一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法

2023-10-07 18:36:09 2

一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，其包括以下步驟：將重組人幹擾素濃縮液與活化聚乙二醇溶液混合充分進行偶聯反應後，再以pH值為4.5的10mM醋酸鈉緩衝液終止上述反應，得到偶聯反應液；將所述偶聯反應液通過離子交換層析分離得到純度≥95%之單修飾的聚乙二醇幹擾素，將所述單修飾的聚乙二醇幹擾素通過切向流超濾系統進行置換緩衝系統的處理，將其置於磷酸鈉緩衝液中，最終得到聚乙二醇幹擾素蛋白。大幅度增加了修飾效率，實現了蛋白質藥物性能的改善，本發明通過特定的偶聯反應工藝，有利於偶聯產物的後續提純，提高了目標產品回收率，降低了聚乙二醇幹擾素的製造成本。
【專利說明】—種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法。
【背景技術】
[0002]幹擾素(英文名稱為interferon,簡稱為IFN)是一種由人體細胞分泌的在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種生物學活性，其活性發揮受細胞基因組的調節和控制並涉及RNA和蛋白質的合成。
[0003]目前，幹擾素是應用廣泛且臨床效果顯著的治療性藥物，其廣譜抗病毒、抗腫瘤及免疫調節功能，在病毒性疾病治療中有不可取代的作用，但普通幹擾素用於臨床治療時，通常為胃腸外給藥，體內藥物代謝的半衰期短，免疫原性強，導致給藥間隔短，給藥頻度高，人體內產生抗體也導致藥效降低，難以達到較理想的臨床效果。近年來，聚乙二醇修飾技術有效地解決了蛋白質藥物的此類缺陷。聚乙二醇(英文名稱為interfeixm，簡稱為PEG)是一種惰性無毒、可生物降解的有機多聚物，在生物技術和製藥領域有著廣泛的用途，聚乙二醇修飾技術就是通過共價結合將聚乙二醇連接到活性蛋白質上，蛋白質藥物經聚乙二醇化後，空間結構發生改變。聚乙二醇具有空間位阻，將蛋白質表面的抗原決定簇掩蓋起來，使蛋白質分子不能與各種細胞表面受體結合，不被機體的免疫系統識別，避免了相應抗體的產生，抑制相應的免疫反應。另外，蛋白質化學修飾之後，修飾劑與蛋白質分子偶聯，使得蛋白質的分子量增大，空間結構發生改變。當修飾後的蛋白質分子量達到或超出腎小球濾過作用的閾值時，蛋白質隨血液循環進入腎臟後就可以逃避腎小球濾過作用，因而可以在血液循環中停留更長的時間。
[0004]蛋白質藥物的聚乙二醇化已經成為蛋白類藥物的發展方向，雖然通過聚乙二醇對蛋白質藥物進行修飾可以獲得種種優點，但是蛋白質藥物修飾是一個複雜的過程，很多因素對蛋白質的化學修飾反應 會造成較大的影響。包括修飾劑的選擇、修飾反應的條件、修飾後是否易於分離、純化等等。因此對某一種藥物而言，有必要建立其聚乙二醇修飾的最優化方法。現有技術中對幹擾素的聚乙二醇修飾，反應後目標產物的回收率較低，成本較高，很難廣泛地進行臨床應用。
[0005]因此，現有技術還有待於更進一步的改進和發展。

【發明內容】

[0006]鑑於上述現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，通過優化聚乙二醇修飾蛋白質的偶聯條件，包括pH、溫度、反應介質、反應物配比等，提高偶聯效率，易於後續產物的分離純化，降低生產成本。
[0007]本發明的技術方案如下:
一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，其包括以下步驟:
A、將重組人幹擾素濃縮液與活化聚乙二醇溶液混合充分進行偶聯反應後，再以pH值為4.5的10 mM醋酸鈉緩衝液終止上述反應,得到偶聯反應液；B、將所述偶聯反應液通過離子交換層析分離得到純度>95%之單修飾的聚乙二醇幹擾素，將所述單修飾的聚乙二醇幹擾素通過切向流超濾進行置換緩衝系統的處理，將其置換於磷酸鈉緩衝液中，最終得到聚乙二醇幹擾素蛋白。
[0008]所述的偶聯方法，其中，在所述步驟A之前還包括:將重組人幹擾素原液通過切向流超濾系統濃縮至蛋白濃度為2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸鹽緩衝液滲濾，得到所述重組人幹擾素濃縮液。
[0009]所述的偶聯方法，其中，所述步驟A具體的包括:
將所述活化聚乙二醇溶解於冷卻至2V _8°C的乙腈溶液中，使其終濃度為40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量為所述重組人幹擾素濃縮液蛋白總量的2-8倍；所述偶聯反應在鹼性條件下進行。
