因的DMSG盒導入細胞或生物體，即測試細胞或測試生物體。根據需要，將對照DMSG盒、緩衝液或者其它空白處理應用於對照細胞或生物體。將測試或對照細胞或生物體維持在基因沉默發生的條件下。觀察測試細胞或生物體的表型，並將其與適當的對照細胞或生物體的表型相比較。此種與對照細胞或生物體的比較可以在上述的經選擇的細胞群之間進行。對於此種比較，對照細胞是用對照DMSG盒處理的，對照DMSG盒與非對照DMSG盒在包括標記物標記的所有方面是相同的，除了對照分子中的模板序列不針對靶基因外。對照分子中的模板序列可以針對相關的或不相關的具有相同或不同物種特異性的第二個基因，或者針對非天然存在的基因。測試和對照細胞或生物體表型間的不同提供了關於靶基因功能的信息。這些信息單獨是有價值的，或者可以與從其它鑑定或定義基因功能的測定或分析中獲得的信息聯合使用。
本發明還包括確定一個基因產物是否是藥物發明或研發的靶的方法。將能夠誘導基因沉默的DMSG盒導入細胞或生物體。細胞或生物體被維持在基因沉默發生的條件下，並且可以通過導入的DMSG分子上攜帶的標記物選擇被靶向的細胞或生物體。確定基因表達的降低是否對細胞或生物體具有影響，其中如果基因表達的降低有影響，那麼該基因產物可作為藥物發明或研發的靶。效應可以是細胞死亡、分化、細胞分裂變化、或任何其它細胞反應。靶基因可以是，任意細胞來源的天然基因，例如信號轉導或細胞周期控制中的基因，或病毒或其它致病原的天然基因，例如參與肝炎病毒、HIV或其它病毒生命周期的基因等。
還提供了用於產生經遺傳修飾的生物體的方法，其中一種或多種DMSG盒通過染色體的複製從一代傳到下一代。在一個實施方案中，通過微注射可以將針對任意特定基因或多個基因的DMSG分子導入早期胚胎並且成為其染色體的一部分。源於該具有整合的DMSG分子的生殖細胞的動物能夠將轉基因DMSG DNA作為其染色體的整合部分傳遞給後代，從而建立具有由所述DNA插入物所編碼的中間體RNA幹擾的靶基因的動物。與目前基因敲除方法相比較，DMSG敲低不依賴於同源重組並且以極高的成功率進行。值得注意地是，由於通過常規方法進行的多基因敲低若不是不可能的話，實際上是非常困難的，而多重DMSG基因的敲低是可行的。DMSG基因敲低沒必要克隆基因組序列和如傳統基因敲低方法所需要的那樣操作較大DNA構建體。原則上，可以將編碼中間體dsRNA有意鏈和反義鏈的小DMSG盒插入染色體的任意位置用於每個基因敲低。此外，由於存在一些對於轉錄而言失活或難以進入的染色體區域(Izumi和Gilbert，J Cell Biochem.2280-289，1999)，隔離元件(insulator element)(能夠阻斷位於其中的序列受到相鄰染色質結構域或元件的調節效應的結構域邊界)可以被包含於DMSG中以保證所編碼的中間體dsRNA分子的連續轉錄。
可以將DMSG盒微注射進入前核胚胎。具有整合的DMSG分子的被注射胚胎中的一些細胞將發育形成生殖系細胞。來源於這些生殖系細胞的第二代動物將攜帶DMSG盒作為它們的染色體的部分。其它動物如具有整合的DMSG分子的蠅、蠕蟲、或斑馬魚也可以通過適當的轉基因方法產生，同樣也可以產生植物。
本發明還提供了控制基因敲低的方法。基因敲低的時間和水平可以通過控制DMSG DNA的轉錄來操縱。在一個實施方案中，DMSG盒處於外源RNA聚合酶的控制之下，例如轉基因的T7、T3、Sp6、或大腸桿菌RNA聚合酶。編碼聚合酶的基因反過來被可誘導啟動子控制，如當存在誘導製劑(誘導劑)如四環素或蛻皮素時僅通過內源聚合酶II轉錄的啟動子。實際上，當在特異的時間點如某個發育階段期望基因敲低時加入誘導劑使外源RNA聚合酶被表達，它隨後轉錄DMSG盒編碼的中間體RNA。在另一個實施方案中，外源RNA聚合酶處於組織特異性啟動子的控制之下，並且因此僅在特異的組織或器官，例如胰腺外分泌細胞、心臟成肌細胞或神經細胞中表達。結果，DMSG基因沉默僅在特異組織或器官中被激活。該方法可以與可誘導的和多種DMSG基因敲低聯合使用。
本發明還提供了用於治療性或預防性治療疾病的組合物和方法。可以將DMSG分子導入生物體以沉默靶基因，從而逆轉或阻止異常或疾病。可以通過直接施用於生物體表面或通過諸如基因槍的方法施用於表面下的細胞來遞送單獨或包含於治療組合物如適當緩衝劑和其它試劑中的DMSG分子。遞送也可以是內部施用，例如通過注射或以適當的組合物口服遞送，從而保護DNA分子的完整性並且產生基因沉默效應。如果DNA分子被整合入宿主染色體，DMSG分子通過生殖系的治療可以是永久的。
鑑定已知功能的基因傳統上是通過遺傳篩選或通過生物化學方法分離基因產物進行的。然而，此類鑑定也可以通過「分子進化」實現，即從DNA或RNA分子庫中富集和選擇預期的遺傳信息，或者通過反向遺傳學實現，即改變所有或一組基因並檢測在研究條件下具有功能的基因。一個實例是用於從RNA或DNA序列變體庫中選擇靶蛋白的高親和力配體的SELEX(通過指數富集而系統進化配體)方法(Gold，Harvey Lect，47-57，1995；Wang等，J Bol Chem.3522227-22235，1997；White等，J Clin.Invest.8929-934，2000)。通過如用於從隨機或優選的庫中選擇具有預期結合能力的蛋白質的噬菌體展示和核糖體展示的例子也可以證明這種概念(Crameri和Kodzius，Comb.Chem.High Throughput Screen 2145-155a，2001；Schaffitzel等，J.Immunol.Methods 1-2119-125，1999)。DMSG盒上的基因沉默信號是以短的模板序列的形式存在的並，因此，適於作為可以進行選擇的簡併庫而變化。為了產生隨機DMSG盒庫，具有簡併模板序列的經化學合成的單鏈DNA寡核苷酸被DNA聚合酶(如T7 DNA聚合酶；T7聚合酶啟動子以5′-TAATACGACTCACTAT-3′(SEQ ID NO37)為例)轉換成dsDNA。該dsDNA模板序列或者被連接到DMSG盒上，此時兩條鏈都可用於轉錄時，或者以相反的方向被克隆進入雙盒DMSG分子上的每個盒。與RNA介導的RNAi的dsRNA相反，DMSG盒的dsDNA本質有利於任意所選擇序列的分子克隆。因此，涉及設計和使用DMSG盒的方法實際上可以被應用於鑑定這樣的基因，即當它們被敲低時能夠改變細胞事件並因此產生特異表型，如阻滯細胞周期、細胞凋亡、細胞分化、癌樣轉化和對藥物的反應或抗性等。
因此本發明涉及鑑定具有特異功能並且當被敲低時表現出特異表型的基因的方法。在一個實施方案中，模板核苷酸序列的每個鹼基都是4個天然鹼基即A、C、G或T中的任意一個，因此產生具有與細胞中任意基因匹配的潛能DMSG盒的庫。然後將除了模板區域(隨機寡核苷酸合成的區域)外其它區域相同的DNA分子轉染進入足夠數量的細胞。可以進行一步或多步驟的細胞選擇以分離表現出所尋找表型的細胞。可以從這些細胞中獲得雙鏈DNA分子，並且或擴增用於下一輪富集和選擇或克隆並測序。從分離的DMSG盒上的模板序列可以鑑定具有目的功能的候選基因。然後將此類基因通過分子克隆方法克隆或者利用生物信息學方法進行鑑定。
本發明還提供了分離具有特定功能的RNA分子的方法。與上面所述的基因鑑定方法相似，可以將編碼候選RNA庫或組合的DMSG盒導入細胞群或生物體，並從它們當中選擇在研究條件下具有表型的細胞。通過克隆dsDNA和測序模板區域獲得了功能RNA序列。可以以這種手段選擇的功能RNA包括，但不限於，具有高效性和特異性siRNA分子、除了能產生RNAi效應的siRNA分子之外的RNA(如那些具有髮夾結構的分子)、反義RNA、和功能複合體如染色體失活複合體的RNA成分(Meller等，Cell4445-457，1997)。
本發明進一步涉及研究真核細胞中非編碼RNA的生物學功能的方法。已經報導在許多動物中存在天然小RNA(microRNA；miRNA)分子，它們通過與RNAi相關的途徑被加工(Grishok等，Cell 123-34，2001；Hutvagner等，Science 5531834-838，2001；Ketting等，Genes Devel.202654-2659，2001；Lagos-Quintana等，Science 5543853-858，2001；Lau等，Science 5543858-862，2001；Lee和Ambros，Science 5543862-864，2001)。編碼此類RNA(或它們的反義鏈或變體)的DMSG盒可以用於轉染的細胞以研究這些RNA的功能。在這方面，應該認識到，象任意RNA一樣，miRNA能夠做為siRNA的靶。此外，miRNA和siRNA是相似的，因為它們中的每一種都是缺乏多聚(A)尾並被參與RNAi過程的因子識別的短RNA分子。因為DMSG盒被設計用於轉錄短的、確定的RNA，包括如可操作連接於增強子、啟動子、終止子或它們的組合的模板克隆位點的此類盒的框架適於通過用miRNA模板代替siRNA模板來表達miRNA。
DNA介導的RNAi被用於在人或其它真核細胞中敲低基因特異表達。如此處公開，通過DNA介導物所實現的基因沉默在等摩爾的基礎上比相應的通過RNA介導物即siRNA所實現的基因沉默效率要高，這可能是由於靶基因的正義和反義序列的中間體siRNA分子的持續產生，從而能夠在細胞內形成功能雙鏈siRNA並活化針對特異基因的RNAi。相應地，本發明涉及含有用於特異基因抑制的遺傳信息的DNA分子。含有對應於靶基因的模板序列的DNA分子能夠通過RNAi介導基因抑制。雖然本發明的DNA分子使用天然存在的核苷酸進行了例證，應該認識到核苷酸類似物，包括非天然存在的合成核苷酸或經修飾的天然存在的核苷酸，也能夠被用於構建核酸分子，如DMSG盒。此類核苷酸類似物在本領域是熟知的並可經商業獲得，含有此類核酸類似物的多核苷酸也是這樣(Lin等，Nucl.Acids Res.225220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry 3411363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.1568-73，1997，每篇文獻此處引用作為參考)。同樣地，雖然連接多核苷酸的核苷酸的共價鍵通常是磷酸二酯鍵，該共價鍵也可以是大量其它鍵中的任意一種，包括硫代二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、肽樣鍵或任意其它在本領域用於連接核苷酸以產生合成多核苷酸的鍵(見，例如Tam等，Nucl.Acids Res.22977-986，1994；Eclcer和Crooke，BioTechnology 13351-360，1995，每篇文獻此處引用作為參考)。當DMSG盒處於含有核酸水解活性的環境中，包括例如組織培養基或當施用於活的受試者時，非天然存在的核苷酸類似物或連接核苷酸的鍵的摻入可能是特別有用的，因為經修飾的核酸分子對降解較不敏感。
模板核苷酸序列是本發明對應於靶基因序列至少一部分的分離DNA分子(或DMSG盒)的元件。照這樣，模板編碼能夠形成siRNA並通過細胞RNAi機械複合體激發RNA的降解的中間體siRNA分子。靶mRNA和靶RNA此處是指那些通過導入DMSG分子被阻止功能的RNA。此種RNA能夠從內源或外源基因轉錄，或通過轉染或其它從細胞或生物體外部向內部轉移的方法作為RNA被導入，並且能夠，但非必需，編碼多肽。從DMSG盒轉錄的中間體siRNA能夠形成部分或全部指導RNA，它能夠與靶RNA進行鹼基配對並指導靶RNA降解。
本發明涉及含有設計的模板序列的DNA分子，模板序列能夠被轉錄成短於30個核苷酸的RNA。使用DNA介導的基因特異沉默的一個主要的關注點是將表達的RNA(有意或反義)控制在有限的長度內，例如短於30個核苷酸，這樣在產生RNAi的條件下不導致宿主細胞內幹擾素和PKR介導的普遍關閉。在哺乳動物RNA聚合酶中，聚合酶III通過轉錄終止結束RNA延伸。在本發明的一個實施方案中，天然來源的或經修飾的聚合酶III終止位點被用於DMSG盒，以獲得RNA長度的有限性。該機制可以用於線性或環狀形式的盒中。在另一個實施方案中，DMSG盒被設計成線性形式，其中模板序列後部不跟隨其它序列。結果，靶細胞內的正在轉錄的RNA聚合酶將「脫離」模板而產生短RNA。對於此種脫離DMSG盒的正在轉錄的RNA聚合酶可以是任何內源的或外源性導入的RNA聚合酶。
