非靶向活化內源基因的組合物和方法

2023-10-09 11:19:04 4

專利名稱：非靶向活化內源基因的組合物和方法
與相關申請的交叉參考本申請是John.Harrington，Bruce Sherf和Stephen Rundlett於1999年3月8日提交的，題為「非靶向活化內源基因的組合物和方法」的美國申請號(＿＿)的部分繼續申請，而後者是1998年9月24日提交的美國申請號09/159,643的部分繼續申請，09/159,643是1997年9月26日提交的美國申請號08/941,223的部分繼續申請，所有這些內容都全文列入本文作為參考。
背景技術：
發明領域本發明的領域是分子生物學和細胞生物學。本發明一般性地涉及通過原位重組法來活化基因表達或導致基因過表達。更具體地，本發明涉及通過將本發明提供的特化活化載體非-靶向地整合至宿主細胞基因組來活化內源基因。本發明還涉及鑑定，活化和分離迄今為止未能被發現的基因的方法，以及含有這種分離基因的宿主細胞和載體。本發明還涉及分離的基因，基因產物，核酸分子，和含有所述基因，基因產物和核酸分子的組合物，它們可用於多種治療和診斷應用。因此，通過本發明，無需知道基因的序列，結構，功能或表達情況，就可以鑑定，活化和分離內源基因，包括那些與人類疾病和發育相關的基因。
相關現有技術鑑定和過表達與人類疾病相關的新基因是開發新的治療藥物的一個重要步驟。目前建立用於過表達蛋白質的細胞文庫的方法是建立在製備和克隆cDNA的基礎上。因此，為了用這種方法鑑定新基因，必須在用於構建文庫的細胞中表達該基因。該基因還必須以足以在文庫中以足夠量出現的水平表達。這其中是有疑問的，因為許多基因僅在少數細胞群中、或者在短暫的發育期間以極低的量表達。
另外，由於某些mRNA的體積太大，很難或不可能製備能表達生物活性蛋白質的全長cDNA分子。在小mRNA中也發現有缺少全長cDNA分子的情況，這被認為是與遺傳信息中那些難於通過逆轉錄來製備的序列或者在細菌中增殖期間不穩定的序列有關。因此，即使最完整的cDNA文庫也只能表達全部可能基因組中的一部分。
最後，許多cDNA文庫是在細菌載體中製備的，用這些載體來表達生物活性哺乳動物蛋白質有很大的局限性，因為多數哺乳動物蛋白質在細菌中不能正確地摺疊和/或不恰當地糖基化。
因此，建立一個更有代表性的蛋白質表達文庫的方法將非常有價值，該文庫能便於真實地表達生物活性蛋白質。
目前用於過表達蛋白質的方法包括克隆目的基因，將其轉入一個構建體，鄰接合適的啟動子/增強子、多腺苷酸化信號以及剪接位點，並將該構建體導入適當的宿主細胞。
一種替代方法包括利用同源重組通過將一個強啟動子或其他調控序列靶定到預先確定的基因上來活化該基因的表達。
WO90/14092描述了在哺乳動物細胞中，原位修復編碼目的蛋白質的基因。該申請描述了用來對編碼目的蛋白質的基因進行定點修飾的單鏈寡核苷酸。也可包括一個標記物。但是，這些方法局限於提供與靶位點有相當同源性的寡核苷酸序列。因此，所述方法需要已知通過定點修飾和同源重組進行活化所需要的位點。用這類方法不能發現新基因。
WO91/06667描述了原位表達哺乳動物基因的方法。利用所述方法，通過同源重組將擴增基因導入目的基因鄰位。然後在合適的培養基中培養細胞，擴增基因和目的基因均被擴增，目的基因表達增強。如上，導入擴增基因的方法限於同源重組，不能用來活化未知其序列或(存在)的新基因。
WO91/01140描述了通過同源重組修飾細胞，從而使內源基因失活。通過這些方法，同源重組被用來修飾和失活基因，並能製備可作為基因療法中的供體的細胞。
WO92/20808描述了原位修飾基因組靶位點的方法。文中描述的是一些小修飾，例如在DNA中改變單個鹼基。該方法依賴於利用用於導向的同源DNA進行基因組修飾。
WO92/19255描述了一種通過同源重組來增強目的基因表達的方法，其中將一個DNA序列整合到基因組或大的基因組片段中。然後可以將被修飾的序列轉入次級宿主中進行表達。可以在目標基因旁邊整合一個擴增基因從而使目標區域可被擴增用於增強表達。同源重組是該定向方法所必須的。
WO93/09222描述了通過活化編碼所需產物的內源基因來製備蛋白質的方法。通過同源重組並將通常與希望其表達的基因相聯的區域替換或失活來靶定調控區域。這一失活或替換導致基因以高於正常的水平表達。
WO94/12650描述了一種活化內源基因在細胞中原位表達和擴增的方法，其中所述基因在細胞中不表達或不以所需水平表達。用這樣的一個外源DNA序列轉染細胞，該序列修復、改變、缺失或替換細胞中存在的一段序列或者它是通常不與細胞中的內源基因功能性地連接的調控序列。為了達到這一目的，用與基因組DNA序列在預選位點上同源的DNA序列來靶定內源基因。另外，可以包括編碼選擇標記的擴增DNA。通過在選擇用於擴增的條件下培養同源重組細胞，內源基因和可擴增標記共擴增，並使基因表達提高。
WO95/31560描述了用於同源重組的DNA構建體。該構建體包括一個靶定序列，一個調控序列、一個外顯子和一個未配對的剪接供體位點。通過構建體與細胞內的基因組序列之間的同源重組實現靶定，使得能在體外或體內製備蛋白質。
WO96/29411描述了利用外源調控序列，通過同源重組將外源外顯子(編碼或非編碼)及剪接供體位點導入基因組中一個預先選定的位點。在此申請中，定位了所導入的DNA，從而使外源調控區域控制下的轉錄子包括存在於血小板生成素、Dnase I或β-幹擾素基因中的外源外顯子和內源外顯子，從而得到其中外源和外源外顯子可操作地相連的轉錄子。這些新的轉錄單位是通過同源重組得到的。
美國專利5272071描述了通過插入一個能增強細胞內常規表達基因的表達水平的DNA調控元件使得該細胞內的轉錄沉默基因發生轉錄活化。插入調控元件使得它與正常情況下沉默的基因可操作地相連。藉助同源重組以下述方式來實現插入用通常情況下沉默的基因的一個片段(靶向DNA)和用來誘導所需轉錄的DNA調控元件來建立DNA構建體。
美國專利5578461討論了通過同源重組活化哺乳動物目的基因表達。將一個DNA序列整合到基因組或一個大基因組片段中來增強目的基因的表達。然後可以將該修飾過的構建體轉入次級宿主中。可以在目的基因鄰近處整合一個擴增基因從而使目的區域發生擴增以實現增強表達。
上述兩種方法(通過克隆或通過體內同源重組構建過表達構建體)均要求在其可被過表達之前將基因克隆並測序。另外，利用同源重組，還必須要知道基因組序列和結構。
不幸的是，許多基因還未被鑑定和/或測序。因此，無論目的基因是否以前已被克隆、其序列和結構是否已知，用於過表達該基因的方法將十分有用。
發明簡述因此，本發明一般性地涉及在細胞內過表達內源基因的方法，所述方法包括將含有轉錄調控序列的載體導入細胞，使載體通過非同源重組整合到該細胞的基因組中，使內源基因在細胞內過表達。該方法不需要預先了解內源基因的序列，甚至不需要知道它的存在。因此，本發明涉及非-靶向基因活化，該術語在本文中指的是通過將特化活化載體非-靶向或非-同源(與靶向或同源相反)地整合至宿主細胞基因組來活化內源基因。
本發明還包括用於經非同源重組來活化基因的表達或過表達基因的新載體構建體。該新構建體不含同源導向序列。這就是說，它不含有這樣一些核苷酸序列，該序列靶定宿主細胞DNA並促進在靶位點進行內源重組，從而導致細胞基因藉助所導入的轉錄調控序列而過表達。
新載體構建體包括這樣的載體，它含有與一個未配對的剪接供體序列可操作地相連的轉錄調控序列，並還含有1或多個可擴增標記。
新載體構建體包括下列構建體具有轉錄調控序列的構建體，該序列與翻譯起始密碼子、分泌信號序列以及未配對的剪接供體位點可操作地相連；具有轉錄調控序列的構建體，該序列與翻譯起始密碼子、表位標記以及未配對的剪接供體位點可操作地相連；含有轉錄調控序列的構建體，該序列與翻譯起始密碼子、信號序列和表位標記以及未配對的剪接供體位點可操作地相連；含有轉錄調控序列的構建體，該序列與翻譯起始密碼子、分泌信號序列、表位標記以及序列特異的蛋白酶位點和未配對的剪接供體位點可操作地相連。
載體構建體可以含有1或多個用於挑選重組宿主細胞的選擇標記。或者，可通過對活化的內源基因產物所致性狀的表型選擇來實現挑選。
這些載體，和實際上本文公開的任何載體，以及本領域技術人員很容易想到的這些載體的變異體可被用於在本文公開的任何方法中配製可由這些方法製備的任何組合物。
用於本發明載體構建體中的轉錄調控序列包括，但不限於啟動子。在優選實施方案中，所述啟動子是一個病毒啟動子。在更優選的實施方案中，病毒啟動子是巨細胞病毒立即早期啟動子。在另一個具體實施方案中，啟動子是細胞非病毒啟動子或誘導型啟動子。
用於本發明載體構建體中的轉錄調控序列也可以包括，但不限於增強子。在優選實施方案中，所述增強子是病毒增強子。在更優選的實施方案中，該病毒增強子是巨細胞病毒立即早期增強子。在另一個具體實施方案中，增強子是細胞非病毒增強子。
在本文中公開的方法的優選實施方案中，載體構建體是，或者可以含有線性RNA或DNA。
可以篩選含有載體的細胞以用於表達基因。
可以於體外在利於由細胞產生預期量內源基因的基因產物(文中又可互換地稱為「表達產物」)的條件下，培養過表達所述基因的細胞，其中該內源基因已被活化或其表達已提高。然後可分離並純化表達產物，用來進行如蛋白質治療或發現藥物。
另一方面，使表達所需基因產物的細胞在體內表達基因產物。在本發明這些具體方面，在利於基因被真核生物體內細胞進行過表達或活化的條件下，可以將含有本發明所述載體構建體(已整合到其基因組中)的細胞導入真核生物(比如脊椎動物，尤其是哺乳動物，更特別是人)。在本發明這些相關方面，可以在將細胞導入真核生物之前將其分離和克隆。
本發明還涉及在細胞內過表達內源基因的方法，包括將含有轉錄調控序列和1或多個可擴增標記的載體導入細胞，使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中，使內源基因在細胞內過表達。
可以篩選含有載體的細胞中所述基因的過表達。
培養過表達基因的細胞，從而獲得內源基因的擴增。然後可以體外培養細胞來製備已發生擴增的內源基因的預期量基因產物，其中所述內源基因已被活化或者其表達已提高。然後可以分離並純化基因產物。
或者，擴增之後，可令細胞在體內表達內源基因並產生預期量基因產物。
但是應當明白，任何用於文中所述方法的載體可以包括1或多個可擴增標記。因此，在細胞內，載體和目的DNA(即含有被過表達的基因的DNA)都被擴增，並獲得內源基因進一步增強的表達。與此相應，所述方法可以包括一個擴增內源基因的步驟。
本發明還涉及在細胞內過表達內源基因的方法，包括將含有轉錄調控序列和未配對剪接供體序列的載體導入細胞，使載體經非同源重組整合到細胞基因組中，在細胞中過表達所述內源基因。
可以篩選含有載體的細胞以表達基因。
可以在體外培養過表達基因的細胞以便製備預期量的其表達已被活化或提高的基因的基因產物。然後可以分離並純化所述基因產物。
或者，可令細胞在體內表達所需基因產物。
載體構建體實質上可由轉錄調控序列組成。
載體構建體實質上可由轉錄調控序列和1或多個可擴增標記組成。
載體構建體實質上可由轉錄調控序列和剪接供體序列組成。
本發明的任何載體構建體還可以包含分泌信號序列。分泌信號序列被安排在構建體中，這樣它將與被活化的內源蛋白可操作地相連。因此，目的蛋白質會在細胞內發生分泌，方便了該蛋白質的純化。與此相應，所述方法可以包括一個使蛋白質表達產物從細胞中分泌出來的步驟。
本發明還包括通過任何上述方法製得的細胞。本發明包括含有所述載體構建體的細胞、其中的載體構建體已整合到細胞基因組中的細胞、以及由內源基因在所導入的轉錄調控序列的引導下過表達所需基因產物的細胞。
可分離並克隆細胞。
可以在任何真核生物來源(比如真菌、植物或動物)的細胞內實施所述方法。在優選實施方案中，可以在脊椎動物細胞內尤其是哺乳動物細胞(包括但不限於大鼠、小鼠、牛、豬、綿羊、山羊和人細胞，更特別是在人細胞中)中實施本發明的方法。
通過上述方法製得的單個細胞可以過表達單個基因或多個基因。可以通過將單一類型的構建體整合到基因組中的多個位置來活化細胞內的多個基因。類似地，可以通過將多重構建體(即多個類型的構建體)整合到基因組中的多個位置來活化細胞內的多個基因。因此，一個細胞可以只含一類載體構建體或不同類型的載體構建體，每個均能活化一個內源基因。
本發明還涉及通過下列一或多項，製備上述細胞的方法將本發明的一或多個載體構建體導入細胞；使導入的構建體通過非同源重組整合到細胞基因組中；在細胞內過表達一或多個內源基因；分離和克隆細胞。本發明還涉及由這些方法製得的細胞，其中該細胞可能是分離的細胞。
本發明還包括利用上述細胞來過表達基因(比如內源的細胞基因)的方法，所述基因已被鑑定(例如，已測序)、未鑑定(例如，一個功能已知但未被克隆或測序的基因)，或是在過表達之前，不知道其存在的基因。可以用細胞在體外或體內製備預期量的表達產物。如果必要，可以隨後通過例如裂解細胞或從生長培養基中分離(當載體含有分泌信號序列時)來分離並純化該表達產物。
本發明還包括由上述方法製得的細胞文庫。每個文庫可以包括得自一次轉染實驗的所有克隆或得自一次轉染實驗的一個亞組的克隆。所述亞組可以過表達相同的基因或多個基因，例如，一類基因。轉染可以用單個構建體或多個構建體進行。
可以通過將得自兩次或多次轉染實驗的所有重組細胞合併、將得自一次轉染實驗的1或多個細胞亞組合併、或者將得自不同轉染實驗的細胞亞組合併從而形成所述文庫。所得文庫可以表達相同的基因或多個基因，例如一類基因。同樣，在每次轉染中，可以使用單個構建體或多個構建體。
文庫可由相同或不同的細胞類型構成。
本發明還涉及通過從相同或不同轉染實驗中挑選各種細胞亞組來製備文庫的方法。
本發明還涉及利用上述細胞或細胞文庫來過表達或活化內源基因的方法，或者獲得這些過表達或活化基因的基因表達產物的方法。根據本發明的這一方面，可以篩選細胞或細胞文庫來表達某因，並可挑選出能表達所需基因產物的細胞。然後用這些細胞來分離或純化用於後續用途的基因產物。可以通過下述方式在細胞內進行表達在有利於由細胞產生內源基因的表達產物的條件下體外培養所述細胞，或者使細胞在體內表達基因。
在本發明的優選實施方案中，所述方法包括一個分離或純化表達產物的過程。在非常優選的實施方案中，培養能表達內源基因產物的細胞，培養條件為有利於產生足夠量的基因產物以便用於商業應用，尤其是診斷、治療和藥物開發等用途。
任何上述方法都可進一步包括在載體整合之前或同時，向細胞的基因組DNA導入雙鏈斷裂。
本發明還涉及可用於活化內源基因的表達和分離對應於活化基因的mRNA和cDNA的載體構建體。
在一個這樣的實施方案中，載體構建體可含有(a)與第一個未配對的剪接供體序列可操作相連的第一個轉錄調節序列；(b)與第二個未配對的剪接供體序列可操作相連的第二個轉錄調節序列；和(c)線性化位點，該位點可位於所述第一個和第二個轉錄調節序列之間。根據本發明，當將載體構建體轉化至宿主細胞，然後整合至宿主細胞基因組時，第一個轉錄調節序列優選與第二個轉錄調節序列的方向相反。在某些優選的此類實施方案中，可通過在線性化位點裂解使載體變成線性。
在另一個實施方案中，本發明提供了具有3』末端和5』末端的線性載體構建體，其含有與未配對的剪接供體位點可操作相連的轉錄調節序列，其中轉錄調節序列在線性載體構建體中所取的方向能介導朝向線性載體構建體3』末端或5』末端的轉錄。
在另一個實施方案中，本發明提供了載體構建體，其依次含有(a)轉錄調節序列；(b)未配對的剪接供體位點；(c)罕見的切割限制性位點；和(d)線性化位點。
在另一個實施方案中，本發明提供了載體構建體，其含有(a)與缺乏聚腺苷酸化信號的選擇標記可操作相連的第一個轉錄調節序列；和(b)與外顯子-剪接供體位點複合物可操作相連的第二個轉錄調節序列，其中第一個轉錄調節序列在載體構建體中的方向與第二個轉錄調節序列的相同，且其中在載體構建體中，第一個轉錄調節序列位於第二個轉錄調節序列的上遊。
在另一些實施方案中，本發明提供了載體構建體，它們含有與缺乏聚腺苷酸化信號的選擇標記可操作相連的轉錄調節序列，並進一步含有未配對的剪接供體位點。
在另一個實施方案中，本發明提供了載體構建體，它們含有與缺乏聚腺苷酸化信號的選擇標記可操作相連的第一個轉錄調節序列，並進一步含有與未配對的剪接供體位點可操作相連的第二個轉錄調節序列。
根據本發明，轉錄調節序列(或具有一個以上轉錄調節序列的載體構建體中的第一或第二個轉錄調節序列)可以是啟動子，增強子或阻抑物，優選其為啟動子，包括動物細胞啟動子，植物細胞啟動子，或真菌細胞啟動子，最優選其為選自下列的啟動子CMV即早期基因啟動子，SV40T抗原啟動子和β-肌動蛋白啟動子。可用於本發明的，源自動物，植物或真菌細胞的其它啟動子是本領域已知的，也是本領域技術人員參照本文的教導能熟知的。本發明的載體構建體中所用的選擇標記可以是任何標記或標記基因，通過將含有選擇標記的載體整合至宿主細胞基因組，可以選擇出含有或表達標記基因的細胞。適當的這種選擇標記包括但不限於新黴素基因、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、嘌呤黴素基因、二氫乳清酸酶基因、穀氨醯胺合成酶基因、組氨酸D基因、氨甲醯磷酸合成酶基因、二氫葉酸還原酶基因、多抗藥性1基因、天冬氨酸轉氨甲醯酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、腺苷脫氨酶基因和胸苷激酶基因。
在相關的實施方案中，本發明提供了載體構建體，其含有正選擇標記，負選擇標記和未配對的剪接供體位點，其中當將載體構建體整合至真核宿主細胞的基因組並活化基因組中的內源基因時，正和負選擇標記和剪接供體位點在載體構建體中所取的方向導致表達活性形式的正選擇標記，和要麼不表達所述負選擇標記，要麼表達非活性形式的負選擇標記。在某些優選的此類實施方案中，正選擇標記或負選擇標記，或這兩者可缺乏聚腺苷酸化信號。本發明的這些方面所用的正選擇標記可以是通過表達可產生便於分離表達標記之細胞的蛋白質的任何選擇標記，它包括但不限於新黴素基因、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、嘌呤黴素基因、二氫乳清酸酶基因、穀氨醯胺合成酶基因、組氨酸D基因、氨甲醯磷酸合成酶基因、二氫葉酸還原酶基因、多抗藥性1基因、天冬氨酸轉氨甲醯酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因或腺苷脫氨酶基因。類似地，本發明的這些方面所用的負選擇標記可以是通過表達可產生便於除去表達標記之細胞的蛋白質的任何選擇標記，它包括但不限於次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、胸苷激酶基因或白喉毒素基因。
本發明還涉及真核宿主細胞，它可以是分離的宿主細胞，其中含有一個或多個本發明的載體構建體。優選的真核宿主細胞包括但不限於動物細胞(包括但不限於哺乳動物(特別是人)細胞，昆蟲細胞，禽細胞，環節動物細胞，兩棲動物細胞，爬行動物細胞和魚細胞)，植物細胞和真菌(尤其是酵母)細胞。在某些這種宿主細胞中，載體構建體可以整合至宿主細胞的基因組。
本發明還涉及引物分子，其含有可通過PCR擴增的序列和簡併的3』末端。根據本發明此方面的引物分子優選具有以下通式結構5』-(dT)a-X-Nb-TTTATT-3』其中a是從1至100(優選從10至30)的整數，X是可通過PCR擴增的序列，它由長度約為10至20個核苷酸的核酸序列組成，N是任何核苷酸，b是從0至6的整數。一個優選引物具有以下核苷酸序列5』-TTTTTTTT-TTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT-3』(SEQ ID NO10)。在相關的實施方案中，根據本發明此方面的引物分子可以被生物素化。
本發明還涉及合成第一條cDNA鏈的方法，所述方法包括(a)使本發明的第一種引物(如上述引物)與RNA模板分子退火，形成第一引物-RNA複合物，和(b)在有利於逆轉錄第一引物-RNA複合物的條件下，用逆轉錄酶和一種或多種脫氧核苷三磷酸分子處理所述第一引物-RNA複合物以合成第一條cDNA鏈。
本發明還涉及分離已活化的基因的方法，特別是從宿主細胞基因組中分離已活化的基因的方法。本發明的這些方法利用了使用本發明的非-靶向基因活化載體產生的mRNA分子結構。本發明的此類方法之一包括例如(a)在宿主細胞(優選為上述真核宿主細胞之一)中導入載體構建體，所述構建體含有轉錄調節序列和未配對的剪接供體位點，(b)在能使載體活化基因組中含有外顯子的內源性基因的條件下，通過非同源重組將載體構建體整合至宿主細胞基因組中，(c)從宿主細胞中分離RNA，(d)根據上述本發明的方法合成第一條cDNA鏈，(e)使特異於載體-編碼的外顯子的第二種引物與第一條cDNA鏈退火，產生第二引物-第一條cDNA鏈複合物，和(f)在有利於產生與第一條cDNA鏈基本上互補的第二條cDNA鏈的條件下，使第二引物-第一條cDNA鏈複合物與DNA聚合酶接觸。根據本發明此方面的方法可包括一個或多個其它的步驟，例如可以用限制性酶處理第二條cDNA鏈，所述酶在位於載體中未配對剪接供體位點下遊的限制性位點處進行裂解，或者也可以使用特異於載體-編碼的外顯子的第三種引物和特異於第二種引物的第四種引物來擴增第二條cDNA鏈。本發明還涉及根據這些方法產生的分離基因，以及含有這些分離基因的載體(可以是表達載體)和宿主細胞。本發明還涉及生產多肽的方法，所述方法包括在有利於宿主細胞表達分離基因所編碼多肽的條件下，培養含有分離基因(或含有分離基因的載體，特別是表達載體)的宿主細胞。本發明還提供了其它生產多肽的方法，所述方法包括將載體導入宿主細胞，所述載體含有與外顯子區域可操作相連的轉錄調節序列，後面接著未配對的剪接供體位點，在有利於所述宿主細胞表達外顯子區域所編碼多肽的條件下培養宿主細胞，其中外顯子含有翻譯起始位點，該位點可位於與未配對的剪接供體位點最靠5』端的鹼基相關的任何開放閱讀框位置(例如，相對於剪接供體位點最靠5』端的鹼基而言，ATG起始密碼子中的「A」可位於-3位，或往上遊增加3個鹼基的位置(例如-6，-9，-12，-15，-18等)，可位於-2位，或往上遊增加3個鹼基的位置(例如-5，-8，-11，-14，-17，-20等)，可位於-1位，或往上遊增加3個鹼基的位置(例如-4，-7，-10，-13，-16，-19等))。在相關的實施方案中，本發明的方法進一步包括分離所述多肽。本發明還涉及根據這些方法產生的多肽，所述多肽可以是，也可以不是分離的多肽。
根據以下附圖和說明書及權利要求，本發明的其它優選實施方案對本領域普通技術人員是顯而易見的。
附圖簡述

圖1.本文所述基因活化過程的示意圖。將活化構建體轉染到細胞內，並使其在DNA斷裂處整合到宿主細胞染色體中。如果斷裂發生在目的基因(例如Epo)的上遊，並且合適的活化構建體在斷裂處整合，則使調控序列與目的基因可操作地相連，基因就被活化。轉錄和剪接產生嵌合RNA分子，該分子含有來自活化構建體和內源基因的外顯子序列。隨後的翻譯將產生目的蛋白。分離重組細胞後，可以進一步藉助基因擴增來增強基因表達。
圖2.未翻譯的活化構建體的示意圖。箭頭表示啟動子序列。外顯子序列表示為空心盒，S/D表示剪接供體序列。與下面說明對應的構建體編號示於左邊。選擇和可擴增標記未示出。
圖3.翻譯的活化構建體的示意圖，箭頭表示啟動子序列。外顯子序列表示為空心盒，S/D表示剪接供體序列。翻譯的信號肽、表位標記以及蛋白酶切割序列示於構建體下的圖標中。與下面說明對應的構建體編號示於左邊。選擇和可擴增標記未示出。
圖4.能活化內源基因的活化構建體的示意圖。
圖5A-5D.pRIG8R1-CD2的核苷酸序列(SEQ IDNO7)。
圖6A-6C.pRIG8R2-CD2的核苷酸序列(SEQ IDNO8)。
圖7A-7C.pRIG8R3-CD2的核苷酸序列(SEQ IDNO9)。
圖8A-8F.Poly(A)陷阱(trap)載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。非翻譯區以帶影線的盒表示，開放閱讀框以空心盒表示。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，信號分泌序列(SP)，表位標記(ET)，新黴素抗性基因(Neo)。在圖8B-8E所示的載體中，可以省略緊接Neo基因下遊的剪接供體位點。在缺少位於Neo基因和下遊啟動子之間的剪接供體位點的載體中，Neo轉錄物將利用位於下遊啟動子3』方向的剪接供體位點。另外，如圖8B-8E的載體中所示，下遊啟動子可驅動外顯子的表達。據認為，當存在該外顯子時，它可在任何閱讀框中編碼密碼子。通過使用多個載體，可產生3個可能的閱讀框的每一個中的密碼子。
圖9A-9F.剪接受體陷阱載體的例子，該載體含有由單啟動子驅動的正和負選擇標記。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。非翻譯區以帶影線的盒表示。這些例子中不存在Poly(A)信號。然而，如說明書中所述，Poly(A)信號可位於載體中任一或兩個選擇標記的3』方向。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，信號分泌序列(SP)，表位標記(ET)，內部核糖體進入位點(ires)，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，和新黴素抗性基因(Neo)。在這些例子中，Neo表示正選擇標記，HPRT表示負選擇標記。在圖9C和9F所示的載體中，被表示為外顯子的區域含有翻譯起始密碼子。如詳述章節所述，外顯子可編碼甲硫氨酸殘基，部分信號序列，完整的信號分泌序列，蛋白質的一部分，或表位標記。另外，密碼子可存在於與剪接供體位點相關的任何閱讀框中。在未顯示的其它載體例子中，表示為外顯子的區域缺少翻譯起始密碼子。
圖10A-10F.剪接受體陷阱載體的例子，該載體含有由不同啟動子驅動的正和負選擇標記。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。非翻譯區以帶影線的盒表示。這些例子中不存在Poly(A)信號。然而，如說明書中所述，Poly(A)信號可位於載體中任一或兩個選擇標記的3』方向。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，內部核糖體進入位點(ires)，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，和新黴素抗性基因(Neo)。在圖10A-10F所示的載體中，Neo表示正選擇標記，HPRT表示負選擇標記。如圖所示，圖10A-10F所示的載體不含位於Neo基因3』方向的剪接供體位點；然而，在未顯示的其它載體中，剪接供體位點可位於Neo基因的3』方向，以便將正選擇標記剪接至內源外顯子的旁邊。在圖10C和10F所示的載體中，被稱為外顯子的區域含有翻譯起始密碼子。如詳述章節所述，外顯子可編碼甲硫氨酸殘基，部分信號序列，完整的信號分泌序列，蛋白質的一部分，或表位標記。另外，密碼子可存在於與剪接供體位點相關的任何閱讀框中。在未顯示的其它載體例子中，被稱為外顯子的區域缺少翻譯起始密碼子。
圖11A-11C.雙向活化載體的示意圖。箭頭表示啟動子序列。外顯子以方格盒表示，剪接供體位點以S/D表示。帶影線的盒表示與上遊啟動子可操作相連的外顯子序列。應懂得這些載體上的外顯子可以是非翻譯的，或者可按本文所述含有起始密碼子和其它的密碼子。圖11B-11C所示載體表明載體可含有選擇標記。在這些載體中，示出了新黴素抗性(Neo)基因。在圖11B中，聚腺苷酸化信號(pA)位於選擇標記下遊。在圖11C中，載體上不存在聚腺苷酸化信號。
圖12A-12G.用於從活化的內源基因中回收外顯子I的載體例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。非翻譯區以帶影線的盒表示。所示載體中不存在Poly(A)信號。然而，如說明書中所述，Poly(A)信號可位於載體中任一或兩個選擇標記的3』方向。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，內部核糖體進入位點(ires)，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，和新黴素抗性基因(Neo)。在這些例子中，Neo表示正選擇標記，HPRT表示負選擇標記。據認為在這些例子中，被稱為外顯子的區域(當其存在時)缺少翻譯起始密碼子。在未顯示的其它例子中，被稱為外顯子的區域含有翻譯起始密碼子。另外，當載體外顯子含有翻譯起始密碼子時，外顯子可編碼甲硫氨酸殘基，部分信號序列，完整的信號分泌序列，蛋白質的一部分，或表位標記。另外，密碼子可存在於與剪接供體位點相關的每個閱讀框中。
圖13.圖示了由圖12A-12G所述的整合載體產生的兩個轉錄物。DNA鏈由水平線表示。載體DNA由黑線表示。內源基因組DNA由灰線表示。矩形表示外顯子。由載體編碼的外顯子以空心矩形表示，而內源外顯子以帶影線的盒表示。S/D表示剪接供體位點。整合之後，載體編碼的啟動子激活內源基因的轉錄。由上遊啟動子導致的轉錄產生了剪接的RNA分子，該分子含有載體編碼的外顯子，所述外顯子與來自內源基因的第二個及後續外顯子相連接。另一方面，下遊啟動子導致的轉錄產生了轉錄物，該轉錄物含有整合載體下遊的序列，所述序列與來自內源基因的外顯子I及後續外顯子相連接。
圖14A-14B.pRIG1的核苷酸序列(SEQ ID NO18)。
圖15A-15B.pRIG21b的核苷酸序列(SEQ ID NO19)。
圖16A-16B.pRIG22b的核苷酸序列(SEQ ID NO20)。
圖17A-17G.Poly(A)陷阱載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，信號分泌序列(SP)，表位標記(ET)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1(VP#1)，和載體啟動子#2(VP#2)。在圖17C-17G所示的載體中，與外顯子可操作相連的啟動子和未配對的剪接供體位點可位於選擇標記的上遊。據認為，該外顯子(當其存在時)可在相對於剪接供體位點的任何閱讀框內編碼起始密碼子。為了活化具有不同閱讀框的基因的蛋白質表達，可使用3個獨立的載體，每個載體在相對於剪接供體位點的不同閱讀框內具有一個起始密碼子。
圖18.圖示了由圖17C的載體整合至宿主細胞基因組的多-外顯子內源基因上遊而產生的轉錄物。每條水平線表示DNA分子，沿DNA鏈的垂直線標出上遊和下遊的載體/細胞基因組的邊界。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用羅馬數字給內源外顯子編號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1(VP#1)，和載體啟動子#2(VP#2)，內源啟動子(EP)和聚腺苷酸化信號(pA)。整合之後，載體啟動子#1表達嵌合轉錄物，該轉錄物含有與整合位點下遊的基因組序列，包括內源基因經加工(剪接)的外顯子相連接的Neo基因。由於轉錄物#1含有內源基因的Poly(A)信號，因此可以有效產生Neo基因產物，從而賦予細胞以藥物抗性。除了轉錄物#1以外，整合的載體還會產生第二個轉錄物，該轉錄物源自載體啟動子#2，被稱為轉錄物#2。轉錄物#2的結構便於有效翻譯內源基因所編碼的蛋白質。如圖17所示，可使用在載體編碼的外顯子中含有另一種編碼信息的載體來產生不同的嵌合蛋白質，所述蛋白質含有例如信號序列和/或表位標記。
圖1 9.二元正選擇標記載體的例子。水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。這些例子中不存在Poly(A)信號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，潮黴素抗性基因(Hyg)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1，和載體啟動子#2。