[0010]所述的偶聯方法，其中，所述步驟B具體的包括:以2-6倍的醋酸鈉緩衝液平衡上樣後的離子交換層析柱，再以含20 mM -SOmM氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，得到純度> 95%之單修飾的聚乙二醇幹擾素。
[0011]本發明提供了一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，以乙腈代替了傳統工藝中的鹽酸作為活化聚乙二醇的溶解劑，活化聚乙二醇在有機溶劑中更為穩定，可增加活化基團與蛋白質氨基的作用，提高偶聯效率與目標產物回收效率；其二，偶聯反應的PH環境採用鹼性條件反應，在不同PH條件下，蛋白的電荷性質不同，導致親核反應的能力有差別，使得聚乙二醇修飾的特異性發生變化，在鹼性條件下反應，大幅度增加了修飾效率，實現了蛋白質藥物性能的改善，其三，反應溫度2-8°C，低溫條件下反應，有利於保留蛋白活性，其四，PEG用量的選擇，PEG用量越大，修飾率和修飾多態性越高，一般增加PEG分子量可延長藥物的循環半衰期，但除個別蛋白的PEG修飾對蛋白質活性影響不大外，大多數蛋白質的活性隨著修飾PEG數目和分子量的增加而降低，因此在修飾率、修飾多態性、活性保留率和成本之間需尋求平衡點；本發明通過特定的偶聯反應工藝，有利於偶聯產物的後續提純，提高了目標產品回收率，降低了聚乙二醇幹擾素的製造成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發明中偶聯方法的流程示意圖；
圖2為本發明中實施例1、實施例2、實施例3與實施例4各自得到之聚乙二醇幹擾素的電泳檢測圖譜；
圖3為本發明中得到之聚乙二醇幹擾素的同分異構體分析圖譜。
[0013]圖4為本發明中實施例1、實施例2、實施例3與實施例4各自得到之聚乙二醇幹擾素的偶聯率對比圖，其中，圖中第1-4道分別是:實施例1、實施例2、實施例3、實施例4、PEG IFN對照及分子量標準；
圖5為聚乙二醇幹擾素a2b原液檢測結果；
圖6為聚乙二醇幹擾素a2b的偶聯率檢測結果；
圖7為聚乙二醇幹擾素a2b的收穫率檢測結果 。
【具體實施方式】[0014]本發明提供了一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，為使本發明的目的、技術方案及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0015]本發明提供了一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，如圖1所示的，其包括以下步驟:
步驟101:將重組人幹擾素濃縮液與活化聚乙二醇溶液混合充分進行偶聯反應後，再以PH值為4.5的10 mM醋酸鈉緩衝液終止上述反應，得到偶聯反應液；
步驟102:將所述偶聯反應液通過離子交換層析分離得到純度> 95%的單修飾的聚乙二醇幹擾素，將所述單修飾的聚乙二醇幹擾素通過切向流超濾進行置換緩衝系統的處理，將其置換於磷酸鈉緩衝液中，最終得到聚乙二醇幹擾素蛋白。
[0016]更進一步的，在所述步驟101之前還包括:將重組人幹擾素原液通過切向流超濾系統濃縮至蛋白濃度為2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸鹽緩衝液滲濾，得到所述重組人幹擾素濃縮液。
[0017]在本發明的另一較佳實施例中，所述步驟101具體的包括:
將所述活化聚乙二醇溶解於冷卻至2V _8°C的乙腈溶液中，使其終濃度為40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量為所述重組人幹擾素濃縮液蛋白總量的2-8倍；所述偶聯反應在鹼性條件下進行。以乙腈代替了傳統工藝中的鹽酸作為活化聚乙二醇的溶解劑，活化聚乙二醇在有機溶劑中更為穩定，可增加活化基團與蛋白質氨基的作用，提高偶聯效率與目標產物回收效率，尤其是在2°C_8°C的低溫條件下反應，有利於保留蛋白活性，實現了修飾率、修飾多態性、活性保留率和低生產成本之間的平衡。
[0018]更進一步的，所述 步驟102具體的包括:以2-6倍的醋酸鈉緩衝液平衡上樣後的離子交換層析柱，再以含20 mM -SOmM氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，得到純度> 95%之單修飾的聚乙二醇幹擾素。
[0019]為了更進一步的描述本發明的方法，以下列舉更為詳盡的實施例進行說明。
[0020]實施例1
重組人幹擾素a 2b濃縮液的製備