本發明還涉及編碼靶基因區域的有意或反義序列的DMSG盒。為了在適於在哺乳動物細胞內誘導RNAi的水平和形式將模板序列轉錄成RNA，此種DMSG盒可以包括特定RNA聚合酶的增強子，特定RNA聚合酶包括但不限於哺乳動物細胞的RNA聚合酶I、II、和III。為了轉錄模板序列，該盒還可以包括RNA聚合酶的啟動子。增強子幫助驅動從啟動子起始的模板序列的轉錄。模板序列前面的增強子和啟動子可以作為獨立的盒以線性順序排列，或者是攜帶於環狀載體上，如質粒或病毒或其它能夠增殖的載體。
本發明涉及在線性形式中包含所有必需DMSG元件的DMSG盒。在一個實施方案中，每條有意或反義中間體RNA鏈被含有優選的DMSG盒的dsDNA編碼。該盒含有最少量的元件，為啟動子、模板序列，隨後是終止子或突然終止。DMSG盒可以含有在靶細胞中幫助產生預期水平轉錄本的增強子。在該實施方案中，從兩條合成的DNA鏈的復性產生dsDNA，其中合成的DNA鏈是用化學合成法產生的一個連續的分子。
本發明還涉及編碼有意或反義中間體RNA而不是連續DNA鏈的線性形式的DMSG盒。在一個實施方案中，通過復性合成的DNA寡核苷酸組裝線性盒，它們中的每一個是DMSG dsDNA的兩條鏈中的任意一條鏈的一部分。通過其它方法也可以產生此種DMSG的dsDNA，它包括，但不限於，產生連續dsDNA分子的此類寡核苷酸的連接(用連接酶)或用分子生物學方法如聚合酶鏈式反應(「PCR」)進行的擴增。通過分子克隆或重組技術也可以產生此類dsDNA分子，這些技術包括加工或剪接DNA片斷，其中所述這些DNA片段如果經轉染進入細胞或生物體它們自身不能介導RNAi。
進一步，本發明還涉及編碼有意和反義中間體RNA這兩者的線性形式的DMSG盒。此種dsDNA可以被描述成具有兩套盒的dsDNA的一個組裝體(具有或不具有切口)，其中每一套盒編碼有意或反義中間體RNA。此種「雙盒」DNA可以由化學合成(或重組合成)的長DNA寡核苷酸退火形成，或者從較短的寡核苷酸退火形成的，這些短的寡核苷酸隨後被組裝和連接並通過PCR進行擴增。
本發明還涉及攜帶於載體上的DMSG盒，載體可以是質粒、噬菌體、病毒、或能夠用於攜帶遺傳信息進入靶細胞的任意其它類型的載體，還涉及攜帶於能攜帶插入的DNA部分的任意通用設計或特殊設計的DNA構建體上的DMSG盒。這可以使用分子方法(包括但不限於連接和重組)，通過將所述的盒插入載體得以進行。相應地，本發明還涉及經修飾的載體和修飾載體的方法，其中插入了編碼有意或反義siRNA序列的模板序列。這可以通過首先將上述的DMSG元件，即增強子或啟動子，插入載體而實施，其中DMSG元件後面是模板克隆位點，在那裡限制性酶位點可用於線性化載體以進行模板序列的插入。模板克隆序列的後面是終止子區域。具體而言，如此處公開，位點是經過選擇和設計的以至於插入到該位點的模板序列將在靶細胞中被轉錄，其中沒有任何或僅有有限數量的非模板序列編碼的核苷酸。不期望非模板序列編碼的核苷酸，因為它們能夠降低或破壞特異RNAi效應(Elbashir等，EMBO J.236877-6888，2001；Parrish等，MolCell 51077-1087，2000)。
本發明還涉及在細胞或生物體或組織，包括例如生物體的心臟、肺、結腸、腎、或皮膚中，介導基因的RNA幹擾的方法。在一個實施方案中，將DMSG盒導入細胞或生物體，其中所述該DMSG盒具有指導轉錄能夠激發靶mRNA降解的有意和反義RNA的能力。細胞或生物體被維持在靶mRNA降解發生的條件下，從而在細胞或生物體介導RNAi。
本發明還涉及靶基因部分地或全部地敲低的方法，該方法提供了基因敲除方法或先前使用RNA分子進行基因敲低方法的可選擇的方法。術語敲低或敲除還用來指當與相應的正常(即未被修飾)的細胞或生物體相比基因功能被消除(抑制)或減弱(降低)對細胞或生物體的影響。本發明還涉及產生敲低細胞或生物體的方法，該方法包括向其中有欲敲低靶基因的細胞或生物體導入編碼能靶向所述基因的RNA的DMSG盒，在基因沉默發生的條件下維持細胞或生物體，和產生敲低或敲除的細胞或生物體。
本發明還涉及從一群細胞中追蹤經歷DMSG處理的特異細胞群。在一個實施方案中，編碼有意或反義RNA的dsDNA的一條或兩條鏈用標記物進行標記。當將此種DNA分子導入細胞時，那些接受DMSG並隨後發生基因沉默效應的細胞可以通過標記物被追蹤。該方法能夠選擇特異的細胞群或部分組織或生物體，而由細胞的混合群體產生的假象可以避免。通過這種方法選擇的基因沉默效應隨後發生的細胞群或組織也是本發明的主題。
本發明進一步涉及研究進一步選擇的細胞群體中基因沉默效應的方法，其中一個以上的基因分別作為單獨的DMSG盒的靶，而DMSG盒的DNA分子用可區別的標記物進行了標記。多基因被敲低的選擇的細胞群或組織或生物體也是本發明的主題。
此外，本發明還涉及檢測或評價含有DMSG盒的細胞或生物體中基因功能的方法。在一個實施方案中，將含有特異模板序列並誘導基因沉默的DMSG盒導入細胞或生物體。細胞或生物體是指測試細胞或生物體。測試細胞或生物體被維持在基因沉默發生的條件下。然後觀察測試細胞或生物體的表型並與適當的用相同DMSG盒不產生靶向的對照細胞或生物體的表型相比較。測試與對照細胞或生物體表型之間的不同提供了關於靶基因功能的信息。
本發明還涉及確定一種試劑對特異基因是否有作用的方法。在該方法中，將誘導基因沉默的DMSG盒導入細胞或生物體。細胞或生物體被維持在基因沉默發生的條件下並通過攜帶於導入的DNA分子上的標記物選擇所靶向的細胞或生物體。可以是任意分子或組合物的測試試劑包括但不限於肽、蛋白質、化學試劑或組合物、基因治療載體或組合物，將測試試劑導入測試細胞或生物體，並將其導入不發生基因沉默的對照細胞或生物體中。試劑處理後，測試細胞或生物體和對照細胞或生物體的表型用於確定試劑和靶基因之間的功能關係。
本發明還涉及從一隨機序列庫中鑑定具有特異功能的RNA分子的方法。對於從簡併庫中進行的任一選擇方法，高回收率是關鍵的。然而，短RNA如siRNA的直接克隆需要多步較難的步驟，包括RNA分離和與結頭連接，和逆轉錄PCR，它們一起導致了低的回收率。DMSG盒的dsDNA的本質利於選擇後短RNA分子序列的高效回收。可以選擇的具有特異功能的RNA分子包括但不限於siRNA分子、諸如那些含有髮夾結構並具有RNAi效應的非siRNA分子的RNA分子、反義RNA分子、諸如染色體失活複合體的功能複合體中的RNA成分。本發明還包括鑑定特別適用於DMSG盒的在靶RNA內的區域的方法，以及評估攜帶於DMSG盒上的任意序列的介導基因沉默能力的方法。因此，本發明還提供了用此種方法鑑定的DMSG盒。
本發明還涉及使用含有此類DNA分子的DNA分子或組合物用於研究和治療性或預防性治療的方法，例如產生疾病狀態的研究模型、尋找藥物發明和研發的靶、或治療與蛋白質或非編碼的功能RNA存在相關的疾病。它們包括但不限於使用DMSG盒、含有DMSG盒的組合物、施用此種盒的試劑盒、和用於研究或治療目的的含有此種盒和適當載體的藥用組合物。
本發明進一步涉及通過特異的將DMSG盒遞送入所選擇的靶細胞在特異細胞群或組織類型中誘導基因沉默的方法。dsDNA可以與信號分子偶聯，其中所述信號分子如肽或多肽(如細胞因子)、抗體、或僅僅對靶細胞表面上表達的蛋白質具有特異親和性的化學基團。該細胞表面蛋白質可以是受體、細胞外基質結合蛋白質、或其它細胞表面分子。當結合在表面分子上後，信號分子可通過內吞或其它機制轉移入靶細胞。偶聯的DMSGdsDNA分子與信號分子一起被內化。其它不表達特異表面分子的細胞不經歷DMSG介導的基因沉默效應。DMSG盒一旦進入靶細胞內，就表達能夠誘導基因沉默的中間體RNA。此類方法具有用於研究和治療的潛能。本發明還包括通過對DMSG盒上模板序列進行序列測定所鑑定的基因，其中所述DMSG盒為當其導入細胞時產生特異表型。此外，本發明還提供了對不同基因的細胞或組織功能的網絡關係進行繪圖的方法。
以下實施例意在闡明本發明但不用於限制本發明。
實施例由於RNAi在敲低靶向基因表達方面的有效性和特異性，它已經成為功能基因組研究的受歡迎技術。目前的方法包括dsRNA或siRNA(21-23個核苷酸的小幹擾RNA)介導的基因沉默，並且長dsRNA分子似乎表現出更強的效應。然而，在較高等的動物中，RNAi介導的基因沉默可能僅能通過短dsRNA分子完成，因為長dsRNA可引起PKR活化和幹擾素效應。此處公開的系統通過特異設計的DNA盒利用了活細胞中靶基因區域的兩條鏈的連續轉錄。
本發明的有效性是在實施例1中使用綠色螢光蛋白(「GFP」)作為靶基因的形式進行證明的；組合物和方法的特異性是在實施例2中證明的。實施例3證明了將DMSG技術與組裝的表達盒聯合的可行性。由於長的寡核苷酸(如＞80個核苷酸)難以合成，這種變化使產生盒更加實際可行。實施例4舉例說明了在小鼠細胞系中用lacZ作為靶基因的經修飾DMSG盒。實施例5和6證明了可以被攜帶於常規環狀載體上的DMSG盒。
實施例1通過線性DMSG盒降解靶mRNADMSG盒特異於編碼綠色螢光蛋白(GFP)的核苷酸序列的寡核苷酸在Core Faciltiy of Allele Biotechnology and Pharmaceuticals公司(SanDiego CA)合成。一般而言，表達盒(從5』到3』)由增強子區域、U6基因(人)聚合酶III的遠側序列元件(DSE，對於盒中的轉錄起始位點而言為-79到-72)、人U6基因聚合酶III的近側序列元件(PSE，-66到-47)、TATA盒(-31到-26)、後面是模版序列(21個核苷酸)、U6基因終止子、和人工終止子(「TM」或「Term」)組成。對於RO盒，省略終止子。單一表達盒由復性結合到一起的兩條DNA鏈(有意鏈和反義鏈)組成。通過將兩條DNA鏈在復性緩衝液(50mM NaCl和50mMTris-HCl，pH7.4)中90℃孵育1分鐘，然後室溫15分鐘進行復性。
表達有意或反義轉錄本的DMSG盒分別指定為(+)或(-)。為了便於以後的克隆，將Bgl II和Nhe I限制性酶切位點的粘末端分別加入到「TM」盒(122bp)的5′和3′末端，並加到RO盒(109bp)的5′末端(Bgl II)。對於TM DMSG(+)，將編碼GFP基因部分序列有意RNA的dsDNA的有意鏈hP3GFP(+)TMs與編碼同一有意RNA的dsDNA的反義鏈hP3GFP(+)TMas一起復性。將編碼GFP靶序列的反義RNA的兩條DNA鏈復性產生TM DMSG(-)。這兩個TM DMSG盒被一起用於誘導基因沉默。同樣地，應用各自的DNA鏈(hP3GFP(+)s與hP3GFP(+)as復性，hP3GFP(-)s與hP3GFP(-)as復性)產生RO DMSG(+)和(-)盒並用於敲低GFP表達。
使用以下寡核苷酸hP3GFP(+)ROs5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGAACGGCATCAAGGTGAACTT-3′(SEQ ID NO1；113個核苷酸)；hP3GFP(+)ROas5′-AAGTTCACCTTGATGCCGTTCggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO2；109個核苷酸)；hP3GFP(+)TMs5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGAACGGCATCAAGGTGAACTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO3；126個核苷酸)；hP3GFP(+)TMas5′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGTTCACCTTGATGCCGTTCggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO4；126個核苷酸)；hP3GFP(-)ROs5′5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3′(SEQ ID NO5；113個核苷酸)；
hP3GFP(-)ROas5′-AAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO6；109個核苷酸)；hP3GFP(-)TMs5′5′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO7；126個核苷酸)；和hP3GFP(-)TMas5′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(sEQ ID NO8).