圖20A-20B.由整合至宿主細胞基因組，並與內源基因鄰接的二元正選擇標記載體產生的轉錄物的例子。圖20A示出載體在多-外顯子基因附近整合所產生的轉錄物。圖20B示出載體在單外顯子基因附近整合所產生的轉錄物。每條水平線表示DNA分子，沿DNA鏈的垂直線標出上遊和下遊的載體/細胞基因組的邊界。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於每個啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用羅馬數字給內源外顯子編號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，潮黴素抗性基因(Hyg)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1(VP#1)，載體啟動子#2(VP#2)，內源啟動子(EP)和聚腺苷酸化信號(pA)。整合之後，載體啟動子#1表達嵌合轉錄物，該轉錄物含有與整合位點下遊的基因組序列，包括內源基因經加工(剪接)的外顯子相連接的Hyg基因。由於轉錄物#1含有內源基因的Poly(A)信號，因此可以有效產生Hyg基因產物，從而賦予細胞以藥物抗性。除了轉錄物#1以外，整合的載體還會產生第二個轉錄物，該轉錄物源自載體啟動子#2，被稱為轉錄物#2。在圖20A中，通過從載體編碼的剪接供體位點和位於載體整合位點下遊的第一個內源剪接受體(即此例子中的外顯子II)中剪接，可從轉錄物#2中去除neo基因。由於多-外顯子基因在每個外顯子(除外顯子I外)的5』末端都含有剪接受體位點，因此在載體已整合至多-外顯子基因附近，並且已轉錄活化該基因的細胞中，可從轉錄物#2中去除neo基因。結果，通過用G418和潮黴素進行選擇可消除具有活化的多-外顯子基因的細胞。在圖20B中，neo基因未通過剪接從轉錄物#2中去除，因為單外顯子基因不含有任何剪接受體序列。因此，用G418和潮黴素雙選擇時，含有整合至單外顯子基因附近之載體的細胞可以存活。可使用本文所述的方法，用這些細胞有效地分離活化的單外顯子基因。
圖21A-21B.含有正和負選擇標記的二元陷阱載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1(VP#1)，，載體啟動子#2(VP#2)和載體啟動子#3(VP#3)。在圖21A-21B所示的載體中，Neo表示正選擇標記，HPRT表示負選擇標記。在圖21B中，第三個啟動子位於選擇標記上遊。該上遊啟動子與外顯子和未配對的剪接供體位點可操作相連。在此例子中，被稱為外顯子的區域含有翻譯起始密碼子。如本文所述，外顯子可編碼甲硫氨酸殘基，部分信號序列，完整的信號分泌序列，蛋白質的一部分，或表位標記。另外，密碼子可存在於與剪接供體位點相關的任何閱讀框中。在未顯示的其它載體例子中，被稱為外顯子的區域缺少翻譯起始密碼子。
圖22.由整合至宿主細胞基因組中多-外顯子內源基因上遊的二元正/負選擇標記載體產生的轉錄物的例子。每條水平線表示DNA分子，沿DNA鏈的垂直線標出上遊和下遊的載體/細胞基因組的邊界。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於每個啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用羅馬數字給內源外顯子編號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，新黴素抗性基因(Neo)，載體啟動子#1(VP#1)，載體啟動子#2(VP#2)，載體啟動子#3(VP#3)，聚腺苷酸化信號(pA)和內源啟動子(EP)。整合之後，載體啟動子#1表達嵌合轉錄物，該轉錄物含有與整合位點下遊的基因組序列，包括內源基因經加工(剪接)的外顯子相連接的Neo基因。由於轉錄物#1含有內源基因的Poly(A)信號，因此可以有效產生Neo基因產物，從而賦予細胞以藥物抗性。除了轉錄物#1以外，整合的載體還會產生第二個轉錄物，該轉錄物源自載體啟動子#2，被稱為轉錄物#2。在此例子中，載體被整合至多-外顯子基因的上遊。由於多-外顯子基因在每個外顯子的5』末端都含有剪接受體位點，因此在載體已整合至多-外顯子基因附近，並且已轉錄活化該基因的細胞中，可從轉錄物#2中去除HPRT基因。結果，通過用G418和8-氮鳥嘌呤6-硫代鳥嘌呤(AgThg)選擇可分離含有活化的多-外顯子基因的細胞。因此，用G418和AgThg雙選擇時，含有整合至單外顯子基因附近之載體的細胞可以存活。可使用本文所述的方法，用這些細胞有效地分離活化的多-外顯子基因。除了轉錄物#1和#2以外，整合載體還產生了被稱為轉錄物#3的第三個轉錄物。源自載體啟動子#3的轉錄物#3含有適於介導內源基因的蛋白表達的外顯子序列。這可通過將啟動子#3下遊的第一個剪接供體位點剪接至內源基因中第一個下遊剪接受體位點處而實現。除了介導蛋白質表達外，可使用本文所述的方法分離轉錄物#3和/或轉錄物#1和/或#2以發現新基因。
圖23A-23D.多-啟動子/活化外顯子載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示啟動子序列。盒表示外顯子，帶影線的盒表示非翻譯區。應懂得這些載體上的外顯子可以是非翻譯的，或者可按本文所述含有起始密碼子和其它的密碼子。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，載體啟動子#1(VP#1)，載體啟動子#2(VP#2)，載體啟動子#3(VP#3)和載體啟動子#4(VP#4)。各個載體活化外顯子被稱為A，B，C和D。每個活化外顯子可含有不同結構。圖的下方顯示了每個活化外顯子及其側翼內含子的結構。然而，應懂得可在這些載體上以任何組合和/或次序使用本文所述的任何活化外顯子，包括編碼信號序列，部分信號序列，表位標記，蛋白質，蛋白質的一部分和蛋白質基元的外顯子。這些外顯子中任一個都可以缺少起始密碼子。另外，儘管這些例子中未顯示，這些載體也可含有選擇標記和/或可放大的標記。選擇標記可含有Poly(A)信號或剪接供體位點。當其存在時，剪接供體位點可位於選擇標記的上遊或下遊。或者，選擇標記可以不與Poly(A)信號和/或剪接供體位點可操作相連。
圖24.由整合至宿主細胞基因組中內源基因上遊的多-啟動子/活化外顯子載體產生的轉錄物的例子。每條水平線表示DNA分子，沿DNA鏈的垂直線標出上遊和下遊的載體/細胞基因組的邊界。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於每個啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用羅馬數字給內源外顯子編號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，載體啟動子#1(VP#1)，載體啟動子#2(VP#2)，載體啟動子#3(VP#3)，載體啟動子#4(VP#4)，內源啟動子(EP)和聚腺苷酸化信號(pA)。各個載體活化外顯子被稱為A，B，C和D。整合之後，每個由載體編碼的啟動子能產生不同的轉錄物。每個轉錄物含有不同的活化外顯子，所述外顯子與內源基因的第一個下遊剪接受體位點(即此例子中的外顯子II)相連接。各個活化外顯子被稱為(A)，(B)，(C)或(D)。內源外顯子被稱為(I)，(II)，(III)或(IV)。通常，在活化外顯子之間，編碼序列和/或閱讀框(如果存在的話)是不同的。儘管此例子中列出了4個活化外顯子，但整合載體上可存在任何數目的活化外顯子。
圖25A-25D.用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用的活化載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示啟動子序列。盒表示外顯子，帶影線的盒表示非翻譯區。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，新黴素抗性基因(Neo)。據認為，DNA結合結構域和活化結構域可以在任何閱讀框(與剪接供體位點相關)中編碼，它們因此能活化具有不同閱讀框的內源基因。
圖26.使用圖25所示載體檢測蛋白質-蛋白質相互作用的一種方法的示意圖。每條水平線表示DNA分子，沿DNA鏈的垂直線標出上遊和下遊的載體/細胞基因組的邊界。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於每個啟動子下遊的所有序列。盒表示外顯子。帶影線的盒表示非翻譯區。使用羅馬數字給內源外顯子編號。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，結合結構域(BD)，活化結構域(AD)，識別序列(RS)和聚腺苷酸化信號(pA)。圖中顯示出結合結構域載體被整合至宿主細胞基因組中被稱為基因A的內源基因上遊，活化結構域載體被整合至相同宿主細胞基因組中被稱為基因B的內源基因上遊。兩個載體被整合至相同宿主細胞的基因組中。整合之後，每個載體能產生含有結合結構域(或根據具體情況為活化結構域)和由下遊內源基因編碼的蛋白質的融合蛋白。如果結合結構域融合蛋白與活化結構域融合蛋白相互作用，將會形成蛋白質複合物。該複合物能增加細胞中存在的報導基因的表達。
圖27.用於體外和體內轉座的活化載體的例子。圖中示出的是每個載體的線性化形式。每條水平線表示DNA分子。箭頭表示啟動子序列。盒表示外顯子，帶影線的盒表示非翻譯區。實心盒表示轉座子信號。據認為轉座子信號有一定的方向，信號以適於轉座反應類型(整合，倒位或缺失)的構象定向。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，新黴素抗性基因(Neo)，二氫葉酸還原酶(DHFR)，嘌呤黴素抗性基因(Puro)，Poly(A)信號(pA)和EB病毒複製起點(oriP)。據認為，活化外顯子可以在任何閱讀框(與剪接供體位點相關)中編碼胺基酸，從而活化具有不同閱讀框的內源基因。
圖28.活化載體通過體外轉座整合至克隆的基因組DNA片段中的示意圖。每條水平線表示DNA分子。克隆的基因組DNA位於BAC載體中。單線表示基因組DNA，矩形表示BAC載體序列。箭頭示出位於DNA分子上的啟動子序列，並指向轉錄方向。被轉錄的區域包括位於每個啟動子下遊的所有序列。空心盒表示載體活化外顯子。帶影線的盒表示克隆的基因組片段中所編碼基因的外顯子。實心盒表示轉座子信號。據認為轉座子信號有一定的方向，信號以適於轉座反應類型(整合，倒位或缺失)的構象定向。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)和聚腺苷酸化信號(pA)。為了將載體整合至基因組片段中，在轉座酶存在下，將活化載體與克隆的基因組DNA一起保溫。在活化載體整合至基因組片段之後，直接將質粒轉染至適當的真核宿主細胞以表達位於載體整合位點下遊的基因。或者，將BAC質粒轉化至大腸桿菌中以產生大量質粒，用於轉染至適當的真核宿主細胞。
圖29A-29B.pRIG14的核苷酸序列。
圖30A-30C.pRIG19的核苷酸序列。
圖31A-31C.pRIG20的核苷酸序列。
圖32A-32C.pRIGad1的核苷酸序列。
圖33A-33D.pRIGbd1的核苷酸序列。
圖34A-34B.pUniBAC的核苷酸序列。
圖35A-35B.pRIG22的核苷酸序列。
圖36.pRIG-TP的示意圖。圖中所示的是載體的線性化形式。水平線表示DNA分子。箭頭表示啟動子。空心盒表示外顯子。實心盒表示轉座子重組信號(來自Tn5-與得自Epicentre Technologies的體外轉座試劑盒相容)。使用了下列名稱剪接供體位點(S/D)，嘌呤黴素抗性基因(Puro)，二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，EB病毒核抗原-1複製蛋白(EBNA-1)，EB病毒複製起點(oriP)，Poly(A)信號(pA)和活化外顯子(AE)。應懂得活化外顯子可含有能介導蛋白質合成的任何序列，包括任何閱讀框中的翻譯起始密碼子，分泌信號序列的一部分，完整的分泌信號序列，表位標記，蛋白質，蛋白質的一部分，或蛋白質基元。活化外顯子也可缺少翻譯起始密碼子。
圖37A-37C.pRIG-T的核苷酸序列。
發明詳述通過非同源重組活化基因大大優於其它基因活化方法。與以前蛋白質過表達不同，本文描述的方法不需克隆(從細胞中分離出)目的基因。它們也不需了解將要過表達的基因的DNA序列或結構(即ORF、內含子、外顯子或上遊和下遊調控元件的序列)或該基因的表達方式(即組織特異性、發育調控等)。另外，這些方法不需要有關目的基因的基因結構(即內含子和外顯子結構)的知識。
因此，本發明的方法涉及載體構建體，其中該載體構建體不含有用於同源重組的靶核苷酸序列。靶序列能使載體DNA與細胞DNA在細胞DNA上的預定位點進行同源重組，所述位點與載體中的序列具有同源性，在預定位點發生的同源重組導致轉錄調控序列被導入基因組，內源基因隨即被活化。
本發明的方法不涉及載體在預定位點處的整合。相反，本方法涉及本發明的載體構建體通過非同源或「非法重組」(也稱為「非靶向基因活化」)整合到細胞DNA(例如，細胞基因組)中。
在相關的實施方案中，本發明還涉及非-靶向基因活化。非-靶向基因活化具有多種重要用途。第一，通過活化一般不在給定細胞類型中表達的基因，可以在不依賴基因的正常表達模式的情況下分離其cDNA拷貝。這有利於分離一般在罕見細胞中，在短暫的發育階段，和/或以很低水平表達的基因。第二，通過翻譯活化基因，可以產生蛋白質表達文庫，而無需克隆全長cDNA。可從這些文庫中篩選出新的酶和蛋白質和/或由內源基因的過表達所致的目標表型。第三，可以產生過表達特定蛋白質的細胞系，並使用該細胞系產生商用量的蛋白質。因此，活化內源基因提供了一種很有效的用於發現和分離新基因和蛋白質，並產生大量特定的商業化蛋白質的方法。
本文中描述的載體不含靶序列。靶序列是載體上的這樣一個序列，它與待活化的基因內部或其上遊的一或多個序列同源(其中上遊區域到達並且包括目的基因相同編碼鏈上的第一個功能剪接受體位點)，將能活化目的基因的轉錄調控序列可藉助該同源性整合到含有待活化基因的細胞的基因組中。在用增強子整合載體來活化內源基因的情況中，在增強子能起到作用的距離內，所述載體不與基因組中目的基因上遊或下遊(或目的基因內部)的任何序列有同源性。
因此這些方法能鑑定到那些已被或可能被常規和現有克隆技術丟失的新基因。利用本文描述的構建體和方法，可以快速鑑定未知和/或未鑑定的基因，並使其過表達以產生蛋白質。這些蛋白質的用途包括人類治療和診斷，及作為藥物開發的靶。
所述方法還能用於已知和/或已鑑定基因的過表達，以便體外或體內製備蛋白質。
「已知的基因」指鑑定基因的水平。本發明能表達已被鑑定和未被鑑定的基因。不同程度的鑑定都是可能的。這些包括詳細的鑑定，比如克隆、DNA、RNA和/或蛋白質測序，以及確定基因的調控和功能與克隆序列的關係(例如，識別啟動子和增強子序列、開放讀碼框的功能，內含子等)。鑑定可以較粗略，比如將基因和相關功能作圖，或得到部分胺基酸序列或核苷酸序列，或已將蛋白質純化並確定了功能。鑑定可能是極基本的，如已知核苷酸或胺基酸序列或者已將蛋白質分離，但功能未知。或者，功能可能是已知的，但相關的蛋白質或核苷酸序列未知，或者雖然知道序列但沒有與功能建立聯繫。最後，也可能沒有做任何鑑定，因為基因的存在及其功能均是未知的。本發明可以在任何上述或其它具體的鑑定程度的水平上表達任何基因。
利用一個活化構建體並在一組轉染中可以活化或過表達許多不同蛋白質(在本文中還可互換地稱為「基因產物」或「表達產物」)。因此，在用相同或不同構建體轉染之後，一組轉染子(文庫)中的一個細胞或不同細胞可以過表達多個蛋白質。而以前的活化方法要求給每個待活化基因建立一個獨特的構建體。
此外，利用一個構建體可以同時形成和檢測一個基因附近的許多不同整合位點。這就使得能快速確定用於蛋白質表達的活化構建體的最佳基因組位置。
利用以前的方法，對於目的基因5』端的序列和結構必須做廣泛的鑑定。必須針對每個要製備的活化構建體分離一個合適的靶序列。通常，靶序列必須是分離自與待活化細胞相同的人或動物實驗株的純合序列。在某些情下，該DNA可能是來自目的基因的50kb或更長片段。因此，製備每個靶向構建體要對內源基因進行大量克隆和測序工作。而因為本發明的方法不需要序列和結構信息，可以活化未知基因和帶有未做鑑定的上遊區域的基因。
這就有可能利用內源DNA序列與胞內DNA進行的非同源重組做原位基因活化。本發明即提供了利用非同源重組實現的這種原位基因活化所需的方法和組分(例如，載體構建體)。
DNA分子可以通過幾種不同的獨立機制發生重組從而重新分配其遺傳內容，所述機制包括同源重組、位點特異性重組、以及非同源/非法重組。同源重組涉及那些序列極其類似的DNA片段之間的重組、已經證實，同源重組涉及在遺傳物重新分配之前，同源序列沿其鏈形成配對。交叉的確切位點可以是同源片段中的任何位點。重組效率與同源導向序列的長度(Hope，發育113399(1991)；Reddy等，病毒學雜誌651507(1991))、兩個發生重組的序列之間的序列相同程度(Von Melchner等，基因進展6919(1992))、以及構建體中同源與非同源DNA的比率(Letson，遺傳學117759(1987))成比例。
另一方面，位點特異性重組涉及遺傳物質在預定位點(由特異DNA序列決定)的交換。在該反應中，蛋白質重組酶結合到重組信號序列上，形成一個鏈斷裂，並促進DNA鏈交換。Cre/Lox重組就是位點特異性重組的實例。
非同源/非法重組，比如本發明的方法有利地所採用的，包括沒有顯著序列同源性的遺傳物質的連接(交換或重新分配)並且不是發生在位點特異性重組序列處。非同源重組的例子包括外源DNA在非同源位點整合到染色體中、染色體易位和缺失，DNA末端連接，染色體末端的雙鏈斷裂修復，橋裂合以及轉染序列的連環化。在多數情況中，認為非同源重組是通過「游離DNA未端」的連接發生的。游離末端是這樣的DNA分子，它含有一個能與第二個DNA末端直接連接、或者在修復或加工後與第二個DNA末端連接的末端。該DNA末端可能含有5′突出端，3′突出端，或者平末端。
在本文中，可以廣泛地將逆轉錄病毒插入和其它轉座反應看作是非同源重組。這些反應不涉及利用發生重組的分子間的同源性。而且，與位點特異性重組不同，這些類型的重組反應不是在離散位點之間進行的。相反，僅在重組配偶體(即，逆轉錄病毒或轉座子)之一上需要有特異蛋白質/DNA複合物，而第二個DNA配偶體(即，細胞基因組)通常是相當非特異性的。結果，這些「載體」不是以定向方式整合到細胞基因組，因此可以根據本發明用它們來遞送活化構建體。
可用於本文所述方法的載體構建體理想情況下可以含有一個轉錄調控序列，它與細胞內的基因組序列發生非同源重組從而在該細胞內過表達內源基因。本發明的載體構建體還缺少同源靶序列。即，它們不含有靶向宿主細胞DNA並促進在靶位點處發生同源重組的DNA序列。因此，本發明的載體構建體通過非同源重組整合到細胞基因組中，並藉助所導入的包含在整合進來的載體構建體中的轉錄調控序列來過表達細胞基因。
本發明一般性地涉及用於在細胞內過表達內源基因的方法，包括將含有轉錄調控序列的載體導入細胞中，使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中，使內源基因在細胞內過表達。該方法不需要預先了解內源基因的序列甚至其存在。而在待活化基因序列已知的情況下，可以將構建體改造為含有合適的載體元件構型(例如，起始密碼子的位置，內源基因的第一個外顯子中存在的附加密碼子、以及合適的讀框)從而獲得最大程度的過表達和/或適當的蛋白質序列。
在本發明的某些實施方案中，可以篩選由基因表達的含有載體的細胞。
可以體外培養過表達所述基因的細胞，培養條件為有利於該細胞產生那些已被活化或其表達已提高的內源基因的預期量的基因產物。如果需要，可以隨後將基因產物分離或純化以便用於，例如，蛋白質療法或藥物開發。
或者，可以使表達所需基因產物的細胞在體內表達所述基因產物。
載體構建體可本質上含有轉錄調控序列。
或者，所述載體構建體可本質上含有轉錄調控序列和1或多個可擴增標記。
因此，本發明還涉及在細胞內過表達內源基因的方法，包括將含有轉錄調控序列和可擴增標記的載體導入細胞中，使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中，使內源基因在細胞內過表達。
篩選含有載體的細胞中過表達所述基因的那些。
培養過表達所述基因的細胞從而使內源基因擴增。然後將細胞體外培養以得到擴增後的內源基因的預期量基因產物，其中該內源基因已被活化，或者其表達已提高，然後可以對基因產物進行分離和純化。
或者，擴增後，使細胞在體內表達內源基因並產生預期量基因產物。
載體構建體可本質上含有轉錄調控序列和剪接供體序列。
因此，本發明還涉及在細胞內過表達內源基因的方法，包括將含有轉錄調控序列和未配對的剪接供體序列的載體導入細胞中，使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中，使內源基因在細胞內過表達。
篩選含有載體的細胞中表達所述基因的那些。
體外培養過表達基因的細胞從而得到預期量的內源基因的基因產物，其中該內源基因的表達已被活化，或者其表達已提高，然後可以對基因產物進行分離和純化。
或者，可以使細胞在體內表達所需基因產物。
載體構建體可本質上含有可操縱地連接到未配對剪接供體序列的轉錄調控序列，並且還含有可擴增標記。
其它活化載體包括下列一些構建體具有轉錄調控序列和含有起始密碼子的外顯子序列的構建體；具有轉錄調控序列和含有翻譯起始密碼子及分泌信號序列的外顯子序列的構建體；具有轉錄調控序列和含有翻譯起始密碼子及表位標記的外顯子序列的構建體；具有轉錄調控序列和含有翻譯起始密碼子、信號序列及表位標記的外顯子序列的構建體；包含轉錄調控序列和含有翻譯起始密碼子、分泌信號序列、表位標記及序列特異性蛋白酶位點的外顯子序列的構建體。在上述每個構建體中，構建體上的外顯子緊鄰未配對的剪接供體位點的上遊。
構建體還可以含有調控序列、缺少poly(A)信號的選擇標記、內部核糖體進入位點(ires)以及未配對的剪接供體位點(圖4)。任選在ires和未配對的剪接供體位點之間包括起始密碼子、分泌信號序列、表位標記、和/或蛋白酶切割位點。當該構建體整合到基因上遊時，由於內源基因可以提供一個poly(A)位點，選擇標記可以被有效地表達。此外，下遊基因也被表達，因為ires使得在下遊開放讀框(即內源基因)處開始進行蛋白質翻譯。因此，由該活化構建體產生的信息是多順反子的。該構建體的優點在於整合事件不在基因附近進行，並且適當取向，不會產生抗藥性集落。其原因是沒有poly(A)尾部(內源基因所提供的)，新黴素抗性基因不能有效地表達。通過減少無效整合的次數，可以在不影響其覆蓋面(被活化的基因的數量)的情況下，降低文庫的複雜程度，這能便利篩選過程。
在所述構建體的另一個實施方案中，可以在調控序列和neo起始密碼子之間以及ires和未配對的剪接供體位點之間(在ires和起始密碼子(如果有)之間)包括上crx-lox重組序列。分離出其目的基因已被活化的細胞後，可以用編碼cre重組酶的質粒轉染該細胞，從而除去neo基因和ires。這能消除多順反子信息，使得內源基因直接從被整合上來的活化構建體上的調控序列進行表達。利用Cre重組來協助從哺乳動物染色體上缺失遺傳元件已有描述(Gu等，科學265103(1994)；Sauer，酶學方法225890-900(1993))。
因此，可用於本文描述的方法的構建體包括，但不限於，下列構建體(見圖1-4)1)具有調控序列和缺少翻譯起始密碼子的外顯子的構建體。
2)具有調控序列和缺少翻譯起始密碼子的外顯子，其後是剪接供體位點的構建體。
3)具有調控序列和讀碼框1(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
4)具有調控序列和讀碼框2(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
5)具有調控序列和讀碼框3(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
6)具有調控序列以及讀碼框1(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子和分泌信號序列的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
7)具有調控序列以及讀碼框2(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子和分泌信號序列的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
8)具有調控序列以及讀碼框3(與剪接供體位點相關)中含有翻譯起始密碼子和分泌信號序列的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
9)具有調控序列以及讀碼框1(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
10)具有調控序列以及讀碼框2(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
11)具有調控序列以及讀碼框3(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
12)具有調控序列以及讀碼框1(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
13)具有調控序列以及讀碼框2(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
14)具有調控序列以及讀碼框3(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列和表位標記的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
15)具有調控序列以及讀碼框1(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列、表位標記和序列特異的蛋白酶位點的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
16)具有調控序列以及讀碼框2(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列、表位標記和序列特異的蛋白酶位點的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
17)具有調控序列以及讀碼框3(與剪接供體位點相關)中含有(從5』到3』)翻譯起始密碼子、分泌信號序列、表位標記和序列特異的蛋白酶位點的外顯子，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
18)具有與選擇標記連接在一起的調控序列，其後是內部核糖體進入位點和未配對剪接供體位點的構建體。
19)構建體18，其中cre/lox重組信號位於a)調控序列和選擇標記的開放讀碼框之間以及b)ires和未配對剪接供體位點之間。
20)具有調控序列，該序列與含有缺少終止密碼子的綠色螢光蛋白的外顯子可操作地相連，其後是未配對剪接供體位點的構建體。
但是應當明白，任何用於文中所述方法的載體可以包括一或多個(即，1、2、3、4、5或更多，最優選1或2個)可擴增標記。與此相應，所述方法可以包括一個擴增內源基因的步驟。在活化構建體上插入一或多個可擴增標記使得在被活化細胞中，目的基因與一或多個可擴增標記並列。一旦分離出被活化細胞，可以通過挑選這樣一些細胞進一步提供表達，所述細胞包含帶有目的基因和活化構建體的基因座拷貝數增加。可以通過本領域已知的挑選方染來實現這一目的，例如在含有1或多種選擇試劑的選擇培養基上培養細胞，其中所述選擇試劑對基因構建體或載體上含有的1或多個可擴增標記有特異性。
經上述任何載體的非同源整合使內源基因活化後，可以通過挑選位於整合載體中的拷貝數增加的可擴增標記來進一步提高內源基因的表達。雖然可以用整合載體上的一個可擴增標記來實施該方法，但在本發明的替代實施方案中，提供了這樣的方法，其中載體可包含2或多個(即2、3、4、5或更多，最優選2個)可擴增標記來協助更有效地挑選出那些載體和旁側目的基因均被擴增的細胞。這種方案對於某些細胞尤其有用，所述細胞有載體上所含的一或多個可擴增標記的一個功能性內源拷貝，因為選擇步驟可以分離出那些不正確地擴增了內源可擴增標記，而不是載體編碼的可擴增標記的細胞。該方法也可用於淘汰那些通過不涉及基因擴增的機制對選擇試劑產生抗性的細胞。在這些情況下，使用兩或多種可擴增標記的方法是有益的，因為一個細胞在沒有擴增整合載體和旁側目的基因的情況下，對兩或多種選擇試劑產生抗性的可能性顯著低於細胞對任何一種選擇試劑產生抗性的可能性。因此，通過同時或連續選擇兩或多個載體編碼的可擴增標記，將有更大百分比的最後分離到的細胞含有被擴增的載體和目的基因。
因此，在另一個實施方案中，本發明的載體可以含有兩或多種(即2，3，4，5，或更多，最優選2種)可擴增標記，該方法能在活化表達後更有效地擴增載體序列和鄰近的目的基因。
可以用於構建所述載體的可擴增標記的例子包括，但不限於二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶、二氫乳清酸酶以及氨甲醯磷酸合成酶。
還應當明白，本文所述的任何構建體可以含有真核生物病毒的複製起點，其可替代可擴增標記或與該標記相連。病毒複製起點的存在使得整合載體和相鄰的內源基因作為游離體分離和/或在導入適當的病毒複製蛋白的情況下，擴增到高拷貝數。有用的病毒起點的例子包括，但不限於SV40 ori和EBV ori P。
本發明還包括一些實施方案，其中本文公開的構建體本質上含有以上具體描述的用於這些構建體的成分。還應當明白，上述構建體是可以用於本文所述方法的構建體的例子，而本發明包括這些構建體的功能等同物。
術語「載體」應理解為一般性地指將核苷酸序列導入細胞中的運載物。它並不試圖限定到任何具體序列。載體本身可以是活化內源基因的核苷酸序列或者可以含有活化內源基因的序列。因此，載體可以僅是一個本質上只含有活化所需的序列的線形成環形多核苷酸，或者可以是存在於較大多核苷酸中的這些序列或者其它構建體，比如一個DNA或RNA病毒基因組、完整的毒粒或其它用來將關鍵核苷酸或其它序列導入細胞中的生物構建體。還應明白，術語「載體構建體」或術語「構建體」可以與本文中的術語「載體」互換使用。
載體可以含有天然存在的或者是通過基因工程或合成法製得的DNA序列。
當構建體非同源整合到細胞基因組中時，其能活化內源基因的表達。內源基因的表達可能產生全長蛋白質，或產生內源蛋白質的截短的生物活性形態，這取決於整合位點(如在上遊區域還是內含子2)。被活化的基因可以是已知基因(例如，已被克隆或鑑定的)或未知基因(未被克隆或鑑定的)，基因的功能可以是已知或未知的。