取重組人幹擾素ct 2b原液4500ml,蛋白濃度1.02mg/ml,通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量10KD)濃縮至蛋白濃度3.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸緩衝液(Ph 8.00)滲濾，最後將濃縮後的重組人幹擾素a 2b蛋白等體積置換於0.05M的硼酸緩衝液中，得到所述重組人幹擾素a 2b濃縮液。
[0021]偶聯反應液的製備:
按1:5的質量比將重組人幹擾素O 2b濃縮液加入溶解於乙腈溶液中的PEG中，在2V -8°C條件下充分反應6小時，以10倍體積的pH為4.5的10 mM的醋酸鈉緩衝液終止上述反應，得到偶聯反應液。
[0022]聚乙二醇幹擾素a2b的製備
將偶聯反應液上離子交換層析柱(EMD COO - 650 (M))，以10 mM醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)流洗平衡至基線平穩，分別以含0.05-0.1M NaCl的10 mM,醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，純度> 95%的單體聚乙二醇幹擾素a2b混合後以通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量30KD)，將蛋白置換於0.1M磷酸鈉緩衝液中。最終得到聚乙二醇幹擾素a2b。
[0023]實施例2
重組人幹擾素a 2b濃縮液的製備
取重組人幹擾素ct 2b原液4820ml,蛋白濃度0.95mg/ml,通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量10KD)濃縮至蛋白濃度5.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸緩衝液(pH 8.00)滲濾。最後將濃縮後的重組人幹擾素a 2b蛋白等體積置換於0.05M的硼酸緩衝液中，得到所述重組人幹擾素a 2b濃縮液。
[0024]偶聯反應液的製備:
按1:4的質量比將重組人幹擾素a 2b濃縮液加入溶解於乙腈溶液中的PEG中，，在2V -8°C條件下充分反應6小時，以20倍體積的pH為4.5的10 mM的醋酸鈉緩衝液終止上述反應，得到偶聯反應液。
[0025]聚乙二醇幹擾素a2b的製備
將所述偶聯反應液通過(EMD COO - 650 (M))離子交換層析柱，以10 mM醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)流洗平衡至基線平穩，再以含0.05-0.1M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液在pH 4.5的條件下洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，純度> 95%的單體聚乙二醇幹擾素a2b混合後以通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量30KD)，將蛋白置換於0.1M磷酸鈉緩衝液中。最終得到聚乙二醇幹擾素a2b。
[0026]實施例3
重組人幹擾素a 2b濃縮液的製備
取重組人幹擾素ct 2b原液5000ml,蛋白濃度0.92mg/ml,通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量10KD)濃縮至蛋白濃度5.0 mg/mL，再用0.05M的硼酸緩衝液(Ph 8.00)滲濾，最後將濃縮後的重組人幹擾素a 2b蛋白等體積置換於0.05M的硼酸緩衝液中滲濾，得到所述重組人幹擾素a 2b濃縮液。
[0027]偶聯反應液的製備:
按1:3的質量比將重組人幹擾素a 2b濃縮液加入溶解於乙腈溶液中的PEG中，在2V -8°C條件下充分反應6小時，以10倍體積的pH為4.5的10 mM的醋酸鈉緩衝液終止上述反應，得到偶聯反應液。
[0028]聚乙二醇幹擾素a2b的製備
將所述偶聯反應液通過(EMD COO - 650 (M))離子交換層析柱，以pH為4.5的10 mM的醋酸鈉緩衝液流洗平衡至基線平穩，再以含0.05-0.1M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液在pH值為4.5的條件下洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，純度^ 95%的單體聚乙二醇幹擾素a2b混合後以通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量30KD)，將蛋白置換於0.1M磷酸鈉緩衝液中。最終得到聚乙二醇幹擾素a2b。
[0029]實施例4
實施例4為現有技術中聚乙二醇幹擾素a 2b的製備流程。