細胞培養和轉染293T(人胚腎)細胞生長於添加了10％FBS、100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的Dulbecco′s改良Eagle培養基(Life Technologies，Rockville，Maryland)中CO2培養箱37℃培養。細胞常規傳代以維持生長。轉染前24小時，胰蛋白酶消化細胞並將其鋪在含上述培養基不含抗生素的24-孔板中(500μl/孔)。使用LIPOFECTIN 2000轉染試劑按照進行了較小修改的製造商提供的方法(INVITROGEN，Carlsbad)轉染70-80％匯片的細胞對於每個轉染反應，將2μl LIPOFECTAMINE 2000轉染試劑與50μl無血清、無抗生素DMEM混合，並室溫孵育5分鐘。DMSG DNA或siRNA連同GFP編碼質粒一起也與50μl無血清、無抗生素DMEM混合。然後將稀釋的LIPOFECTAMINE 2000轉染試劑逐滴加入稀釋的DNA或RNA中，並在室溫孵育20分鐘後加入細胞。每孔使用1μgpEGFP載體質粒(CLONTECH)。用螢光顯微鏡檢測轉染效率。用不同濃度(3pmole或45pmole)的線性表達盒(「RO」或「TM」)與pEGFP質粒共轉染。用GFP siRNA作為陽性對照。本試驗的對照還包括用無質粒轉染或無轉染試劑轉染。轉染48小時後，在倒置螢光顯微鏡(Zeiss)下分析細胞。
為了評估產生於DMSG盒的針對GFP表達的轉錄本是否能特異性阻斷基因表達，在共轉染研究中將pEGFP質粒用作報告子。在GFP siRNA轉染的細胞中GFP表達降低。重要的是，在用3pmole(+)和(-)DMSG盒轉染的細胞中都能觀察到可比水平的GFP下調。而且，用45pmole兩種盒轉染的細胞GFP表達完全是陰性的。在這些細胞中GFP的表達被檢測超過2周並且在這段時間內DMSG的基因沉默作用是持續的。用pEGFP和兩種盒轉染的一些細胞僅在20天後出現綠色螢光，推測來自於通過細胞分裂維持的共轉染pEGFP質粒。這可能是由於這樣一個事實，線性dsDNA比質粒DNA更易於降解，這表明在mRNA水平GFP表達的沉默與其他效應如pEGFP質粒的重排或缺失相反。
通過siRNA的基因沉默效果低於DMSG盒，儘管GFP siRNA的摩爾量大約比所用的低濃度DMSG盒的摩爾量(3pmole)高10倍。這些觀察表明線性DMSG盒更有效並且能產生比siRNA更深遠的基因沉默效果，這可能是由於DMSG盒介導持續產生dsRNA。值得注意的是，編碼相應GFP基因dsRNA的正鏈或負鏈的DMSG盒能輕微降低GFP表達，這可能是由於在其他物種如真菌中觀察到的未知「共抑制」作用(Cogoni和Macino，Nature 6732166-169，1999)，或關於負鏈盒的反義作用。還可以觀察到，用無關DNA或RNA共轉染延遲了靶基因的表達，這可能是通過幹擾轉染和異位表達過程中的某些步驟。這也對用(+)或(-)盒在觀察期間降低基因表達起作用。
利用表達靶向編碼dsRed螢光蛋白多核苷酸的siRNA的DMSG盒也得到了相似的結果。當通過螢光缺失測定時，用編碼有意和反義dsRedsiRNA的DMSG盒處理細胞能抑制dsRed表達。此外，利用DMSG介導的RNA幹擾，已經獲得了對外源基因，包括如GsαG蛋白、β-連環蛋白、SRPK1和T-盒l9不超過90％的表達。結果證明dsDNA分子(即DMSG盒)能在真核細胞中介導基因沉默。
實施例2DMSG盒反義鏈上的錯配影響基因沉默編碼有意RNA鏈的dsDNA與實施例1中的相同(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。編碼反義RNA鏈的dsDNA的有意鏈也與實施例1中的相同(SEQ ID NO7)，而與GFP序列相比dsDNA的反義鏈含有錯配。如實施例1中通過將DNA寡核苷酸hP3GFPTM(+)s和hP3GFPTM(+)as復性產生了編碼GFP部分序列的有意RNA的TM DMSG(+)盒。通過將hP3GFPTM(-)s分別與hP3GFPTM(-)as M1、M2、M3或M4復性產生了編碼靶GFP序列反義RNA的具有不同突變的DMSG(-)盒。轉染操作如其中錯配鹼基為粗體並斜體的寡核苷酸如下hP3GFPTMasM15′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATgAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO9；126個核苷酸)；hP3GFPTMasM25′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGgATgAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO10；126個核苷酸)；bP3 GFPTMasM35′-CTAGcAAAAACtgtaaatAGAACGGCATCAAGGTGAAgggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO11；126個核苷酸)；和hP3GFPTMasM45′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAtgggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO12；126個核苷酸)。
為了評估DMSG的機制和特異性，將單一或雙點突變在線性DMSG盒反義鏈上的不同位置導入模板序列區域。觀察到了基因沉默程度與突變數量之間的緊密相關性。同樣，模板序列中間附近的突變可能比末端附近的突變對基因沉默具有更強的作用。這些結果表明靶向識別過程是序列特異性的而且並非模板序列上的所有位置對靶向識別作用都是等同的。
實施例3
由短寡核苷酸組裝的DMSG盒介導基因沉默實驗方法如前面的實施例，除了dsDNA是由較短的寡核苷酸組裝(圖3)。與從連續的長序列相比，從較短的寡核苷酸能更容易地製備DMSG盒。從短的寡核苷酸組裝DMSG盒具有實際意義，因為，對於每一基因沉默，可能僅需要合成一對對應於模板序列的短寡核苷酸，然後將它與DMSG盒其他成分的其他通用寡核苷酸組裝。
短的寡核苷酸，hP3GFPTM(-)s1、s2、s3、as1、和as2，用於組裝靶向GFP的TM DMSG(-)盒。將等摩爾的這些寡核苷酸混合併如實施例1復性，然後用於與pEGFP和靶向GFP的TM DMSG(+)盒共轉染。轉染和細胞培養方法同實施例1。
寡核苷酸如下hP3GFPTM(-)s15′-gatcTATTTGCATggactatcatatgcttaccgtaacttgaa-3′(SEQ ID NO13)；hP3GFPTM(-)s25′-agtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacga-3′(SEQ ID NO14)；hP3GFPTM(-)s35′-aacaccGTTCACCTTGATGCCGTTCTTtttacaGTTTTTg-3′(SEQ ID NO15)；hP3GFPTM(-)as15′-CTAGcAAAAACtgtaaaAAGAACGGCATCAAGGTGAACggtgtttcgtcctttccacaagata-tat-3′(SEQ ID NO16)；和hP3GFPTM(-)as25′-aaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccATGCAAATA-3′(SEQ ID NO17).