具有已知活性的蛋白質的例子包括，但不限於，細胞因子、生長因子、神經遞質、酶、結構蛋白質、細胞表面受體，胞內受體、激素、抗體以及轉錄因子。可以用本方法製備的已知蛋白質的具體例子包括，但不限於，紅細胞生成素、胰島素、生長激素、葡糖腦苷脂酶，組織纖溶酶原活化物、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ，白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、TGF-β，凝血因子V，凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、TSH-β、骨生長因子-2、骨生長因子-7，腫瘤壞死因子、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III，白血病抑制因子、胰高血糖素、蛋白C、蛋白激酶C、幹細胞因子、促卵泡激素β、尿激酶、神經生長因子、胰島素樣生長因子、促胰島素(insulinotropin)、甲狀旁腺激素、乳鐵蛋白、補體抑制因子、血小板衍生生長因子，角質細胞生長因子、肝細胞生長因子、內皮細胞生長因子、神經營養蛋白-3、血小板生成素、絨膜促性腺激素、血栓調節蛋白、α糖苷酶、表皮生長因子以及成纖維細胞生長因子。本發明還能活化許多表達跨膜蛋白的基因，並製備和分離這些蛋白質，它們包括但不限於生長因子、激素、神經遞質和細胞因子(如上面描述的那些)的細胞表面受體、跨膜離子通道、膽固醇受體、脂蛋白(包括LDL和HDL)和其它類脂部分的受體、整合蛋白和其它胞外基質受體、細胞骨架錨蛋白、免疫球蛋白受體、CD抗原(包括CD2、CD3、CD4、CD8和CD34抗原)，以及本領域已知的其它細胞表面跨膜型結構和功能蛋白。正如本領域普遍技術人員能想到的，通過本發明的方法還可以製備本領域已知的其它細胞蛋白和受體。
本文所述方法的一個優點是它實際上能活化任何基因。但是，由於基因有不同的基因組結構，包括不同的內含子/外顯子界線和起始密碼子的位置，為了在一群細胞中活化最大數量的不同基因，要提供許多活化構建體。
可以將這些構建體分別轉染到細胞中製備文庫，每個文庫含有的細胞帶有獨特的一組活化基因。某些基因被幾種不同的活化構建體活化。另外，可以活化基因的某些部分來產生截短的、生物活性蛋白質。截短的蛋白質可以這樣製備，例如將活化構建體整合到內源基因中部的內含子或外顯子中，而不是整合到第二個外顯子的上遊。
使用不同構建體還可以使活化了的基因被修飾從而使其含有新的序列。例如，可以在活化構建體上包含分泌信號序列來促進活化基因的分泌。在某些情況中，根據內含子/外顯子結構和目的基因的情況，分泌信號序列可以取代內源基因的全部或部分信號序列，在另外一些情況中，信號序列能使通常位於胞內的蛋白質分泌出去。
載體上的調控序列可以是組成型啟動子。或者，啟動子可以是誘導型的，使用誘導型啟動子能使細胞在常規培養和擴增過程中只產生低基底水平的活化蛋白質。然後例如在製備或篩選過程中，細胞可以被誘導以產生大量所需蛋白質。誘導型啟動子的例子包括，但不限於，四環素誘導型啟動子和金屬硫蛋白啟動子。
在本發明的優選實施方案中，本發明載體上的調控序列可以是啟動子，增強子，或阻抑物，它們中的任一個可以是組織特異性的。
載體上的調控序列可以分離自細胞或病毒基因組。細胞調控序列的例子包括，但不限於，來自肌動蛋白基因、金屬硫蛋白I基因、免疫球蛋白基因、酪蛋白I基因、血清白蛋白基因、膠原蛋白基因、球蛋白基因、層粘連蛋白基因、血影蛋白基因、錨蛋白基因、Na/K ATP酶基因和微管蛋白基因的調控元件。病毒調控序列的例子包括，但不限於，來自巨細胞病毒(CMV)立即早期基因、腺病毒晚期基因、SV40基因、逆轉錄病毒LTR和皰疹病毒基因的調控元件。通常，調控序列含有轉錄因子(比如NF-kB、SP-1、TATA結合蛋白、AP-1、和CAAT結合蛋白)的結合位點。從功能上說，調控序列是由其啟動、增強或者改變內源基因轉錄的能力所定義的。
在某些優選實施方案中，調控序列是病毒啟動子。在特別優選的實施方案中，啟動子是CMV立即早期基因啟動子。在其它實施方案中，所述調控元件是細胞的、非病毒的啟動子。
在其它優選實施方案中，調控元件可以是或可含有一個增強子。在特別優選的這類實施方案中，增強子是CMV立即早期基因增強子。在其它實施方案中，所述增強子是細胞的、非病毒的增強子。
在其它優選的實施方案中，調控元件可以是或可含有阻抑物。在特別優選的這類實施方案中，阻抑物可以是病毒阻抑物或細胞性非-病毒阻抑物。
轉錄調控序列也可含有一個或多個支架結構附著區或基質附著位點、負調控元件以及轉錄因子結合位點。調控序列還可以包括基因座控制區。
本發明也包括逆轉錄病毒轉錄調控序列，例如長末端重複的使用。但是當用這些序列時，它們不必與能極大地影響轉錄調控序列作為待活化的內源基因(即轉錄調控序列將要與之重組以便活化的細胞基因)的轉錄啟動子或增強子功能的任何逆轉錄病毒序列相連。
本發明的載體構建體也可含有一個不與載體上的外顯子序列可操作地相連的調控序列。例如，當調控元件是一個增強子，它可以在內源基因附近(例如，上遊、下遊、或在內含子內部)進行整合併刺激該基因從其內源啟動子處開始表達。通過這個活化機制，在被活化基因的轉錄產物中不存在來自載體的外顯子序列。
或者，調控元件可以與外顯子可操作地相連，該外顯子可以是天然產生的序列或者可以是非天然產生的(例如合成製備的)序列。為了活化在其第一個外顯子中缺少起始密碼子的內源基因(例如，促卵泡激素β)，優選將載體上的外顯子的起始密碼子缺失。為了活化其第一個外顯子中含有起始密碼子的內源基因(例如，紅細胞生成素和生長激素)，優選載體上的外顯子含有起始密碼子，通常是ATG，優選是一個高效翻譯起始位點(kozak，分子生物學雜誌196947(1987))。外顯子可以含有跟在起始密碼子後面的附加密碼子。這些密碼子可以來源於天然產生的基因或者是非天然產生的(例如，合成的)。密碼子可以與待活化內源基因的第一個外顯子中的密碼子相同。或者，密碼子可與內源基因的第一個外顯子中的密碼子不同。例如，所述密碼子可以編碼一個表位標記、分泌信號序列、跨膜結構域、選擇標記或篩選標記。任選，緊鄰外顯子序列3』端有一個未配對的剪接供體位點。當待活化的基因的結構已知時，應將剪接供體位點放在緊鄰載體外顯子的位置，這樣在剪接之後，載體中的密碼子將與內源基因的第二個外顯子的密碼子讀框一致。當待活化的內源基因的結構未知時，使用分別含有不同讀碼框的構建體。
可操縱地連接被定義為一個允許通過指定序列進行轉錄的構型。例如，與外顯子序列可操縱地連接的調控序列表明該外顯子序列被轉錄。載體上存在起始密碼子時，可操縱地連接還表明載體外顯子的開放讀碼框與內源基因的開放讀碼框是讀框一致的。在非同源整合之後，載體上的調控序列(例如，啟動子)變成與內源基因可操作地相連，並在一個通常稱為CAP位點的位點上協助轉錄起始。轉錄依次通過載體上的外顯子元件(以及如果有的話，通過起始密碼子、開放讀碼框，和/或未配對的剪接供體位點)並通過內源基因而推進。由這個可操縱連接產生的初級轉錄產物被剪接以產生一個含有來自載體和內源基因兩者的外顯子序列的嵌合轉錄產物。翻譯後，該轉錄產物能產生一個內源蛋白質。
外顯子或「外顯子序列」定義為存在於成熟RNA分子中的任何被轉錄的序列。載體上的外顯子可以含有非翻譯序列，例如，5』非翻譯區。或者，或者與非翻譯序列連接在一起，外顯子可以含有編碼序列，比如起始密碼子和開放讀碼框。開放讀碼框可以編碼天然產生的胺基酸序列或非天然產生的胺基酸序列(例如，合成密碼子)。開放讀碼框還可以編碼分泌信號序列、表位標記、外顯子、選擇標記、篩選標記或者核苷酸，當與內源基因進行剪接時，該核苷酸用於保護該開放讀碼框。
初級轉錄產物的剪接(通過該過程去除內含子)由分別位於內含子5』和3』端的剪接供體位點和剪接受體位點引導進行。剪接供體位點的其有序列是(A/C)AG GURAGU(其中R代表嘌呤核苷酸)，其中1-3位的核苷酸位於外顯子中，核苷酸GURAGU位於內含子中。
未配對的剪接供體位點在本文中定義為位於活化構建體上的沒有下遊剪接受體位點的剪接供體位點。當載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中時，未配對的剪接供體位點與來自內源基因的剪接受體位點形成配對。來自載體的剪接供體位點，與來自內源基因的剪接受體位點一起，將引導載體剪接供體位點和內源剪接受體位點之間的所有序列的切除。這些間插序列的切除去掉了幹擾內源蛋白質翻譯的序列。
本文中所用的術語「上遊」和「下遊」，意指相對編碼鏈，分別是5』或3』方向。術語基因的「上遊區域」定義為該基因第二外顯子5』端(相對於編碼鏈)到達並包括第一個具有相同編碼鏈的相鄰基因中最後一個外顯子的核苷酸序列。從功能上來說，上遊區域是內源基因第二外顯子5』方向的能使非同源整合的載體與內源基因可操作地相連的任何位點。
載體構建體可以含有選擇標記以便協助鑑定和分離含有非同源整合的活化構建體的細胞。選擇標記的例子包括編碼下列物質的基因新黴素抗性(neo)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、嘌呤黴素(pac)、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)、組氨酸D(hisD)、氨甲醯磷酸合成酶(CAD)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、多抗藥性1(mdr 1)、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)和腺苷脫氨酶(ada)。
或者，載體可以含有一個篩選標記以代替選擇標記或補充選擇標記。篩選標記能使含有載體的細胞分離出來，而不需給它們施加藥物或其它選擇壓力。篩選標記的例子包括編碼細胞表面蛋白、螢光蛋白和酶的基因。包含載體的細胞可以通過FACS利用針對細胞表面蛋白的螢光標記型抗體或者用能被載體編碼的酶轉化為螢光產物的底物來分離。
或者，可以通過由內源基因產物提供的性狀進行表型選擇來挑選。因此，活化構建體除了由內源基因自身提供的「標記」外可以不含選擇標記。在該實施方案中，可以根據活化基因所賦予的表型來挑選活化細胞。可選擇的表型的例子包括細胞增殖、不依賴生長因子的生長、集落形成、細胞分化(例如，分化成神經元細胞，肌細胞、上皮細胞等)、不依賴於貼壁的生長、對細胞因子(例如，激酶，轉錄因子，核酸酶等)的活化作用、細胞表面受體/蛋白的表達、獲得或喪失細胞-細胞粘附性、遷移和細胞活化(例如，靜息或活化的T細胞)。
當篩選轉染細胞的基因活化產物而不是篩選穩定的整合子時，可以刪除構建體上的選擇標記。當穩定整合效率高時，這一點尤其有用。
載體可以含有一或多個(即1、2、3、4、5或更多，最優選1或2個)可擴增標記以便挑選出包含拷貝數增加的整合載體和相鄰的活化型內源基因的細胞。可擴增標記的例子包括，但不限於二氫葉酸還原酶(DHFR)、腺苷脫氨酶(ada)、二氫乳清酸酶穀氨醯胺合成酶(GS)和氨甲醯磷酸合成酶(CAD)。
載體可以含有用於基因擴增的真核生物的病毒複製起點。這些起點可以取代可擴增標記或者與可擴增標記共存。
載體還可以含有用於構建體在微生物中增殖的遺傳元件。有用的遺傳元件的例子包括微生物的複製起點和抗生素抗性標記。
這些載體和文中公開的任何載體，以及本領域普通技術人員容易想到的變體可以用於本文描述的任何方法從而形成可由這些方法製得的任何組合物。
構建體非同源整合到細胞基因組中可使來自載體的調控元件和來自內源基因的外顯子之間形成可操縱的連接。在優選實施方案中，利用載體調控序列的插入來上調內源基因的表達。上調基因表達包括將一個轉錄上的沉默基因轉化為轉錄上的活化基因。它還包括使那些已具轉錄活性的基因，但蛋白質產生量低於所需量的基因的表達增強。在其它實施方案中，可以用其它方法來影響內源基因的表達，比如下調表達、建立誘導型表型或改變表達的組織特異性。
根據本發明，製備基因表達產物的體外方法可能包括，例如，(a)將本發明的載體導入細胞；(b)使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中；(c)由載體上所含的轉錄調控序列上調細胞中的內源基因，從而使其過表達；(d)篩選過表達內源基因的細胞；以及(e)在有利於細胞產生所述內源基因的表達產物的條件下培養細胞。本發明的這種體外方法可能還包含分離表達產物來製備分離的基因表達產物。在這種方法中，可以有利地使用任何本領域已知的分離蛋白質的方法，包括但不限於層析(例如，HPLC、FPLC、LC、離子交換、親和、體積排阻等)、沉澱(例如，硫酸銨沉澱、免疫沉澱等)、電泳及其它為本領域普通技術人員所熟知的蛋白質分離和純化方法。
類似地，體內製備基因表達產物的方法可能包括，例如(a)將本發明的載體導入細胞；(b)使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中；(c)由載體上所含的轉錄調控序列上調細胞中的內源基因，從而使其過表達；(d)篩選過表達內源基因的細胞；以及(e)在有利於所述細胞在真核生物體內過表達內源基因的條件下，將分離且克隆的細胞導入真核生物中。根據發明的這個方面，可以有利地使用任何真核生物，包括真菌(尤其是酵母)，植物和動物，更優選動物，還優選的是脊椎動物，最優選哺乳動物，尤其是人。在某些相關實施方案中，本發明提供了這樣的方法，它還進一步包括在將細胞導入真核生物之前對它進行分離和克隆。
本文中所用短語在細胞中或使細胞在體外「有利於製備表達產物的條件」，「有利於基因過表達的條件」以及「有利於基因活化的條件」是指任何和所有適宜的環境、物理、營養或生化的參數，這些參數能允許、協助或促進細胞在體外產生表達產物、或者過表達或活化基因。這類條件當然包括使用培養基、保溫、光照、溼度等，其可能是最佳或能允許、協助或促進細胞在體外產生表達產物、或者使基因過表達或活化的條件。類似地，本文中所用短語在細胞中或使細胞在體內「有利於製備表達產物的條件」，「有利於基因過表達的條件」以及「有利於基因活化的條件」指任何和所有適宜的環境、物理、營養或生化、行為、遺傳和情感的參數，在這些條件下維持含有所述細胞的動物，這些條件能允許、協助或促進由真核生物的細胞體內產生表達產物或者使基因過表達或活化。利用已描述過的篩選方法和下面例舉的方法，或者其它本領域常規的測量基因表達、活化或過表達的方法，本領域普通技術人員可以確定給定的一組條件是否有利於體外或體內進行基因表達、活化或過表達。
本文所用術語「活化內源基因」指以高於含有內源基因至細胞中正常水平的量，誘導編碼內源基因之轉錄物的產生。在一些應用中，「活化內源基因」也指以高於含有內源基因之細胞中正常水平的量，產生由內源基因編碼的蛋白質，或蛋白質的一部分。
本發明還包括由上述任何方法製得的細胞。本發明包括含有所述載體構建體的細胞，已整合了載體構建體的細胞以及那些在所導入的轉錄調控序列的驅動下，由內源基因過表達所需基因產物的細胞。
用於本發明的細胞可以來源於任何真核物種，可以是原代、次代或永生化的細胞。此外，細胞可以來源於生物體內的任何組織。可用來從中分離和活化細胞的組織的例子包括，但不限於，肝、腎、脾、骨髓、胸腺、心臟、肌肉、肺、腦、睪丸、卵巢、胰島、腸、骨髓、皮膚、骨、膽囊、前列腺、膀胱、胚胎以及免疫和造血系統。細胞類型包括成纖維細胞、上皮細胞、神經元細胞、幹細胞和濾泡細胞。但是，利用本發明，可以用任何細胞或細胞類型來活化基因表達。
可以在來源於真核生物比如真菌、植物或動物的任何細胞中實施所述方法。優選實施方案包括脊椎動物，尤其是哺乳動物，更特別是人。
可以將構建體整合到原代、次代或永生化的細胞中。原代細胞是分離自脊椎動物，並且未被傳代的細胞。次代細胞是已被傳代的原代細胞，但未被永生化。永生化的細胞是可以無限傳代的細胞系。
在優選實施方案中，細胞是永生化的細胞系。永生化的細胞系的例子包括，但不限於，HT1080、HeLa、Jurkat、293細胞、KB癌、T84結腸上皮細胞系、Raji、HepG2或Hep 3B肝癌細胞系、A2058黑素瘤、U937淋巴瘤和WI38成纖維細胞系、體細胞雜合體及雜交瘤。
用於本發明的細胞可以來源於任何真核生物物種，包括但不限於哺乳動物細胞(比如大鼠、小鼠、牛、豬、綿羊、山羊和人)、鳥類細胞、魚類細胞、兩棲動物細胞、爬行動物細胞、植物細胞和酵母細胞。優選地，通過活化來自某物種的細胞中的基因表達來過表達特定物種的內源基因或基因產物。例如，使用人類細胞來過表達內源人類蛋白質。類似地，要過表達內源牛蛋白質(例如牛生長激素)，使用牛細胞。
所述細胞可以來源於真核生物中的任何組織。可用來從中分離和活化細胞的脊椎動物組織的例子包括，但不限於，肝、腎、脾、骨髓、胸腺、心臟、肌肉、肺、腦、免疫系統(包括淋巴系統)、睪丸、卵巢、胰島、腸、胃、骨髓、皮膚、骨、膽囊、前列腺、膀胱、受精卵、胚胎和造血組織。有用的脊椎動物細胞類型包括，但不限於，成纖維細胞、上皮細胞、神經元細胞、生殖細胞(即精母細胞/精子以及卵母細胞)、幹細胞和濾泡細胞。可用來從中分離和活化細胞的植物組織包括，但不限於葉組織、子房組織、雄蕊組織、雌蕊組織、根組織、塊莖、配子、種子、胚芽等。但本領域普通技術人員會想到，利用本發明可以用任何真核的細胞或細胞類型來活化基因表達。
上述任何方法製備的任何細胞都可用來篩選所需基因產物的表達，並提供所需量的細胞內過表達的基因產物。可以將該細胞分離和克隆。
可用以該方法製得的細胞來在體外(例如用於蛋白質治療)或體內(用於細胞療法)製備蛋白質。
工業上的生長和製備條件經常與用於分析用途(例如克隆、蛋白質或核酸測序、製備抗體、X-射線晶體學分析、酶學分析等)的細胞生長和製備條件不同。用於搖瓶中生長的細胞放大試驗包括提高細胞可以附著的表面積。因此經常加入微載體珠來提高工業生長用的表面積。旋轉器培養中的細胞放大試驗可能涉及體積的較大提高。微載體和旋轉器培養可能需要5升或更大體積。根據目的蛋白質的固有效價(比活)，體積低至1-10升。常見的是10-15升。但是，可能會需要達到50-100升，體積可能會高至10,000-15,000升。在某些情況中，可能需要更高體積。還可以在大量T型燒瓶(例如50-100個)中培養細胞。
除了生長條件，工業規模上的蛋白質純化也與分析用純化相當不同。在工業實踐中，可以由相當於10升(大約104細胞/ml)細胞量等同物開始純化蛋白質。開始蛋白質純化的細胞量等同物可以達到10升(高達106或107細胞/ml)的細胞。但本領域普通技術人員會想到，更高或更低一些的起始細胞量等同物也可用於本方法。
另一種工業培養條件，特別在當終產物要臨床使用時，是在無血清培養基中培養細胞，無血清培養基是指不含血清或所含血清沒有達到細胞生長所需量的培養基。很顯然，這避免了對有毒汙染物(例如病毒)或其它類型汙染物(例如會使純化過程複雜的蛋白質)的不希望的共純化。用於細胞生長的無血清培養基、這種培養基的工業來源及在無血清培養基中培養細胞的方法是本領域普通技術人員熟知的。
由上面描述的方面獲得的單個細胞能過表達一個基因或多個基因。通過整合一個構建體或在同一細胞中整合多重構建體(即多種類型的構建體)可以活化多個基因。因此，一個細胞可以只含一類載體構建體或不同類型的構建體，每種構建體能活化一個內源基因。
本發明還涉及通過下列一或多項步驟來製備上述細胞的方法導入一或多個載體構建體；使導入的構建體通過非同源重組整合到細胞基因組中；在細胞內過表達1或多個內源基因；以及分離和克隆所述細胞。
方便起見，當討論將多核苷酸導入細胞中時，本文採用術語「轉染」。但是，應當明白該術語的特定用途已被用來泛指將多核苷酸導入細胞的方法，也用來指用其它本文描述的方法實現的導入，比如電穿孔，脂質體介導的導入，逆轉錄病毒介導的導入等(以及依照其自身特定含義的導入方法)可以通過許多本領域已知方法將載體導入細胞。這些方法包括，但不限於，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE右旋糖苷、脂質體轉染和受體介導的胞吞、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞基聚甲溴化物(polybrene)、粒子轟擊和顯微注射。或者，可臺將載體以病毒顆粒(可複製感受態病毒或複製缺陷型病毒)的形式遞送到細胞中。可用於遞送核苷酸的病毒的例子包括，但不限於，腺病毒、腺病毒相關病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和痘苗病毒。本領域技術人員知道的其它適用於將核苷酸分子遞送到細胞中的病毒可以被等效地用於該方法。
轉染之後，在一定條件下培養細胞，該條件是本領域已知的適合載體和宿主細胞基因組之間進行非同源整合的條件。可以進一步在本領域已知的使被活化內源基因進行表達的條件下，培養含有非同源整合的載體的細胞。
可以在一個DNA構建體或各自獨立的構建體上將載體構建體導入細胞，並發生連環化。
儘管在優選實施方案中，載體構建體是雙鏈DNA載體構建體，載體構建體也包括單鏈DNA、單鏈和雙鏈DNA的結合形式、單鏈RNA、雙鏈RNA、以及單鏈和雙鏈RNA的結合形式。因此，例如，載體構建體可以是單鏈RNA，其由逆轉錄酶將其轉化為cDNA，cDNA再被轉化為雙鏈DNA，而雙鏈DNA最終與宿主細胞基因組發生重組。
在優選實施方案中，導入細胞之前將構建體線性化。活化構建體的線性化產生游離DNA末端，它能在整合過程中與染色體末端反應。一般來說，構建體在調控元件(以及外顯子和剪接供體序列，如果有這些序列)下遊被線性化。可以通過，例如在調控序列下遊加入一個獨特的限制位點並在轉染前用相應的限制酶處理構建體來促進線性化。在構建體上的線性化位點和近端最具功能的元件(例如未配對的剪接供體位點)之間插入一個「間隔區」序列是有利的，但這一作法不是必須的。有間隔區序列存在能保護載體上的重要功能元件在轉染過程中免受外切核苷酶的降解。所述間隔區可以由任何不會改變文中所述載體的基本功能的核苷酸序列構成。
也可以用環形構建體來活化內源基因表達。本領域已知，環形質粒在轉染到細胞中時能整合到宿主細胞基因組中。據推測，轉染過程中在環形質粒中發生DNA斷裂，從而產生能連接到染色體末端的游離DNA末端。構建體中的某些斷裂將發生在不破壞載體的關鍵功能的位置(例如，斷裂發生在調控序列下遊)，因此可以使構建體以能活化內源基因的構型整合到染色體中。如上所述，可以在構建體上插入間隔區序列(例如，調控序列下遊)。轉染過程中，發生在間隔區的斷裂將在構建體上的某個位點形成游離末端，該游離末端適合構建體整合到宿主細胞基因組中後活化內源基因。
本發明還包括由上述方法製得的細胞文庫。一個文庫可以包括得自一次轉染實驗的所有克隆或者得自一次轉染實驗的一個亞組的克隆，所述亞組可以過表達相同的基因或多個基因，例如，一類基因。轉染可以用單個類型的構建體或多個類型的構建體進行。
可以將得自兩次或多次轉染實驗的所有重組細胞合併，將得自一次轉染實驗的1或多個亞組的細胞合併或者將得自多次轉染實驗的亞組的細胞合併來構成文庫。所得文庫可以表達相同基因，或多個基因，例如，一類基因。同樣，在每次轉染過程中，可以使用一個構建體或多個構建體。
所述文庫可以由相同細胞類型或不同細胞類型構成。
所述文庫可以由一類細胞組成，該細胞含有一種類型活化構建體，所述構建體在自發DNA斷裂形成的斷裂處或由同時施加(給相同細胞)或者分別施加(給各個細胞群，然後將細胞合併在一起構成文庫)的輻射、限制酶、和/或DNA斷裂劑導致的斷裂處整合到染色體中。文庫可以由多類細胞組成，這些細胞含有一個或多個構建體，所述構建體整合到用輻射、限制酶，和/或DNA斷裂劑一起施加給相同細胞或者分別(施加給各個細胞群，然後將細胞合併在一起構成文庫)處理過的細胞的基因組中。
本發明還涉及從相同或不同轉染實驗中挑選各種細胞亞組來製備文庫的方法。例如，可以將所有表達核因子的細胞(由轉染構建體20的細胞中核綠色螢光蛋白的存在來確定)合併以形成含有活化核因子的細胞文庫。類似地，可以合併表達膜蛋白或分泌蛋白的細胞。也可以將細胞根據表型分組，例如，生長因子獨立型生長、生長因子獨立型增殖、集落形成、細胞分化(例如分化為神經細胞、肌細胞、上皮細胞等)、不依賴於貼壁的生長、活化細胞因子(例如，激酶、轉錄因子、核酸酶等)，細胞—細胞粘附的獲得或喪失、遷移或細胞活化(例如休眠或活化T細胞)。
本發明還涉及利用細胞文庫來過表達內源基因的方法。篩選文庫用於基因的表達，並挑選出能表達所需基因產物的細胞。然後，可以用細胞來純化基因產物，用作隨後使用。可以體外培養細胞或者使細胞體內表達基因來使細胞進行表達。
本發明還涉及利用文庫來鑑定新基因和基因產物的方法。
本發明還涉及通過用能刺激或影響非同源整合方式的試劑處理細胞來提高基因活化效率的方法。已經證實，不同細胞類型的基因表達方式、染色質結構以及甲基化方式顯著不同。即使來自相同細胞類型的不同細胞系也可能有明顯差異。這些差異能通過影響DNA斷裂方式和修復過程而影響非同源整合的方式。例如，染色質化的DNA片段(可能與失活基因有關的性狀)可能對限制酶和化學試劑引起的斷裂作用的抗性更高，而對輻射引起的斷裂作用敏感。
此外，可將失活基因甲基化，在這種情況中，被CpG甲基化阻斷的限制酶不能在失活基因附近切割甲基化位點，從而更難用甲基化敏感酶來活化該基因。通過用各種DNA斷裂劑在多個細胞系中建立活化文庫可以避開這些問題。這樣做，可以產生更完全的整合方式，並能最大可能地活化給定基因。
本發明的方法可包括給含有將要過表達的內源基因的細胞的DNA中導入雙鏈斷裂。這些方法在載體整合之前或同時給細胞內的基因組DNA中導入雙鏈斷裂。DNA斷裂的機制對基因組中DNA的斷裂方式會有顯著影響。這樣，用輻射、限制酶、博來黴素或其它斷裂劑可以在不同位置自發或人為地產生DNA斷裂。
為了提高整合效率以及整合位點分布的隨機性，可以在轉染之前或之後用低、中或高劑量輻射處理細胞。藉助人工誘導的雙鏈斷裂，這時作為DNA修復過程的一部分，轉染DNA可以整合到宿主細胞染色體中。通常，形成用作整合位點的雙鏈斷裂是限速步驟。因此，通過用輻射(或其它DNA破壞劑)來增加染色體斷裂，在給定轉染中能得到更多整合子。此外，由輻射引起的DNA斷裂的機制與自發斷裂的機制不同。
當高能光子擊中DNA分子時，輻射能直接誘導DNA斷裂。或者，輻射可以活化細胞中的某些化合物，後者接著與DNA鏈反應並使其斷裂。而另一方面，自發斷裂被認為是由細胞內產生的反應性化合物(比如超氧化物和過氧化物)和DNA分子之間的相互作用導致的。但是細胞內的DNA不是以裸露、去蛋白化的聚合物的形式存在，而是與染色質結合，並以凝聚狀態存在。因此在細胞內導致雙鏈斷裂的試劑無法接近某些區域。輻射產生的光子波長具有擊中DNA的高度凝聚區的足夠短的波長，從而誘發那些不能發生自發斷裂的DNA區域的斷裂。因此，輻射能產生不同的DNA斷裂方式，後者接下去導致不同的整合方式。
這樣，利用經過/未經過輻射處理的細胞中的相同活化構建體製得的文庫可能含有不同活化基因組。最後，輻射處理能將非同源整合效率提高5-10倍，這使得能用較少細胞產生完整的文庫。因此，輻射處理能提高基因活化效率並在轉染細胞中形成新的整合和活化方式。有用的輻射類型包括α、β、γ、x-射線，以及紫外照射。適用的輻射劑量隨細胞類型而不同，但通常來說，導致0.1％到99％細胞存活的劑量範圍是有用的。對於HT1080細胞，這相當於大約0.1rads到1000rads的137Cs源的輻射劑量。也可以使用其它劑量，只要該劑量能提高整合頻率或者改變整合位點的形式。
除了輻射，也可以用限制酶來人工誘導轉染細胞內的染色體斷裂。與輻射一樣，DNA限制酶能形成染色體斷裂，後者隨之作為轉染DNA的整合位點。該大量的DNA斷裂使得活化構建體的整體整合效率提高。另外，由限制酶導致的斷裂機制與輻射斷裂不同，染色體斷裂的方式也很可能不同。
較之光子和能破壞DNA的小代謝物，限制酶是相對大的分子。因此，限制酶傾向於將比整個基因組的緊密程度小的區域斷裂。如果目的基因存在於基因組的可接近區域內，則用限制酶處理細胞能提高活化構建體整合到目的基因上遊的可能性。由於限制酶識別特異序列，並且由於給定的限制位點不存在於目的基因的上遊，可以使用多種限制酶。由於每種酶有不同的特性(例如大小、穩定性、切割甲基化位點的能力以及最適反應條件)，這些特性會影響到宿主染色體中哪個位點被切割，因此使用多種限制酶是重要的。每種酶，由於其可切割的限制位點的不同分布，將產生不同的整合方式。
因此，在導入活化構建體之前、期間或之後，導入限制酶(或能表達限制酶的質粒)將導致不同基因組的活化。最後，限制酶誘導的斷裂使整合效率提高5-10倍(Yorifuji等，突變研究243121(1990))，這就使得可以轉染較少的細胞而製備到完整的文庫。這樣，可以用限制酶形成新的整合方式，以便使那些在自發斷裂或其他人工誘導的斷裂處通過非同源重組產生的文庫中不能被活化的基因活化。
還可以用限制酶使活化構建體偏性整合到基因組中的預期位點。例如，已描述過幾種罕見的限制酶，它們能平均每50-1000kb切割真核DNA。如果一個罕見的限制酶識別序列恰巧位於目的基因的上遊，通過在活化構建體進行轉染的同時導入該限制酶，可以擇優地在目的基因上遊形成DNA斷裂。然後，這些斷裂可以作為活化構建體的整合位點。能在目的基因內部或附近的合適位置進行切割並且其識別位點在基因組的其他位置不多出現，或者在所述基因附近過多出現(例如，含有CpG的限制位點)，任何這樣的酶都可以。對於以前未被鑑定的基因，可以使用具有8bp識別位點的限制酶(例如，NotI、SfiI、PmeI、SwaI、SseI、SrfI、SgrAl、PacI、AscI、SgfI和Sse8387I)、識別含有CpG的位點的酶(例如WagI、Bsi-WI、MluI和BssHII)以及其他罕見的切割酶。
以這種方法，可以形成富含特定類型活化基因的「偏性」文庫。就這方面來說，含有CpG二核苷酸的限制酶位點尤其有用，因為這些位點在整個基因組中含量少，而在許多基因5』端的CpG島(正是用於基因活化的位置)中含量豐富。因此，識別這些位點的酶能優先在基因序列5』端切割。
可以通過幾種方法將限制酶導入宿主細胞。首先，可以通過電穿孔將限制酶導入細胞(Yorifuji等，突變研究243121(1990)；Winegar等，突變研究22549(1989))。通常，導入細胞的限制酶的量與它在電穿孔介質中的濃度成比例。必須通過調節電壓、電容和電阻來優化每個細胞系的脈衝條件。其次，可以由編碼該酶的質粒在真核生物調控元件的控制下瞬時表達限制酶。可以通過使用誘導型啟動子以及改變誘導的強度來控制所產生的酶的含量。在某些情況中，可能希望限制所產生的限制酶的量(由於其毒性)。在這些情況中，可以利用弱的或突變的啟動子、剪接位點、翻譯起始密碼子和poly(A)尾部來降低所產生的酶量。再次，可以通過能與細胞膜融合或通透的試劑來導入限制酶。脂質體和鏈球菌溶血素O(Pimplikar等，細胞生物學雜誌1251025(1994))是這類試劑的例子。最後，可以利用機械穿孔和顯微注射來將核酸酶和其他蛋白質導入細胞。但是，任何能將活性酶遞送到活細胞中的方法都是適用的。
由博萊黴素和其他DNA損傷劑誘導的DNA斷裂也可以產生不同的DNA斷裂方式。因此，任何能在細胞中產生雙鏈斷裂的試劑或培養條件都可以用來提高非同源重組的效率和/或改變其位點。各類化學DNA損傷劑的例子包括，但不限於，過氧化物和其他能產生自由基的化合物、烷基化試劑、拓撲異構酶抑制劑、抗腫瘤藥物、酸、取代核苷酸和烯二炔(enediyne)抗生素。
特異性化學DNA損傷劑包括，但不限於，博萊黴素、過氧化氫、氫過氧化枯烯、氫過氧化叔丁基、次氯酸(與苯胺、1-萘胺或1-萘酚反應)、硝酸、磷酸、阿黴素、9-脫氧阿黴素、去甲基-6-阿黴素、5-亞氨基柔紅黴素、亞德裡亞黴素(adriamycin)、4-(9-丫啶氨基)甲磺間茴香胺、新制癌菌素、8-甲氧咖啡因、依託泊甙、橢圓玫瑰樹鹼、碘代脫氧尿嘧啶核苷和溴脫氧尿苷。
已經證明可以通過將細胞預先暴露於低劑量DNA斷裂劑，比如輻射或博萊黴素中，來誘導細胞內的DNA修復機制。在轉染前用這些試劑將細胞預處理大約24小時，細胞在轉染後能更有效地修復DNA斷裂和整合DNA。另外，可以使用較高劑量的輻射或其他DNA斷裂劑，因為預處理後的LD50(導致50％處理細胞死亡的劑量)更高。這就使得能以多種劑量產生隨機活化文庫並在宿主細胞的染色體中形成分布不同的整合位點。