[0030]取重組人幹擾素a 2b原液5000ml，蛋白濃度0.95mg/ml，加入10倍體積的ρΗ9.0的50mM硼酸鹽緩衝液。通過切向流超濾(過濾膜包截留分子量10KD)濃縮至蛋白濃度10.0mg/mL,
按重組人幹擾素a 2b與活化聚乙二醇摩爾比為1:3的比例稱取適量的活化聚乙二醇，溶解於2mM的HCl中，加入重組人幹擾素a 2b濃縮液，反應2小時，用冰醋酸調節pH至PH4.5終止該反應。用滅菌注射用水稀釋10倍。[0031]將上述反應液通過離子交換層析柱(CM SePharose FF)以20 mM醋酸鈉緩衝液(pH4.4)流洗平衡至基線平穩；分別以含0.2-0.SM氯化鈉的20 mM,醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)洗脫，根據紫外檢測儀收集0.75MNaCl洗脫峰，以SuperdexS_300對聚乙二醇幹擾素a 2b進一步純化，洗脫液為0.2 M醋酸鈉緩衝液(pH 6.0)，收集聚乙二醇幹擾素a 2b洗脫峰，SDS-PAGE電泳法檢測純度，得到聚乙二醇幹擾素a2b。
[0032]將實施例1、實施例2、實施例3獲得之聚乙二醇幹擾素蛋白及實施例4獲得之現有技術中聚乙二醇幹擾素a 2b蛋白進行檢測，對終產品分別進行蛋白含量、電泳純度、生物活性、同分異構體、游離PEG含量的檢測，其具體的如圖2、圖3所示的。同時再取偶聯後樣品進行偶聯率的測定，根據中國藥典三部，蛋白含量以微量法(Lowry法)進行，生物活性以細胞病變抑制法(Wish-VSV系統)進行，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，濃縮膠5%、分離膠10%，並以SDS-PAGE電泳碘染法檢測游離PEG含量，HPLC法檢測同分異構體。將檢測結果列於圖5、圖6以及圖7，圖5為聚乙二醇幹擾素a2b原液檢測結果，圖6為聚乙二醇幹擾素a2b的偶聯率檢測結果，圖7為聚乙二醇幹擾素a2b的收穫率檢測結果。
[0033]從圖5中可見實施例1、實施例2、實施例3的聚乙二醇幹擾素a2b電泳純度均值可達97.2 %，幹擾素生物活性7.82 X 105IU/ml，明顯優於對照組實施例4的結果。從圖6中可看出，偶聯後的電泳檢測結果從原有技術的30%提高至50%左右，可見發明的修飾效果比現有技術有較大提高，從圖7中可看出實施例1、實施例2、實施例3的蛋白收穫率平均可達到29.96%，與傳統方法的23.12%相比提高了近30%，有較顯著的提高。
[0034]應當理解的是，本發明的應用不限於上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬於本發明所附權利要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種用於聚乙二醇幹擾素的偶聯方法，其包括以下步驟: A、將重組人幹擾素濃縮液與活化聚乙二醇溶液混合充分進行偶聯反應後，再以pH4.5的10 mM醋酸鈉緩衝液終止上述反應,得到偶聯反應液； B、將所述偶聯反應液通過離子交換層析分離得到純度>95%之單修飾的聚乙二醇幹擾素，將所述單修飾的聚乙二醇幹擾素通過切向流超濾進行置換緩衝系統的處理，將其置換於磷酸鈉緩衝液中，最終得到聚乙二醇幹擾素蛋白。
2.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特徵在於，在所述步驟A之前還包括:將重組幹擾素原液通過切向流超濾系統濃縮至蛋白濃度為2.0 -10.0 mg/ml，再用50mM的硼酸鹽緩衝液滲濾，得到所述重組人幹擾素濃縮液。
3.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特徵在於，所述步驟A具體的包括: 將所述活化聚乙二醇溶解於冷卻至2°C -8°C的乙腈溶液中，使其終濃度為40-80 mg/ml，使所述活化聚乙二醇的量為所述重組人幹擾素濃縮液蛋白總量的2-8倍；所述偶聯反應在鹼性條件下進行。
4.根據權利要求1所述的偶聯方法，其特徵在於，所述步驟B具體的包括:以2-6倍的醋酸鈉緩衝液平衡上樣後的離子交換層析柱，再以含20 mM -SOmM氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫，根據紫外檢測儀分段收集洗脫峰，以SDS-PAGE電泳法檢測純度，得到純度> 95%之單修飾的聚乙二醇幹擾。
【文檔編號】C07K1/107GK103467591SQ201310394181
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】劉芃實, 賀永山, 卡特琳娜·阿爾瓦斯, 劉長春 申請人:長春海伯爾生物技術有限責任公司