由這些短寡核苷酸組裝的DMSG盒與實施例1中合成的連續盒產生相似水平的基因沉默結果。本實施例的結果表明不連續的寡核苷酸，當設計合理時，可以用作基因沉默的轉錄本模板。
實施例4標記的DMSG盒在小鼠細胞和人細胞中引起基因沉默等同於那些用於實施例1中hp3GFPTm DMSG盒的元件，小鼠U6基因元件被設計到靶向lacZ基因的連續或組裝的盒上。將DNA寡核苷酸復性並且，或轉染入穩定表達lacZ基因的NIH3T3細胞系，或與lacZ報告質粒pCMVβ(Clontech)共轉染入293T細胞。DSE、PSE、TATA盒和終止子在小鼠和人U6基因之間高度保守。
轉然後48-72小時，用PBS洗滌細胞，室溫用1％戊二醛溶液(溶於PBS)固定15分鐘。用溶於PBS的1mM MgCl2溶液洗細胞2次，然後加入X-GAL染色液(1mg/ml N，N-二甲基甲醯胺、5mM K3Fe(CN)6、5mMK4Fe(CN)6·3H2O、1mM MgCl2溶於PBS、24孔板中0.3ml/孔)。將反應混合物與經固定細胞37℃孵育10分鐘到3小時直到顏色變為預期的水平。用水將細胞洗3次並於4℃貯於暗處。然後在顯微鏡下觀察蓋玻片上藍色的細胞。對於FITC標記的DNA，也在螢光顯微鏡下觀察細胞。
將DNA寡核苷酸mP3LacTM(+)s和MP3LacTM(+)as如實施例1復性以產生靶向lacZ的TM DMSG(+)盒。將DNA寡核苷酸mP3LacTM(-)s和mP3LacTM(-)as復性以產生靶向lacZ的TM DMSG(-)盒。在為組裝的TM DMSG(-)盒的情況下，將mP3LacTM(-)s1和s2F與mP3LacTM(-)as復性，或mP3LacTM(-)as1和as2F與mP3LacTM(-)s復性。「F」表示在標準偶聯反應中使用FITC-CPG進行DNA合成而將FITC標記在寡核苷酸的3』末端。
寡核苷酸如下mP3LacTM(+)s5′-gatcTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttGGTAAACAGTTGATTGAACTTttgttcGTTTTFg-3′(SEQ ID NO18；126個核苷酸)；mP3LacTM(-)s5′-gatcTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttGTTCAATCAACTGTTTACCTTttgttcGTTTTTg-3′(SEQ ID NO19；126個核苷酸)；
mP3LacTM(+)as5′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGTTCAATCAACTGTTTACCaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAATa-3′(SEQ ID NO20；126個核苷酸)；mP3LacTM(-)as5′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGGTAAACAGTTGATTGAACaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAATa-3′(SEQ ID NO21；126個核苷酸)；mP3LacTM(-)s15′-gatTATTTGCATacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagacta-3′(SEQ IDNO22)；mP3LacTM(-)s2F5′-taaatatcccttggagaaaagccttgtttGTTCAATCAACTGttTACCTTttgttcGTTTTTt-FTTC-3′(SEQ ID NO23)；mP3LacTM(-)as15′-CTAGcAAAAACgaacaaAAGGTAAACAGTTGATTGAACaaacaaggcttttctccaagggat-3′(SEQ ID NO24)；和mP3LacTM(-)as2F5′-tttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtATGCAAAt-FITC-3′(SEQ IDNO25)；mP3LacTM(-)s1和mP3LacTM(-)s2是mP3LacTM(-)s的兩個部分；mP3LacTM(-)as1和mP3LacTM(-)as2是mP3LacTM(-)as的兩個部分。跟在寡核苷酸名稱後面的「F」表示寡核苷酸3′端用FITC標記。
與將GFP基因在人細胞中用作靶標的實驗相似，上述mP3DMSG盒在lacZ報告基因穩定轉染的小鼠細胞中或與報告基因共轉染的293T細胞中降低相匹配的lacZ基因的表達。圖4顯示共轉染的結果。與實施例1的觀察結果一致，編碼相應lacZ基因dsRNA的正鏈或負鏈的DMSG盒輕微降低lacZ基因的表達，這可能是由於在其他情況如真菌中觀察到的未知「共抑制」作用(Cogoni和Macino，Nature 6732166-169，1999)，或在只有負鏈盒情況下的反義作用。然而，當使用編碼RNA兩條鏈的DMSG盒時，基因沉默效果是更加顯著的。
這些結果顯示FITC標記的DMSG DNA分子具有引起基因沉默的功能。當FITC標記的DNA寡核苷酸用於組裝盒時，一些細胞具有綠色螢光，同時它們不被染成藍色。這證明導致靶細胞具有綠色螢光的DMSG分子轉染誘導lacZ基因沉默。帶有標記DNA分子的DMSG提供了跟蹤轉染細胞以觀察基因沉默效果的方法。
實施例5環狀載體上的DMSG盒DMSG盒可以存在於環狀載體。將具有Bgl II和Nhe I突出端的hP3GFPTM(+)盒插入pIND/V5-HisA載體(Invitrogen)的Bgl II和Nhe I位點之間。將具有Bgl II和Nhe I突出端的hP3GFPTM(-)盒插入到相同載體Bam HI和Xba I限制酶的可兼容位點之間。該質粒，pDMSGGFP(+/-)，帶有hP3GFPTM(+)盒和hP3GFPTM(-)盒並可用於以GFP表達沉默為目的的轉染。僅將一個盒(+或-)插入到Bgl II和Nhe I位點之間建立pDMSGGFP(+)或pDMSGGFP(-)。如果僅將一個盒(編碼(+)或(-)RNA鏈)插入到Bgl II和Nhe I位點之間，則產生含有任一盒的質粒，稱為pDMSGGFP(+)或pDMSGGFP(-)。
在與實施例1相似的轉染實驗中，不用線性DMSG盒，而是pDMSGGFP(+/-)單獨或pDMSGGFP(+)和pDMSGGFP(-)一起用於沉默GFP的表達。由於環狀dsDNA通常比線性盒更穩定，所以基因沉默的作用預期比線性盒的作用持續時間更長。
實施例6DMSG載體的一般用途本實施例描述可以被用於導入和表達用於基因沉默的多種模板核苷酸序列的DMSG載體的構建。
如實施例5中的質粒pDMSGGFP(+)用於例證說明DMSG載體。用核苷酸序列CATTCN25GAATGC(SEQ.ID.NO26；只顯示有意鏈，N代表A、T、C和G四個鹼基中的任意一個)代替質粒pDMSGGFP(+)的啟動子最後一個鹼基和5′終止子的第一個鹼基之間的序列，以產生載體pDMSG1(也見，SEQ ID NO44；圖5)。為了將針對靶基因的模板序列插入載體，用Bsm I消化pDMSG1並且將相應於正義或反義靶RNA序列的dsDNA寡核苷酸(具有Bsm I粘性末端)連接入載體(見圖5)以產生含有單一盒的質粒(也見SEQ ID NO45)。可以將兩個此類編碼正義或反義中間體siRNA的質粒組合共轉染進入細胞，以沉默siRNA特異的任意靶基因。靶基因的模板序列(正義方向)可以是約15-30個核苷酸(例如17個核苷酸)區域，它以AAG開始以C結尾，並且一般跟著約1-5個核苷酸的突出端，例如1、2、3、4或5個胸腺嘧啶核苷殘基。
其他限制性位點可以用於製備其它具有不同序列需求的載體。例如，可以用核苷酸序列GAGACG-N25-CGTCTC(SEQ.ID.NO27；僅顯示有意鏈)代替質粒pDMSGGFP(+)(實施例5)的啟動子最後一個鹼基和5′終止子第一個鹼基之間的序列，以產生載體pDMSG2(見圖6；也見，SEQID NO46)。當將針對靶基因的模板序列插入載體時，用BsmB I(同切點酶如ESPI3，它具有相同的限制性內切酶識別位點ACCTGC(N)4/8，SEQID NO33)消化DMSG2並且將具有BsmB I粘性末端相應於正意或反義RNA的dsDNA寡核苷酸，它們不支持自連，連接於載體(圖4)以產生含有單一盒的質粒(也見，SEQ ID NO47)。通過使用兩種不同的插入位點，可以將正盒和負盒都被一個載體所攜帶。
實施例7T7啟動子控制下的DMSG盒利用例如含有特異於T7 RNA聚合酶的轉錄調控元件的DMSG盒可以在細胞內產生足量siRNA，其中所述T7 RNA聚合酶可以由與DMSG盒共轉染進入細胞的編碼質粒來表達，並且它利用「脫落式」機制。
按照實施例1中描述的方法並利用下面顯示的包含GFP特異的模板核苷酸序列的寡核苷酸可以製備含有T7 RNA聚合酶啟動子的DMSG盒
T7GFP(+)ROs5′-taatacgactcactataGGAACGGCATCAAGGTGAACTT-3′(SEQ ID NO28；39個核苷酸)；T7GFP(+)ROa5′-AAGTTCACCTTGATGCCGTTCCtatagtgagtcgtatta-3′(SEQ ID NO29；39個核苷酸)；T7GFP(-)ROs5′-taatacgactcactataGGTTCACCTTGATGCCGTTCTT-3′(SEQ ID NO30；38個核苷酸)；T7GFP(-)ROa5′-AAGAACGGCATCAAGGTGAACCtatagtgagtcgtatta-3′(SEQ ID NO31；38個核苷酸)。
備選地，通過T7聚合酶的siRNA的轉錄可以由一個或串聯的多個II類終止子(ATCTGTT，SEQ ID NO32；(He等，J Biol.Chem.3018802-18811，1998))終止。由於實際終止通常發生於該信號下遊的3-7個核苷酸，這將產生與靶mRNA正意或反義序列不匹配的3′部分。然而，當通過髮夾中間體產生siRNA時，3′末端的突出端不影響RNAi效應(Paul等，Nat.Biotechnol.5505-508，2002)。由噬菌體RNA聚合酶如Sp6和T7聚合酶進行的轉錄也終止於含有阻滯位點的多聚(T)處，其中阻滯位點如位點Ia(GGGACGTTTTTTTCCC；SEQ ID NO42)或相關位點II(TTTTTTC；SEQ ID NO43)(Mote和Reines，J；Biol.Chem.2716843-16852，1998)，這種特點適合用於產生siRNA或shRNA。利用此處公開的構建體和方法，可通過從諸如組織特異性或發育階段特異性啟動子表達T7聚合酶進一步控制T7聚合酶的表達，從而使DMSG盒介導的RNAi可成功地以時間的、空間的和細胞類型特異的方式起作用。
實施例8RNAi微陣列本實施例描述了RNAi微陣列(MAR)方法學，其中公開的基於DNA的RNAi技術適用於細胞微陣列形式，由此允許高通量基因功能研究和藥物篩選測定。
微陣列技術已經改革了多種生物醫學研究領域，包括監測基因表達、單核苷酸多態性(SNP)基因分型和測序。已經研發出幾種類型的微陣列，其中特殊分子(如DNA、抗體、重組蛋白質)被物理性連接於固體支持物上的確定位置。此類微陣列允許高通量測定和高解析度分析。DNA微陣列包括那些點在晶片上的cDNA分子，其中所述cDNA分子可以通過如PCR方法產生並且能代表大量基因產物中的任意一種，並且還包括那些在支持物表面如矽表面合成的寡核苷酸，它們的序列是特異的或是隨機的、偏性的或富於變化的。後一方法可用於生產高密度微陣列，以GeneChipTM微陣列(Affymetrix)為例。此類DNA分子通常以特定的方式(陣列)排列於支持物表面上，從而通過對例如雜交於支持物上特定位置的未知核酸分子的檢測提供關於未知核酸分子識別的指示。此類可尋址陣列提供了鑑定樣本中特定核酸分子，或鑑定特定細胞類型中基因表達模式的適合方法，例如包括，當與標準或對照模式相比時，提供鑑定特定疾病的模式。
最近已經確立了細胞微陣列的原理(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001；美國專利申請號US 2002/0006664 A1)，其中在允許將寡核苷酸導入與微陣列特定位置相接觸的細胞的條件下，將寡核苷酸(如cDNA分子)陣列與細胞簇相接觸。此類微陣列對於鑑定藥物靶點和表達克隆改變細胞生理的基因是有用的。這些方法的成功需要將寡核苷酸點在固體支持物上使它們可以從支持物上被移開，還需要處理寡核苷酸從而使它們可以被與它們相接觸的細胞內化。Ziauddin和Sabatini所描述的方法在將寡核苷酸點在玻片上之前先用明膠溶液與cDNA分子混合。乾燥後，將DNA斑點暴露於轉染試劑，然後將玻片放置於培養皿中並用培養基中的貼壁哺乳動物細胞覆蓋(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)。由於DNA分子和細胞的加入是顛倒順序的，所以該方法被稱為反向轉染。
如此處所公開，細胞微陣列可適用於本發明的LineSilenceTM盒。最初，通過製備穩定且均一表達螢光蛋白質，如GFP、EGFP、dsRed或短半壽期的d2EGFP變體，可以產生模型系統。已經製備得到了表達中等水平EGFP的Hela細胞系，並且單獨或同時永久表達dsRed、d2EGFP的Hela和293正在用雙藥物篩選進行選擇。可以篩選多核苷酸資料庫，包括含有編碼相關多肽如轉錄因子的多核苷酸的資料庫，以選擇可以用此處公開的DNA介導的基因表達沉默進行RNAi的靶序列。
按照本發明的方法所使用的細胞類型的例子包括如Hela細胞和293細胞，在這些細胞中RNAi已經被驗證(見實施例1)。象293細胞一樣，Hela細胞表現出高的RNAi效率，所述細胞為表達提供了額外的好處，因為它以高水平表達目的基因p53。因為RNAi實驗的目的是以從一定的可檢測水平降低基因的表達，並且理想上降低到零，所以以高水平穩定表達諸如GFP、dsRed等等的蛋白質的細胞對於微陣列斑點中的定量評價是特別有用的。在此類細胞中表達的任何稍微的不均衡可以通過對每一個靶基因多點數據的平均來降低。而且，隨後的內部對照系統允許校正靶基因的表達誤差，並且還能夠監測和校準非特異的RNAi效應。
對於內部對照和數據分析，採用了能夠穩定表達GFP和dsRED這兩者的細胞系。這些細胞用編碼不針對GFP和dsRED、針對兩者之一、或針對兩者的siRNA的LineSilenceTM盒進行反向轉染。在不同時間點，用雷射螢光掃描儀檢測綠色和紅色螢光強度，並且對樣品進行照相以便用適當的軟體進行分析。用針對兩者之一的基因特異LineSilenceTM盒處理所獲得的細胞中綠/紅螢光比值用於評估沉默效應的特異性。處理和未處理細胞之間的螢光強度比提供了有關沉默效率的數據。對同一玻片上多點的數據進行採集，並且用幾張玻片進行重複採集以得出統計學意義的結論。
方法使用轉染試劑如FuGene6(Roche)，用pDsRED-N1和pd2EGFP、或pEGFP轉染Hela或293細胞，然後用潮黴素B(pEGFP)或G418(pDsRED-N1)篩選細胞。按標準方法挑取表達預期螢光蛋白質的單克隆，並增殖，然後，選擇細胞之間表達水平差異最小的克隆。
按此處所公開的方法或使用商業可得的試劑盒(LineSilenceTM試劑盒；Allele Biotechnology)並使用製造商提供的方法產生LineSilenceTM盒，然後純化、定量並貯存於TE緩衝液中。製備三種劑量的含大約0.17％明膠的LineSilenceTM盒DNA溶液(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)，0.1、0.033或0.001μg/μl，並且使用自動陣列儀點在玻片上。將玻片乾燥並用轉染試劑如FuGene6轉染試劑或EffecteneTM轉染試劑(Qiagen)處理，然後將細胞鋪在玻片上(Ziauddin和Sabatini，見上文，2001)。