篩選一旦製備了一個活化文庫(或多個文庫)，就可以用許多檢測方法來篩選。根據目的蛋白質的特性(例如分泌的與胞內蛋白)和用於形成文庫的活化構建體的性質，可以使用以下描述的任何或所有檢測方法。也可以使用其他檢測形式。
ELISA.可以利用酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)來檢測已活化的蛋白質。如果活化的基因產物被分泌出來，在含有結合的目的蛋白質的特異抗體的孔中溫育活化文庫細胞集的培養物上清液。如果一個或一群細胞已經活化了目的基因，蛋白質將分泌到培養基中。通過篩選文庫克隆集(所述集合可以是1到100,000個以上文庫成員)，可以鑑定到含有目的基因已被活化的細胞的集合。然後可以通過同胞選擇、有限稀釋或其他本領域已知技術將目的細胞從其他文庫成員中純化出來。除了分泌蛋白，還可以使用ELISA來篩選表達胞內或膜結合蛋白質的細胞。在這些情況下，不是篩選培養物上清液，而是從文庫集合(每個細胞在每個集合中至少出現100-1000次)中取出少量細胞、裂解、澄清並加入包被抗體的小孔。
ELISA斑點檢測將ELISA斑點包被目的蛋白質的特異抗體。包被後，用1％BSA/PBS將小孔於37℃封閉1小時。隨後，將隨機活化文庫中的100,000到500,000個細胞加入每個孔中(代表全部集合的約10％)。通常，每個孔加入一個集合。如果細胞表達目的蛋白質的頻率是1/10000(即集合包含10000個單克隆，其中之一表達目的蛋白質)，則每孔鋪500000個細胞將產生50個特異細胞。將細胞在孔中於37℃無移動或無幹擾地溫育24到48小時。溫育結束時，吸出細胞並將培養板用PBS/0.05％Tween 20洗3次，用PBS/1％BSA洗3次。以適當的濃度將二抗加入孔中，於室溫溫育2小時或者4℃溫育16小時。可以將這些抗體生物素化或者直接用辣根過氧化酶(HRP)標記。吸出二抗，用PBS/1％BSA將培養板洗3次。加入標記了HRP的三抗或鏈黴抗生物素蛋白，並於室溫溫育1小時。
FACS檢測可以利用螢光激活細胞分選儀(FACS)以多種方法來篩選隨機活化文庫。如果目的基因編碼細胞表面蛋白質，則可以將螢光標記的抗體與來自活化文庫的細胞一起溫育。如果目的基因編碼分泌蛋白質，則可以將細胞生物素化，並與偶聯到目的蛋白質的特異抗體的鏈黴抗生物素蛋白一起溫育(Manz等，美國科學院學報921921(1995))。溫育後，將細胞放入高濃度明膠中(或其他聚合物，比如瓊脂糖或甲基纖維素)以便限制分泌蛋白質的擴散。當細胞分泌出蛋白質時，它被結合到細胞表面上的抗體捕獲。就可以通過螢光標記的二抗來檢測是否存在目的蛋白質。對於分泌和膜結合蛋白質，都可以隨後根據其螢光信號分選細胞。然後可以分離出螢光細胞，擴增並進一步經FACS、有限稀釋或其他本領域已知的細胞純化技術將其富集。
磁珠分離這項技術的原理與FACS類似。通過將活化文庫與偶聯抗體的、目的蛋白質特異的磁珠一起溫育來檢測膜結合蛋白質和捕獲的分泌蛋白質。如果蛋白質存在於細胞表面，磁珠會與該細胞結合。利用一個磁體，可以將表達目的蛋白質的細胞從文庫中的其他細胞中純化出來。然後將細胞從小珠上釋放、擴增、分析並在需要時進一步純化。
RT-PCR收集少量細胞(至少等於集合中各克隆的數目)並裂解以便純化RNA。分離後，用逆轉錄酶將RNA進行逆轉錄。然後用目的基因的cDNA的特異性引物進行PCR。
可供選擇的是，可以使用跨越活化構建體中的合成外顯子和內源基因的外顯子的引物。該引物不會與內源表達的目的基因雜交，也不使其擴增。反之，如果活化構建體整合到目的基因的上遊，並活化了基因表達，則該引物與所述基因的第二個特異引物一起，依靠剪接到內源基因的外顯子上的合成外顯子的存在而使被活化基因發生擴增。因此，可以用這個方法來檢測那些通常情況下目的基因的表達低於預期水平的細胞內的活化基因。
表型分組在這個實施方案中，可以根據活化基因賦予的表型來挑選細胞。可以選擇的表型的例子包括增殖、生長因子獨立型生長、集落形成、細胞分化(例如分化成神經細胞、肌細胞、上皮細胞等)、不依賴於貼壁的生長、對細胞因子的活化作用(例如，激酶，轉錄因子，核酸酶等)、獲得或喪失細胞-細胞粘著性、遷移和細胞活化(例如，休眠或活化的T細胞)。分離顯示一種表型(比如上面描述的)的活化細胞非常重要，因為預計是由整合構建體使內源基因活化導致了所觀察到的細胞表型。因此，活化基因可能是重要的治療藥物或者是治療或誘導所觀察到的表型的藥物靶。
可以通過瞬時上調文庫細胞中的基因表達來有效地提高上述每一檢測方法的靈敏度。對於含有NF-kB位點的啟動子(在活化構建體上)，通過向文庫中加入PMA和腫瘤壞死因子-α可以做到這一點。單獨加入丁酸鈉或者它與PMA和腫瘤壞死因子-α一起可以進一步增強基因表達。加入這些試劑可以提高目的基因的表達，從而可以利用較低靈敏度的檢測方法來鑑定目的基因已活化的細胞。
由於建立了巨大的活化文庫以便儘可能多地活化許多基因，將文庫克隆組織為集合是有益的。每個集合可以含有1到100000個以上單個克隆。因此，在給定集合中，通常產生稀釋濃度的許多活化蛋白質(原因在於集合的整個尺寸和該集合內產生給定活化蛋白質的有限數目的細胞)。因此，篩選前將蛋白質濃縮能有效地提高在篩選方法中檢測活化蛋白質的能力。一個特別有用的濃縮方法是超濾；但是，也可以用其他方法。例如，在結合所存在的多數或全部蛋白質的條件下，通過吸附到離子交換、疏水、染料、羥基磷灰石、凝集素以及其他合適的樹脂上來非特異或半特異地濃縮蛋白質。這樣在篩選前可以將結合蛋白質以小體積移走。有益的做法是使細胞在無血清培養基中生長以便協助蛋白質的濃縮。
在另一個實施方案中，活化構建體上可以包括的有用序列是表位標記。所述表位標記可以包含一個能親合純化(例如在免疫親合或螯合基質上)活化蛋白質的胺基酸序列。因此，通過在活化構建體上包括表位標記可以純化活化文庫中所有的活化蛋白質。通過將活化蛋白質從其他細胞和培養基蛋白質中純化出來，可以協助篩選新的蛋白質和酶活性。在某些情況中，可能會希望在將活化蛋白質提純後除去表位標記。通過在活化構建體上的表位標記下遊包括一個蛋白酶識別序列(例如，因子IIa或腸激酶切割位點)可以達到該目的。將純化的活化蛋白與合適的蛋白酶一起溫育可以從蛋白質上釋放出表位標記。
在那些表位標記位於活化構建體上的文庫中，可以利用親合純化將所有活化蛋白質從所有其他細胞和培養基蛋白質中純化出來。這不僅使活化蛋白質得到濃縮，還使其從可能干擾用於篩選文庫的檢測方法的其它活性中純化出來。
一旦鑑定到含有過表達目的基因的細胞的克隆集合，可以採取措施來分離活化細胞。利用許多本領域已知的方法可以實現活化細胞的分離。細胞純化方法的例子包括有限稀釋、螢光活化細胞分選、磁珠分離、同胞選擇和利用克隆環進行的單克隆純化。
在本發明的優選實施方案中，所述方法包括一個純化表達產物的步驟。在極其優選的實施方案中，培養表達內源基因產物的細胞以便產生工業應用上，特別是在診斷和治療以及藥物開發用途上可行用量的基因產物。
任何用於本文所述方法中的載體可以包括一個可擴增標記。這樣，可以在細胞內使載體和目的DNA(即含有過表達的基因)得到擴增，並進一步增強內源基因的表達。與此相應，所述方法可以包括一個擴增內源基因的步驟。
一旦已經分離了活化細胞，可以通過使含有目的基因和活化構建體的基因座擴增來進一步提高表達。通過以下描述的各種方法，單獨或組合使用可以做到這一點。
可擴增標記是能挑選到更高拷貝數的基因。可擴增標記的例子包括二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶、二氫乳清酸酶以及氨甲醯磷酸合成酶。對於這些例子，可以選擇拷貝數增加的可擴增標記和旁側序列(包括目的基因)用作由可擴增標記起作用的藥物或毒性代謝物。總之，隨著藥物或毒性代謝物濃度升高，含有較少拷貝可擴增標記的細胞死亡，而含有拷貝增加的標記的細胞存活並形成集落。可以將這些集落分離、擴增並分析目的基因產物的增加水平。
在活化構建體上插入一個可擴增標記將導致活化細胞中的目的基因與可擴增標記並列。在存在增加量選擇劑(通常是藥物或代謝物)的情況下培養細胞，就可以挑選出含有拷貝數增加的可擴增標記和目的基因的活化細胞。例如，可以用氨甲喋呤來選擇二氫葉酸還原酶(DHFR)的擴增。
當在每個升高藥物濃度下得到抗藥集落時，可以挑選出單個集落並鑑定可擴增標記和目的基因的拷貝數，並分析目的基因的表達。可以挑選出活化基因表達水平最高的單個克隆用於在更高藥物濃度下的進一步擴增。在最高藥物濃度下，克隆會表達量已經大大增加的目的蛋白質。
擴增DHFR時，可以方便地在幾個不同濃度的氨甲喋呤處鋪上大約1×107細胞。有用的氨甲喋呤的起始濃度在大約5到100nM之間。但是必須針對每個細胞系和整合位點根據經驗確定氨甲喋呤的最佳濃度。在含有氨甲喋呤的培養基中生長之後，從最高濃度氨甲喋呤中挑出集落並分析目的基因表達的提高。然後將具有最高濃度氨甲喋呤的克隆生長在更高濃度的氨甲喋呤中以便挑選出進一步擴增的DHFR和目的基因。對於含有最高程度基因擴增的克隆可以使用微摩和毫摩範圍的氨甲喋呤濃度。
在活化構建體上插入一個病毒複製起點(例如，人細胞中的ori P或SV40以及小鼠細胞中的多瘤ori)將導致在活化細胞中目的基因與病毒複製起點並列。通過以反式導入病毒複製蛋白可以使起點和旁側序列擴增。例如，使用ori P(Epstein-Barr病毒的複製起點)時，可以瞬時或穩定表達EBNA-I。EBNA-I能起始從整合的ori P基因座開始複製。所述複製可以從起點雙向延伸。當產生各個複製產物時，它又能起始複製。結果，可以得到許多拷貝病毒起點和包括目的基因的旁側基因組序列。該更高的拷貝數使細胞能產生更大量的目的基因。
在某個頻率處，複製產物會重新結合形成含有旁側基因組序列(包括目的基因)的環形分子。通過單細胞克隆以及Hirt提取和Southern印跡分析可以分離出含有攜帶目的基因的環形分子的細胞。一旦得到純化，可以將含有拷貝數增加(通常10-50拷貝)的附加體基因組座位的細胞在培養基中增殖。為了獲得更高的擴增，可以通過在原始構建體中的第一個起點鄰近出包括一個第二起點來進一步增加附加體。例如，可以用T抗原來使ori P/SV40附加體拷貝數增加到約1000(Heinzel等，病毒雜誌623738(1988))。這種拷貝數的顯著增加能明顯地提高蛋白質的表達。
本發明包括體外和體內過表達內源基因。因此，可以在體外用細胞以產生預期量的基因產物或者可以在體內用細胞以在完整動物提供基因產物。
本發明還包括由本文所述方法產生的蛋白質。這些蛋白質得自已知或未知基因。可以用所述方法製備的已知蛋白質的例子包括，但不限於，紅細胞生成素、胰島素、生長激素、葡糖腦苷脂酶，組織纖溶酶原活化物、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ，白介素-2、白介素-6、白介素-11、白介素-12、TGF-β，凝血因子V，凝血因子-VII、凝血因子-VIII、凝血因子-IX、凝血因子-X、TSH-β、骨生長因子-2、骨生長因子-7，腫瘤壞死因子、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III，白血病抑制因子、胰高血糖素、蛋白C、蛋白激酶C、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子、促卵泡激素β、尿激酶、神經生長因子、胰島素樣生長因子、促胰島素、甲狀旁腺激素、乳鐵蛋白、補體抑制因子、血小板衍生生長因子，角質細胞生長因子、神經營養蛋白-3、血小板生成素、絨膜促性腺激素、血栓調節蛋白、α糖苷、表皮生長因子、FGF、巨噬細胞集落刺激因子以及上述每種蛋白質的細胞表面受體。
從活化細胞中純化蛋白質產物時，可以採用任何本領域已知的蛋白質純化方法。
分離含有活化的膜蛋白編碼基因的細胞從藥物開發的觀點來看，那些編碼膜相關蛋白質的基因特別令人感興趣。可以用這些基因和它們編碼的蛋白質利用組合化學庫和高產量篩選方法來，例如，開發小分子藥物。另一方面，可以用這些蛋白質或蛋白質的可溶形式(例如缺少跨膜區的截短的蛋白質)作為人或動物的治療活性劑。還可以使用膜蛋白的鑑定利用雙元雜交法或親合捕集技術來鑑定新配體(例如，細胞因子、生長因子以及其他效應分子)。膜蛋白還可能有許多其他應用。
目前鑑定編碼完整膜蛋白的基因的手段包括從cDNA文庫中分離所述基因並將其測序。然後利用能鑑定蛋白質的跨膜區的疏水性曲線通過ORF分析來鑑定完整膜蛋白質。不幸的是，用這個方法不能鑑定編碼完整膜蛋白的基因，除非該基因能在用於製備cDNA文庫的細胞中表達。另外，許多基因只在很少的細胞中，在很短的發育時期內，和/或以極低水平表達。因此，不能用現有的方法來有效地鑑定這些基因。
利用本發明能在不知道基因的序列、結構、功能或表達方式的情況下活化內源基因。利用本發明公開的方法，可以只在轉錄水平下活化基因，或者在轉錄和翻譯水平下活化基因。因此，可以在含有已整合載體的細胞中製備由活化內源基因編碼的蛋白質。此外，利用本文公開的特異載體，可以將由活化內源基因產生的蛋白質進行修飾以便如包括一個表位標記。其他載體(例如，上面描述的載體12-17)可以編碼一個跟有表位標記的信號肽。可以用該載體來分離那些已經活化完整膜蛋白質表達的細胞(見以下實施例5)。還可以用該載體引導通常不分泌的蛋白質的分泌。
因此，本發明還涉及鑑定編碼細胞完整膜蛋白質或跨膜蛋白質的內源基因的方法。本發明的這些方法可以包括一或多個步驟。例如，本發明的一個這種方法可包括(a)將本發明的一個或多個載體導入細胞中；(b)使載體通過非同源重組整合到細胞基因組中；(c)由整合載體構建體上所含的轉錄調控序列上調細胞中的內源基因，使其過表達；(d)篩選過表達內源基因的細胞；以及(e)鑑定活化基因以便確定它作為編碼細胞完整膜蛋白質的基因的同一性。在相關實施方案中，本發明提供的這類方法還包括在鑑定活化基因之前從細胞中分離活化基因。
為了鑑定編碼完整膜蛋白質的基因，整合到細胞基因組的載體應包含一個與外顯子序列連接在一起的調控序列，所述外顯子序列含有起始密碼子、信號序列和表位標記，隨後是未配對的剪接供體位點。當內源基因發生整合和活化時，產生含有來自載體的信號肽和表位標記的嵌合蛋白質，所述載體與由內源基因的下遊外顯子編碼的蛋白質融合在一起。該嵌合蛋白質，通過載體編碼的信號肽的存在，被引導到分泌途徑，在此完成蛋白質的翻譯並分泌蛋白。但是，如果活化內源基因編碼完整膜蛋白質，並且該基因的跨膜區由位於載體整合位點3』處的外顯子編碼，則該嵌合蛋白質會到達細胞表面，表位標記將會在細胞表面顯示出來。利用已知的細胞分離方法(例如流式細胞計分選、磁珠細胞分選、免疫吸附或其他本領域技術人員熟悉的方法)，可用該表位標記的抗體從細胞群中分離出顯示錶位標記且已活化完整膜蛋白質編碼的基因的細胞。然後用這些細胞來研究膜蛋白質的功能。另一方面，用本領域已知的任何方法來從這些細胞中分離出活化基因，例如通過與載體編碼的外顯子具有特異性的DNA探針進行雜交來對篩選由這些細胞製備到的cDNA文庫，或者利用本文描述的基因構建體。
由載體外顯子編碼的表位標記可以是一個能結合到抗體上的短肽、一個能結合到底物(例如多組氨酸/二價金屬離子載體、麥芽糖結合蛋白/麥芽糖載體、穀胱苷肽S-轉移酶/穀胱苷肽載體)上的短肽或者一個來自其上存在抗體或配體的完整膜蛋白質的胞外區(缺少跨膜區)。但是，應當理解，可以根據本發明等效地使用本領域技術人員熟悉的其他類型的表位標記。
非-靶向活化內源基因的載體如上所述，非-靶向基因活化具有很多重要的用途，包括活化宿主細胞中的內源基因，籍此提供很有效的方法，用於發現和分離新基因和蛋白質，並產生大量特定的商業化蛋白質。對於非-靶向基因活化的一些應用而言，需要產生細胞文庫，其中文庫的每個成員含有整合至宿主細胞基因組中唯一位置的活化載體，而且，文庫的每個成員活化了不同的內源基因。另外，需要從文庫中除去含有整合載體，但不能活化內源基因的細胞。由於真核基因組經常含有缺少基因的大區域，因此，活化載體經常會整合至缺少基因的區域。然而，這些整合載體不能活化內源基因，當活化載體中包括選擇標記(由適當啟動子驅動，後面接著聚腺苷酸化信號)時，卻仍能賦予宿主細胞以藥物抗性。對發現基因而言甚至更成問題，不管基因是否已被活化，這些細胞中都產生了含有載體序列的轉錄物。在基因未被活化的情況下，這些含有載體序列的轉錄物含有非-基因的基因組DNA序列。結果，當分離已活化的基因時，無法分離到得自整合載體的所有RNA(或cDNA)分子(即含有載體序列的轉錄物)，因為這些轉錄物中很多不編碼內源基因。為了克服這些困難，本發明提供了高度特異性的載體和便於分離載體-活化的基因的方法。
本發明的這些載體可用於活化內源基因的表達，和分離對應於活化基因的mRNA和cDNA。一個這種載體降低了細胞數目，所述中載體整合至基因組中，但不能活化內源基因的表達(或轉錄)。通過除去這些細胞，可產生較少的文庫成員，通過對它們的篩選可以分離給定數目的活化基因。另外，不能活化基因表達的含載體的細胞產生了RNA分子，該分子能干擾真正的活化基因的分離。因此，本文所公開的載體可特別地用於產生適於蛋白質過表達的細胞和/或分離對應於活化基因的cDNA分子。本發明第二種類型的載體可用於從活化的內源基因中分離外顯子I。結果，可使用這些載體從活化的RNA轉錄物中得到全長基因。本文所述的每種功能性載體組分可以分開使用，或者互相組合使用。
Poly(A)陷阱活化載體為了便於分離已活化的基因，本發明提供了新的基因活化載體，該載體能優先通過活化內源基因產生耐藥集落。所述載體在本文中被稱為「poly(A)陷阱載體」。圖8A-8F中示出了poly(A)陷阱載體的例子。圖15A-15B示出了一個被稱為pRIG21b的二元poly(A)陷阱載體的核苷酸序列(SEQ IDNO19)。這些載體含有轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為如CMV立即早期基因啟動子，SV40 T抗原啟動子，四環素誘導型啟動子或β-肌動蛋白啟動子等啟動子)，所述調控序列與缺少poly(A)信號的選擇標記基因可操作相連。由於選擇標記基因缺少聚腺苷酸化信號，其信息將不穩定，不能有效產生標記基因產物。然而，如果活化載體整合至內源基因的上遊，選擇標記可利用內源基因的聚腺苷酸化信號，從而產生足夠量的選擇標記蛋白質以賦予藥物抗性。因此，僅當內源基因被活化時，整合了該活化載體的細胞一般才形成耐藥集落。
poly(A)陷阱活化載體可包括任何選擇或篩選標記。另外，選擇標記可由任何啟動子表達，只要所述啟動子在用於產生整合文庫的細胞中可以起作用即可。因此，選擇標記可由病毒或非-病毒啟動子表達。任選地，未配對的剪接供體位點可包括在構建體中，優選包括在選擇標記的3』方向，以使編碼選擇標記的外顯子直接被剪接至內源基因外顯子的旁邊。當載體上包括下遊轉錄調控序列和剪接供體位點時，在選擇標記附近包括剪接供體位點導致從信使RNA中除去這些下遊元件。
在相關的實施方案中，第二個轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為啟動子)可位於選擇標記下遊，並與選擇標記方向相同。任選未配對的剪接供體位點可與下遊的轉錄調控序列相連接。在此構型中，poly(A)陷阱載體能產生含有由載體-編碼的下遊外顯子的信息，所述外顯子被剪接至內源外顯子的旁邊。如下文所述，根據由載體-編碼的外顯子的特性，這些嵌合轉錄物可被翻譯成天然或經修飾的蛋白質。
本文所用術語「由載體-編碼的外顯子」指載體中位於轉錄調控序列下遊，轉錄起始位點和未配對的剪接供體位點之間的區域。由載體-編碼的外顯子存在於轉錄物的5』末端，所述轉錄物含有全加工信息的內源基因。類似地，本文所用術語「由載體-編碼的內含子」是位於未配對的剪接供體位點下遊的載體區域。當載體上存在線性化位點時，由載體-編碼的內含子是位於由載體-編碼的外顯子下遊，於未配對的剪接供體位點和線性化位點之間的載體區域。在RNA加工過程中，從活化的基因轉錄物中除去由載體-編碼的內含子。
剪接受體陷阱(SAT)載體作為另一種除去不能活化內源基因的細胞的方法，本發明提供了另一類載體，本文稱之為「剪接受體陷阱」(SAT)載體。這些載體被設計成從載體編碼的剪接供體位點剪接至內源剪接受體位點。另外，經設計，載體在未發生剪接的情況下可產生對宿主細胞有毒的產物(或能選擇性針對宿主細胞的產物)。因此，這些載體便於消除其中由載體-編碼的外顯子不能剪接至內源外顯子旁邊的細胞。
剪接受體陷阱載體可含有正選擇標記和負選擇標記基因，它們在載體上的取向相同。本文所用正選擇標記是這樣一類基因，通過其表達，可產生便於分離表達該標記的細胞的蛋白質。類似地，本文所用負選擇標記是另外一類基因，通過其表達，可產生便於除去表達該標記的細胞的蛋白質。
在載體構建體中，優選用未配對的剪接供體位點將正選擇標記和負選擇標記隔開。然而，在其它實施方案中，正選擇標記可與負選擇標記基因融合。在此構型中，未配對的剪接供體位點位於正和負選擇標記之間，以保留負選擇標記的閱讀框。未配對的剪接供體位點優選位於正和負選擇標記的連接處。然而，未配對的剪接供體位點可位於融合基因的任何位置，致使通過剪接至內源剪接受體位點，正選擇標記以活性形式被表達，負選擇標記以無活性的形式被表達，或根本不表達。在此構型中，正選擇標記位於負選擇標記的上遊。
本領域技術人員參照本文所包括的描述可以清楚地知道SAT載體上的正和負選擇標記不必表達成融合蛋白。在一個實施方案中，在正選擇標記和負選擇標記之間插入了內部核糖體進入位點(ires)。在此構型中，未配對的剪接供體位點可位於兩個標記之間，或者位於任一標記基因的開放閱讀框中，使得通過剪接，正選擇標記以活性形式被表達，負選擇標記以無活性的形式被表達，或根本不表達。在另一個實施方案中，驅動正選擇標記和負選擇標記的轉錄調控序列不同。在此構型中，未配對的剪接供體位點位於負選擇標記的5』非翻譯區域，或者位於負選擇標記的開放閱讀框中的任何位置，使得通過剪接，負選擇標記以無活性的形式產生，或根本不產生。另外，當正和負標記由不同的轉錄調控序列驅動時，正選擇標記可位於負選擇標記的上遊或下遊，正選擇標記在其3』末端可含有或缺少剪接供體位點。
本文所述的載體可含有任何正選擇標記。可用於本發明的正選擇標記的例子包括編碼下列物質的基因新黴素(neo)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)、嘌呤黴素(pac)、二氫乳清酸酶，穀氨醯胺合成酶(GS)、組氨酸D(hisD)、氨甲醯磷酸合成酶(CAD)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、多抗藥性1(mdr1)、天冬氨酸轉氨甲醯酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)和腺苷脫氨酶(ada)。或者，載體可以含有一個篩選標記，代替正選擇標記。篩選標記包括任何能在宿主細胞中產生可識別表型的蛋白質。篩選標記的例子包括細胞表面表位(如CD2)和酶(如β-半乳糖苷酶)。
本文所述的載體也可以含有，或任選含有任何可被選擇去掉的負選擇標記。負選擇標記的例子包括次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)，胸苷激酶(TK)和白喉毒素。負選擇標記也可以是篩選標記，例如細胞表面蛋白或酶。通過例如螢光激活細胞分選(FACS)或磁珠細胞分選可除去表達負選擇標記的細胞。
為了分離已活化內源基因表達的細胞，可將含有整合載體的細胞置於適當藥物選擇之下。可同時保留選擇正選擇標記和去掉負選擇標記。在另一實施方案中，可依次選擇。當依次選擇時，首先選擇保留正選擇標記，再去掉負選擇標記。或者，首先去掉負選擇標記，再選擇保留正選擇標記。
通過位於每個基因的翻譯起始位點上遊的轉錄調控元件可表達正和負標記。當使用正/負標記融合基因或ires序列時，單個轉錄調控元件驅動這兩種標記的表達。可將poly(A)信號置於每個選擇標記的3』方向。如果使用正/負融合基因，可將單個poly(A)信號置於標記的3』方向。或者，可從載體上去除poly(A)信號，以使基因活化事件具有額外的特異性(見下文的二元poly(A)/剪接受體陷阱載體)。
二元poly(A)/剪接受體陷阱載體為了進一步降低缺乏基因活化事件的細胞的數目，本發明還提供了這樣一種載體，其中僅當載體-編碼的外顯子被剪接至內源基因外顯子的旁邊，並獲得poly(A)信號時，載體才能賦予宿主細胞存活力。本文將這些載體稱為「二元poly(A)/剪接受體陷阱載體」或「二元poly(A)/SAT載體」。通過獲得細胞存活所需的剪接和聚腺苷酸化，可從活化文庫中更有效地去除不能活化內源基因的細胞。
二元poly(A)/剪接受體陷阱載體含有正選擇標記和負選擇標記，它們的構型與SAT載體中的相同；然而，這兩個基因都不含功能性的poly(A)信號。因此，正選擇標記只有通過剪接捕獲到內源性的poly(A)信號才能以高水平表達。除了缺少poly(A)信號外，此類載體的所有其它特徵和方案都與本文所述的SAT載體相同。圖9A-9F和10A-10F顯示出二元poly(A)/SAT載體的例子。圖16A-16B顯示出一個被稱為pRIG22b的此類二元poly(A)/SAT載體的核苷酸序列(SEQ ID NO20)。
活化內源基因蛋白質表達的載體在很多非-靶向基因活化的例子中，需要由活化的內源基因產生蛋白質。為了達到此目的，可將第二種轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為啟動子)置於本文所述任何載體的選擇標記下遊。當使用poly(A)陷阱載體，SAT載體，或二元poly(A)陷阱/SAT載體時，下遊轉錄調控序列所處的位置應使其能在與上遊選擇標記相同的方向上驅動表達。然而，為了用這種類型的載體活化全長蛋白質的表達，必須將載體整合至內源基因的5』UTR中以避免在外顯子I的上遊出現隱蔽的ATG起始密碼子。
或者，為了使用非-靶向基因活化來增加蛋白表達的頻率，可使載體上的下遊轉錄調控序列與後面緊接剪接供體位點的外顯子序列可操作相連。在優選實施方案中，載體外顯子缺少起始密碼子。該載體對活化不編碼外顯子I中翻譯起始密碼子的基因的蛋白質表達特別有用。在另一個優選實施方案中，載體外顯子含有起始密碼子。其它密碼子可位於翻譯起始密碼子和剪接供體位點之間。例如，載體外顯子上可編碼信號分泌序列的一部分。信號序列的一部分可以是能與內源基因的部分信號序列互補以產生功能性信號序列的任何胺基酸序列。該部分序列可編碼1至100個胺基酸，可得自現存的基因，或由新序列組成。因此，該載體可用於由外顯子I中編碼內源性信號序列的一部分和在後續外顯子中編碼其餘部分的基因產生和分泌蛋白質。在另一例用於活化特定類型的內源基因的載體中，載體外顯子上可編碼功能性信號序列。該載體使外顯子I中編碼信號序列的基因能產生和分泌蛋白質。也可以使用該載體產生一般不能被分泌的蛋白質的分泌形式。
當載體外顯子上包括起始密碼子時，有利於在每個閱讀框中產生載體。通過改變起始密碼子和剪接供體連接位點之間的核苷酸數目即可達到此目的。總之，優選的載體構型能由內源基因產生蛋白質，而不用管外顯子/內含子結構，翻譯起始密碼子的位置或閱讀框如何。
從活化的內源基因中分離外顯子I所用的載體上文所述的非-靶向基因活化載體可用於活化和分離內源基因，並由內源基因產生蛋白質。然而，通過整合至內源基因的上遊，這些載體中的每一個都產生了缺少內源基因的外顯子I的轉錄物。由於載體被設計成可產生轉錄物，所述轉錄物含有由載體編碼的外顯子，該外顯子被剪接至載體整合位點下遊的第一個剪接受體位點旁邊，又因為真核基因的第一個外顯子不含剪接受體位點，通常，在得自非-靶向基因活化的mRNA分子上無法回收內源基因的第一個外顯子。對於一些基因，例如在第一個外顯子中含有編碼信息的基因來說，需要有效回收經活化的內源基因的第一個外顯子。
為了回收經活化的內源基因的第一個外顯子，可在活化載體上包括轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為啟動子)，將其置於第二個轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為啟動子)的下遊，所述第二個轉錄調控序列驅動由載體編碼的外顯子的表達。因此，上遊轉錄調控序列與未配對的剪接供體位點連接，而下遊轉錄調控序列不與剪接供體位點相連接。這兩個轉錄調控序列的取向使得它們能在相同的方向上驅動表達。圖12A-12G顯示了這種外顯子I回收載體的例子。這種類型的載體的整合會產生至少兩種不同類型的RNA轉錄物(圖13)。第一種轉錄物得自上遊轉錄調控序列，並含有剪接至內源基因外顯子II旁邊的載體外顯子。第二種轉錄物得自下遊轉錄調控序列，並且，沿5』至3』方向含有位於載體和基因轉錄起始位點之間的區域，外顯子I，外顯子II和所有下遊外顯子。使用本文所述的方法，可回收和分析這兩種轉錄物，從而鑑定出基因中通過非-靶向基因活化分離得到的外顯子I。
位於活化載體上的外顯子可編碼選擇標記，蛋白質，蛋白質的一部分，分泌信號序列，信號序列的一部分，表位，或不編碼任何物質。當蛋白質由外顯子編碼時，可將poly(A)信號包括在由載體-編碼的基因的下遊。或者，可省略poly(A)信號。在另一個實施方案中，正和負選擇標記可與上遊轉錄調控序列可操作相連。在此實施方案中，未配對剪接供體位點相對於選擇標記的位置與上文對SAT載體和二元poly(A)/SAT載體所述的相同。
單外顯子和多外顯子基因捕獲所用的基因活化載體如上所述，在一個實施方案中，本發明的poly(A)陷阱載體可含有與選擇標記可操作相連的啟動子，所述選擇標記之後緊接著未配對的剪接供體位點。當所述載體整合至基因中，或整合於基因附近時，會產生含有選擇標記的轉錄物，所述選擇標記被剪接至內源基因上。由於內源基因編碼poly(A)信號，所得mRNA被聚腺苷酸化，從而使轉錄物的翻譯水平足以使含有整合載體的細胞具有藥物抗性。
儘管上文所述的載體能「捕獲」內源基因，但在該載體的幾種潛在應用中，不能使用位於選擇標記下遊的剪接供體位點，而且，在一些情況下，所述剪接供體位點可幹擾這些應用。首先，不能使用這些載體選擇性地捕獲單外顯子基因，因為這些基因不含剪接受體位點。第二，由於藥物抗性僅依賴於poly(A)信號上遊的載體整合，因此這些載體經常「捕獲」隱蔽基因。不幸的是，基因組中存在隱蔽的poly(A)信號，導致形成耐藥細胞，並產生含有選擇標記的非-基因轉錄物。這些細胞和轉錄物可幹擾使用這些載體來尋找基因的應用。第三，未經過本文所述(見上文)的那些新修飾，這些載體不能有效地由活化的內源基因產生蛋白質。另外，甚至當在選擇標記和剪接供體位點之間包括內部核糖體進入位點(ires)時，內源基因的蛋白質表達水平也很低，這是因為相對於從ires開始翻譯而言，從轉錄物5』末端的第一個起始密碼子開始翻譯通常更加有效。因此，需要能更加特異性地捕獲內源基因，包括單外顯子基因，並能由活化的內源基因有效表達蛋白質的載體。
因此，在其它實施方案中，本發明提供了這種載體。在一個這種實施方案中，載體可含有與一個或多個(即1，2，3，4，5或多個)選擇標記可操作相連的啟動子，其中選擇標記之後未接剪接供體位點或poly(A)信號(見圖17A-17G)。一般說來，由於選擇標記不能被聚腺苷酸化，通過整合至宿主細胞基因組，該載體不能產生足夠量的選擇標記。然而，如果載體整合至包括單外顯子基因在內的基因附近，或整合至所述基因中，選擇標記將獲得來自內源基因的poly(A)信號，從而穩定化標記轉錄物，並賦予細胞藥物抗性表型。除了選擇基因內部或附近的載體整合外，也可以按照本申請中題為「從活化的內源基因中分離外顯子I所用的載體」一節中所述，使用根據本發明此方面的載體回收活化基因的外顯子I。
