一種製備高活性低毒副作用肝素的方法

2023-10-10 06:10:34

專利名稱：一種製備高活性低毒副作用肝素的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備高活性低毒副作用肝素的方法。屬生物醫藥領域。
背景技術：
肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以I — 4糖苷鍵交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之間，平 均分子量為15000Da ；肝素作為抗凝試劑和抗栓試劑已有60多年的歷史。肝素的抗凝血活性主要通過含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心結合抗凝血酶(AT-III)，誘導其發生構象改變，從而顯示抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor IIa)。但是由於肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用會引起出血和誘導性血小板減少、骨質疏鬆等副作用，從而大大的限制了肝素在臨床上的應用。此外，肝素還具有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、調血脂等方面的生活功能。現有研究表明，肝素的抗凝血活性取決於其戊糖活性中心的數量。戊糖結構中N-, 6-0-及3-0-位硫酸基參與結合AT-III，與抗凝血活性有關，而艾杜糖醛酸的作用尚不清楚。其中3-0-位硫酸基尤為重要如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性則會降低1000倍以上；相反，增加一個3-0-位硫酸基，則可以將肝素的抗凝血活性提高數倍。肝素由多4種生物合成酶在線粒體內合成。合成過程中會涉及多種合成酶，如2-0-，6-0_，3-0-硫酸基轉移酶(2-0ST，6-0ST, 3-0ST)分別對主鏈不同位置上的羥基進行部分硫酸化，其中3-0-位硫酸化由3-0ST完成。這些硫酸基轉移酶大多具有多種異構型式，如3-0ST就具有六種異構體。其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中。現有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-0ST-1和3-0ST-5很好的底物。因此，用3-0ST-1和3-0ST-5對低分子量肝素選擇性修飾，使80%不具有戊糖活性中心的低分子量肝素經過反映後擁有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的數量，從而提高其抗凝血活性(理論上可以同時提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。此外研究還表明，2-0硫酸基對肝素髮揮抗凝活性是非必須的。與普通肝素相比，2-0-位硫酸基的缺失降低電荷密度降低減少非特異性蛋白吸附，可一定程度降低出血風險、減少血小板聚集等。2-0-位脫硫酸化可以由2-0-sulfatase完成,2-0_sulfatase對肝素及低分子量肝素又很好的底物特異性。