轉染效率很大程度上可以決定使用RNAi技術沉默基因的有效性。一些細胞系，特別是培養基中的原代細胞，對如鈣沉澱、陽離子脂質體、DEAE-葡聚糖和多聚季胺等傳統轉染試劑有相當的抗性。雖然電穿孔在一些情況下會導致細胞的死亡，但它對於一些細胞類型而言能夠提高轉染效率。微注射能夠提供一種將DNA直接遞送到細胞或細胞核的手段，然而，該方法不方便使用，許多實驗室不能夠開展，並且也不適於產生大量的改變細胞。
蛋白質轉導結構域(PTD)是通過非受體依賴的機制橫跨生物膜的短肽，並且可以遞送大量生物分子進入細胞(Becker等，Methods 24247-256，2001，此處引用作為參考)。PTD來源於HIV Tat蛋白質(命名為TAT)、果蠅轉錄因子觸角足的同源結構域、HSV蛋白質VP22和鹼性成纖維細胞生長因子(Becker等，supra，2001)。此外，通過設計一些肽可以具有相似的特性，所述肽包括例如MPG、Pep-1和L-或D-精氨酸、賴氨酸和組氨酸的寡聚體。TAT已經用於遞送大的融合蛋白質進入各種細胞和成體動物，並可以高效地穿過血-腦屏障。照這樣，PTD對於將DMSG盒導入細胞是有用的，因此這就提供了一種在實際上所有細胞類型和動物模型中完成RNAi的方法。
由於DMSG盒可以線性形式產生，例如通過PCR或全長DNA合成，所以本發明的RNAi表達盒特別適用於與PTD結合，因此允許大範圍和高效地轉染。如果期望，在寡核苷酸合成過程中或之後，可以將氨基、巰基或生物素基團連接於DMSG盒末端，然後利用化學交聯劑通過功能基團將PTD肽連接於DMSG盒。
本發明的DMSG盒也可以連接於雙功能肽，其中所述雙功能肽含有PTD結構域和第二種「貨物」結合結構域。通過將載體肽與貨物分子如DMSG盒混合，可以形成可直接應用於細胞的複合體，因此繞過結合步驟。該方法可用於此處公開的DNA-介導的RNAi，並且特別適用於低成本快速地進行高通量測定以產生穩定且可測量的效應。已經研發出大量人工肽如KALA和ppTGl，它們在螺旋的一側是疏水的，以透過膜，並且在另一側是具正電的，以結合多核苷酸(Rittner等，Mol.Ther.5104-114，2002，此處引用作為參考)。這些人工肽的兩個缺點是它們是pH依賴的(質子化態影響帶電胺基酸和DNA之間主要的靜電相互作用)，並且它們不能從單鏈DNA、RNA或其它帶電分子中區別出雙鏈DNA，因此理論上可作為相對非特異的載體遞送非預計貨物分子進入細胞。
以非靜電相互作用結合dsDNA的一種短肽是噬菌體HK022 Nun蛋白質的C-末端9個胺基酸區域(Watnick等，Genes Devel.14731-739，2000，此處引用作為參考)。該肽區域與dsDNA直接相互作用，並且Nun蛋白質不能夠使聚合酶停滯在單鏈DNA模板上，這表明它的DNA結合基序僅結合雙鏈DNA。C-末端區域的點突變已經證明它在結合雙鏈DNA方面是有作用的，並且精確地指出倒數第二個殘基色氨酸(W108)對於此種結合是最關鍵的殘基。W108僅僅能夠被其它芳香族胺基酸(如酪氨酸)進行功能替代的事實表明結合發生在色氨酸殘基插入雙鏈DNA時。所述結合似乎沒有任何可檢測的序列偏好。
將九個殘基的Nun C-末端肽(NCP)與TAT融合，之間只間隔一個甘氨酸殘基。如此處所公開，融合蛋白質(稱為TAN)結合雙鏈DNA形成多聚體，解離常數大約為1×10-5M。將0.1μg雙鏈DNA與遞增量(0.05、0.1、0.2或0.4μg)TAN肽(或0.1、0.2或0.4μg對照肽，Ht31)在20μl 0.9％NaCl溶液中進行孵育。室溫孵育20分鐘後，取一小份液體用1％瓊脂糖凝膠進行分析。條帶遷移凝膠分析顯示TAN肽以相對濃度依賴的方式結合雙鏈DNA(即隨著TAN量的增加結合的DNA的量也增加)。
快速擴大的蛋白酶和肽酶家族被描述為能夠水解膜脂雙層疏水環境中的底物蛋白質和肽。此類酶稱為膜內剪切蛋白酶(I-CliPs)，並且將它們的底物稱為跨膜結構域(TMDs；見Wolfe和Selkoe，Science 2962156-2157，2002，此處引用作為參考)。如此處所公開，對於MAR利用載體蛋白質如明膠將LineSilenceTM盒點在固體支持物上而言，作為備選的是通過TMD肽將盒連接到支持物的表面，這樣當與細胞接觸時，TMD肽能夠被細胞膜中的I-CliP水解，從而允許LineSilenceTM盒移動進入細胞。I-CliP以早老因子(早老因子1和早老因子2)為例，它們能夠剪切細胞膜內的TMD肽，因此釋放底物的胞質部分入細胞質(見Wolfe和Selkoe，見上文，2002)。當將TMD肽連接到DMSG盒上時，肽的剪切釋放所述盒進入細胞質，以至於DMSG盒能夠隨後進入細胞核。使用能夠被早老因子剪切的TMD肽的優點是早老因子在所有組織和細胞類型中普遍表達，因此允許基於早老因子剪切的LineSilenceTM盒的MAR適用於各種各樣的哺乳動物細胞(見Lee等，J.Neurosci.16P7513-7525，1996，此處引用作為參考)。
作為早老因子底物的TMD肽的例子包括β-澱粉樣前體蛋白的TMD；果蠅蛋白質notch、Sevenless、Torso和δ，以及它們的哺乳動物同系物的TMD；人血型糖蛋白-A的TMD(Struhl和Adachi，Mol.Cell 6625-635，2000，此處引用作為參考)。照這樣，這些或其它TMD可以被結合在固體支持物表面，DMSG盒可以被連接到它們上面，並且，如果期望，還可以將PTD結構域(如TAN)進一步連接到DMSG盒上，因此有利於進行MAR分析。
如上所述的表達螢光蛋白質的細胞的用途允許RNAi微陣列(MAR)方法學的優化，然後可以應用於功能基因的分析，特別是那些當敲低時表現出可檢測效應的基因。兩個級別的實驗次序進行，一個使用已知的系統用於方法的驗證，第二個用於篩選鑑定先前未描述的基因功能。
系統驗證Fas介導的凋亡途徑基因可用作靶基因檢測基因功能，因為該途徑涉及的許多基因是已知的(例如FADD和caspase 8)，因此它們可被點樣至玻片上的LineSilenceTM盒靶向。Fas介導的凋亡是可誘導過程並且適於MAR，因為正常細胞能夠在玻片上生長、能夠內化DNA和在刺激前達到預期的密度。通過用Fas配體或活化抗體處理來激活凋亡。能夠對Fas介導的信號發生反應的細胞是可得的並且易於轉染，如Hela-Fas細胞。凋亡反應是快速的並且能夠在約24小時之內檢測到。重要的是，使用這種方法刺激細胞在以前開展過，用於篩選核酶文庫(Kawasaki和Taira，NucleicAcids Res.303609-3614，2002，此處引用作為參考)。照這樣，已經建立了誘導和檢測的條件，並且鑑定了新的靶點。
按如下方法產生Fas途徑LS微陣列。針對如下的每一基因設計4個靶位點，其中所述基因是先前已知的或由Kawasaki和Taira(supra，2002)鑑定的-Fas、FADD、easpase 8、Bik、caspase 3、caspase 9、apaf-1和CAD。如上述的方法將LineSilenceTM盒DNA點印來製備MAR玻片。Hela-Fas細胞在所製備的MAR玻片上生長並且24小時之後用Fas特異的抗體處理細胞。36小時後固定細胞(Kawasaki和Taira，supra，2002)。用TUNEL法檢測凋亡；螢光信號作為數據讀出。作為選擇，使用如ApoAlert凋亡試劑盒(Clontech)通過GFP偶聯的annexin V檢測凋亡。進入凋亡途徑的進程的減緩(以TUNEL-陽性細胞減少為證據)和已知的前凋亡Fas途徑介導物表達降低之間的相關性(或負相關)表明MAR適於此類功能分析。
該系統的三個條件對於實驗的成功是至關重要的。第一，RNAi介導的基因沉默的成功率必須高，意思是說選擇作為靶的大多數位點能夠發生RNAi。當前來自於本領域研究和本發明實驗的一致意見表明大約50-80％的靶提供了明確可以檢測的近乎完全沉默的效果。可以選擇最佳的靶位點，例如通過設計編碼siRNA的DMSG盒，其中所述該siRNA能夠與靶基因中RNA結合蛋白質結合位點外的區域相互作用。此外，對於每個轉錄本使用多於1個，如2、3、4或更多靶點能夠增加每一基因在至少一個設計的點上產生沉默的可能性。因為陰性的點不能夠解釋為無關基因，通過針對每一個siRNA同時設計一個錯配對照，在錯配對照中21個核苷酸的siRNA的中間核苷酸是突變的，來控制假陽性的發生。通過觀察一致發現該位點的錯配導致siRNA無功能。
對於本發明系統成功的第二個標準是需要細胞高效攝入DNA。上面討論的並用上述方法進行優化的條件，包括使用Hela-Fas細胞，將有助於決定如何最大地獲得有效的DNA攝入。然而，如果轉染效率極其低，可以將蛋白質轉導結構域(PTD)偶聯到DMSG盒上以增加轉染效率。PTD已顯示出有利於試劑跨細胞膜高效率轉移並且同樣可用於增強LineSilenceTM盒攝取進入細胞。
對於最好地實現當前敘述的MAR系統的第三個標準是需要可清楚檢測的表型以測定RNAi。使用上述的模型系統作為例子，Fas活化誘導的細胞死亡需要測定MAR數據的信號對背景的比率。從使用相同途徑的瞬時核酶文庫篩選試驗相關的報告可以得到有關該課題的大量信息(見Kawasake和Taira，supra，2002)。然而，如果實驗被Fas介導的凋亡途徑的內在困難所阻礙，其它可選擇的途徑如TNF和TNFR相關的細胞死亡途徑或生長因子介導的增殖可以基於相似的實驗設計進行使用。
作為功能性篩選影響啟動子活性基因的工具，MAR方法特別有用。照這樣，該方法提供了功能性選擇基因的手段，這些基因包括先前未知的參與改變細胞表型或特定基因表達的基因，特別是那些先前未知的具有此功能的基因。通過在靶向大約2000個已知人轉錄因子(其序列可由資料庫獲得)的微陣列上建立基因沉默盒，並篩選調節目的啟動子活性的基因，可以進行利用RNAi微陣列的轉錄調控相關分析。對於這種篩選，MAR微陣列是基於如上述建立的條件且以容納所有候選基因的較高密度而製備的。如果必要，可以使用多個玻片。
已進行了廣泛研究的基因的相對簡單的啟動子可用來證實MAR測定結果的有效性。照這樣，可以使用人p53基因啟動子，這是因為它被定義為位於轉錄起始位點5』部分的大約85個鹼基對序列(對於本研究也可以使用該5′序列的300個鹼基對區域)，還因為結合到該區域並參與調控p53基因表達的因子，包括p53本身，是已知的(Tuck和Crawford，Mol.Cell.Biol.92163-2172，1989；Albor等，Mol.Carc.11176-183，1994；Hudson等，DNA Cell Biol.14759-766，1995，每一文獻此處引用作為參考)。作為DNA損傷的反應，p53蛋白質可起增強G1期細胞周期阻斷的作用，這是預防腫瘤的重要過程。然而，通過何種方法調控p53基因並不是完全清楚的。例如，最近的研究表明參與細胞周期進程和增殖的轉錄因子E2F出乎意料地調控p53，而與p53啟動子區域沒有明顯的結合位點(Ren等，Genes Devel.15245-256，2002，此處引用作為參考)。此外，其它因子可以在轉錄水平直接或間接調控p53的表達。
PCR和標準克隆技術用於設計報告基因上遊所定義的p53啟動子區域。可以使用為啟動子研究設計的質粒如pd2EGFP-Basic(Clontech)。按如上所述的方法建立表達所述構建體的穩定細胞系，並生長於點了LineSilenceTM盒的玻片上。根據它們在玻片上的坐標確定引起報告物表達顯著改變的基因，並通過獨立的試驗，使用標準的過表達或RNAi介導基因沉默的方法以證實對內源性p53表達有影響，來確定它們的功能。
對數據的統計學分析將利用現有的慣例，這些慣例來源於對其他使用熟知的或先前描述的方法的微陣列如ChIPTM陣列或GeneChipTM陣列的分析。如果期望，可以進行額外的實驗以提高該方法的靈敏性和可靠性。例如，在較後的階段，可以建立基於β-內醯胺酶系統的報告子系統並利用螢光共振能量轉移(FRET)技術，從而提供比螢光蛋白質報告物靈敏性更高的系統(Zlokarnik等，Science 27984-88，1998，此處引用作為參考)。
儘管已經以上述實施例作為參考對本發明進行了描述，仍然可以理解對其進行的修飾和改變仍包含於本發明的精神和範圍之內。因此，本發明僅由下述權利要求所限制。
序列表110美國綠陽生物技術及醫藥公司120用於DNA介導基因沉默的組合物130ALLELE1100-2WO140PCT/US 02/416421412002-12-26150US 10/217,5641512002-08-12150US 10/202,4791512002-07-23150US 60/343,6971512001-12-2716051170PatentIn版本3.12101211113212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4001gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgaacggca tcaaggtgaa ctt 1132102211109212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4002aagttcacct tgatgccgtt cggtgtttcg tcctttccac aagatatata aagccaagaa60atcgaaatac tttcaagtta cggtaagcat atgatagtcc atgcaaata 1092103211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4003gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgaacggca tcaaggtgaa ctttttacag 120tttttg 1262104211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4004ctagcaaaaa ctgtaaaaag ttcaccttga tgccgttcgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 1262105211113212DNA213人工序列
220
223合成的寡核苷酸4005gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgttcacct tgatgccgtt ctt 1132106211109212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4006aagaacggca tcaaggtgaa cggtgtttcg tcctttccac aagatatata aagccaagaa60atcgaaatac tttcaagtta cggtaagcat atgatagtcc atgcaaata 1092107211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4007gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg60ctttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca ccgttcacct tgatgccgtt ctttttacag 120tttttg 1262108211126212DNA213人工序列
220