在優選實施方案中，載體可在第一個選擇標記上遊含有第二個選擇標記(見圖18)。上遊選擇標記優選與轉錄調控序列，最優選與啟動子可操作相連。任選地，未配對的剪接供體位點可位於上遊選擇標記的轉錄起始位點和翻譯起始位點之間。或者，剪接供體位點可位於上遊選擇標記開放閱讀框中的任何位置，使得當載體整合至宿主細胞基因組之後，通過從由載體編碼的剪接供體位點剪接至內源外顯子，以無活性的形式產生，或根本不產生上遊選擇標記。通過選擇產生活性形式的下遊正選擇標記的細胞，可以分離出含有整合至基因中，或整合至基因附近的載體的細胞。另外，通過對產生無活性形式的上遊選擇標記的細胞進行選擇，可除去其中載體轉錄物已被剪接至多-外顯子內源基因的外顯子旁邊的細胞。換句話說，可使用這些載體分離細胞，所述細胞含有整合至單外顯子基因或多外顯子基因最靠3』端的外顯子的載體，因為在這些情況下，由載體編碼的剪接供體位點和內源性poly(A)信號之間缺少剪接受體位點。因此，大多數含有活化的多-外顯子基因的細胞不會在選擇中存活，結果，含有活化的單外顯子基因的細胞將在文庫中大量富集。
在另一個優選實施方案中，根據本發明此方面的載體可在第一個選擇標記的上遊含有一個或多個(即1，2，3，4，5或多個，優選為1個)負選擇標記(見圖19A和19B)。負選擇標記優選與啟動子可操作相連。任選地，未配對的剪接供體位點可位於負選擇標記的轉錄起始位點和翻譯起始位點之間。或者，剪接供體位點可位於負選擇標記開放閱讀框中的任何位置，使得當載體整合至宿主細胞基因組之後，通過從由載體編碼的剪接供體位點剪接至內源外顯子，以無活性的形式產生，或根本不產生負選擇標記。通過選擇產生活性形式的正選擇標記的細胞，並對產生活性形式的負選擇標記的細胞進行選擇，可使用這些載體鑑定出含有整合至內源基因中，或整合至內源基困上遊的載體的細胞。由於(1)剪接至內源外顯子旁邊和(2)獲得poly(A)信號都是細胞存活所必需的，因此，在文庫內，含有隱蔽的基因捕獲事件的細胞有所減少。其原因是載體整合至隱蔽的剪接受體位點和隱蔽的poly(A)信號這兩者旁邊的可能性實質上低於載體整合至單個隱蔽位點旁邊的可能性。因此，與以前的載體相比，這些載體捕獲基因的特異性程度較高。
本領域技術人員參照本文所述的教導可以知道可使用含有正和負選擇標記的載體由活化的內源基因產生蛋白質。一個能介導蛋白質產生的載體構型由位於負選擇標記5』UTR中的剪接供體位點組成。通過剪接，產生了嵌合轉錄物，其含有與內源基因的第二個外顯子相連接的負選擇標記5』UTR。該載體能活化基因的蛋白質產生，所述基因編碼第二個或隨後的外顯子中的翻譯起始密碼子。類似地，可將剪接供體位點置於負選擇標記開放閱讀框中，放置在除非發生剪接，否則不會干擾標記功能的位置。也可以使用類似的載體，所述載體含有剪接供體位點，所述位點所處的閱讀框與翻譯起始密碼子所處的閱讀框不同。通過剪接至內源基因旁邊，這些載體可產生嵌合轉錄物，其含有與活化內源基因的外顯子II融合的得自負選擇標記的起始密碼子。因此，這些載體能活化編碼外顯子I中的翻譯起始密碼子的基因的蛋白質表達。下文描述了能由活化的內源基因有效產生蛋白質的其它正/負選擇載體設計。
本發明的任何載體可在下遊選擇標記的3』方向含有內部核糖體進入位點(ires)。Ires使得通過載體整合至內源基因即可翻譯內源基因。任選地，可在選擇標記和ires序列之間包括翻譯起始密碼子。當存在起始密碼子時，外顯子上可存在其它密碼子。起始密碼子(和如果存在其它密碼子的話)可存在於相對於剪接供體位點而言的任何，和總共所有的閱讀框內。另外，翻譯起始密碼子下遊的密碼子如果存在的話，可編碼例如信號分泌序列，部分信號序列，蛋白質(包括全長蛋白質，蛋白質的一部分，蛋白質基元，表位標記等)，或間隔區域。
在其它優選實施方案中，本文所述的任何載體可在選擇標記上遊含有與外顯子區域可操作相連的第二個轉錄調控序列(最優選為啟動子)，後面緊接未配對的剪接供體位點。該上遊外顯子對於由活化的內源基因表達蛋白質特別有用。外顯子可缺少翻譯起始密碼子。或者，外顯子可含有翻譯起始密碼子。當存在起始密碼子時，外顯子上可存在其它密碼子。起始密碼子(和如果存在其它密碼子的話)可存在於相對於剪接供體位點而言的任何，和總共所有的閱讀框內。另外，翻譯起始密碼子下遊的密碼子如果存在的話，可編碼例如信號分泌序列，部分信號序列，蛋白質(包括全長蛋白質，蛋白質的一部分，蛋白質基元，表位標記等)，或間隔區域。
用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用的活化載體檢測蛋白質-蛋白質相互作用所用的遺傳方法已被描述過(例見美國專利號5,283,173；5,468,614和5,667,973，它們的內容皆全部列入本文作為參考)。此類方法依賴於克隆編碼DNA結合結構域的基因片斷附近和框內的第一個cDNA分子，和克隆編碼轉錄活化結構域的基因片斷附近和框內的第二個cDNA分子。由位於嵌合基因上遊的啟動子區域表達每個嵌合基因。為了檢測表達，將這兩個嵌合基因轉染至報導細胞中。如果第一個嵌合蛋白質與第二個嵌合蛋白質(經由與DNA結合和轉錄活化結構域融合的克隆cDNA所編碼的蛋白質)發生相互作用，DNA結合結構域和轉錄活化結構域會在單個蛋白質複合物內相互連接。結果，蛋白質-蛋白質相互作用複合物可結合報導基因的調控區域並活化其表達。
已知方法的局限性體現在它僅能檢測已被克隆為cDNA的基因之間的蛋白質-蛋白質相互作用。如本文所述，很多基因以很低的水平，在罕見的細胞類型中，或在短暫的發育階段被表達；因此，這些基因一般會從cDNA文庫中丟失。另外，很多基因太大，以致於不能作為全長克隆被有效分離，從而難以使用以前的這些方法。
本發明能活化內源基因或轉染的基因組DNA的蛋白質表達。與以前的方法不同的是，事實上不論其正常表達模式如何，任何基因都可被有效表達。另外，由於本發明也能修飾由內源基因(或轉染的基因組DNA)表達的蛋白質，因此可以產生嵌合蛋白質以用於蛋白質-蛋白質相互作用分析。
為了通過本發明檢測蛋白質-蛋白質相互作用，使用了兩種載體。第一種載體一般被稱為BD/SD(結合結構域/剪接供體)，其含有與編碼DNA結合結構域的多核苷酸可操作相連的啟動子和未配對的剪接供體位點。第二種載體一般被稱為AD/SD(活化結構域/剪接供體)，其含有與編碼轉錄活化結構域的多核苷酸可操作相連的啟動子和未配對的剪接供體位點。為了給具有不同閱讀框的基因提供空間，可在相對於未配對的剪接供體位點而言的3個可能的閱讀框中的每一個中編碼結合結構域和活化結構域。另外，與本文所述的其它載體一樣，BD/SD和AD/SD載體可具有其它功能性元件，包括選擇標記和可擴增標記。載體也可含有選擇標記，其在構型中的取向允許選擇出其中的載體已使基因活化的細胞。多-啟動子/活化外顯子載體也是有用的。圖25中顯示出幾個BD/SD和AD/SD載體的例子。圖26中顯示了使用這些載體檢測蛋白質-蛋白質相互作用的例子。
BD/SD載體的DNA結合結構域可編碼任何能結合特定核苷酸序列的蛋白質結構域。當使用轉錄活化蛋白質提供DNA結合結構域時，可從BD/SD載體中省略轉錄活化結構域。編碼具有DNA結合結構域的蛋白質的基因例子包括但不限於酵母GAL4基因，酵母GCN4基因和酵母ADR1基因。也可使用原核和真核來源的其它基因提供DNA結合結構域。
AD/SD載體的轉錄活化結構域當位於報導基因啟動子區域附近時，可編碼能增強報導基因轉錄的蛋白質結構域。當使用轉錄活化蛋白質提供轉錄活化結構域時，可從AD/SD載體上省略DNA結合結構域。編碼具有轉錄活化結構域的蛋白質的基因例子包括但不限於酵母GAL4基因，酵母GCN4基因和酵母ADR1基因。也可使用原核和真核來源的其它基因提供轉錄活化結構域。
在本發明中，可使用上文所述的BD/SD和AD/SD載體檢測蛋白質-蛋白質相互作用，以活化位於基因組DNA序列中的基因的表達。
在一個實施方案中，BD/SD載體隨機整合至報導細胞系的基因組中。與本文所述的其它載體相同，BD/SD載體能活化位於載體整合位點下遊的基因的蛋白質表達。由於BD/SD載體上的活化外顯子編碼DNA結合結構域，活化的內源蛋白質可作為融合蛋白質的形式被產生，所述融合蛋白質的N末端含有DNA結合結構域。因此，通過將BD/SD載體整合至宿主細胞基因組中，可產生融合蛋白質文庫，其中每個蛋白質的N末端都含有DNA結合結構域。
據認為，AD/SD載體可整合至報導細胞系的基因組中以產生細胞文庫，其中文庫的每個成員作為與轉錄活化結構域融合的不同內源基因被表達。
一旦產生，可用表達與轉錄活化結構域融合的特定基因(下文稱之為基因X)的載體轉染BD/SD文庫。事實上，這樣可以檢測基因組中編碼的任何基因與基因X的相互作用。類似地，可用表達與DNA結合結構域融合的特定基因(如基因X)的載體轉染AD/SD文庫。事實上，這樣可以檢測基因組中編碼的任何基因與基因X的相互作用。據認為，在構建BD/SD或AD/SD文庫之前，特定基因可在宿主細胞中穩定表達。
在另一個實施方案中，將基因組DNA分別克隆至BD/SD和/或AD/SD載體中DNA結合結構域和活化結構域的下遊。如果存在基因，而且基因在基因組DNA中的取向正確的話，BD/SD載體(或AD/SD載體)能將基因表達為融合蛋白，所述融合蛋白可用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用。與原位整合BD/SD(或AD/SD)載體相同，可檢測任何基因，而不用管該基因以前是否作為cDNA分子被分離過。
在另一個實施方案中，在第一個文庫的細胞中產生了第二個文庫。例如，可將AD/SD載體整合至含有BD/SD文庫的細胞中。反之，可將BD/SD載體整合至含有AD/SD文庫的細胞中。這樣可以使所有蛋白質被表達成針對所有活化結構域融合蛋白被檢測的結合結構域融合蛋白。由於本發明能在真核生物體中表達基本上所有的蛋白質(表達為與結合和活化結構域的融合蛋白)，該方法第一次能在單個文庫中檢測所有的蛋白質-蛋白質相互作用組合。為了檢查生物體中所有的蛋白質-蛋白質相互作用，文庫中的文庫必須基本上是全面的。例如，為了檢測含有100,000個基因的生物體中約50％的蛋白質-蛋白質相互作用，第一個文庫必須含有至少100,000個各自表達活化基因的細胞。然後，在第一個文庫的每個克隆中，可使用第二種載體產生具有至少100,000個克隆的文庫，所述克隆各自含有活化基因。因此，總文庫含有100,000個克隆x100,000個克隆，或總共1010個克隆。這是假定所有基因以同等的頻率被活化，每個基因活化事件導致在活化的內源基因框內產生融合蛋白。為了產生具有大於50％蛋白質-蛋白質相互作用覆蓋率的文庫，和/或為了確保以較低頻率被活化的蛋白質能表現出來，可產生較大的文庫。
據認為可使用幾種方法產生文庫對文庫的篩選。首先，通過將BD/SD和AD/SD載體整合至相同報導細胞的基因組中，同時或依次產生兩種文庫。第二，通過將BD/SD載體整合至報導細胞基因組中以產生第一個文庫，通過轉染含有克隆的基因組DNA的AD/SD載體以產生第二個文庫。據認為，在此方法中，可首先產生AD/SD文庫，接著導入含有克隆的基因組DNA的BD/SD載體。據認為，也可以通過轉染含有克隆的基因組DNA的BD/SD載體(或AD/SD載體)，接著將第二種載體整合至報導細胞的基因組中，籍此產生第一個文庫。第三，通過用BD/SD和AD/SD載體轉染細胞，同時或依次產生這兩個文庫，其中每個載體含有克隆的基因組DNA片斷。第四，據認為，當在BD/SD載體或AD/SD載體中使用克隆的基因組片斷時，可在其它載體中產生cDNA文庫，並將此文庫導入細胞。這樣就可以檢測cDNA文庫中存在的所有基因與基因組中的所有其它基因之間的相互作用。
由於文庫/文庫篩選涉及產生大的細胞文庫，因此，重要的是使基因活化的頻率和文庫成員中框內融合蛋白的產生最大化。至少有兩種方法可以達到此目的。第一，BD/SD和AD/SD載體可含有選擇標記，其構型可「捕獲」基因。圖8，9，10，17，19，21和25中顯示了選擇陷阱載體的例子。這些載體選擇其中活化載體已轉錄活化了基因的細胞。第二，可在BD/SD和AD/SD載體中包括多啟動子/活化外顯子單位。每個啟動子/活化外顯子單位在相對於未配對的剪接供體位點而言的不同閱讀框內編碼結合結構域(或活化結構域)。圖23中顯示了多-啟動子/外顯子載體的例子。這種類型的載體確保任何在轉錄水平上被活化的基因能作為框內融合蛋白由載體上的一個啟動子/活化外顯子單位產生。第三，可使用有效的轉染方法將載體導入報導細胞。在此方面，通過逆轉錄病毒整合插入BD/SD和AD/SD載體是有利的。
可用於本發明的報導細胞包括能適當剪接由BD/SD和AD/SD載體產生的轉錄物的任何細胞。報導細胞含有在由BD/SD和AD/SD載體表達的蛋白質之間存在蛋白質-蛋白質相互作用時能以較高水平表達的報導基因。報導基因可以是選擇標記，例如本文所述的任何標記。或者，報導基因可以是篩選標記。本文描述了有用的選擇標記和篩選標記的例子。
在報導細胞中，基本啟動子與報導基因可操作相連。為了增加存在蛋白質-蛋白質相互作用時的報導基因表達量，可以使DNA結合位點位於基本啟動子內，或其附近，以使DNA結合位點能被BD/SD載體的DNA結合結構域區域所編碼的蛋白質識別。當缺乏蛋白質-蛋白質相互作用時，由BD/SD產生的DNA結合結構域融合蛋白缺少轉錄活化結構域，因此，不能活化由報導基因基本啟動子驅動的轉錄。然而，如果由BD/SD產生的DNA結合結構域融合蛋白能與由AD/SD載體產生的活化結構域融合蛋白相互作用，蛋白質複合物可活化報導基因的表達。使用針對篩選標記的分析試驗，或使用針對選擇標記的藥物選擇，可以檢測增加的報導基因表達。
據認為可以將其它報導系統與本發明一起使用，用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用。特別地，可以將任何蛋白質與本發明一起使用，所述蛋白質含有兩個分開的結構域，每個結構域需要與另一個緊密相鄰以產生生物化學或結構活性。
多-啟動子/活化外顯子載體在目的為活化未知基因的蛋白質表達的非靶向基因活化應用中，一般必須使用載體的集合。因此，在另一個實施方案中，本發明提供了含有一個或多個啟動子/活化外顯子單位的載體(見圖20A-20E)。
為了給真核細胞基因組中存在的多個基因結構提供空間，根據本發明此方面的載體優選含有轉錄調控序列(例如啟動子)，所述序列與具有不同結構的活化外顯子可操作相連。總的說來，這些活化外顯子能活化基本上所有內源基因的蛋白質表達。例如，為了活化編碼外顯子II(或外顯子II下遊的外顯子)中的翻譯起始密碼子的基因的蛋白質表達，一個載體可含有轉錄調控序列(例如啟動子)，所述序列與缺少翻譯起始密碼子的活化外顯子可操作相連。為了活化編碼外顯子I中的翻譯起始密碼子的所有類型的基因的蛋白質表達，必須使用3個獨立的載體，每個載體含有與不同活化外顯子可操作相連的轉錄調控序列(例如啟動子)。每個活化外顯子編碼不同閱讀框中的起始密碼子。其它活化外顯子構型也是有用的。例如，為了活化編碼外顯子I中的部分信號分泌序列的基因的蛋白質表達和分泌，必須使用3個獨立的載體，每個載體含有與不同活化外顯子可操作相連的轉錄調控序列(例如啟動子)。每個活化外顯子編碼不同閱讀框中的部分信號序列。為了活化編碼外顯子I中的完整信號序列的基因的蛋白質表達和分泌，必須使用3個載體，每個載體含有與不同活化外顯子可操作相連的轉錄調控序列(例如啟動子)。每個活化外顯子含有不同閱讀框中的完整信號分泌序列。除了活化編碼分泌蛋白質的基因的表達外，啟動子/編碼完整信號序列的活化外顯子也能活化一般不能被分泌的蛋白質的表達和分泌。這樣就有利於純化一般位於細胞內的蛋白質。
根據本發明此方面的載體的活化外顯子中也可包括其它有用的編碼序列，包括但不限於編碼蛋白質(包括全長蛋白質，蛋白質部分，蛋白質基元，和/或表位標記)的序列。如本文所述，根據本發明此方面的載體可以各自或集中整合至宿主細胞基因組中以產生細胞文庫。文庫的每個成員將潛在地過表達不同的內源蛋白質。因此，這些載體的集合使得活化真核宿主細胞中的所有或基本上所有內源基因成為可能。
如上文所述，當將載體集合整合至宿主細胞時，可以活化基本上任何基因的蛋白質表達。不幸的是，為了由所有內源基因產生蛋白質，必須產生大量文庫成員。這部分是由於宿主細胞編碼的大量基因所致。另外，使用此方法，很多細胞將含有整合至內源基因中或內源基因附近的載體；然而，整合的載體將含有活化外顯子，所述外顯子具有的結構與活化內源基因的蛋白質表達不相容。例如，載體外顯子可編碼閱讀框1(相對於剪接接頭而言)中的起始密碼子，而由整合載體下遊的第一個外顯子編碼的蛋白質可以位於閱讀框2(相對於剪接接頭而言)中。因此，很多文庫成員將含有整合載體，所述載體已活化內源基因的轉錄，但不能產生由內源基因編碼的蛋白質。
為了減少在載體整合至內源基因中，或內源基因附近之後不能活化蛋白質表達的細胞數目，可使用含有多個啟動子/活化外顯子的載體。在此載體上，每個啟動子/活化外顯子單位能活化具有不同結構的內源基因的蛋白質表達。由於含有多個活化外顯子的單個載體能產生各含有不同活化外顯子的多個轉錄物，整合至基因中或基因附近的單個載體能活化蛋白質表達，而不用管內源基因的結構如何(見圖21)。
多-啟動子/活化外顯子載體可含有兩個或多個啟動子/活化外顯子。每個啟動子/活化外顯子單位後面緊接著未配對的剪接供體位點。在一個這種實施方案中，載體上包括兩個啟動子/活化外顯子，其中每個啟動子/活化外顯子能活化不同類型內源基因的蛋白質表達。在優選實施方案中，載體可含有3個啟動子/活化外顯子，其中每個外顯子編碼不同閱讀框中的翻譯起始密碼子。在另一個優選實施方案中，載體可含有3個啟動子/活化外顯子，其中每個外顯子編碼不同閱讀框中的部分信號分泌序列。在另一個優選實施方案中，載體可含有3個啟動子/活化外顯子，其中每個外顯子編碼不同閱讀框中的完整信號分泌序列。其它實施方案包括含有第四個啟動子/活化外顯子的上述每個載體，其中第四個活化外顯子不編碼翻譯起始密碼子。
載體上可包括任何數目(例如1個或多個，2個或多個，3個或多個，4個或多個，5個或多個等)的啟動子/活化外顯子單位。當單個載體上存在多個啟動子/活化外顯子時，優選它們彼此的取向相同(即啟動子在相同方向上驅動表達)。
驅動不同活化外顯子的轉錄的啟動子可以彼此相同，或者，一個或多個啟動子可以不同。啟動子可以是病毒的，細胞的，或合成的。啟動子可以是組成型或誘導型的啟動子。也可以使用本領域技術人員熟知的或本文所述的其它類型的啟動子和調控序列來製備根據本發明此方面的載體。
任何含有多個啟動子/活化外顯子單位的載體可任選包括一個或多個選擇標記和/或可擴增標記。選擇和/或可擴增標記可含有poly(A)信號。或者，標記可缺少poly(A)信號。選擇標記可以是正或負選擇標記。選擇標記可在標記的上遊，內部或下遊含有未配對的剪接供體位點。或者，選擇標記可缺少未配對的剪接供體位點。當其存在時，選擇標記和/或可擴增標記可位於啟動子/活化外顯子單位的上遊，內部或下遊。相對於啟動子/活化外顯子單位而言，選擇和/或可擴增標記可以任何取向位於載體上。當選擇標記的目的是捕獲內源基因時，優選選擇標記的取向與啟動子/活化外顯子的相同。
可擴增標記本文所述的任何載體也任選含有一個或多個(例如2，3，4，5或更多個)可擴增標記。可擴增標記的例子包括上文詳細描述的那些。優選可擴增標記位於正/負選擇標記的上遊。當使用聚腺苷酸化陷阱載體時，較為有利的是從可擴增標記中除去聚腺苷酸化信號，以消除在整合之前捕獲得自載體串聯體化的由載體-編碼的poly(A)信號的可能性。
當其存在時，可擴增標記可位於活化轉錄調控序列(即負責介導從載體至整個內源基因的轉錄的啟動子)上遊。可擴增標記可以任何方向存在於載體上(即開放閱讀框可存在於任一條DNA鏈上)。
也應明白，可擴增標記也可以是與正選擇標記相同的基因。可用作正選擇標記和可擴增標記的基因包括例如二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶(ada)、二氫乳清酸酶、穀氨醯胺合成酶(GS)和氨甲醯磷酸合成酶(CAD)。
在一些實施方案中和對某些應用而言，需要在載體上放置多個可擴增標記。使用一個以上可擴增標記可以對每個可擴增標記進行二元選擇或者依次選擇。這樣有利於分離已擴增了載體和側翼基因組基因座，包括所需基因的細胞。
啟動子應懂得可在這些活化載體上使用任何啟動子和調節元件，以驅動選擇標記，可擴增標記(如果存在的話)和/或內源基因的表達。在其它優選實施方案中，驅動內源基因表達的啟動子是強啟動子。CMV立即早期基因啟動子，SV40T抗原啟動子和β-肌動蛋白啟動子是此類啟動子的例子。在另一個優選實施方案中，使用誘導型啟動子驅動內源基因的表達。這樣可以使內源蛋白質以更加能被控制的方式表達。四環素誘導型啟動子，熱激啟動子，ectdysone啟動子和金屬硫蛋白啟動子是此類啟動子的例子。在另一個實施方案中，使用組織特異性啟動子驅動內源基因的表達。組織特異性啟動子的例子包括但不限於免疫球蛋白啟動子，酪蛋白啟動子和生長激素啟動子。
限制性位點本發明的載體可含有一個或多個限制性位點，所述位點位於載體中未配對的剪接供體位點下遊。在轉染之前，可使用這些限制性位點線性化質粒載體。在線性構型中，活化載體在相對於轉錄鏈的5』至3』方向含有啟動子，剪接供體位點和線性化位點。
載體內含子中也可包括限制性位點以便於除去含有載體內含子的cDNA分子。在此實施方案中，載體在相對於轉錄鏈的5』至3』方向含有啟動子，剪接供體位點，限制性位點和線性化位點。通過將限制性位點包括在未配對的剪接供體位點和線性化位點之間，可通過用適當的限制性酶消化cDNA，除去未剪接的轉錄物。得自基因活化的cDNA分子已除去了含有限制性位點的載體內含子，因此，不會被消化。這樣可以在擴增/克隆的過程中優先富集基因被活化的轉錄物，大大有利於鑑定和分析內源基因。
載體外顯子中也可包括限制性位點以便於克隆活化的基因。基因活化之後，從細胞中回收mRNA併合成為cDNA。通過用在載體外顯子中切割的限制性酶消化cDNA，基因被活化的cDNA分子將在5』末端含有適當突出端，用於隨後克隆至適當的載體中。這樣便於分離基因被活化的cDNA分子。
在一個實施方案中，位於載體外顯子中的限制性位點不同於位於載體內含子中的限制性位點。這樣有利於除去含有載體內含子的cDNA分子，因為含有載體內含子的轉錄物的經消化的cDNA片段可被設計成具有與克隆載體(見下文)不相容的突出端。或者，被相同酶識別的簡併限制性位點可位於載體外顯子和內含子中。裂解這些位點的酶能裂解多個位點，在識別序列中具有奇數鹼基的位點，具有間斷的回文，非迴文序列的位點，或含有一個或多個簡併鹼基的位點。換句話說，如果酶在載體外顯子中產生的突出端不同於在載體內含子中產生的突出端，可以使用被相同限制性內切核酸酶識別的限制性位點。由於產生了不同的突出端，可使用含有與載體外顯子突出端相容，與載體內含子突出端不相容的位點的克隆載體，優先克隆含有載體外顯子而缺少載體內含子的cDNA分子。有用的簡併限制性位點的例子包括能被SfiI，Acci，AflIII，SapI，PleI，Tsp45I，ScrFI，TseI，PpuMI，RsrII和SgrAI識別的DNA序列。
位於載體內含子和/或外顯子中的限制性位點可以是罕見的限制性位點(例如8 bp限制性位點)或極罕見的位點(例如由內含子編碼的核酸酶識別的位點)。具有8bp限制性位點的限制性酶的例子包括NotI，SfiI，PacI，AscI，FseI，PmeI，SgfI，SrfI，SbfI，Sse8387I和SwaI。由內含子編碼的限制性酶的例子包括I-PpoI，I-SceI，I-CeuI，PI-PspI和PI-TliI。或者，可將小於8bp的限制性位點置於載體上。例如，可使用由7bp，6bp，5bp或4bp組成的限制性位點。通常，使用較小的限制性識別位點會導致克隆小於全長的基因。在一些情況下，例如產生雜交探針時，分離較小的cDNA克隆較為有利。
雙向活化載體本文所述的活化載體也可以是雙向的。當載體上存在單個活化轉錄調控序列時，僅當載體整合至適當位置(例如基因上遊)並且整合的方向正確時才會發生基因活化。即為了活化內源基因，活化構建體上的啟動子必須面向內源基因以轉錄編碼鏈。該朝向需求的結果是基因座內的整合事件僅有一半可導致內源基因的轉錄活化。另一半整合事件導致載體轉錄遠離所需基因。因此，為了使基因活化的頻率增加2倍，本發明提供了雙向載體，該載體可用於活化內源基因，而不用管載體整合至宿主細胞基因組中的方向如何。
根據本發明此方面的雙向載體優選含有兩個轉錄調控序列(可以是任何轉錄調控序列，包括但不限於本文所述的啟動子，增強子和阻抑物，優選為啟動子或增強子，最優選為啟動子)，兩個剪接供體位點，和一個線性化位點。當剪接供體位點有用時，每個轉錄調控序列與分開的剪接供體位點可操作相連，轉錄調控序列/剪接供體對彼此的方向可以相反(即第一個轉錄調控序列整合至宿主細胞基因組的方向可以與第二個轉錄調控序列整合至宿主細胞基因組中的方向相反)。兩個方向相反的轉錄調控序列/剪接供體位點可以被線性化位點隔開。線性化位點的功能是在轉錄調控序列/剪接供體位點之間(即在適於活化內源基因的位置)產生游離的DNA末端。圖11A-11C顯示了本發明雙向載體的例子。
兩個方向相反的轉錄調控序列可以是相同的轉錄調控序列或不同的轉錄調控序列。任選在任一個或兩個由載體編碼的外顯子上包括翻譯起始密碼子(如ATG)和一個或多個其它的密碼子。當存在翻譯起始密碼子時，任一個或兩個載體外顯子可編碼蛋白質，蛋白質的一部分，信號分泌序列，部分信號分泌序列，蛋白質基元或表位標記。或者，任一個或兩個載體外顯子可缺少翻譯起始密碼子。
根據本發明此方面的雙向載體可任選包括一個或多個選擇標記和一個或多個可擴增標記，包括本文詳細描述過的那些選擇標記和可擴增標記。如上文所述，雙向載體也可具有poly(A)陷阱載體，剪接受體陷阱載體，或二元poly(A)/剪接受體陷阱載體的構型。也可將上文中針對非雙向載體描述的其它載體構型摻入雙向載體。
用非-靶向活化載體共-轉染基因組DNA據認為，在轉染至真核宿主細胞之前，本文所述的任何載體可以整合至基因組DNA中，或要不然與之結合。這樣實際上就可以高水平地表達基因組中的任何基因，而不用管基因的正常表達特徵如何。因此，可使用本發明的載體活化由分離的基因組DNA片段編碼的基因的表達。為了達到此目的，可將載體整合至含有至少一個基因，或基因的一部分的基因組DNA中，或要不然與之結合。一般，活化載體必須位於基因內或其上遊以活化基因表達。一旦插入(或連接)，可通過將載體/基因組DNA導入適當的真核宿主細胞來表達下遊基因(表達成轉錄物或蛋白質)。導入宿主細胞之後，載體編碼的啟動子驅動由分離的DNA編碼的基因的表達，剪接之後，產生成熟的mRNA分子。使用適當的活化載體，該方法可以由經轉染的基因組DNA所編碼的任何基因表達蛋白質。另外，使用本文所述的方法，可產生和分離對應於由經轉染的基因組DNA所編碼的基因的cDNA分子。
為了獲得活化基因的穩定表達，可將經轉染的活化載體/基因組DNA整合至宿主細胞基因組。或者，將經轉染的活化載體/基因組DNA維持為穩定的附加體(例如使用病毒複製起點和/或核保留功能-見下文)。在另一個實施方案中，可由例如質粒瞬時表達活化基因。
本文所用術語「基因組DNA」指的是未經剪接的細胞遺傳物質。剪接指的是在轉錄之後從基因中除去內含子的過程。因此，與mRNA和cDNA相反，基因組DNA含有未剪接形式的外顯子和內含子。由於大多數真核基因含有外顯子和內含子，而且本發明的很多載體被設計成能通過剪接至第一個下遊外顯子旁邊，並除去間插的內含子來活化基因組DNA中編碼的基因，因此，在本發明中，得自真核細胞的基因組DNA特別有用。
可使用本領域已知的任何方法分離可用於本發明的基因組DNA。分離高分子量基因組DNA和超-高分子量基因組DNA(完整的，並被包裝於瓊脂糖塞中)的多種方法已被描述(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，(1989))。另外，分離多種大小的基因組DNA的商用試劑盒也是可以獲得的(Gibco/BRL，Stratagene，Clontech等)。
本發明中使用的基因組DNA可包含生物體的整個基因組。或者，基因組DNA可僅包括生物體的整個基因組的一部分。例如，基因組DNA可含有多個染色體，單個染色體，染色體的一部分，基因座，單個基因或基因的一部分。
在導入宿主細胞之前，用於本發明的基因組DNA可以基本上是完整的(即未片段化的)。或者，在導入宿主細胞之前，基因組DNA可以是片段化的。通過例如機械剪切，核酸酶處理，化學處理，照射，或本領域已知的其它方法可以實現此目的。當基因組DNA被片段化時，可調節片段化條件以產生任何所需大小的DNA片段。一般說來，DNA片段應足夠大以含有至少一個基因，或基因的一部分(例如至少一個外顯子)。無需預先進行克隆，可將基因組DNA直接導入適當的真核宿主細胞。或者，可在轉染之前將基因組DNA(或基因組DNA片段)克隆至載體中。有用的載體包括但不限於高和中等拷貝數的質粒(例如pUC，pBluescript，pACYC184，pBR322等)，粘粒，細菌人工染色體(BAC)，酵母人工染色體(YAC)，P1人工染色體(PAC)和噬菌體(例如λ，M13等)。也可以使用本領域已知的其它克隆載體。當已經將基因組DNA克隆至克隆載體時，特定的克隆DNA片段可被分離並用於本發明。例如，可通過雜交來篩選YAC，BAC，PAC或粘粒文庫以鑑定出作圖於特定染色體區域的克隆。任選地，一旦分離出這些克隆，可將它們安排好以產生貫穿所需染色體區域的重疊群。為了快速分離該重疊群中存在的基因的cDNA拷貝，這些基因組克隆可以分開或與活化載體一起被轉染至宿主細胞。然後可分離和分析含有載體編碼的外顯子，而缺少載體編碼的內含子的cDNA。因此，由於重疊群中存在的所有基因都可作為cDNA克隆被快速分離，該方法大大增強了定位克隆方法的速度。
本文所述的任何活化載體，包括本領域技術人員熟知的衍生物可以與基因組DNA一起共轉染，因此，可用於本發明。形式最簡單的載體可含有與外顯子可操作相連的啟動子，所述外顯子後面緊接著未配對的剪接供體位點。其它有用的載體的例子包括但不限於poly(A)陷阱載體(例如圖8，9，11C，12F和17中所述的載體)，二元poly(A)/剪接受體陷阱載體(例如圖9，10，12G，19和21中所述的載體)，雙向載體(例如圖11中所述的載體)，單個外顯子陷阱載體(例如圖19中所述的載體)，多-啟動子/活化外顯子載體(例如圖23中所述的載體)，用於分離對應於活化基因的cDNA的載體，和用於活化經活化的基因的蛋白質表達的載體(例如圖2，3，4，8B-F，9B-C，9E-F，10B-C，10E-F，11，12，17B-G和23中所述的載體)。
活化載體也可含有病毒複製起點。病毒複製起點的存在使得含有基因組片段的載體可作為附加體在宿主細胞中增殖。有用的病毒複製起點的例子包括oriP(Epstein Barr病毒)，SV40 ori，BPV ori，和痘苗病毒ori。為了便於由這些起點開始複製，可由載體表達適當的病毒複製蛋白。例如，含有EBV oriP和SV40 ori的載體也可分別編碼和表達EBNA-1或T抗原。或者，可將載體導入已在表達病毒複製蛋白(例如EBNA-1或T抗原)的細胞中。表達EBNA-1和T抗原的細胞分別包括例如被EBNA-1表達單位轉染的人293細胞(Clontech)和COS-7細胞(美國典型培養物保藏中心；ATCC號CRL-1651)。
活化載體也可含有可擴增標記。這樣就可以分離含有拷貝數有所增加的載體和側翼基因組DNA(或者為附加體，或者整合至宿主細胞基因組中)的細胞。含有拷貝數有所增加的載體和側翼基因組DNA的細胞以較高的水平表達活化基因，便於基因分離和蛋白質產生。
可將活化載體和基因組DNA導入任何宿主細胞，所述細胞能自載體編碼的剪接供體位點剪接至由基因組DNA編碼的剪接受體位點。在優選實施方案中，將基因組DNA/活化載體轉染至宿主細胞中，該細胞與分離得到基因組DNA的細胞屬於同一個種。然而，在一些情況下，較為有利的是將基因組DNA轉染至宿主細胞中，該細胞與分離得到基因組DNA的細胞屬於不同的種。例如，將得自一個種的基因組DNA轉染至屬於第二個種的宿主細胞便於使用雜交技術分析在經轉染的基因組DNA中被活化的基因。在高嚴緊性的雜交條件下，能將由經轉染的DNA編碼的活化基因與得自宿主細胞的基因區分開。將得自一個種的基因組DNA轉染至屬於另一個種的宿主細胞也可被用於在異源細胞中生產蛋白質。這樣就可以在能提供生長，蛋白質修飾或製備優點的異源細胞中產生蛋白質。