發明內容
本發明的目的是提供一種製備高抗凝血活性低毒副作用肝素的方法本發明所提供的製備高抗凝血活性低分子量肝素的方法，是以肝素為底物，採用PAPS (3』 -磷酸腺苷-5』 -磷酸硫酸)再生系統，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶、2-0-sulfatase對其進行選擇性修飾，增加抗凝活性中心的數量、降低電荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本發明方法所採用的3-0-硫酸基轉移酶、2-0-sulfatase均可通過發酵製備；所述PAPS再生系統，以PNPS (對硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應的硫酸基供體，極大地降低了生產成本，使工業化成為可能。本發明為高活性低毒副作用肝素的酶法工業化生產提供了新的途徑。所述肝素是市售的未分級肝素。所述PAPS 再生系統中，反應液為含 I % Triton X-100,1% BSA7ImM MgCI2, ImMMnCI2, pH 為 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCI 緩衝液。所述PAPS再生系統中，PNPS的濃度為O. I-IOmM, PAP的濃度為O. l_50uM。所述方法中，AST-IV的用量為 O. l-50mg/ml ;優選 5-lOmg/ml。所述方法中，肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶的用量為O. l-50mg/mg底物；優選 l_20mg/ml 底物。所述方法中，按照以下方法純化低分子量肝素終止反應後，離心分離得到上清 液，將此上清液與兩倍提及的緩衝液A混合，對DEAE柱上樣；一詞以緩衝液A和緩衝液B進行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素；所述DEAE分離所用的緩衝液A為喊質量百分含量為O. 5-2. 5%的NaCI水溶液，緩衝液B為含質量百分含量為2. 5-5. 0%的 NaCI 水溶液。本發明的方法採用具有高效酶活性的肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶、2-0-sulfatase製備高抗凝血活性低毒副作用肝素。重組的AST_IV、3-0ST_1及2-0-sulfatase均可通過發酵獲得，且均攜帶6個組氨酸標籤，一步純化就可得到90%以上的蛋白酶。利用AST-IV對PNPS以及PAP的雙底物進行硫酸基酶促反應，實現了 PNPS的再生系統，從而可以使用極為廉價的PNPS作為硫酸基供體，降低了高抗凝血活性低分子量肝素的成本。本發明通過用高活性3-0ST-l、2-0-sulfatase對肝素進行選擇性修飾，得到了高抗凝血活性低毒副作用的肝素(抗凝血活性比現有低分子量肝素提高3-5倍)，具有巨大的工業應用價值。
具體實施例方式下述實施例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例I、肝素的3-0-位的硫酸化修飾PAPS再生系統組分濃度為PNPS的濃度為5mM，PAP的濃度為20uM ；PAPS再生系統中AST-IV的用量為10mg/mM PAPS。按以上組成所製備的溶液加入製備高活性低分子量肝素的溶液，作為肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶修飾反應的硫酸基供體。以肝素為原料，反映條件為Img肝素溶解在20ml反應液中於室溫震蕩(300)反應 6h。反應液包含 50mM 的 Tris-HCI (pH 7. 2), 1% Triton X-100,1 % BSA, ImM MgCI2, ImMMnCI2, ImM PNPS,40uM PAP，8mg3-0ST_l 及 4mgAST_IV。100°C下加熱反應 15 分鐘終止反應，分離得到上清液，100°C下加熱反應液15分鐘終止反應，12000rpm高速離心，真空冷凍乾燥得凍乾粉。實施例2、肝素的2-0-位的脫硫酸化修飾以3-0-位硫酸化修飾的肝素為原料，反映條件為IOmg未分級肝素溶解在Iml的反應液中，30°C震蕩(300)反應。反應液包含2-0-脫硫酸基酶3IU/g肝素，10mg/ml的肝素，50mM NaCl, 50mM咪唑pH6. 5。將上清液雨量被提及的2. 0%的NaCI水溶液混合，對DEAE柱上樣；一次以2. 0%的NaCI水溶液和3. 0%的NaCI水溶液進行梯度洗脫，收集第二次洗脫所得洗脫液，得到高活性低分子量肝素。所得溶液用去離子水透析24小時，凍幹得高活性肝素凍乾粉。實施例3、高活性低毒副作用肝素的抗凝血活性研究用lmg/mL BSA的磷酸緩衝液(PBS)，將凝血因子Xa稀釋至lU/mL，用lmg/mL BSA的PBS溶解抗凝血酶AT得到濃度為27mM的儲液，以PBS稀釋溶解凝血酶發色底物S-2765，終濃度為 1禮。用 50rnMTris』 HCl (pH 8. 4)，7. 5mM 的 Na2EDTA 和 175mM NaCl 的 緩衝液溶解樣品及對照的低分子量肝素。反應液包含25mL抗凝血酶儲液和25mL的肝素溶液，反應過程，加入檸檬酸終止反應後，在405nm的波長下面測定反應液的紫外吸光度，抗FXa活性測定過程是在不同肝素濃度的條件下。
權利要求
1.一種製備高抗凝活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素為底物，採用3』 -磷酸腺苷-5』-磷酸硫酸(PAPS)再生系統，以肝素生物合成酶3-0-硫酸基轉移酶對其進行選擇性修飾，再以2-0-脫硫酸基酶對2-0-位硫酸基脫硫酸化，增加抗凝活性中心的數量並降低其電荷密度，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。
2.根據權利要求I所述方法，其特點在於所述PAPS再生系統中，反應液為含1%Triton X-100，I % BSA, ImM MgCI2, ImM MnCI2, pH 為 5. 0-8. O 的 50mM Tris-HCI 緩衝液，PNPS 的濃度為 O. I-IOmM, PAP 的濃度為 O. l_50Um，AST-IV 的用量為 O. l_50mg/ml ;優選5-10mg/ml ;所述方法中，肝素生物合成酶3_0_硫酸基轉移酶的用量為O. l-50mg/mg底物，優選l_20mg/ml底物，反應溫度為10_40°C，優選30_40°C，酶促反應的時間為1_20小時，優選5-10小時。
3.根據權利要求I所述方法，其特點在於2-0_脫硫酸基酶的用量O.l-10IU/g肝素，優選3IU/g肝素；所述用於反應液為50mM NaCl, 50mM咪唑pH6. 5緩衝液，反應溫度為10-40°C，優選30-40°C，酶促反應的時間為1-20小時，優選5_10小時。
全文摘要
本發明公開了一種製備高活性低毒副作用肝素的方法。本發明製備高活性低毒副作用肝素的方法，是以肝素為底物，採用PAPS(3』-磷酸腺苷-5』-磷酸硫酸)再生系統，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基轉移酶、2-O-脫硫酸基酶對其進行選擇性修飾，得到高抗凝活性低毒副作用肝素。本發明方法所採用的3-O-硫酸基轉移酶、2-O-脫硫酸基酶可通過發酵製備；所述PAPS再生系統，以PNPS(對硝基苯酚磺酸鉀鹽)作為酶修飾反應的硫酸基供體，極大地降低了生產成本，使工業化成為可能。本發明為工業化製備高活性低毒副作用肝素提供了新的途徑。
文檔編號C12P19/04GK102911981SQ20121046412
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者陳敬華, 劉衛超, 周斌, 王敏, 程詠梅, 滕麗萍, 陳荊曉 申請人:江南大學