223合成的寡核苷酸4008ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 1262109211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸4009ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatga aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 12621010211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40010ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacgggatga aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 126
21011211126212DNA213人工序列220
22合成的寡核苷酸40011ctagcaaaaa ctgtaaatag aacggcatca aggtgaaggg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 12621012211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40012ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgatggg tgtttcgtcc tttccacaag60atatataaag ccaagaaatc gaaatacttt caagttacgg taagcatatg atagtccatg 120caaata 1262101321142212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40013gatctatttg catggactat catatgctta ccgtaacttg aa 42
2101421144212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40014agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acga 442101521140212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40015aacaccgttc accttgatgc cgttcttttt acagtttttg 402101621166212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40016ctagcaaaaa ctgtaaaaag aacggcatca aggtgaacgg tgtttcgtcc tttccacaag60atatat 662101721160212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40017aaagccaaga aatcgaaata ctttcaagtt acggtaagca tatgatagtc catgcaaata6021018211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40018gatctatttg catacaaaag gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga60ctataaatat cccttggaga aaagccttgt ttggtaaaca gttgattgaa cttttgttcg 120tttttg 12621019211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40019gatctatttg catacaaaag gaaactcacc ctaactgtaa agtaattgtg tgttttgaga60ctataaatat cccttggaga aaagccttgt ttgttcaatc aactgtttac cttttgttcg 120tttttg 12621020211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40020ctagcaaaaa cgaacaaaag ttcaatcaac tgtttaccaa acaaggcttt tctccaaggg60atatttatag tctcaaaaca cacaattact ttacagttag ggtgagtttc cttttgtatg 120caaata 12621021211126212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40021ctagcaaaaa cgaacaaaag gtaaacagtt gattgaacaa acaaggcttt tctccaaggg60atatttatag tctcaaaaca cacaattact ttacagttag ggtgagtttc cttttgtatg 120caaata 1262102221162212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40022gattatttgc atacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac60ta 622102321163212DNA213人工序列
220
223合成的寡核苷酸40023taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg ttcaatcaac tgtttacctt ttgttcgttt60ttt 632102421162212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40024ctagcaaaaa cgaacaaaag gtaaacagtt gattgaacaa acaaggcttt tctccaaggg60at 622102521162212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40025tttatagtct caaaacacac aattacttta cagttagggt gagtttcctt ttgtatgcaa60at 622102621136212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(36)223n為任一種核苷酸40026cat tcnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gaatgc 362102721137212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(37)223n為任一種核苷酸40027gagacgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ncgtctc 372102821139212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40028taatacgact cactatagga acggcatcaa ggtgaactt 392102921139212DNA213人工序列
220
223合成的寡核苷酸40029aagttcacct tgatgccgtt cctatagtga gtcgtatta 392103021139212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40030taatacgact cactataggt tcaccttgat gccgttctt 392103121139212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40031aagaacggca tcaaggtgaa cctatagtga gtcgtatta 39210322117212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸40032atctgtt 7
2103321114212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(7)..(14)223n為任一種核苷酸220
221misc_feature222(11)..(14)223核苷酸11-14任選地存在40033acctgcnnnn nnnn 142103421120212DNA213人(Homo sapiens)40034cttaccgtaa cttgaaagta202103521120212DNA213鼠40035ctcaccctaa ctgtaaagta2021036211265212DNA213人
40036aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac60aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagtttttaa aattatgttt 180taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata 240tatcttgtgg aaaggacgaa acacc 2652103721116212DNA213T7噬菌體40037taatacgact cactat162103821187212DNA213人工序列220
223經修飾的U6基因增強子220
221misc_feature222(8)..(67)223n為任一種核苷酸220
221misc_feature222(18)..(67)223核苷酸18-67位任選地存在40038attgcatnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn60nnnnnnnctt accgtaactt gaaagta87
2103921187212DNA213人工序列220
223經修飾的U6基因增強子220
221misc_feature222(8)..(67)223n為任一種核苷酸220
221misc_feature222(18)..(67)223核苷酸18-67位任選地存在40039attgcatnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn60nnnnnnnctc accctaactg taaagta872104021140212DNA213人工序列220
223經修飾的U6基因增強子220
221misc_feature222(1)..(40)223n為任一種核苷酸40040attgcatnnn nnnnnnnnnn cttaccgtaa cttgaaagta 4021041
21140212DNA213人工序列220
223經修飾的U6基因增強子220
221misc_feature222(1)..(40)223n為任一種核苷酸40041attgcatnnn nnnnnnnnnn ctcaccctaa ctgtaaagta 40210422116212 DNA213SP6噬菌體40042gggacgtttt tttccc16210432117212DNA213SP6噬菌體40043ttttttc 72104421143212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature
222(1)..(43)223n為任一種核苷酸40044accgcattcn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngaatgc ttt 432104521124212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(5)..(20)223n為任一種核苷酸220
221misc_feature222(19)..(20)223核苷酸19-20位任選地存在40045accgnnnnnn nnnnnnnnnn cttt 242104621147212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(1)..(47)223n為任一種核苷酸40046acaccgagac gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncgtc tcttttt 47
2104721128212DNA213人工序列220
223合成的寡核苷酸220
221misc_feature222(7)..(22)223n為任一種核苷酸220
221misc_feature222(21)..(22)223核苷酸21-22位任選地存在40047acaccgnnnn nnnnnnnnnn nncttttt 282104821111212DNA213人40048tttttacatc a 11210492119212DNA213Mouse40049ttttgttcc 92105021115
212DNA213人工序列220
223經修飾的人RNA聚合酶III終止子40050tttttacagt ttttg 152105121115212DNA213人工序列220
223經修飾的小鼠RNA聚合酶III終止子40051ttttgttcgt ttttg 1權利要求
1.分離的脫氧核糖核酸(DNA)分子，其包含編碼中間體小幹擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個核苷酸的可表達模板核苷酸序列，所述分離的DNA分子介導靶RNA的RNA幹擾，所述中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補的至少約15個核苷酸的5′部分和含有不與靶RNA有意鏈互補的約1-5個核苷酸的3』端部分，其中該siRNA選擇性地與靶RNA有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分和含有不與靶RNA反義鏈互補的約1-5個核苷酸的3』端部分，其中該siRNA選擇性地與靶RNA反義鏈雜交。
2.權利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長度約為16-30個核苷酸。
3.權利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長度約為20-25個核苷酸。
4.權利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA長度約為21個核苷酸。
5.權利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA的3′端部分長度約為2-4個核苷酸。
6.權利要求1的分離的DNA分子，其中中間體siRNA的3′端部分長度約為2或3個核苷酸。
7.權利要求1的分離的DNA分子，其為雙鏈DNA分子。
8.權利要求7的分離的DNA分子，其中雙鏈DNA分子的一條鏈編碼與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA，並且其中雙鏈DNA分子的第二條鏈編碼與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA。