活化載體也可以與基因組DNA一起被共轉染至宿主細胞中，其中在導入細胞之前，載體不與基因組DNA結合。在此實施方案中，在轉染過程中基因組DNA會變成片段，從而產生游離的DNA末端。這些DNA末端可通過細胞的DNA配對機制與共轉染的活化載體連接在一起。與活化載體連接之後，可通過非-同源重組的方法將基因組DNA和活化載體整合至宿主細胞基因組中。如果在進行此方法的過程中，載體與經轉染的基因組DNA所編碼的基因相連接的話，載體將活化其表達。
或者，在轉染之前，使非-靶向活化載體與基因組DNA物理連接。在優選實施方案中，在轉染之前使基因組DNA片段與載體相連接。這樣較為有利，因為它使載體與基因組DNA所編碼的基因可操作相連的可能性最大化，並使載體整合至不含異源基因組DNA的宿主細胞基因組的可能性最小化。
在相關實施方案中，可將基因組DNA克隆至活化載體中，使其位於活化外顯子的下遊。在此實施方案中，在能容納大基因組片段的載體中便於克隆大基因組片斷。因此，可在BAC，YAC，PAC，粘粒或能增殖大的基因組DNA片段的類似載體中構建活化載體。
另一種連接活化載體與基因組DNA的方法包括轉座。在此實施方案中，在轉染至細胞之前，通過轉座或逆轉錄病毒整合反應將活化載體整合至基因組DNA中。因此，活化載體可含有便於轉座和/或逆轉錄病毒整合所必需的順式序列。圖27中示出了含有轉座子信號的載體例子；然而，據認為本文所述的任何載體都可含有轉座子信號。
本發明中可使用任何能將外源序列插入基因組DNA的轉座系統。另外，也可使用便於倒位和缺失的轉座子來實施本發明。儘管缺失和倒位系統不能將活化載體整合至基因組DNA中，但是，當基因組DNA已被克隆至活化載體中時，卻能使活化載體相對於克隆的基因組DNA而言改變位置。因此，通過將活化載體(通過整合，倒位或缺失)改組至基因組片斷內或外的多個位置，即可活化給定基因組片斷內的多個基因。可用於本發明的轉座系統的例子包括但不限於dg，Tn3，Tn5，Tn7，Tn9，Tn10，Ty，逆轉錄病毒整合和逆轉錄-轉座子(Berg等，可移動的DNA，ASM出版社，華盛頓，p879-925(1989)；Strathman等，美國國家科學院學報881247(1991)；Berg等，基因1139(1992)；Liu等，核酸研究159461(1987)；Martin等，美國國家科學院學報928398(1995)；Phadnis等，美國國家科學院學報865908(1989)；Tomcsanyi等，細菌學雜誌1726348(1990)；Way等，基因32369(1984)；Bainton等，細胞65805(1991)；Ahmed等，分子生物學雜誌178941(1984)；Benjamin等，細胞59373(1989)；Brown等，細胞49347(1987)；Eichinger等，細胞54955(1988)；Eichinger，Genes Dev，4324(1990)；Braiterman等，分子細胞生物學145719(1994)；Braiterman等，分子細胞生物學145731(1994)；York等，核酸研究261927(1998)；Devine等，核酸研究183765(1994)；Goryshin等，生物化學雜誌2737367(1998))。
使用轉座，活化載體可整合至任何形式的基因組DNA中。例如，活化載體可整合至完整的或片段化的基因組DNA中。或者，活化載體可整合至基因組DNA的克隆片段中(圖28)。在此實施方案中，基因組DNA可位於任何克隆載體上，包括高和中等拷貝數的質粒(例如pUC，pBluescript，pACYC184，pBR322等)，粘粒，細菌人工染色體(BAC)，酵母人工染色體(YAC)，P1人工染色體(PAC)和噬菌體(例如λ，M13等)。也可以使用本領域已知的其它克隆載體。如上文所述，可分離特定基因座的基因組片斷，並將其用作活化載體整合的底物。
整合活化載體之後，可將基因組DNA直接導入適當宿主細胞以表達活化基因。或者，可將基因組DNA導入中間體宿主細胞並在其中增殖。例如，將活化載體整合至BAC基因組文庫之後，可將BAC文庫轉化至大腸桿菌。這樣就可以通過選擇活化載體上存在的抗生素抗性標記來富集含有轉座子的質粒。結果，通過抗生素選擇可除去缺少整合的活化載體的BAC質粒。
使用純化的酶，可在體外發生轉座介導的活化載體整合。或者，可在體內發生轉座反應。例如，可使用攜有轉座子的供體菌株在細菌中進行轉座，所述轉座子或者位於載體上，或者作為整合的拷貝位於基因組中。將所需的靶導入轉座宿主，所述靶在該宿主中接受整合。然後通過遺傳選擇從宿主中回收攜有插入物的靶。類似地，可使用真核宿主細胞，例如酵母，植物，昆蟲或哺乳動物細胞，在轉座子的介導下將活化載體整合至基因組DNA片段中。
分離由活化的內源基因產生的mRNA和cDNA
在其它實施方案中，本發明涉及分離使用本發明的載體活化的基因，特別是真核細胞基因組中所含基因的方法。這些方法利用了使用本發明的非-靶向基因活化載體產生的mRNA分子的結構。本文所述的本發明方法實際上可以分離任何活化基因，而不用管該基因以前是否被分離和鑑定過，也不用管該基因是否具有已知的生物活性。通過本發明的整合載體所產生的嵌合轉錄物的特性可以做到這一點。使用本文所述的方法，可將活化載體整合至細胞基因組中。然而，通常將活化載體整合至很多細胞的基因組中以產生獨特整合事件的文庫。該文庫的每個成員含有位於獨特整合位點的載體，並潛在含有活化的內源基因。當活化載體整合至內源基因最靠3』方向的外顯子上遊，並且其取向能允許至載體至整個內源基因進行轉錄時，就會發生基因活化。整合位點可以位於內源基因的內含子或外顯子中，或者可以位於基因轉錄起始位點的上遊。整合之後，活化構建體被設計成可以產生轉錄物，所述轉錄物能從由活化載體編碼的外顯子剪接至由內源基因編碼的外顯子。結果，產生了嵌合信息，其含有與內源基因的外顯子相連接的載體外顯子，其中內源外顯子得自位於載體整合位點下遊的區域。該嵌合轉錄物的結構可被用於基因回收目的。例如，嵌合轉錄物可被快速分離以用作探針(分離基因的全長cDNA或基因組拷貝，或者鑑定基因)或被直接測序和/或鑑定。
為了分離通過載體插入來活化的嵌合轉錄物，由含有活化事件的文庫成員產生cDNA。也可以從文庫成員庫中分離嵌合轉錄物以增加該方法的流通量。然後由收集自活化細胞的mRNA產生cDNA。或者，可使用總RNA來產生cDNA。在任一種情況下，可使用寡dT引物，寡dT/poly(A)信號引物或隨機引物進行第一條鏈的合成。為了便於克隆cDNA產物，可使用具有下列結構的基於poly dT的引物5』-引物X(dT)1-100-3』。寡dT/poly(A)信號引物可具有結構5』-(dT)10-30-引物X-N0-6-TTTATT-3』。隨機引物可具有結構5』-(引物X)NNNNNN-3』。在每個引物中，引物X是任何可用於隨後PCR擴增靶核酸分子的序列。當需要克隆活化基因的擴增產物時，在引物X序列內包括一個或多個限制性位點以便於隨後的克隆將是有用的。也可使用本領域技術人員熟知的其它引物產生第一鏈cDNA產物，包括缺少引物X區域的引物。
根據本發明，引物可與一個或多個半抗原分子偶聯以便於隨後分離含有這種引物的核酸分子(例如第一和/或第二鏈cDNA產物)。在引物與核酸分子(經由在cDNA合成的過程中摻入而)結合之後，使用相應的配體選擇性分離含有半抗原化引物的分子，所述配體可以通過配體-半抗原相互作用與半抗原特異性地相互作用和結合。在優選的此方面，配體可以與例如固體支持物結合。一旦與固體支持物結合，可通過用溶液，優選為緩衝液或水洗滌固體基質，將所需分子(含有半抗原化引物的核酸分子)與汙染的核酸和其它物質分開。裂解引物內的一個或多個裂解位點，或通過用高離子強度的洗脫緩衝液處理含有核酸分子的固體支持物，可以從固體支持物上除去所需的核酸分子。
可用於本發明此方面的優選固體支持物包括但不限於硝酸纖維素，重氮纖維素，玻璃，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，Sepharose，瓊脂，澱粉，尼龍，乳膠珠，磁珠，順磁珠，超級順磁珠或微滴板，最優選為含有一個或多個配體分子的磁珠，順磁珠或超級順磁珠，所述配體分子能特異性地識別和結合引物上的半抗原分子。
本發明的引物分子上所用的特別優選的半抗原分子包括但不限於(i)生物素；(ii)抗體；(iii)酶；(iv)脂多糖；(v)脫鐵運鐵蛋白；(vi)鐵運鐵蛋白(ferrotransferrin)；(vii)胰島素；(viii)細胞因子(生長因子，白細胞介素或集落刺激因子)；(ix)gp120；(x)β-肌動蛋白；(xi)LFA-1；(xii)Mac-1；(xiii)血型糖蛋白；(xiv)層粘連蛋白；(xv)膠原；(xvi)纖連蛋白；(xvii)玻連蛋白；(xviii)整聯蛋白αvβ1和αvβ3；(xix)整聯蛋白α3β1，α4β1，α4β7，α5β1，αvβ1，αIIbβ3，αvβ3和αvβ6；(xx)整聯蛋白α1β1，α2β1，α3β1和αvβ3；(xxi)整聯蛋白α1β1，α2β1，α3β1，α6β1，α7β1和α6β5；(xxii)錨蛋白；(xxiii)C3bi，血纖蛋白原或X因子；(xxiv)ICAM-1或ICAM-2；(xxv)血影蛋白或胞影蛋白；(xxvi)CD4；(xxvii)細胞因子(例如生長因子，白細胞介素或集落刺激因子)受體；(xxviii)胰島素受體；(xxix)運鐵蛋白受體；(xxx)Fe+++；(xxxi)多粘菌素B或內毒素-中和蛋白(ENP)；(xxxii)酶-特異性底物；(xxxiii)蛋白A，蛋白G，細胞表面Fc受體或抗體-特異性抗原；和(xxxiv)親和素和鏈黴親和素。特別優選的是生物素。
依次與上述半抗原分子相對應的，根據本發明此方面的特別優選的配體分子包括但不限於(i)親和素和鏈黴親和素；(ii)蛋白A，蛋白G，細胞表面Fc受體或抗體-特異性抗原；(iii)酶-特異性底物；(iv)多粘菌素B或內毒素-中和蛋白(ENP)；(v)Fe+++；(vi)運鐵蛋白受體；(vii)胰島素受體；(viii)細胞因子(例如生長因子，白細胞介素或集落刺激因子)受體；(ix)CD4；(x)血影蛋白或胞影蛋白；(xi)ICAM-1或ICAM-2；(xii)C3bi，血纖蛋白原或X因子；(xiii)錨蛋白；(xiv)整聯蛋白α1β1，α2β1，α3β1，α6β1，α7β1和α6β5；(xv)整聯蛋白α1β1，α2β1，α3β1和αvβ3；(xvi)整聯蛋白α3β1，α4β1，α4β7，α5β1，αvβ1，αIIbβ3，αvβ3和αvβ6；(xvii)整聯蛋白αvβ1和αvβ3；(xviii)玻連蛋白；(xix)纖連蛋白；(xx)膠原；(xxi)層粘連蛋白；(xxii)血型糖蛋白；(xxiii)Mac-1；(xxiv)LFA-1；(xxv)β-肌動蛋白；(xxvi)gp120；(xxvii)細胞因子(生長因子，白細胞介素或集落刺激因子)；(xxviii)胰島素；(xxix)鐵運鐵蛋白；(xxx)脫鐵運鐵蛋白；(xxxi)脂多糖；(xxxii)酶；(xxxiii)抗體；和(xxxiv)生物素。特別優選與本發明生物素化的引物一起使用的是親和素和鏈黴親和素。
第一條鏈合成之後，可使用特異於載體編碼的外顯子的引物進行第二條cDNA鏈的合成。這樣就可以由衍生自載體編碼的啟動子的所有轉錄物產生雙鏈cDNA。由於轉錄物的5』末端缺少載體外顯子，由內源啟動子產生的所有細胞mRNA(和cDNA)仍為單鏈形式。一旦進行第二條鏈的合成，可用限制性酶消化cDNA，將其克隆至載體中並進行增殖。
為了便於克隆，可使用特異於載體外顯子的引物和特異於第一條cDNA鏈引物(如引物X)的引物，經PCR擴增含有載體外顯子的cDNA分子。PCR擴增導致產生不同長度的DNA片斷，表示在第一條鏈合成和/或擴增不同基因的多個嵌合轉錄物的過程中引發的位置不同。可將這些擴增產物克隆至質粒中以進行鑑定，或者進行標記並用作探針。
也可使用其它擴增技術，例如使用RNA聚合酶進行線性擴增(VanGelder，美國國家科學院學報871663-1667(1990)；Eberwine，方法10283-288(1996))。例如，當使用RNA聚合酶進行線性擴增時，可將啟動子(例如T7啟動子)置於載體外顯子上。結果，基因活化的轉錄物將在轉錄物的5』末端含有啟動子序列。或者，可在第一條鏈和第二條鏈合成之後，將啟動子連接至cDNA分子上。使用任一種策略，然後在核糖核苷酸三磷酸存在下將RNA聚合酶與cDNA一起保溫，以由cDNA產生RNA轉錄物。然後逆轉錄這些轉錄物以產生cDNA。由於RNA聚合酶可由單個cDNA分子產生幾千個轉錄物，又由於每個轉錄物都能逆轉錄成cDNA，因此可獲得大擴增。至於PCR，用RNA聚合酶擴增便於克隆活化基因。也可以使用其它類型的擴增策略。
在另一個實施方案中，無需擴增即可分離出含有載體外顯子的cDNA分子。當在擴增過程中出現偏好(例如一個DNA片斷的擴增比另一個更有效)時，該方案是有用的。為了產生標記信息有所增強的cDNA，可從活化文庫中分離RNA。將引物(例如隨機六聚體，寡(dT)或含有與poly(dT)或隨機核苷酸相連接之引物的雜合引物)與RNA退火，並用於介導第一條鏈的合成。然後使第一鏈cDNA分子與特異於載體編碼的外顯子的引物雜交。該引物介導第二條鏈的合成。第二條鏈合成之後，可用在載體外顯子和第一條鏈引物(例如引物X-見上文)中切割的限制性酶消化cDNA。然後將第二條鏈的產物克隆至有用的載體中以使它們能被增殖。
本領域技術人員參照本文所含的描述可以清楚地知道根據本發明的方法製備的cDNA產物也可被克隆至適於轉染或轉化多種原核(細菌)或真核(酵母，植物或動物，包括人和其它哺乳動物)細胞的克隆載體中。可以是表達載體的克隆載體包括但不限於染色體-，附加體-和病毒-衍生的載體，例如衍生自細菌質粒或噬菌體的載體，和衍生自上述組合的載體，例如粘粒和噬粒，BAC，MAC，YAC等。其它適用於本發明此方面的載體，和將DNA片斷插入所述載體和用這種克隆載體轉化宿主細胞的方法是本領域技術人員所熟知的。
除去未剪接的轉錄產物在一些情況下，活化載體會整合至基因組中缺少基因的區域。或者，整合至含有基因的區域，但其整合的方向導致非-編碼鏈的轉錄。在每一種情況下，都會產生基因被活化的轉錄物，其一般含有與載體編碼的外顯子相鄰接的未被轉錄的DNA序列。這些序列使鑑定和分析新基因變得更加困難。因此，選擇性除去這些基因組分子將是有利的。
為了除去含有載體編碼的內含子的cDNA分子，用能識別位於載體編碼的內含子上的序列的限制性酶處理雙鏈cDNA。優選限制性酶產生的突出端不同於通過裂解載體外顯子產生的突出端。這樣就可以通過防止裂解產物連接至克隆載體上而確保僅克隆活化基因。
從活化的內源基因中回收外顯子I為了從活化基因中回收外顯子I，可使用特化載體產生非-靶向基因活化文庫。最簡單形式的該載體自5』至3』含有啟動子，未配對的剪接供體位點和第二個啟動子。下遊啟動子與上遊啟動子的方向相同。通過整合至內源基因上遊，這種類型的載體產生了兩種類型的轉錄物。第一種轉錄物含有與內源基因的外顯子II相連接的載體外顯子。上文描述了分離該轉錄物的方法。第二種轉錄物含有內源基因的上遊區域，其後緊接著與外顯子II和其它來自內源基因的下遊外顯子相連接的外顯子I(圖6)。
使用兩步法，從含有整合載體的細胞中回收外顯子I。第一步，使用上文所述的方法分離含有載體外顯子的轉錄物(即轉錄物#1型，圖13)。一旦分離完畢，可對包括外顯子II的轉錄物的5』末端進行測序以測定側翼內源外顯子的序列。第二步，一旦已知側翼內源外顯子的序列，可產生能與活化基因的外顯子II(或下遊外顯子)退火的PCR引物。使用改良形式的反向PCR(Zeiner，M.，生物技術，17(6)1051-1053(1994))，用這些引物擴增轉錄物#2中的外顯子I。簡單地說，通過以上文測定的序列信息為基礎，用基因特異性的引物進行第一條cDNA鏈的合成，即可擴增內源基因的外顯子I。在本領域技術人員眾所周知的條件下，使用大腸桿菌DNA聚合酶I進行第二條鏈的合成。然後用限制性酶消化雙鏈cDNA，所述酶在第一鏈cDNA引物上遊的內源基因中裂解至少一次，但在載體外顯子中不裂解。消化之後，cDNA自身連接，產生環狀分子。使用在限制性/環化位點上遊的內源基因中退火的反向PCR引物，經PCR進行擴增，產生含有內源基因的外顯子I序列的DNA產物。
選擇含有較高水平的基因活化轉錄物/蛋白質的細胞的方法在本發明所公開的幾個實施方案中，活化載體含有可擴增標記(例如DHFR)和病毒複製起點(例如EBV oriP)。在其它實施方案中，可擴增標記和病毒複製起點存在於含有克隆的基因組DNA片斷的克隆載體上。在另一個實施方案中，活化載體含有一個元件(例如DHFR)，攜有基因組插入物的克隆載體含有另一個元件(例如OriP)。不論可擴增標記和病毒複製起點原來的位置如何，在導入宿主細胞之前或之中，將元件連接在相同的DNA分子上。
除了順式作用的元件外，附加體的有效複製一般也需要反式作用的病毒蛋白質。反式作用的病毒蛋白質的例子包括EBNA-1和SV40 T抗原。為了促進附加體的有效複製，可由附加體表達反式作用的病毒蛋白質。因此，可由轉座的活化載體表達病毒反式作用的蛋白質，或者，所述蛋白質可位於克隆載體的骨架上。或者，可由導入附加體的真核宿主細胞表達反式作用的病毒蛋白質。
一旦可擴增標記和病毒複製起點位於相同的分子上，並且存在於表達適當病毒複製蛋白質的宿主細胞中，即可增加附加體的拷貝數。為了增加附加體的拷貝數，可將細胞置於適當的選擇之下。例如，如果DHFR存在於附加體上，可在培養物中添加氨甲蝶呤。可以使用相對高濃度的選擇試劑以分離已具有高附加體拷貝數的群體中的細胞。或者，以較低的濃度使用選擇試劑，並且周期性地增加濃度。藥物濃度的兩倍增加會導致拷貝數的逐步增加。
為了降低非-特異性藥物抗性(即與附加體拷貝數增加不相關的藥物抗性)的頻率，可在載體上放置一個以上可擴增標記。在附加體上包括多個可擴增標記使得可以用多種藥物(同時或依次)選擇細胞。由於非-特異性的藥物抗性是相對罕見的事件，細胞對多種藥物產生非-特異性藥物抗性的可能性極小。因此，附加體上多個可擴增標記的存在便於分離具有高附加體拷貝數的細胞。
擴增附加體拷貝數可增加得自載體活化基因的轉錄物的數目。這反過來有利於分離衍生自活化基因的cDNA分子。另外，擴增附加體拷貝數可顯著增加活化基因的蛋白質表達。較高水平的蛋白質產生有利於產生生物分析篩選，細胞分析篩選和製備目的所用的蛋白質。
作為上文所述的很合乎需要的特徵的結果，含有病毒複製起點和可擴增標記的載體，和這些載體快速擴增附加體載體拷貝數的用途，代表了超越活化基因組DNA中所存在基因的表達的重大突破。例如，可使用這些載體過表達cDNA編碼的基因，以產生高水平的蛋白質表達，而無需將基因整合至具有可擴增標記的宿主細胞基因組。另外，與擴增染色體序列相同，可以分離具有幾百至幾千個附加體載體拷貝的細胞，並在培養中維持這些細胞。因此，本文所述的載體及其用途可以在哺乳動物細胞中高水平地增殖克隆的基因組DNA，便於分離作為基因組插入物存在於載體上的基因的cDNA拷貝，並可以使克隆的cDNA和真核基因的基因組拷貝的蛋白質產生最小化。
對本文描述的方法和應用的其他合適的改進和變化對本領域技術人員是顯而易見的，並且可以在不脫離本發明的範圍或其實施方案下而進行。上面已詳細描述了本發明，參照以下實施例可以更清楚地理解本發明，這些實施例在此僅做例證，而非意在限制本發明。
實施例實施例1轉染細胞以活化內源基因表達方法構建pRIG-1人DHFR由cDNA通過PCR進行擴增，所述cDNA是由HT1080細胞使用引物DHFR-F1(5』TCCTTCGAAGCTTGTCATGGTTGGTTCGCTAAACTGCAT3』)(SEQ ID NO1)和DHFR-R1(5』AAACTTAAGATCGATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAA3』)(SEQ ID NO2)通過PCR製備的，並將人DHFR克隆至pTARGETTM(Promega)中的T位點產生pTARGETDHFR。用NheI和XbaI消化PREP9分離RSV啟動子，並將其插入pTARGETDHFR的NheI位點產生pTgTRSV+DHFR。將寡核苷酸JH169(5』ATCCACCATGGCTACAGGTGAGTACTCG3』)(SEQ ID NO3)和JH170(5』GATCCGAGTACTCACCTGTAGCCATGGTGGATTTAA3』)(SEQ ID NO4)退火，並將其插入pTgTRSV+DHFR的I-Ppo-I和NheI位點以產生pTgTRSV+DHFR+Exl。用引物Tet F1(5』GGCGAGATCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAAT3』)(SEQ ID NO5)和Tet F2(5』GGCCAGATCTGCTACCTTAAGAGAGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA3』)(SEQ ID NO6)將相應於pBR322的230-508位核苷酸的279bp區進行PCR擴增。用BglII消化擴增產物，並將其克隆至pTgTRSV+RSV+DHFR+Exl的BamHI位點產生pRIG-1。
轉染—在HT1080細胞中形成pRIG-1基因活化文庫為了活化基因表達，從上述構建體組中選擇合適的活化構建體。然後將所選的活化構建體通過本領域任何已知轉染方法導入細胞。轉染方法的例子包括電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沉澱、DEAE右旋糖和受體介導的胞吞。導入細胞中之後，使DNA經非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。整合可以在自發染色體斷裂處或人工誘導的染色體斷裂處進行。
方法用pRIG1轉染人細胞。使2×109HH1細胞(HT1080細胞的HPRT亞克隆)在150mm組織培養板中生長至90％鋪滿。將培養液從細胞中吸出，作為條件培養液保存(參見下文)。通過將細胞與胰蛋白酶短暫溫育而使其從培養板上脫落，將其加入培養液/10％胎牛血清中以便中和胰蛋白酶，並在Jouan離心機中於1000rpm沉澱5分鐘。將細胞在1X PBS中洗滌、計數並如上述重新沉澱。將細胞沉澱以終濃度2.5×107細胞/ml重懸在1XPBS(Gibco BRL Cat#14200-075)中。然後將細胞暴露於50rads來自137Cs源的γ照射中。用BamHI將pRIG1(圖14A-14B；SEQ ID NO18)線性化，用酚/氯仿提純，用乙醇沉澱並重懸於PBS中。將純化和線性化的活化構建體加入細胞懸浮液中至終濃度為40μg/ml。然後將DNA/照射過的細胞混合物混勻，向每個0.4cm的電穿孔管(BioRad)中移入400μl該混合物。用電穿孔裝置(BioRad)給小管以250伏、600微法拉、50歐姆輸送脈衝。電脈衝後，將細胞於室溫培養10分鐘，然後移入含有青黴素/鏈黴素(Gibco/BRL)的αMEM/10％FBS中。將細胞鋪在含有35mlαMEM/10％FBS/penstrep(33％條件培養液/67％新鮮培養液)的培養板上，濃度為大約7×106細胞/150mm板。於37℃培養24小時後，將取自60mg/ml儲液的G418(Gibco/BRL)加入到每個培養板中至終濃度為500μg/ml。經4天選擇後，用新鮮的αMEM/10％FBS/penstrep/500μg/ml G418替換培養液。然後再將細胞保溫7-10天，培養物上清液用於檢測新的蛋白因子的存在或者儲存在-80℃用於後面的分析。耐藥克隆可以保存在液氮中用於後面的分析。
實施例2利用電離輻射來提高DNA整合的頻率和隨機性方法HH1細胞90％鋪滿時收集，在1×PBS中洗滌，以7.5×106細胞/ml的細胞濃度重懸於1×PBS中。向細胞中加入15μg線性化的DNA(pRIG-1)，並混勻。將400μl加入各電穿孔管(BioRad)中，用電穿孔儀(BioRad)以250伏、600微法拉、50歐姆輸送脈衝。電脈衝後，將細胞於室溫培養10分鐘，然後移入2.5mlαMEM/10％FBS/1×penstrep中。從每次脈衝照射中取300μl細胞在轉染前或者轉染後1或4小時以0、50、500和5000rads照射。照射後，立即將細胞鋪在含完全培養基的組織培養板上。鋪板24小時後，向培養物中加入G418至終濃度為500μg/ml。選擇後7天時，將培養基換成含有500μg/ml G418的新鮮完全培養基。選擇後10天時，從培養板中吸出培養基，用考馬斯藍/90％甲醇/10％乙酸將細胞集落染色，並計數多於50個細胞的集落。
實施例3用限制酶在基因組中產生隨機、半隨機或導向的斷裂方法HHI細胞90％鋪滿時收集，在1×PBS中洗滌，以7.5×106細胞/ml的細胞濃度重懸於1×PBS中。為了檢測整合效率，向每份400μl等分的細胞中加入15μg線性化的DNA(PGK-βgeo)並混勻。然後向幾份細胞中加入限制酶XbaI、NotI、HindIII、IppoI(10-500單位)以便分離細胞/DNA混合物。取400μl加入每個電穿孔管中，用電穿孔儀(BioRad)以250伏、600微法拉、50歐姆輸送脈衝。電脈衝後，將細胞於室溫培養10分鐘，然後移入2.5mlαMEM/10％FBS/1×penstrep中。從每次脈衝照射的2.5ml總細胞中取300μl細胞鋪在含完全培養基的組織培養板上。鋪板24小時後，向培養物中加入G418至終濃度為600μg/ml。選擇後7天時，將培養基換成含有600μg/ml G418的新鮮完全培養基。選擇後10天時，從培養板中吸出培養基，用考馬斯藍/90％甲醇/10％乙酸將細胞集落染色，並計數多於50個細胞的集落。
實施例4通過對位於整合載體上的兩個可擴增標記進行選擇來進行擴增載體整合到宿主細胞基因組後，可以通過同時或連續選擇位於整合載體上的1或多個可擴增標記使遺傳基因座的拷貝數擴增。例如，可以使包含兩個可擴增標記的載體整合到基因組中，並通過對位於載體上的這兩個可擴增標記進行選擇來提高給定基因(即位於載體整合位點處的基因)的表達。這種方法大大方便了分離已經擴增了正確基因座(即含有整合載體的基因座)的細胞克隆。
一旦載體通過非同源重組整合到基因組中，則可將含有在獨特位置處整合的載體的細胞的單個克隆與其他含有在基因組中其它位置處整合的載體的細胞分離開。另一種方法是可選擇混合的細胞群體用於擴增。
然後在對第一可擴增標記具有特異性的第一種選擇試劑存在下培養含有整合載體的細胞。該試劑挑選出已經擴增載體和內源染色體上的可擴增標記的細胞。然後，通過在對第二可擴增標記具有特異性的第二種選擇試劑存在下培養細胞選擇這些細胞用於第二個選擇標記的擴增。經過該第二個選擇步驟，載體和旁側基因組DNA均已擴增的細胞能存活，而只擴增了內源的第一可擴增標記的細胞或者是具備了非特異性抗性的細胞不能存活。當含有兩個以上(如3，4，5或更多)的可擴增標記的載體整合到細胞基因組中時，可以以類似的方式，通過在對整合載體上所含的其他可擴增標記具有特異性的選擇試劑存在下對細胞進行連續培養來做附加選擇。挑選後，檢測存活細胞的所需基因的表達水平，並選出表達水平最高的細胞做進一步擴增。替代的做法是，可以進一步培養對兩種(如果使用了兩個可擴增標記)或全部(如果使用了兩個以上可擴增標記)選擇試劑具有抗性的細胞的集合，而不分離出單個克隆。然後將這些細胞擴增，並在更高濃度的第一種選擇試劑(通常是高兩倍)存在下進行培養。重複該過程直至達到預期的表達水平。
或者，可以同時針對兩種(如果使用了兩個可擴增標記)或全部(如果使用了兩個以上可擴增標記)可擴增標記來挑選含有整合載體的細胞。通過將兩種(如果使用了兩個標記)或全部(如果使用了兩個以上標記)選擇試劑加入其中培養了轉染細胞的選擇培養基中來實現同時挑選。大多數存活細胞已擴增了整合載體。然後可以將這些克隆分別篩選來鑑定表達水平最高的細胞，或者把它們作為一個集合來進行。給這些細胞施加更高濃度的各選擇試劑(通常是高兩倍)。然後再檢測存活細胞的表達水平。重複該過程直至達到預期表達水平。
利用任何一種選擇策略(即同時或連續選擇)，通過從沒有細胞毒性的低濃度到導致多數細胞死亡的高濃度滴定選擇試劑來獨立地確定所述選擇試劑的起始濃度。通常，選擇能形成離散集落(例如，所鋪的每100000個細胞形成幾百個集落)的濃度作為起始濃度。
實施例5分離編碼跨膜蛋白質的cDNApRIG8R1-CD2(圖5A-5D；SEQ ID NO7)、pRIG8R2-CD2(圖6A-6C；SEQ ID NO8)和pRIG8R3-CD2(圖7A-7C；SEQ ID NO9)載體含有可操縱地連接到外顯子上的CMV立即早期啟動子，其後是一個未配對剪接供體位點。載體上的外顯子編碼一個信號肽，該信號肽連接到CD2的胞外結構域(缺少框內終止密碼子)。每個載體在相對剪接供體位點來說是不同的讀碼框內編碼CD2。
為了建立活化基因文庫，用50rads137Cs源照射2×107細胞，並用15μg線性化的pRIG8R1-CD2(SEQ ID NO7)進行電穿孔。然後分別用pRIG8R2-CD2(SEQ ID NO8)，再用pRIG8R3-CD2(SEQ ID NO9)重複該過程。轉染後，將三組細胞合併，以每皿5×106細胞的濃度鋪入150mm培養皿中，來建立文庫#1。轉染後24小時，用500μg/mlG418將文庫#1選擇14天。將含有整合至宿主細胞基因組中的載體的耐藥克隆合併、等分並冷凍以便分析。如上所述建立文庫#2，但其中用pRIG8R1-CD2、pRIG8R2-CD2和pRIG8R3-CD2分別轉染3×107細胞、3×107細胞和1×107細胞。
為了分離含有編碼完整膜蛋白質的活化基因的細胞，培養來自各文庫的3×106細胞並如下處理
.用4ml胰蛋白酶-EDTA將細胞胰蛋白酶消化。
.在細胞脫落後，添加8mlαMEM/10％FBS中和胰蛋白酶。
.用無菌PBS將細胞洗一次，經800g離心7分鐘收集。
將細胞沉澱重懸於2mlαMEM/10％FBS中。1ml用於分選，另1ml重鋪在含有500μg/mlG418的αMEM/10％FBS中，擴增並保存。
.將用於分選的細胞用無菌αMEM/10％FBS洗一次，經800g離心7分鐘收集。
.吸去上清液，將沉澱重懸於1mlαMEM/10％FBS中。取100μl所述細胞用同種型對照物染色。
.向900μl細胞中加入200μl抗-CD2 FITC(Pharmingen目錄號#30054X)，而向100μl細胞中加入20μl小鼠IgG1同種型對照物(Pharmingen目錄號#33814X)。將上述細胞在冰上培養20分鐘。
.向含有用抗人CD2 FITC染色的細胞的試管中加入5ml PBS/1％FBS。向同種型對照物中加入900μl PBS/1％FBS。以600g離心6分鐘收集細胞。
.從試管中吸出上清液。將已用同種型對照物染色的細胞重懸於500μlαMEM/10％FBS中，將已用抗CD2 FITC染色的細胞重懸於1.5mlαMEM/10％FBS中。
.在FACS Vantage流式細胞計(Becton Dickinson ImmunocytometrySystems；Mountain View，CA)上通過連續分選細胞5次來分選細胞。在每次分選中，收集所示的細胞總數的百分比的代表螢光最強的細胞(見下文)，將其擴增，再分選。分選HT1080細胞作為陰性對照物。每次分選中分選並收集到以下細胞群
將每個文庫最後一次分選得到的細胞擴增並保存於液氮中。
從FACS分選細胞中分離活化基因一旦經如上所述將細胞進行了分選，通過基於PCR的克隆從所述分選細胞中分離活化內源基因。但本領域技術人員容易想到，可以等效地使用本領域公知的任何克隆基因的方法來從FACS分選的細胞中分離活化基因。
按照以下方案分離基因(1)利用PolyATract System1000 mRNA分離試劑盒(Promega)，從來自文庫#1和#2的3×107CD2+細胞(如上所述，通過FACS分選5輪)中分離mRNA。
(2)分離mRNA後，通過將0.5μl分離的mRNA稀釋到99.5μl水中並測定OD260來確定mRNA的濃度。從CD2+細胞回收到21μgmRNA。
(3)然後如下合成第一鏈cDNA(a)PCR儀維持在4℃，通過連續添加以下成分製備第一鏈反應混合物41μl DEPC處理過的ddH2O4μl 10mM各種dNTP8μl 0.1MDTT16μl 5×MMLV第一鏈緩衝液(Gibco-BRL)5μl(10pmol/μl)共有聚腺苷酸化位點引物GD.R1(SEQ ID NO10)*1μl RNAsin(Promega)3μl(1.25μg/μl)mRNA*備註GDR1，5』TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT3』(SEQ ID NO10)是用於由mRNA合成第一鏈cDNA的「基因開發」引物；該引物被設計成能與多腺苷酸化信號AATAAA和下遊的多腺苷酸區退火。它能給第一鏈導入一個NotI位點。
一旦製備好樣品，即如下進行溫育(b)70℃ 1分鐘
(c)維持於42℃，然後向每份樣品中加入2μl 400U/μl的SuperScriptII(Gibco-BRL；Rockville，MD)，以產生82μl的最終總體積。大約3分鐘後，如下溫育樣品(d)37℃ 30分鐘(e)94℃ 2分鐘(f)4℃ 5分鐘然後向各樣品中加入2μl 20U/μl的RNace-IT(Stratagene)，將樣品於37℃溫育10分鐘。
(4)第一鏈合成後，用PCR洗滌試劑盒(Qiagen)如下純化cDNA(a)將80μl第一鏈反應產物轉移入1.7ml矽烷化的eppendorf管，並加入400μl PB。
(b)然後將樣品移入PCR純化柱子，於14000RPM離心2分鐘(c)將柱子拆下，傾析出徑流，向沉澱中加入750μl PE，然後將試管於14000RPM離心2分鐘。
(d)將柱子拆下，傾析出徑流，將試管於14000RPM離心2分鐘以便乾燥樹脂。
(e)用50μl EB通過轉移柱將cDNA洗脫至新的矽烷化的eppendorf管中，然後以14000RPM離心2分鐘。
(5)如下合成第二鏈cDNA(a)於室溫，連續添加以下成分製備第二鏈反應混合物ddH2O55μl10×PCR緩衝液 10μl50mM MgCl25μl10mM dNTP 2μl25pmol/μl RIG.751-Bio*4μl25pmol/μl GD.R2**4μl第一鏈產物20μl*備註RIG.751-Bio，5』生物素-CAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGG3』(SEQ ID NO11)，在由pRIG載體表達得到的轉錄產物的帽子位點處退火。
**備註GD.R2，5』TTTTCGTCAGCGGCCGCATC3』(SEQ ID NO12)是用於PCR擴增cDNA的引物，所述cDNA是使用引物GDR1(SEQ ID NO10)製備的。GD.R2是GDR1的亞序列，其帶有到達polyA信號序列前的簡併鹼基的配對序列。
(b)開始合成第二鏈94℃ 1分鐘，加入1μl Taq(5U/μl，Gibco-BRL)，加入1μl Vent DNA pol(0.1U/μl，New England Biolabs)，(c)於63℃溫育2分鐘，(d)於72℃溫育3分鐘，(e)將步驟(b)重複4次，(f)於72℃溫育6分鐘，(g)於4℃溫育(維持)，(h)結束。
(6)用STE洗3次製備200μl 1mg/ml鏈黴抗生物素蛋白-Paramagnetic顆粒(SA-PMP)。
(7)將第二鏈反應產物直接加入SA-PMP中，於室溫溫育30分鐘。
(8)結合後，利用磁體收集SA-PMP，並回收徑流物質。
(9)用500μl STE將磁珠洗3次。
(10)將磁珠重懸於50μl STE中，用磁體在試管底部收集磁珠。然後小心地將STE上清液吸出。
(11)將磁珠重懸於50μl ddH2O中，在100℃水浴中放置2分鐘，從PMP上釋放出純化的cDNA。
(12)在磁體上收集PMP，並小心地吸出含有cDNA的上清液，從而回收到純化的cDNA。
(13)將純化產物移至乾淨試管中，於14000RPM離心2分鐘除去所有殘存的PMP。
(14)然後如下進行PCR反應以便特異擴增RIG活化cDNA(a)通過於室溫連續添加以下成分來製備PCR反應混合物H2O 59μl10×PCR緩衝液10μl
50mM MgCl25μl10mM dNTP 2μl25pmol/μl RIG.F781*2μl25pmol/μl GD.R22μl第二鏈產物 20μl*備註RIG.F781，5』ACTCATAGGCCATAGAGGCCTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAG3』(SEQ ID NO13)，在GD.F1、GD.F3、GD.F5-Bio以及RIG.F751-Bio的下遊退火，並引入一個SfiI位點用於cDNA的5』克隆。該引物用於巢式PCR擴增RIG Exon1特異第二鏈cDNA。
(b)啟動熱循環器94℃ 3分鐘，加入1μl Taq(5U/μl，Gibco-BRL)，加入1μl 0.1U/μl的Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)，將步驟(c)到(e)循環10次做PCR(c)94℃ 30秒，(d)60℃ 40秒，(e)72℃ 3分鐘。
然後進行以下步驟完成PCR(f)94℃ 30秒，(g)60℃ 40秒，(h)72℃ 3分鐘，(i)72℃，每個循環20秒，共10個循環，(j)72℃ 5分鐘，(k)維持於4℃。
(15)用50μl EB將文庫材料洗脫後，加入10μl NEB緩衝液2、40μldH2O和2μl SfiI，並於50℃消化1小時將樣品進行消化，以便在由正向引物(RIG.F781；SEQ ID NO13)編碼的SfiI位點處切割cDNA的5』端。
(16)SfiI消化後，向每份樣品中加入5μl 1M NaCl和2μl NotI，於37℃將樣品消化1小時以便在由第一鏈引物(GD.R1；SEQ ID NO10)所編碼的NotI位點處切割cDNA的3』端。
(17)然後，在1％低熔點瓊脂糖凝膠上分離消化過的cDNA。從膠上切下大小為1.2Kb到8Kb範圍的cDNA。
(18)用Qiaex II Gel Extraction(Qiagen)從切下的瓊脂糖凝膠上回收cDNA。在總共10μl的1XT4連接酶緩衝液(NEB)中，用400單位T4 DNA連接酶(NEB)將2μl cDNA(大約30mg)與7μl(35ng)pBS-HSB(用SfiI/NotI線性化過的)連接在一起。
(19)用得自步驟(18)的0.5μl連接反應混合物轉化成大腸桿菌DH10B。
(20)回收103個菌落/0.5μl連接的DNA。
(21)用引物M13F20和JH182(RIG Exon1特異性)經PCR在12.5μl體積中如下篩選這些菌落的外顯子(a)將100μl LB(含有選擇抗生素)分裝到適當數量的96孔培養板中(b)挑選出單菌落，接種到96孔培養板的各個孔中，將培養板在37℃培養廂中不震蕩放置2-3小時。
(c)在冰上如下製備PCR反應的「主混物」
(d)將10μl主混合物分裝到PCR反應板的每個孔中(e)從每份100μl大腸桿菌培養物中取2.5μl移入PCR反應板上的相應孔中(f)採用典型的PCR循環條件進行PCR反應(i)94℃/2分鐘(細菌裂解和質粒變性)，(ii)92℃變性15秒；60℃引物退火20秒；72℃引物延伸40秒；做30個循環，(iii)72℃最終延伸5分鐘，
(iv)維持於4℃。
(g)向PCR反應中加入溴酚藍；將樣品混勻、離心，然後將全部反應混合物裝入瓊脂糖凝膠上。
(23)在所篩選的200個克隆中，78％是載體外顯子陽性的。這些克隆中的96個作為小量製備物，並依照Qiagen小量製備手冊(1997年4月)用Qiagen96孔turbo-prep純化。
(24)將2μl DNA同時用NotI、BamHI、XhoI、HindIII、EcoRI在NEB緩衝液3中(總體積為22μl)進行消化，然後在1％瓊脂糖凝膠上電泳來除去許多重複克隆。
結果用所述方案篩選兩個不同的cDNA文庫。在第一個文庫(TMT#1)中，將分離到的活化基因中的8個測序。在這8個基因中，4個基因編碼已知的完整膜蛋白質，6個是新基因。在第二個文庫(TMT#2)中，將11個分離到的活化基因進行測序。11個基因中，一個基因編碼已知的完整膜蛋白質，一個基因編碼部分測序的與一個完整膜蛋白同源的基因，9個是新基因。在分離出的基因對應已做鑑定的已知基因的所有情況下，該基因是完整膜蛋白質。
以下顯示分離自每個文庫的基因的示範性的顯著性比對(得自GenBank)TMT#1顯著性比對179761|gb|M76559|HUMCACNLB人神經DHP-敏感性電壓依賴性，鈣通道α-2b亞單位mRNA完整CD長度＝3600＞gi|3183974|emb|Y10183|HSMEMD人MEMD蛋白質的mRNA長度＝4235TMT#2顯著性比對＞gi|476590|gb|U06715|HSU06715人細胞色素B561，HCYTO B561，mRNA部分CD長度＝2463
＞gi|2184843|gb|AA459959|AA459959 zx66c01.sl soares總胚胎Nb2HF89w人cDNA克隆7964143』類似於gbJ03171幹擾素α受體前體(人)長度＝431。
實施例6使用poly(A)陷阱載體活化內源基因HT1080細胞(1×107細胞)用50rad137Cs源照射，並用15μg線性化的pRIG14(圖29A-29B)進行電穿孔。轉染後，將細胞以每皿5×106細胞的濃度鋪入150mm培養皿中。24小時之後，加入3μg/ml嘌呤黴素。於37℃，在3μg/ml嘌呤黴素存在下將細胞保溫12天。每5天換一次培養基。第12天時，計數集落數目，細胞用胰蛋白酶消化，並重新鋪於新培養皿上。將細胞培養至90％鋪滿，收集細胞以進行冷凍儲存和基因分離。一般每1×107個轉染細胞產生1000-3000個集落。
實施例7使用二元poly(A)陷阱/SAT載體活化內源基因1×107HH1細胞(HPRT陰性HT1080細胞)用50rad137Cs源照射，並用15μg線性化的pRIG-22進行電穿孔。轉染後，將細胞以每皿5×106細胞的濃度鋪入150mm培養皿中。24小時之後，新黴素加至500μg/ml G481。於37℃，在500μg/ml G481存在下將細胞保溫4天。培養基用含有500μg/mlG481和AgThg的新鮮培養基置換，並在這兩種藥物存在下再培養7天。或者，作為HPRT活性的對照，培養基用含有500μg/ml G481和HAT(得自LifeTechnologies，Inc.，Rockville，MD，並以廠商推薦的濃度使用)的新鮮培養基置換，並在這兩種藥物存在下再培養7天。轉染後的第12天時，計數集落數目，細胞用胰蛋白酶消化，並重新鋪於新培養皿上。將細胞培養至90％鋪滿，收集細胞以進行冷凍儲存和基因分離。一般說來，細胞經過G418/AgThg選擇之後，每1×107個轉染細胞產生1000-3000個集落。與之形成對照的是，細胞經過G418/HAT選擇之後，每1×107個轉染細胞產生約100個集落。
實施例8分離已活化的基因使用本發明的方法將非-靶向基因活化載體整合至真核細胞基因組。通過將載體整合至多個細胞中，產生了文庫，其中細胞表達不同的載體活化基因。使用商用RNA分離試劑盒從這些細胞中分離RNA。在此實施例中，使用Poly(A)Tract 1000(Promega)從細胞中分離RNA。將RNA轉變為cDNA，進行擴增，大小分級分離，並克隆至質粒中以進行分析和測序。以下是該方法的簡述
1)將4ml GTC提取緩衝液(Poly(A)Tract 1000試劑盒-Promega)放置於15ml聚碳酸酯螺旋蓋試管中，並加入168μl 2-巰基乙醇，置於70℃水浴上。
2)針對每一個經處理的細胞沉澱物，將8ml稀釋緩衝液置於15ml聚碳酸酯螺旋蓋試管中，加入168μl 2-巰基乙醇，並置於70℃水浴上。
3)取出在-80℃儲存的細胞沉澱物(1×107-1×108個細胞)，所述細胞含有整合至其基因組的非-靶向基因活化載體。立即移取4ml GTC提取緩衝液至細胞沉澱物上。上下吸取幾次，直至沉澱物被重懸，將細胞懸浮液轉移至15ml翻蓋(snap cap)聚丙烯試管中。
4)加入8ml稀釋緩衝液，通過倒轉進行混合。
5)加入10μl(500pmol)生物素化的寡dT引物並混合。
6)在70℃水浴上放置5分鐘，每2分鐘反轉一次以確保均勻受熱。
7)於25℃，用Sorvall HB-6轉頭，以7800rpm(10k×g)離心10分鐘。在此期間，通過使用Poly(A)Tract系統1000磁體，用6ml 0.5×SSC將6ml鏈黴親和素-順磁顆粒(SA-PMP)洗滌3次。
8)洗滌3次之後，將SA-PMP重懸於6ml 0.5×SSC中。
9)移液以從RNA製品中取出上清液，加入經重懸的SA-PMP(取上清液時要小心，不能破壞沉澱物)。
10)混合SA-PMP/RNA，並在室溫下保溫2分鐘。
11)通過使用Poly(A)Tract系統1000磁體捕獲磁珠。應注意由於液體的粘度高，因此使所有珠沉澱需要較長時間。
12)倒出上清液，使用2ml移液管將珠重懸於1.7ml 0.5×SSC中，並轉移至2ml螺旋蓋試管中。
13)使用所述磁體捕獲SA-PMP，並通過用P1000移液除去上清液。
14)加入1.7ml 0.5×SSC，將試管反轉幾次以進行混合。
15)將步驟14和15再重複兩次。
16)將SA-PMP重懸於1ml無核酸酶的水中，反轉幾次以進行混合。
17)捕獲SA-PMP，移出mRNA。
18)將0.5ml mRNA置於兩個經矽烷化的eppendorf管的每一個中，加入50μl經DEPC-處理的3M NaOAc溶液和0.55ml異丙醇。反轉幾次以進行混合，並置於-20℃放置至少4小時。
19)以最大RPM(14k)離心mRNA 10分鐘。
20)小心移出上清液，用200μl 80％乙醇通過以14K RPM再次離心2分鐘而洗滌沉澱物。應注意沉澱物的顏色經常為棕色或棕黃色。這種顏色是由殘留的SA-PMP引起的。
21)取出洗滌試劑，讓沉澱物在室溫下風乾不超過10分鐘。
22)將每份沉澱物重懸至5μl，並且集中到一個試管中。
23)以14K RPM離心2分鐘以除去殘留的SA-PMP，並小心取出mRNA。
24)通過將0.5μl稀釋至99.5μl水中，並測定OD260來測定mRNA的濃度。注意1 OD 260＝40μg RNA。
25)將PCR儀維持在4℃，通過連續添加以下成分建立受試樣品和陰性對照(HT1080)的第一鏈反應步驟142μl DEPC處理過的ddH2O4μl 10mM每種dNTP8μl 0.1M DTT16μl 5×MMLV第一鏈緩衝液5μl(10pmol/μl)GDR11μl RNAsin(Promega)4μl(1.25μg/μl)mRNA步驟270℃ 1分鐘步驟3維持於42℃步驟41分鐘後，加入2μl SuperScript II(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)，37℃保溫30分鐘步驟594℃ 2分鐘步驟64℃/∞步驟7加入2μl RNase，37℃保溫10分鐘步驟84℃/∞26)在1％瓊脂糖凝膠上分析8μl cDNA以檢查cDNA合成，並使用得自Qiagen的PCR純化(cleanup)試劑盒，通過將70μl第一鏈反應產物轉移入1.5ml矽烷化的eppendorf管，並加入400μl PB，來純化其餘的cDNA。
27)轉移至PCR純化柱，以最大RPM離心2分鐘。
28)將柱子拆下，傾析出徑流，加入750μl PE，以最大RPM離心2分鐘。
29)將柱子拆下，傾析出徑流，以最大RPM離心2分鐘以便乾燥樹脂。
30)用50μl EB經轉移柱洗脫至新的矽烷化的eppendorf管中，然後以最大RPM離心2分鐘。
31)在室溫下建立第二鏈cDNA合成H2O 8.5μl10×PCR緩衝液 5μl50mM MgCl22.5μl10mM dNTPs1μl25pmol/μl GDF5Bio10μl25pmol/μl GDR2 10μl第一鏈產物15μl步驟994℃ 1分鐘步驟1060℃ 10分鐘加入0.25μl Taq聚合酶步驟1160℃ 2分鐘步驟1272℃ 10分鐘步驟1394℃ 1分鐘步驟14最少再回到「步驟11」4次步驟1560℃ 2分鐘步驟1672℃ 10分鐘步驟17結束32)用STE洗3次以製備100μl SA-PMP，並使用磁體進行收集。最後一次洗滌之後，將珠重懸於150μl STE中。
33)使用Qiagen的PCR純化試劑盒純化第二鏈反應產物。洗脫至50μlEB中，並將第二鏈反應產物加入150μl PMP中。
34)室溫下溫和混合30分鐘。
35)結合後，利用磁體收集SA-PMP，並回收徑流物質(保留此物質！)。
36)磁珠用500μl STE洗3次，再用NEB 2(1×)洗1次。
37)將磁珠重懸於100μl NEB 2(1×)中。
38)加入2μl SfiI，於50℃消化30分鐘，每10分鐘溫和混合一次。
39)用磁體回收純化的cDNA，並小心除去上清液。
40)將產物轉移至新試管中，以最大RPM離心2分鐘以除去所有的珠。
41)建立PCR反應以特異性擴增RAGE活化的cDNA。
H2O 37μl10×PCR緩衝液 10μl10mM dNTPs 2μl25pmol/μl GDF 781 10μl25pmol/μl GDR210μl第二鏈產物 25μl步驟194℃ 2分鐘步驟294℃ 45秒步驟360℃ 10分鐘加入0.5μl Taq聚合酶步驟472℃ 10分鐘步驟660℃ 2分鐘步驟772℃ 10分鐘步驟8循環至步驟5，8更多次步驟994℃ 45秒步驟1060℃ 2分鐘步驟1172℃ 10分鐘，每輪循環+20秒步驟12循環至步驟9，14更多次步驟1372℃ 5分鐘步驟14維持於4℃42)通過在1％瓊脂糖凝膠上分析，檢查HT1080的PCR擴增對文庫物質的特異性。如果cDNA擴增的特異性高，則可以使用Qiagen PCR純化試劑盒來純化PCR產物。
43)用50μl EB將文庫物質洗脫後，加入10μl NEB2、40μl dH2O和2μl SfiI，並於50℃消化1小時。
44)加入5μl 1M NaCl和2μl NotI，於37℃消化1小時。
45)製備並電泳1％低熔點瓊脂糖凝膠，並在凝膠上電泳文庫物質。對物質進行觀察後，切下大小為500bp到10Kb的片斷。
46)用Qiaex II Gel Extraction Protocol(Qiagen)從瓊脂糖上回收文庫DNA，並將DNA洗脫至10μl EB中。在10μl總體積中將5μl該物質與4μl pBS-HSB(SfiI/NotI)或pBS-SNS連接在一起。
47)每40μl大腸桿菌細胞用0.5μl已連接的DNA轉化。
48)挑選菌落，在LB中培養過夜，分離質粒。
49)通過限制性消化和DNA測序分析基因活化的cDNA插入物。
實施例9從扣除型cDNA庫中分離活化基因按實施例8步驟1-24所述，使用Poly-A Tract 1000系統(Promega)製備未經轉染的HT1080細胞的純化mRNA，按下述，使用EZ-LinkTM BiotinLC-ASA試劑(Pierce)使其生物素化1)在矽烷化的微量離心管中加入25μl經DEPC-處理的dH2O和15μl含有10μg HT1080 mRNA，將離心管置於冰上。
2)在柔和的光線下工作，在反應管中加入40μl已製備好的LC-ASA儲備試劑(於100％乙醇中，濃度為1mg/ml)。
3)在離心管上方5cm處設置紫外線(波長為365nm)，使用該紫外線照射反應混合物15分鐘。
4)通過按廠商的說明，使反應混合物流經無RNase的MicroSpin P-30柱(BioRad)，從經標記的HT1080 mRNA中除去未連接的生物素試劑。
HT1080細胞用poly(A)陷阱pRIG活化載體轉染，並按實施例1所述在選擇培養基中培養以產生耐藥集落群。按實施例8所述，使用Promega Poly-ATract 1000系統從集中的集落中製備純化的mRNA。按實施例8步驟25所述，使用寡GD.R1(TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT)(SEQ ID NO10)，由5μg此mRNA製備第一鏈cDNA。使反應混合物流經Qiagen PCR快速純化柱，將純化的第一鏈cDNA回收至100μl EB中。
按下述進行生物素化的HT1080 mRNA(扣除群體)與製備自經pRIG-轉染之集落超級庫的第一鏈cDNA(靶群體)的扣除雜交1)將9μg生物素化的mRNA加入含有0.5μg第一鏈cDNA的0.5ml微量離心管中。
2)在該管中加入1/100體積的10mg/ml糖原，1/10體積的3M醋酸鈉，pH5.5和2.6倍體積的100％乙醇，然後混合。
3)將該管於-80℃放置1小時，然後在微量冷凍離心管中離心20分鐘。
4)使經沉澱的核酸團排水(drain)，用70％乙醇洗滌1次，然後風乾。
5)用5μl HBS(50mM HEPES，pH7.6；2mM EDTA；0.2％ SDS；500mMNaCl)使沉澱物溶劑化，在上面覆蓋5μl輕(light)礦物油，然後加熱至95℃達2分鐘，接著置於68℃放置24小時。
6)用100μl HB(不含SDS的HBS)稀釋反應混合物，並用100μl氯仿提取1次以除去油。
7)將經稀釋的雜交混合物加至300μl經鏈黴親和素包被的順磁顆粒(Promega)，所述順磁顆粒已用300μl HB預洗了3次。
8)室溫下將混合物保溫10分鐘，通過磁捕獲從溶液中除去SA-PMP和結合的生物素-mRNADNA雜合體。
9)將步驟7和8重複1次。
10)對經清洗的溶液再進行一輪扣除雜交及對所捕獲的雜合體的磁去除(步驟1-9)，不同之處如下步驟6用2×PCR緩衝液(40mM Tris-HCl，pH8.4；100mM KCl)稀釋雜交反應物。
步驟7用1×PCR緩衝液預先洗滌PMP。
根據實施例8，步驟31所述的熱循環，通過混合45μl第一鏈cDNA，7μl dH2O，5μl 50mM MgCl2，2μl 10mM每種dNTP的預混物，1μl 10×PCR緩衝液，20μl 12.5pmol/μl GD19F1-Bio(5』生物素-CTCGTTTAGTGCGGCCGCTCAG-ATCACTGAATTCTGACGACCT)(SEQ ID NO14)，20μl12.5pmol/μl GD.R2(TTTTCGTCAGCGGCCGCATC)(SEQ ID NO12)和0.5μl Taq聚合酶，使用2次-扣除的第一鏈cDNA產生第二鏈cDNA。按實施例8，步驟32-49所述，擴增第二鏈cDNA產物，對其進行進一步加工以產生基於大腸桿菌的cDNA文庫。
實施例10選擇性捕獲被RIG-活化的轉錄物按實施例6所述，用pRIG19活化載體(圖30A-30C)轉染HT1080細胞，並在選擇培養基中培養2周。根據廠商說明，使用TRIzol試劑(LifeTechnologies，Inc.，Rockville，MD)，從含有108個細胞的沉澱物中製備總RNA，並將總RNA溶解於720μl經DEPC-處理的dH2O(dH2ODEPC)。通過混合80μl NEB 10×緩衝液2，8μl Promega RNasin和20μl RO1 Promega無RNase的DNase，於37℃保溫30分鐘，依次用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿提取，與1/10體積的醋酸鈉(pH5.5)混合，用2倍體積的100％乙醇沉澱RNA，並將乾燥的RNA沉澱物溶解於dH2ODEPC中至終濃度為4.8μg/μl，即可從RNA製品中除去汙染的基因組DNA。
通過在2ml不含RNase的微量離心管中混合150μl總RNA，150μlHBDEPC(50mM HEPES，pH7.6；2mM EDTA；500mM NaCl)，3μl PromegaRNasin和2.5μl(25pmol/μl)寡GD19.R1-Bio(見表1)，然後於70℃保溫5分鐘，接著於50℃保溫15分鐘，可從總細胞RNA庫中選擇性捕獲得自pRIG19-活化基因的mRNA轉錄物。用磁力捕獲1ml得自Promega的經鏈黴親和素包被的順磁顆粒(SA-PMP)，用1.5ml 0.5×SSC洗滌共3次，所得SA-PMP不重懸。將溫熱的寡核苷酸RNA雜交反應物直接加至含有半-幹SA-PMP的試管中。室溫下保溫10分鐘之後，用1ml 0.5×SSC將SA-PMP洗滌3次。
表1引物和寡核苷酸序列
最終的磁捕獲之後，將SA-PMP懸浮於190μl dH2ODEPC中，於68℃保溫15分鐘。通過暴露於磁力中以固定化PMP，將含有RIG-活化轉錄物的清亮溶液轉移至微量離心管中。將63μl被捕獲的RIG-活化轉錄物轉移至PCR管中，其中按下述使用PCR程序「1+2CDNA」進行第一和第二鏈cDNA合成
步驟14℃/∞在含有RIG-活化的轉錄物的PCR管中加入20μl 5×Gibco BRL RT緩衝液，1μl Promega RNasin，10μl 100mM DTT，5μl各為10mM的dNTP預混物，1μl 25pmol/μl寡核苷酸GD.R1(見表1)。
步驟270℃ 3分鐘步驟342℃ 10分鐘步驟4加入2.5μl SuperScript II(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)，37℃保溫1小時步驟594℃ 2分鐘步驟64℃/∞在第一鏈cDNA混合物中加入2μl Stratagene RNase-It，並於37℃將混合物保溫15分鐘。在反應物中加入600μl Qiagen PB試劑，然後轉移至Qiagen PCR純化柱，並根據廠商提供的方法進行處理。從柱上將cDNA洗脫至50μl EB中，並轉移至PCR管中。按實施例9所述，使用寡核苷酸GD19.F2-Bio(表1)和GD.R2(表1)進行第二鏈cDNA反應。按實施例9所述，將第二鏈產物捕獲在Promega SA-PMP上，不同之處在於最終的SA-PMP懸浮液在1×NEB 4緩衝液中，使用限制性內切核酸酶AscI從顆粒上將捕獲的cDNA裂解下來。按實施例9所述，使用寡核苷酸GD19.F2和GD.R2擴增第二鏈cDNA產物，使用內切核酸酶SfiI和NotI消化經擴增的cDNA，並在克隆之前對cDNA進行大小選擇。通過將cDNA集合體從Qiagen PCR純化柱上洗脫至30μl EB中，獲得最終的cDNA純品。使11μl cDNA與4μl5×GibcoBRL連接酶緩衝液，4μl預先用SfiI，NotI和CIP消化而製備的pGD5載體DNA混合。加入1μl T4 DNA連接酶，於16℃將反應混合物保溫過夜。使用1μl連接反應產物轉化電-感受態大腸桿菌DH10B細胞，隨後將大腸桿菌細胞塗布於含有12.5μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上。一般每μl轉化的連接混合物可回收60至80個細菌菌落。
實施例11選擇性捕獲被RIG-活化的轉錄物按實施例6所述，用pRIG19活化載體轉染HT1080細胞，並在選擇培養基中培養2周。根據廠商說明，使用TRIzol試劑(Life Technologies，Inc.，)，從含有108個細胞的沉澱物中製備總RNA，並將總RNA溶解於720μl經DEPC-處理的dH2O(dH2ODEPC)。通過混合80μl NEB 10×緩衝液2，8μlPromega RNasin和20μlRO1 Promega無RNase的DNase，於37℃保溫30分鐘，依次用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿提取，與1/10體積的醋酸鈉(pH5.5)混合，用2倍體積的100％乙醇沉澱RNA，並將乾燥的RNA沉澱物溶解於dH2ODEPC中至終濃度為4.8μg/μl，即可從RNA製品中除去汙染的基因組DNA。
通過在2ml不含RNase的微量離心管中混合150μl總RNA，150μlHBDEPC(50mM HEPES，pH7.6；2mM EDTA；500mM NaCl)，3μl PromegaRNasin和2.5μl(25pmol/μl)寡核苷酸GD19.R1-Bio(見表1)，然後於70℃保溫5分鐘，接著於50℃保溫15分鐘，可從總細胞RNA庫中選擇性捕獲得自pRIG19-活化的基因的mRNA轉錄物。用磁力捕獲1ml得自Promega的經鏈黴親和素包被的順磁顆粒(SA-PMP)，用1.5ml 0.5×SSC洗滌共3次，所得SA-PMP不重懸。將溫熱的寡核苷酸RNA雜交反應產物直接加至含有半-幹SA-PMP的試管中。室溫下保溫10分鐘之後，用1ml 0.5×SSC將SA-PMP洗滌3次。最終的磁捕獲之後，將SA-PMP懸浮於190μl dH2ODEPC中，於68℃保溫15分鐘。通過暴露於磁力中以固定化PMP，將含有RIG-活化的轉錄物的清亮溶液轉移至微量離心管中。將63μl被捕獲的RIG-活化轉錄物轉移至PCR管中，其中按下述使用PCR程序「1+2CDNA」進行第一和第二鏈cDNA合成步驟14℃/∞在含有RIG-活化轉錄物的PCR管中加入20μl 5×GibcoBRL RT緩衝液，1μl Promega RNasin，10μl100mM DTT，5μl各為10mM的dNTP預混物，1μl 25pmol/μl寡核苷酸GD.R1(見表1)。
步驟270℃ 3分鐘步驟342℃ 10分鐘步驟4加入2.5μl SuperScript II(Life Technologies，Inc)，37℃保溫1小時步驟594℃ 2分鐘步驟660℃/∞；在保持溫度的同時加入下列物質2μl 50mM MgCl2，1μl 25pmol/μl寡核苷酸GD19.F1-Bio(見表1)和2μl Stratagene RNase-It。10分鐘之後，加入0.5μl Taq DNA聚合酶(Life Technologies，Inc)，並繼續循環步驟772℃ 10分鐘步驟84℃/∞
將100μl體積的cDNA反應混合物轉移至1.5ml矽烷化的微量離心管中，依次用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿提取，將水相轉移至新管中，於37℃置於真空離心蒸發濃縮器(Speed-vac)中5分鐘。通過加入74μl dH2O，20μl NEB 10×緩衝液2，2μl 1mg/ml BSA，4μl SfiI，並於50℃保溫1小時，然後加入10μl 1M NaCl，4μl NotI並於37℃再保溫1小時，而對cDNA進行限制性消化。依次用等體積的苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿提取反應混合物，然後通過加入1/100體積的10mg/ml糖原，1/30體積的3M醋酸鈉，pH7.5和2倍體積的100％無水乙醇，並於-80℃冷凍1小時以沉澱cDNA。用70％乙醇將cDNA沉澱物洗滌1次，風乾15分鐘，然後在5μl dH2O，1μl 10×NEB連接酶緩衝液，4μl預先用SfiI，NotI和CIP消化而製備的pGD5載體DNA中溶解。加入0.5μl T4 DNA連接酶，於16℃將反應混合物保溫過夜。在連接反應物中加入10μl dH2O，使用0.5μl連接反應物轉化電-感受態大腸桿菌DH10B細胞。一般每μl轉化的連接混合物可回收6至10個菌落。