9.權利要求1的分離的DNA分子，它是具有第一末端和第二末端的線性DNA分子。
10.載體，其包含權利要求1的分離的DNA分子。
11.權利要求10的載體，其為表達載體。
12.細胞，其包含權利要求1的分離的DNA分子。
13.多種分離的DNA分子，其包含至少兩種權利要求1的分離的DNA分子。
14.權利要求13的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
15.權利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
16.權利要求15的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5』部分與第二分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5』部分互補。
17.權利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
18.權利要求14的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
19.權利要求13的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
20.權利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
21.權利要求20的多種分離的DNA分子，其中第一分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5』部分與第二分離的DNA分子編碼的中間體siRNA的5』部分互補。
22.權利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
23.權利要求19的多種分離的DNA分子，其中至少第二分離的DNA分子編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
24.DNA介導的基因沉默(DMSG)盒，其包含可操作地連接於至少一個異源核苷酸序列的權利要求1的分離DNA分子。
25.權利要求24的DMSG盒，其中異源核苷酸序列包含限制性核酸內切酶識別位點、重組酶識別位點、或它們的組合。
26.權利要求24的DMSG盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個轉錄調控元件。
27.權利要求26的DMSG盒，其中至少一個轉錄調控元件包含啟動子、增強子、終止子、或它們的組合。
28.權利要求24的DMSG盒，其包含可操作連接的啟動子、權利要求1的DNA分子和終止子。
29.權利要求26的DMSG盒，其中轉錄調控元件包含RNA聚合酶III轉錄調控元件。
30.權利要求29的DMSG盒，其中RNA聚合酶III轉錄調控元件包含人U6基因RNA聚合酶III轉錄調控元件。
31.權利要求27的DMSG盒，其中轉錄調控元件是誘導型啟動子、誘導型增強子、組成型的活化啟動子、組成型的活化增強子、或它們的組合。
32.權利要求27的DMSG盒，其中轉錄調控元件是組織特異性啟動子或發育階段特異性啟動子。
33.權利要求24的DMSG盒，其中可表達的模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，並且其中異源核苷酸序列包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個核苷酸的第二可表達模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5』部分與第一中間體siRNA的5』部分互補，因此，當表達時，第一中間體siRNA的5』部分選擇性地與第二中間體siRNA的5』部分雜交，從而形成髮夾結構。
34.權利要求33的DMSG盒，其進一步包含至少一個RNA聚合酶III轉錄調控元件。
35.權利要求33的DMSG盒，其進一步包含至少一個人U6基因轉錄調控元件。
36.權利要求24的DMSG盒，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，所述有意多核苷酸序列包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ ID NO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、和編碼中間體siRNA的至少約16個核苷酸的模板核苷酸序列；b)與a)的核苷酸序列互補的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
37.權利要求36的DMSG盒，其中a)的有意多核苷酸進一步包含可操作連接的至少一個含有TTTTT五核苷酸序列的轉錄終止子；其中b)的反義多核苷酸進一步包含可操作連接的AAAAA五核苷酸序列；或其中a)的有意多核苷酸進一步包含可操作連接的至少一個含有TTTTT五核苷酸序列的轉錄終止子，並且b)的反義多核苷酸進一步包含可操作連接的AAAAA五核苷酸序列。
38.權利要求24的DMSG盒，它是線性表達盒。
39.權利要求24的DMSG盒，它是環狀表達盒。
40.權利要求24的DMSG盒，其進一步包含可檢測標記。
41.權利要求40的DMSG盒，其中可檢測標記是螢光標記、放射性核素、酶、順磁性標記、生物發光標記、或化學發光標記。
42.權利要求41的DMSG盒，其中所述的螢光標記是螢光素、R-藻紅素、Cy3、Cy5、或德克薩斯紅。
43.權利要求24的DMSG盒，其進一步包含靶向部分。
44.權利要求43的DMSG盒，其中靶向部分是多核苷酸、肽、肽模擬物、或小的有機分子。
45.權利要求43的DMSG盒，其中靶向部分包括細胞受體的配體、細胞配體的受體、或抗體。
46.載體，其包含權利要求24的DMSG盒。
47.細胞，其包含權利要求24的DMSG盒。
48.多種DMSG盒，其包含至少兩種權利要求24的DMSG盒。
49.權利要求48的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
50.權利要求49的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
51.權利要求50的多種DMSG盒，其中由第一DMSG盒的可表達核苷酸序列編碼的中間體siRNA的5』部分與第二DMSG盒的可表達核苷酸序列編碼的中間體siRNA的5』部分互補。
52.權利要求49的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
53.權利要求50的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
54.權利要求48的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
55.權利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
56.權利要求55的多種DMSG盒，其中由第一DMSG盒編碼的中間體siRNA的5』部分與第二DMSG盒編碼的中間體siRNA的5』部分互補。
57.權利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
58.權利要求54的多種DMSG盒，其中至少第二分離的DNA分子的可表達模板核苷酸序列編碼包含與第二靶RNA的有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
59.細胞內介導靶RNA的RNA幹擾的方法，該方法包括將至少一種權利要求24的DMSG盒導入細胞，因此包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達引發靶RNA的降解，從而在所述的細胞中介導RNA幹擾。
60.權利要求59的方法，其中至少一種DMSG盒編碼與靶RNA有意鏈互補的中間體siRNA。
61.權利要求59的方法，其包括將至少兩種DMSG盒導入細胞。
62.權利要求61的方法，其中至少兩種DMSG盒中的第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，並且其中至少兩種DMSG盒中的第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。
63.權利要求62的方法，其中與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA的5』部分與與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA的5』部分互補，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
64.權利要求59的方法，其中靶RNA是信使RNA(mRNA)。
65.權利要求64的方法，其中mRNA是由細胞內的內源基因編碼的。
66.權利要求59的方法，其中靶RNA是病毒RNA。
67.權利要求66的方法，其中病毒RNA是雙鏈RNA。
68.樣本中敲低靶基因表達的方法，該方法為將樣本與至少一種權利要求24的DMSG盒接觸，其中包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達引發靶基因編碼的靶RNA分子的降解，從而部分或完全敲低樣本中靶基因的表達。
69.權利要求68的方法，其包括將樣本與至少兩種DMSG盒接觸。
70.權利要求69的方法，其中至少兩種DMSG盒的第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，並且其中至少兩種DMSG盒的第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA。
71.權利要求70的方法，其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補，由此第一中間體siRNA和第二中間體siRNA選擇性雜交形成siRNA。
72.權利要求68的方法，它是在體外進行的。
73.權利要求68的方法，其中樣本包括細胞，所述的方法包括將至少一種DMSG盒導入細胞，由此包含由DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA的表達引發RNA分子的降解，從而敲低細胞中靶基因的表達。
74.權利要求73的方法，其中細胞是培養的細胞。
75.權利要求73的方法，其中細胞包含原位細胞。
76.權利要求73的方法，其中靶基因是細胞中的內源基因。
77.權利要求73的方法，其中細胞是生殖細胞。
78.在細胞群中跟蹤經歷DNA介導的基因沉默的特異細胞或特異細胞群的方法，該方法包括將至少一種權利要求35的DMSG盒導入特異細胞或特異細胞群體中的每個細胞；以及檢測可檢測標記，從而在細胞群中跟蹤經歷DNA介導的基因沉默的特異細胞或特異細胞群。
79.權利要求78的方法，其包括將第一DMSG盒和第二DMSG盒導入特異細胞或特異細胞群，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。
80.鑑定經歷DNA介導的基因沉默的細胞的方法，該方法包括在足以將DMSG盒導入細胞的條件下，將至少一個細胞與至少一種權利要求35的DMSG盒接觸；以及檢測細胞中至少一種DMSG盒的可檢測標記，從而鑑定經歷DNA介導的基因沉默的細胞。
81.權利要求80的方法，其包括將至少一個細胞與第一DMSG盒和第二DMSG盒接觸，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。
82.權利要求81的方法，其中第一DMSG盒的可檢測標記不同於第二DMSG盒的可檢測標記，且其中所述的檢測步驟包括檢測第一DMSG盒的可檢測標記和第二DMSG盒的可檢測標記。
83.評估測試細胞中基因功能的方法，該方法包括將至少一種權利要求24的DMSG盒導入測試細胞，以及當表達DMSG盒編碼的siRNA時，觀察測試細胞的表型，由此將測試細胞與對照細胞的表型進行比較而指示靶基因的功能，從而評估測試細胞中基因的功能。
84.確定試劑是否影響測試細胞中特異基因的方法，該方法包括在測試細胞中表達包含被至少一種權利要求24的DMSG盒編碼的中間體siRNA的siRNA，其中中間體siRNA包含與測試細胞中特異基因編碼的RNA分子互補的5』部分；將測試細胞和對照細胞與試劑相接觸，以及比較測試細胞的表型和對照細胞的表型，從而評估試劑是否影響測試細胞中的特異基因。
85.權利要求84的方法，其包括在細胞中表達由第一DMSG盒編碼的第一中間體siRNA和由第二DMSG盒編碼的第二中間體siRNA，其中第一中間體siRNA包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分，其中第二中間體siRNA包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分，且其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。
86.權利要求84的方法，其中由測試細胞的表型相對於對照細胞的表型的變化確定所述試劑為影響特異基因的試劑。
87.通過誘導針對靶RNA介導的疾病的RNAi改善個體中RNA介導的疾病的方法，該方法包括將表現RNA介導的疾病個體的細胞與至少一種DMSG盒接觸，其中表達包含由DMSG盒的模板核苷酸序列編碼的一種或多種中間體siRNA分子的siRNA能夠介導針對靶RNA的RNAi。
88.權利要求87的方法，其中在體外將個體細胞與DMSG盒接觸，從而產生經遺傳修飾的細胞，該方法進一步包括將經遺傳修飾的細胞回施與受試者。
89.權利要求87的方法，其中在體內將個體細胞與DMSG盒接觸，該方法包括在一些條件下將包含DMSG盒的組合物施與個體，從而使表現出RNA介導的疾病的細胞與DMSG盒接觸。
90.權利要求87的方法，其中靶RNA是內源RNA。
91.權利要求87的方法，其中靶RNA是外源RNA。
92.權利要求91的方法，其中內源RNA是細菌RNA或病毒RNA。
93.一種試劑盒，其包含至少一種權利要求1的分離的DNA分子。
94.一種試劑盒，包含至少一種權利要求24的DMSG盒。
95.權利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含限制性核酸內切酶識別位點、重組酶識別位點、或它們的組合。
96.權利要求95的試劑盒，其進一步包含至少一個啟動子、至少一個終止子、或它們的組合，其中啟動子或終止子包含足以可操作連接於編碼中間體siRNA的核苷酸序列上的末端。
97.權利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個啟動子、至少一個終止子、或它們的組合。
98.權利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含人U6基因啟動子或RNA聚合酶III啟動子。
99.權利要求94的試劑盒，其包含經修飾的U6基因增強子，所述增強子包含下述核苷酸序列5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ IDNO38)；或5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ IDNO39).
100.權利要求99的試劑盒，其中經修飾的U6基因增強子被可操作連接於啟動子。
101.權利要求94的試劑盒，其中異源核苷酸序列包含至少一個增強子元件。
102.權利要求94的試劑盒，其中試劑盒進一步包含轉染輔助物。
103.權利要求94的試劑盒，其包含第一DMSG盒和至少第二DMSG盒。
104.權利要求94的試劑盒，其包含第一DMSG盒和第二DMSG盒。
105.權利要求103的試劑盒，其中第一DMSG盒編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的第一中間體siRNA，其中第二DMSG盒編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的第二中間體siRNA，且其中第一中間體siRNA的5』部分與第二中間體siRNA的5』部分互補。
106.分離的經修飾U6基因增強子，其包含5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ IDNO38)；或5′-ATTGCAT-N(10-60)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ IDNO39).
107.權利要求106的分離的經修飾U6基因增強子，其包含5′-ATTGCAT-N(13)-CTTACCGTAACTTGAAAGTA-3′(SEQ ID NO40)；或5′-ATTGCAT-N(13)-CTCACCCTAACTGTAAAGTA-3′(SEQ ID NO41).
108.權利要求106的分離的經修飾U6基因增強子，其包含SEQ IDNO1的6-46位核苷酸。
109.非人的轉基因生物，其包含權利要求24的DMSG盒。
110.權利要求109的轉基因生物，其中轉基因生物是哺乳動物。
111.權利要求109的轉基因生物，其中轉基因生物是轉基因嚙齒類動物。
112.權利要求109的轉基因生物，其中轉基因生物是轉基因小鼠。
113.權利要求109的轉基因生物，其中DMSG盒包含組織特異的啟動子、誘導型啟動子、或發育階段特異的啟動子。
114.DNA介導的基因沉默(DMSG)盒，其包含可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動子、可表達的模板核苷酸序列、和至少一個pol III終止子，其中可表達模板核苷酸序列與pol III啟動子是異源的，其中可表達模板核苷酸序列由編碼中間體小幹擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個核苷酸組成，它介導靶RNA的RNA幹擾，所述的中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和任選地含有約1-5個核苷酸的3′端部分，其中該中間體siRNA選擇性地與靶RNA的有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和任選地含有約1-5個核苷酸的3′端部分，其中該中間體siRNA選擇性地與靶RNA的反義鏈雜交。
115.權利要求114的DMSG盒，其中中間體siRNA長度約為21-23個核苷酸。
116.權利要求114的DMSG盒，其中中間體siRNA的3′端部分長度約為1-4個核苷酸。
117.權利要求114的DMSG盒，其中pol III啟動子或pol III終止子包含哺乳動物U6基因pol III啟動子或pol III終止子。
118.權利要求117的DMSG盒，其中哺乳動物U6基因是人U6基因或小鼠U6基因。
119.權利要求114的DMSG盒，其還包含可操作連接的增強子。
120.權利要求119的DMSG盒，其中增強子是組成型的活化增強子或誘導型增強子。
121.權利要求114的DMSG盒，其是雙鏈DNA分子。
122.權利要求121的DMSG盒，其中雙鏈DNA分子的一條鏈編碼與靶RNA有意鏈互補的第一中間體siRNA，其中雙鏈DNA分子的第二條鏈編碼與靶RNA反義鏈互補的第二中間體siRNA，並且其中第一中間體siRNA與第二中間體siRNA選擇性雜交形成雙鏈siRNA。
123.權利要求122的DMSG盒，其中雙鏈siRNA在每一3′末端包含1-4個核苷酸的3′突出端。
124.一種載體，其包含權利要求114的DMSG盒。
125.一種細胞，其包含權利要求114的DMSG盒。
126.權利要求114的DMSG盒，其中可表達的模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，並且其中可表達模板核苷酸序列被可操作連接於編碼第二中間體siRNA的第二可表達模板核苷酸序列，其中第二中間體siRNA的5』部分與第一中間體siRNA的5』部分互補，由此當表達時，第一中間體siRNA的5』部分選擇性地與第二中間體siRNA的5』部分雜交，從而形成髮夾結構。
127.權利要求114的DMSG盒，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ IDNO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個含有TTTT四核苷酸序列的轉錄終止子；b)與a)的核苷酸序列互補的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
128.權利要求127的DMSG盒，其中轉錄終止子包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO49。
129.權利要求127的DMSG盒，其中轉錄終止子包含SEQ ID NO50或SEQ ID NO51。
130.權利要求114的DMSG盒，其進一步包含可檢測標記、靶向部分、或它們的組合。
131.多種DMSG盒，其包含至少兩種權利要求114的DMSG盒。
132.權利要求131的多種DMSG盒，其中第一DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA有意鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
133.權利要求132的多種DMSG盒，其中至少第二DMSG盒的可表達模板核苷酸序列編碼包含與靶RNA反義鏈互補的5』部分的中間體siRNA。
134.多種分離的脫氧核糖核酸(DNA)分子，其中每一DNA分子被固定在固體支持物上，並且其中每一DNA分子都包含編碼中間體小幹擾核糖核酸(RNA)分子(siRNA)的至少約16個核苷酸的可表達模板核苷酸序列，其介導靶RNA的RNA幹擾，所述中間體siRNA包含a)含有與靶RNA有意鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和含有不與靶RNA有意鏈互補的約1-5個核苷酸的3′端部分，其中所述siRNA選擇性地與靶RNA有意鏈雜交；或b)含有與靶RNA反義鏈互補的至少約15個核苷酸的5』部分，和含有不與靶RNA反義鏈互補的約1-5個核苷酸的3′端部分，其中所述siRNA選擇性地與靶RNA反義鏈雜交。
135.權利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子進一步包含可操作連接於可表達模板核苷酸序列上的RNA聚合酶III(pol III)啟動子，並且其中可表達模板核苷酸序列相應於pol III啟動子而言是異源的。
136.權利要求135的多種DNA分子，其中pol III啟動子是人U6基因pol III啟動子。
137.權利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子包含可操作連接的RNA聚合酶III(pol III)啟動子、可表達的模板核苷酸序列、和至少一個pol III終止子，並且其中可表達的模板核苷酸序列相應於polIII啟動子而言是異源的。
138.權利要求137的多種DNA分子，其包含可操作連接的a)有意多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO1的核苷酸6-13、SEQ IDNO1的核苷酸19-38、SEQ ID NO1的核苷酸66-69、模板核苷酸序列、和至少一個含有TTTT四核苷酸序列的轉錄終止子；b)與a)的核苷酸序列互補的反義多核苷酸；或c)包含a)的有意多核苷酸和b)的反義多核苷酸的雙鏈多核苷酸。
139.權利要求138的多種DNA分子，其中轉錄終止子包含SEQ IDNO48或SEQ ID NO49。
140.權利要求138的多種DNA分子，其中轉錄終止子包含SEQ IDNO50或SEQ ID NO51。
141.權利要求134的多種DNA分子，其中可表達模板核苷酸序列編碼第一中間體siRNA，其中可表達模板核苷酸序列被可操作連接於包含編碼第二中間體siRNA的至少約16個核苷酸的第二可表達模板核苷酸序列的核苷酸序列上，並且其中第二中間體siRNA的5』部分與第一中間體siRNA的5』部分互補，由此當表達時，第一中間體siRNA的5』部分選擇性地與第二中間體siRNA的5』部分雜交，從而形成髮夾結構。
142.權利要求134的多種DNA分子，其中每一DNA分子都被固定在固體支持物的特定位置上。
143.權利要求134的多種DNA分子，其中DNA分子定位在陣列上。
144.權利要求143的多種DNA分子，其中陣列是可尋址陣列。
145.權利要求134的多種DNA分子，其中用明膠將多種的DNA分子固定在固體支持物上。
146.權利要求134的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進一步包含可操作連接的跨膜結構域肽，其中跨膜結構域肽是膜內剪切蛋白酶的底物。
147.權利要求146的多種DNA分子，其中DNA分子通過跨膜結構域肽被固定在固體支持物上。
148.權利要求146的多種DNA分子，其中跨膜結構域肽包括β-澱粉樣前體蛋白質的肽、果蠅Sevenless蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅torso蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅δ蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質的肽。
149.權利要求146的多種DNA分子，其中跨膜結構域肽是早老因子的底物。
150.權利要求146的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進一步包含可操作連接的蛋白質轉導結構域。
151.權利要求134的多種DNA分子，其中多種的DNA分子進一步包含可操作連接的蛋白質轉導結構域。
152.權利要求151的多種DNA分子，其中蛋白質轉導結構域包括人免疫缺陷病毒TAT結構域、果蠅觸角足同源結構域、單純皰疹病毒VP22轉導結構域、或成纖維細胞生長因子轉導結構域。
153.權利要求134的多種DNA分子，其中固體支持物包括微晶片、玻片、或珠子。
154.一種試劑盒，它包含權利要求134的多種DNA分子。
155.將DNA介導的基因沉默(DMSG)盒導入細胞的方法，其包括在足以使DMSG盒進入細胞的條件下，將固定於固體支持物上的權利要求24的DMSG盒與細胞接觸，從而將DMSG盒導入細胞。
156.權利要求155的方法，其中DMSG盒進一步包含可操作連接的跨膜結構域肽，並且其中跨膜結構域肽是膜內剪切蛋白酶的底物。
157.權利要求156的方法，其中DMSG盒通過跨膜結構域肽被固定於固體支持物上。
158.權利要求156的方法，其中跨膜結構域肽包括β-澱粉樣前體蛋白質的肽、果蠅sevenless蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅torso蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、果蠅δ蛋白質或其哺乳動物同系物的肽、或人血型糖蛋白-A蛋白質的肽。
159.權利要求156的方法，其中跨膜結構域肽是早老因子的底物。
160.權利要求155的方法，其中DMSG盒進一步包含可操作連接的蛋白質轉導結構域。
161.權利要求155的方法，其中DMSG盒進一步包含可操作連接的蛋白質轉導結構域。
162.權利要求161的方法，其中蛋白質轉導結構域包括人免疫缺陷病毒TAT結構域、果蠅觸角足同源結構域、單純皰疹病毒VP22轉導結構域、或成纖維細胞生長因子轉導結構域。
163.權利要求155的方法，其中DMSG盒包括多種DMSG盒中的DMSG盒，並且其中多種中的每一DMSG盒都被固定於固體支持物上。
164.權利要求163的方法，其中多種的DMSG盒定位在陣列上。
165.權利要求164的方法，其中陣列是可尋址陣列。
166.權利要求155的方法，其中DMSG盒是用明膠固定在固體支持物上的。
167.權利要求155的方法，其中固體支持物包括微晶片、玻片、或珠子。
168.權利要求155的方法，其中，當在包含DMSG盒的細胞中表達DMSG盒的可表達核苷酸序列時，細胞中基因的表達降低或被抑制。
169.權利要求168的方法，其中基因降低的或被抑制的表達是通過檢測細胞的表型變化而檢測的。
170.權利要求168的方法，其中基因編碼轉錄因子、生長因子、生長因子受體、蛋白激酶、或G蛋白。
171.權利要求168的方法，其中基因為在呈現病理疾病的細胞中表達，而在相應的不呈現病理疾病的細胞中不表達的基因。
172.權利要求171的方法，其中呈現病理疾病的細胞是癌細胞。
173.權利要求163的方法，其進一步包括從多種DMSG盒中，鑑定能夠降低或抑制包含DMSG盒的細胞中基因表達的DMSG盒。
174.通過權利要求173的方法分離的DMSG盒。
全文摘要
提供了通過RNA幹擾介導基因沉默的DNA組合物。DNA組合物包括驅動編碼中間體小幹擾RNA分子的核苷酸序列表達的RNA聚合酶III啟動子和RNA聚合酶III終止子。
文檔編號A61K48/00GK1636010SQ02828345
公開日2005年7月6日 申請日期2002年12月26日 優先權日2001年12月27日
發明者王繼武 申請人:美國綠陽生物技術及醫藥公司