實施例12連接活化載體與基因組DNA並轉染至人的細胞根據已公開的方法(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，(1989))，從人細胞系HT1080(108個細胞)中收集基因組DNA。在導致不完全消化的條件下用BamHI消化分離的基因組DNA。通過在反應中滴加BamHI即可達到此目的。每個反應中含有10μg基因組DNA，和濃度為0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56，5.62或11.24個單位的BamHI。於37℃保溫1小時之後，通過苯酚提取，然後進行乙醇沉澱以終止反應。通過瓊脂糖凝膠電泳分離來自每個反應的經消化的DNA。混合主要含有10kb至400kbDNA的反應以與活化載體連接。然後將集中的經消化的基因組DNA加入含有經BamHI線性化的活化載體的1×連接緩衝液中。加入連接酶(LifeTechnologies，Inc，40個單位)，於16℃將連接反應物保溫24小時。連接之後，根據廠商提供的方法，使用LIPOFECTIN(Life Technologies，Inc)將基因組DNA/活化載體轉染至HT1080細胞。任選地，在轉染之前或之後照射HT1080細胞。當照射細胞時，發現劑量範圍為0.1rad至200rad最有效。轉染之後，在完全培養基中培養細胞。在轉染之後36小時，在培養基中加入G418(300μg/ml)。在選擇之後10至14天，集中，擴增和收集耐藥克隆。從收穫的細胞中收集總RNA或mRNA。然後使用本文所述的方法(例見上文實施例8)合成和分離得自載體活化基因的cDNA。
實施例13用活化載體共轉染BAC重疊群克隆根據已公開的方法(Shizuya等，美國國家科學院學報898794(1992))，在pUniBAC(圖34A-34B)中產生基因組文庫。一般說來，基因組片斷的大小可以為1kb至500kb，優選為50kb至500kb。在大腸桿菌中增殖BAC文庫。為了製備轉染用的質粒，將文庫塗布於含有12.5μg/ml氯黴素的LB瓊脂平板上。每個150mm平板上出現約1000個克隆。培養和選擇之後，通過加入LB從每個瓊脂平板上洗下菌落併集中起來。在1升LB/12.5μg/ml氯黴素中將每份集中的菌落(約10000個克隆)培養過夜。然後使用商用試劑盒(Qiagen)從每份集中的菌落中分離BAC質粒。
用I-Ppo-I消化純化的BAC克隆，該酶裂解BAC載體上側翼於克隆位點的唯一位點。由於I-Ppo-I是非常罕見的切割酶，它不會消化絕大多數基因組DNA插入物。消化之後，根據廠商說明，使用LIPOFECTIN(LifeTechnologies，Inc)將線性化的基因組文庫克隆共轉染至HT1080細胞。簡單地說，在a-MEM(無血清)中混合10μg BAC基因組DNA與1μg線性化的pRIG20(圖31A-31C)。在DNA中加入5μg LIPOFECTIN，室溫下保溫混合物15分鐘。然後將DNA/LIPOFECTIN混合物加入6孔平皿的105HT1080細胞中。在無血清的a-MEM中將細胞與DNA/LIPOFECTIN保溫12小時，洗滌細胞，並將其於a-MEM/10％FBS中放置36小時。為了選擇已整合了載體和基因組DNA的細胞，將經轉染的細胞重新鋪於10cm平皿中，在300μg/ml G418存在下保溫10天。按本文實施例8所述擴增並收集耐藥克隆以分離活化的cDNA分子。
實施例14將活化載體體外整合至純化的基因組DNA中並將整合產物轉染至宿主細胞中使用公開的方法(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，(1989)；Shizuya等，美國國家科學院學報898794(1992))，分離基因組DNA並將其克隆至細菌人工染色體pUniBAC(圖34A-34B)中。將基因組插入物連接至pUniBAC之後，將該質粒轉化至大腸桿菌菌株DH10B(Life Technologies，Inc)，並在四環素上進行選擇。將各個細菌克隆集中為含有約1000個成員的庫。在1升LB/四環素中將每個庫培養至飽和。使用商用試劑盒(Qiagen)從細菌中分離含有基因組DNA插入物的pUniBAC質粒。
對每個pUniBAC克隆庫而言，於37℃，將2μg文庫與50ng活化載體pRIG-T和1個單位的突變的Tn5轉座酶一起保溫2小時(轉座酶可得自Epicentre Technologies)。保溫之後，將pUniBAC克隆轉化至DH10B細胞中，並進行氯黴素選擇。組合每個庫中的所有集落，並在1升LB/氯黴素上培養。根據廠商說明，使用Qiagen Tip-500柱收穫質粒。
對每個庫而言，根據廠商說明，使用30μg Ex-gen 500(MBI Fermentas)將20μg文庫轉染至2×106個HT1080細胞。在轉染後48小時，將細胞置於含有3μg/ml嘌呤黴素的培養基中。在嘌呤黴素存在下培養10天之後，集中，擴增並收穫耐藥克隆以發現基因。為了分離經載體活化的基因，可按實施例8所述分離每個細胞庫的mRNA，將其轉變為cDNA，並克隆至質粒中。通過限制性消化和測序分析各個cDNA克隆。
實施例15由克隆的基因組DNA產生蛋白質表達文庫按實施例13和14所述，在pUniBAC中產生含有基因組DNA插入物(平均大小為100kb)的基因組文庫。(注意在本發明的一些實施方案中，將基因組片段克隆至活化載體的線性化位點，其中活化載體優選為YAC，BAC，PAC或基於粘粒的載體)。在此實施例中，按實施例14所述，利用體外轉座將活化載體pRIG-TP整合至BAC基因組文庫。圖36中顯示了pRIG-TP。整合之後，將文庫質粒轉化至大腸桿菌，在氯黴素平板上選擇含有整合的pRIG-TP載體的BAC載體。集中菌落，在LB/四環素中培養至飽和。使用商用試劑盒(Qiagen)收集BAC質粒。
對於每次轉染而言，根據廠商說明，使用30μg Ex-gen 500(MBIFermentas)將20μg BAC文庫轉染至2×106個HT1080細胞。在轉染後48小時，將細胞置於含有3μg/ml嘌呤黴素的培養基中。選擇10天之後，集中並擴增耐藥克隆。將經擴增的耐藥克隆庫分成獨立的組以進行冷凍，蛋白質生產和附加體擴增。
為了分離並檢測活化的分泌蛋白，收集培養物上清液，儲存於-80℃直至用於特定的試驗。從細胞裂解物(通過本領域已知的任何方法製備)中收集被活化的細胞內蛋白質並用於體外試驗。
為了擴增BAC附加體的拷貝數，用濃度漸增的氨甲碟呤選擇細胞。在這些實驗中，氨甲碟呤的起始濃度為20nM。每過7天使氨甲碟呤的濃度加倍直至得到抗5μM的細胞。在每個氨甲碟呤濃度，取出一部分細胞進行儲存和蛋白質生產。如對非-氨甲碟呤選擇的細胞的所述，從這些細胞中收集經活化的分泌型和細胞內的蛋白質。
為了清楚理解的目的，通過闡述和實施例對本發明進行詳細描述後，本領域技術人員容易想到，可以在更寬和等效的條件配方以及其他參數範圍內對本發明進行改進或變化，而不會影響本發明的範圍或其任何具體實施方案，並且所述改進或變化包括在所附權利要求書的範圍內。
本說明書提及的所有出版物、專利和專利申請用於表明與本發明相關的本領域技術人員的技術水平，此處相同程度地引入作為參考文獻，並視作每篇出版物、專利和專利申請均是具體並單獨地引入作為參考文獻。
權利要求
1.一種載體構建體，其含有(a)與第一個未配對的剪接供體序列可操作相連的第一個轉錄調控序列；和(b)與第二個未配對的剪接供體序列可操作相連的第二個轉錄調控序列。
2.權利要求1的載體構建體，其中所述第一個轉錄調控序列與所述第二個轉錄調控序列方向相同。
3.權利要求1的載體構建體，其中所述第一個轉錄調控序列與所述第二個轉錄調控序列方向相反。
4.權利要求2或權利要求3的載體，其中所述載體已線性化。
5.一種載體構建體，其依次含有(a)轉錄調控序列；(b)未配對的剪接供體位點；(c)罕見的切割限制性位點；和(d)線性化位點。
6.一種載體構建體，其依次含有(a)轉錄調控序列；(b)含有罕見的切割限制性位點的外顯子；(c)未配對的剪接供體位點；和(d)線性化位點。
7.權利要求6的載體構建體，其進一步含有第二個罕見的切割限制性位點，所述位點位於所述未配對的剪接供體位點和所述線性化位點之間。
8.一種載體構建體，其含有與缺少聚腺苷酸化信號的選擇標記可操作相連的第一個轉錄調控序列，並進一步含有與未配對的剪接供體位點可操作相連的第二個轉錄調控序列。
9.權利要求1或權利要求8的載體構建體，其中所述第一個轉錄調控序列或所述第二個轉錄調控序列是啟動子。
10.權利要求9的載體構建體，其中所述啟動子選自CMV立即早期基因啟動子，SV40 T抗原啟動子，四環素-誘導型啟動子和β-肌動蛋白啟動子。
11.權利要求5至7中任一項的載體構建體，其中所述轉錄調控序列是啟動子。
12.權利要求11的載體構建體，其中所述啟動子選自CMV立即早期基因啟動子，SV40 T抗原啟動子，四環素-誘導型啟動子和β-肌動蛋白啟動子。
13.權利要求8的載體構建體，其中所述選擇標記選自新黴素基因、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、嘌呤黴素基因、二氫乳清酸酶基因、穀氨醯胺合成酶基因、組氨酸D基因、氨甲醯磷酸合成酶基因、二氫葉酸還原酶基因、多抗藥性1基因、天冬氨酸轉氨甲醯酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、腺苷脫氨酶基因和胸苷激酶基因。
14.含有權利要求1，5，6，7和8中任一項的載體構建體的真核宿主細胞。
15.權利要求14的真核宿主細胞，其中所述細胞是動物細胞。
16.權利要求15的真核宿主細胞，其中所述動物細胞選自哺乳動物細胞，昆蟲細胞，禽細胞，環節動物細胞，兩棲動物細胞，爬行動物細胞和魚細胞。
17.權利要求15的真核宿主細胞，其中所述動物細胞是哺乳動物細胞。
18.權利要求17的真核宿主細胞，其中所述哺乳動物細胞是人的細胞。
19.權利要求14的真核宿主細胞，其中所述細胞是植物細胞。
20.權利要求14的真核宿主細胞，其中所述細胞是真菌細胞。
21.權利要求20的真核宿主細胞，其中所述真菌細胞是酵母細胞。
22.權利要求15的真核宿主細胞，其中所述細胞是分離的細胞。
23.權利要求15的真核宿主細胞，其中所述載體構建體整合至所述宿主細胞的基因組中。
24.一種引物分子，其含有可通過PCR擴增的序列和簡併的3』末端，其中所述引物分子具有以下結構5』-(dT)a-X-Nb-TTTATT-3』其中a是從1至100的整數，X是可通過PCR擴增的序列，它由長度約為10至20個核苷酸的核酸序列組成，N是任何核苷酸，b是從0至6的整數。
25.權利要求24的引物分子，其中所述可通過PCR擴增的序列含有一個或多個限制性位點。
26.權利要求24的引物分子，其中a是從10至30的整數。
27.權利要求24的引物分子，其中所述引物分子含有一個或多個與所述引物分子的一個或多個鹼基偶聯的半抗原分子。
28.權利要求27的引物分子，其中所述半抗原分子選自生物素，地高辛配基，抗體，酶，脂多糖，脫鐵運鐵蛋白，鐵運鐵蛋白，胰島素，細胞因子，細胞外基質蛋白，整聯蛋白，錨蛋白，C3bi，血纖蛋白原，血影蛋白，細胞因子受體，胰島素受體，運鐵蛋白受體，多粘菌素B，內毒素-中和蛋白(ENP)，酶-特異性底物，蛋白A，蛋白G，細胞表面Fc受體，抗體-特異性抗原，抗體-特異性肽，親和素和鏈黴親和素。
29.權利要求27的引物分子，其中所述半抗原分子是生物素。
30.合成第一條cDNA鏈的方法，所述方法包括(a)使權利要求24的引物與RNA模板分子退火，形成引物-RNA複合物，和(b)在有利於逆轉錄所述引物-RNA複合物的條件下，用逆轉錄酶和一種或多種脫氧核苷分子處理所述引物-RNA複合物以合成第一條cDNA鏈。
31.一種載體構建體，其含有與未配對的剪接供體序列可操作相連的轉錄調控序列和一個或多個可擴增標記，其中所述載體構建體不含同源靶向序列。
32.一種載體構建體，其含有轉錄調控序列，可擴增標記和病毒複製起點。
33.一種載體構建體，其含有選擇標記，與翻譯起始密碼子可操作相連的轉錄調控序列，分泌信號序列，表位標記和未配對的剪接供體位點。
34.一種載體構建體，其含有與翻譯起始密碼子可操作相連的轉錄調控序列，分泌信號序列，表位標記，序列-特異性蛋白酶位點和未配對的剪接供體位點。
35.一種載體，其含有(a)與翻譯起始密碼子可操作相連的轉錄調控序列；(b)編碼4個或更多個胺基酸長的胺基酸序列的核酸序列，其中所述胺基酸序列單獨不足以構成信號肽活性，但當所述核酸序列與內源基因的外顯子聯合或位於所述外顯子上遊時，足以構成信號肽活性；和(c)未配對的剪接供體位點。
36.權利要求33至35中任一項的載體構建體，其中所述構建體進一步含有一個或多個可擴增標記。
37.權利要求31和33至35中任一項的載體構建體，其中所述轉錄調控序列是啟動子。
38.權利要求37的載體構建體，其中所述啟動子是病毒啟動子。
39.權利要求38的載體構建體，其中所述病毒啟動子是巨細胞病毒立即早期基因啟動子。
40.權利要求38的載體構建體，其中所述啟動子是非-病毒啟動子。
41.權利要求38的載體構建體，其中所述啟動子是誘導型啟動子。
42.含有權利要求31至35中任一項的載體構建體的細胞。
43.含有權利要求36的載體構建體的細胞。
44.權利要求42的細胞，其中所述載體構建體已整合至細胞基因組中。
45.權利要求43的細胞，其中所述載體構建體已整合至細胞基因組中。
46.權利要求44或45的細胞，其中通過用所述載體構建體上的所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因。
47.權利要求42的細胞，其中所述細胞是分離的細胞。
48.權利要求43的細胞，其中所述細胞是分離的細胞。
49.製備宿主細胞的方法，所述方法包括將權利要求31至35中任一項的構建體導入細胞。
50.產生內源細胞基因或其部分的表達產物的方法，所述方法包括(a)將權利要求31至35中任一項的構建體導入含有基因組的細胞；(b)通過非同源重組將所述構建體整合至所述細胞的基因組中；和(c)在所述細胞中過表達所述內源基因。
51.權利要求50的方法，其中所述過表達在體外完成。
52.權利要求50的方法，其中所述過表達在體內完成。
53.權利要求50的方法，其進一步包括從所述細胞中分離所述表達產物。
54.一種細胞文庫，其含有被權利要求31至35中任一項的構建體轉化的細胞集合，其中所述構建體通過非-同源重組整合至所述細胞的基因組中。
55.獲得細胞文庫的基因產物的方法，所述方法包括篩選權利要求54的文庫中所述基因產物的表達，從所述文庫中選擇過表達所述基因產物的細胞，和從所述經選擇的細胞中獲得所述基因產物。
56.產生內源細胞基因的表達產物的方法，所述方法包括(a)在細胞中導入載體，所述載體含有與分泌信號序列可操作相連的轉錄調控序列和未配對的剪接供體序列；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因或其部分的所述細胞；和(e)在有利於所述細胞產生所述內源基因或其部分的表達產物的條件下培養所述細胞。
57.權利要求56的方法，其進一步包括分離所述表達產物。
58.在體內細胞中過表達內源基因的方法，所述方法包括(a)在細胞中導入載體，所述載體含有轉錄調控序列；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；和(e)在有利於所述細胞在體內過表達所述內源基因的條件下將所述分離並克隆的細胞導入動物。
59.在體內產生內源細胞基因的表達產物的方法，所述方法包括(a)在細胞中導入載體，所述載體含有與未配對的剪接供體序列可操作相連的轉錄調控序列；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；和(e)在有利於所述細胞在體內過表達所述內源基因的條件下將所述分離並克隆的細胞導入動物。
60.產生內源細胞基因的表達產物的方法，所述方法包括(a)在細胞中導入載體，所述載體含有轉錄調控序列和一個或多個可擴增標記；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；(e)在所述載體和所述內源基因能在所述細胞中擴增的條件下培養所述細胞；和(f)在有利於所述細胞產生所述內源基因的表達產物的條件下培養所述細胞。
61.權利要求60的方法，其進一步包括分離所述表達產物。
62.權利要求60的方法，其中所述載體進一步包括與所述轉錄調控序列可操作相連的剪接供體位點。
63.權利要求60或權利要求62的方法，其中所述內源基因或其部分編碼選自下列的蛋白質紅細胞生成素、胰島素、生長激素、葡糖腦苷脂酶，組織纖溶酶原活化物、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ，白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、TGF-β，凝血因子V，凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、TSH-β、骨生長因子-2、骨生長因子-7，腫瘤壞死因子、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III，白血病抑制因子、胰高血糖素、蛋白C、蛋白激酶C、幹細胞因子、促卵泡激素β、尿激酶、神經生長因子、胰島素樣生長因子、促胰島素、甲狀旁腺激素、乳鐵蛋白、補體抑制因子、血小板衍生生長因子，角質細胞生長因子、肝細胞生長因子、內皮細胞生長因子、神經營養蛋白-3、血小板生成素、絨膜促性腺激素、血栓調節蛋白、α糖苷酶、表皮生長因子，成纖維細胞生長因子，細胞表面受體、跨膜離子通道、膽固醇受體、脂蛋白受體、整聯蛋白、細胞骨架錨蛋白、免疫球蛋白受體和CD抗原。
64.權利要求60或權利要求62的方法，其中所述內源基因或其部分編碼紅細胞生成素蛋白。
65.權利要求60或權利要求62的方法，其中所述內源基因或其部分編碼生長激素蛋白。
66.權利要求60或權利要求62的方法，其中所述內源基因或其部分編碼G-CSF蛋白。
67.由權利要求60或權利要求62的方法產生的基因表達產物，其中所述基因表達產物是選自下列的蛋白質紅細胞生成素、胰島素、生長激素、葡糖腦苷脂酶，組織纖溶酶原活化物、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ，白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、TGF-β，凝血因子V，凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、TSH-β、骨生長因子-2、骨生長因子-7，腫瘤壞死因子、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III，白血病抑制因子、胰高血糖素、蛋白C、蛋白激酶C、幹細胞因子、促卵泡激素β、尿激酶、神經生長因子、胰島素樣生長因子、促胰島素、甲狀旁腺激素、乳鐵蛋白、補體抑制因子、血小板衍生生長因子，角質細胞生長因子、肝細胞生長因子、內皮細胞生長因子、神經營養蛋白-3、血小板生成素、 絨膜促性腺激素、血栓調節蛋白、α糖苷酶、表皮生長因子，成纖維細胞生長因子，細胞表面受體、跨膜離子通道、膽固醇受體、脂蛋白受體、整聯蛋白、細胞骨架錨蛋白、免疫球蛋白受體和CD抗原。
68.由權利要求60或權利要求62的方法產生的基因表達產物，其中所述基因表達產物是紅細胞生成素蛋白。
69.由權利要求60或權利要求62的方法產生的基因表達產物，其中所述基因表達產物是生長激素蛋白。
70.由權利要求60或權利要求62的方法產生的基因表達產物，其中所述基因表達產物是G-CSF蛋白。
71.在體內細胞中過表達內源基因的方法，所述方法包括(a)在細胞中導入載體，所述載體含有轉錄調控序列和一個或多個可擴增標記；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；和(e)在有利於所述細胞在體內過表達所述內源基因的條件下將所述經分離和克隆的細胞導入動物。
72.權利要求56，58至60，62和71中任一項的方法，其中所述轉錄調控序列是啟動子。
73.權利要求72的方法，其中所述啟動子是病毒啟動子。
74.權利要求73的方法，其中所述病毒啟動子是巨細胞病毒立即早期啟動子。
75.權利要求72的方法，其中所述啟動子是非-病毒啟動子。
76.權利要求72的方法，其中所述啟動子是誘導型啟動子。
77.權利要求56、58-60、62和71中任一項的方法，其進一步包括在所述載體發生整合之前或同時向所述細胞基因組DNA中導入雙鏈斷裂。
78.權利要求49的方法，其進一步包括在所述載體發生整合之前或同時向所述細胞基因組DNA中導入雙鏈斷裂。
79.權利要求50的方法，其進一步包括在所述載體發生整合之前或同時向所述細胞基因組DNA中導入雙鏈斷裂。
80.由權利要求56、58-60、62和71中任一項的方法產生的基因表達產物。
81.權利要求56、58-60、62和71中任一項的方法，其中所述載體構建體是線性的。
82.在細胞中產生內源基因的表達產物的方法，所述方法包括(a)在至少一個分離的含有基因組的細胞中導入載體，所述載體含有轉錄調控序列；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；和(e)在減少血清的培養基中培養所述細胞。
83.發現蛋白質的方法，所述方法包括(a)在至少一個分離的含有基因組的細胞中導入載體，所述載體含有轉錄調控序列；(b)通過非同源重組將所述載體整合至所述細胞的基因組中；(c)在用所述轉錄調控序列上調內源基因而允許所述細胞過表達該基因或其部分的條件下，在減少血清的培養基中培養所述細胞，從而產生細胞-條件培養基；和(d)篩選所述細胞-條件培養基中所述基因或其部分的表達產物的存在。
84.權利要求83的方法，其進一步包括在(d)中篩選之前濃縮所述細胞-條件培養基。
85.權利要求82至84中任一項的方法，其中所述方法包括高流通量的試驗。
86.產生內源細胞基因的表達產物的方法，所述方法包括(a)將含有轉錄調控序列的載體導入細胞；(b)使所述載體通過非同源重組整合至所述細胞的基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；(d)篩選過表達所述內源基因的所述細胞；(e)在有利於所述細胞產生所述內源基因的表達產物的條件下培養所述細胞；和(f)從等同於至少10升濃度為104個細胞/ml的細胞生物量中分離所述表達產物。
87.權利要求82至84和86中任一項的方法，其中所述載體進一步含有一個或多個可擴增標記。
88.權利要求82至84和86中任一項的方法，其中所述載體進一步含有未配對的剪接供體位點。
89.不需利用表型已知的內源基因的任何序列信息而提高該基因的細胞內原位表達的方法，該方法包括以下步驟(a)構建包含可擴增標記，轉錄調控序列和未配對的剪接供體序列的載體；(b)將載體拷貝遞送至大量細胞中；(c)在允許在插入的載體和細胞基因組之間發生非同源重組的條件下培養細胞；(d)通過分析所述內源基因的表型來篩選重組細胞以便鑑定其中所述基因的表達已被增強的細胞；和(e)選擇所述可擴增標記和所述內源基因的表達均已增強的細胞。
90.權利要求89的方法，其中所述表型是特定蛋白質的產生，通過檢測該蛋白質產量的增加來進行分析。
91.一種其基因組中包含插入的基因構建體的分離細胞，所述基因構建體包含可擴增標記和轉錄調控序列，其中所述構建體插入基因或基因的上遊區域並活化該基因的表達，並且該基因和該基因的上遊區域不含與所述基因構建體同源的核苷酸序列。
92.權利要求91的細胞，其中所述基因構建體進一步含有外顯子-未配對的剪接供體序列。
93.權利要求91或權利要求92的分離的細胞，其中所述基因編碼選自下列的蛋白質紅細胞生成素、胰島素、生長激素、葡糖腦苷脂酶，組織纖溶酶原活化物、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、幹擾素α、幹擾素β、幹擾素γ，白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-6、白介素-8、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、TGF-β，凝血因子V，凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、TSH-β、骨生長因子-2、骨生長因子-7，腫瘤壞死因子、α-1抗胰蛋白酶、抗凝血酶III，白血病抑制因子、胰高血糖素、蛋白C、蛋白激酶C、幹細胞因子、促卵泡激素β、尿激酶、神經生長因子、胰島素樣生長因子、促胰島素、甲狀旁腺激素、乳鐵蛋白、補體抑制因子、血小板衍生生長因子，角質細胞生長因子、肝細胞生長因子、內皮細胞生長因子、神經營養蛋白-3、血小板生成素、絨膜促性腺激素、血栓調節蛋白、α糖苷酶、表皮生長因子，成纖維細胞生長因子，細胞表面受體、跨膜離子通道、膽固醇受體、脂蛋白受體、整聯蛋白、細胞骨架錨蛋白、免疫球蛋白受體和CD抗原。
94.權利要求91或權利要求92的分離的細胞，其中所述基因編碼紅細胞生成素蛋白。
95.權利要求91或權利要求92的分離的細胞，其中所述基因編碼生長激素蛋白。
96.權利要求91或權利要求92的分離的細胞，其中所述基因編碼G-CSF蛋白。
97.增強基因表達的方法，所述方法包括(a)將載體導入細胞基因組，所述載體含有增強子序列和一或多個可擴增標記，其中所述載體缺少基因特異性靶向序列；(b)篩選所述細胞中表達內源基因的那些；和(c)選擇所述可擴增標記和所述內源基因的表達均已增強的細胞。
98.權利要求97的方法，其進一步包括分離其中所述內源基因的表達已增強的細胞。
99.增強內源基因在細胞中表達的方法，包括(a)使載體通過非同源重組整合到細胞內，所述載體含有增強子序列和一個或多個可擴增標記；(b)篩選表達所述內源基因的非同源重組細胞，其中所述增強子序列具有活性的該基因和該基因的上下遊區域與所述載體沒有同源性；和(c)選擇所述可擴增標記和所述內源基因的表達均已增強的細胞。
100.其基因組中包含插入的人工基因構建體的分離細胞，所述基因構建體包含一個或多個可擴增標記和能有效增強基因在所述細胞內表達的增強子，其中所述基因構建體被插入基因或基因的上遊或下遊區域，其中增強子序列具有活性的該基因及其上下遊區域與所述基因構建體沒有同源性。
101.權利要求53，56，58-60，62，71，82-84和86中任一項的方法，其中所述內源基因編碼跨膜蛋白。
102.權利要求89，97和99中任一項的方法，其中所述基因編碼細胞跨膜蛋白。
103.權利要求58，59，62和71中任一項的方法，其進一步包括在將所述細胞導入動物之前分離並克隆所述細胞。
104.權利要求58，59，62和71中任一項的方法，其中所述動物是哺乳動物。
105.權利要求104的方法，其中所述哺乳動物是人。
106.鑑定能表達內源基因的細胞的方法，所述內源基因編碼一種完整的膜蛋白，所述方法包括(a)將載體導入細胞中，所述載體含有(i)與含有起始密碼子的外顯子序列可操作相連的轉錄調控序列，(ii)信號序列，和(iii)表位標記，其後緊接著未配對的剪接供體位點；(b)使所述載體通過非同源重組整合到所述細胞基因組中；(c)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因或其部分；和(d)篩選所述細胞中能在其表面表達所述表位標記的那些。
107.鑑定能表達內源基因的細胞的方法，所述內源基因編碼一種完整的膜蛋白，所述方法包括(a)從真核宿主細胞中分離基因組DNA；(b)將所述分離的基因組DNA與載體組合以形成基因組DNA-載體複合物，所述載體含有(i)與含有起始密碼子的外顯子序列可操作相連的轉錄調控序列，(ii)信號序列，和(iii)表位標記；(c)將所述基因組DNA-載體複合物導入真核宿主細胞；(d)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因；和(e)篩選所述細胞中能在其表面表達所述表位標記的那些。
108.鑑定能表達內源基因的細胞的方法，所述內源基因編碼一種完整的膜蛋白，所述方法包括(a)從真核宿主細胞中製備cDNA；(b)將所述分離的cDNA與載體組合以形成cDNA-載體複合物，所述載體含有(i)與含有起始密碼子的外顯子序列可操作相連的轉錄調控序列，(ii)信號序列，和(iii)表位標記，其後緊接著未配對的剪接供體位點；(c)將所述cDNA-載體複合物導入真核宿主細胞；(d)通過用所述轉錄調控序列上調內源基因而在所述細胞中過表達該基因；和(e)篩選所述細胞中能在其表面表達所述表位標記的那些。
109.權利要求106至108中任一項的方法，其進一步包括分離表達所述表位標記的所述細胞。
110.權利要求109的方法，其進一步包括從所述分離的細胞中分離所述過表達的內源基因。
111.一種載體，其含有(a)與外顯子和未配對的剪接供體位點可操作相連的第一個啟動子；和(b)與缺少聚腺苷酸化信號的選擇標記可操作相連的第二個啟動子。
112.權利要求111的載體，其中所述第一個和第二個啟動子以相同的方向位於所述載體上。
113.權利要求112的載體，其中所述載體是線性的，其中所述選擇標記位於所述第一個啟動子的3』方向。
114.權利要求112的載體，其中所述載體是線性的，其中所述第二個啟動子位於所述未配對的剪接供體位點的5』方向。
115.權利要求111的載體，其中所述外顯子缺少翻譯起始密碼子。
116.權利要求111的載體，其中所述外顯子含有翻譯起始密碼子。
117.權利要求111的載體，其中所述外顯子含有翻譯起始密碼子和信號分泌序列。
118.一種載體構建體，其含有(a)第一個啟動子；(b)正選擇標記；(c)負選擇標記；和(d)未配對的剪接供體位點，其中所述正和負選擇標記和所述剪接供體位點在所述載體構建體上的取向使得當所述載體構建體以在所述載體-編碼的剪接供體位點和基因組-編碼的剪接受體位點之間發生剪接的方式整合至真核宿主細胞基因組時，所述正選擇標記以活性形式被表達，所述負選擇標記或者不表達，或者以無活性的形式被表達。
119.權利要求118的載體，其中所述正和負選擇標記以融合基因的形式存在。
120.權利要求118的載體，其中所述正選擇標記，所述負選擇標記，或者所述正和負選擇標記缺少聚腺苷酸化位點。
121.權利要求118的載體，其中所述載體進一步含有與第二個未配對的剪接供體位點可操作相連的第二個啟動子。
122.含有第一個啟動子和第二個啟動子的載體，所述第一和第二個啟動子的方向相同，其中(a)所述第一個啟動子，而不是所述第二個啟動子，與未配對的剪接供體位點可操作相連；和(b)所述載體在所述第一個啟動子或所述第二個啟動子的下遊不含聚腺苷酸化信號。
123.權利要求122的載體，其中所述載體是線性的，其中所述第二個啟動子位於所述第一個啟動子的3』方向。
124.一種載體，其含有(a)與含有未配對的剪接供體位點的第一個選擇標記可操作相連的第一個啟動子；和(b)與第二個選擇標記可操作相連的第二個啟動子，其中所述第一個選擇標記和所述第二個選擇標記都不含聚腺苷酸化信號。
125.權利要求124的載體，其中所述第一個和第二個選擇標記是正選擇標記。
126.權利要求124的載體，其中所述第一個選擇標記位於所述第二個選擇標記的上遊。
127.一種載體，其含有(a)與第一個外顯子和第一個未配對的剪接供體位點可操作相連的第一個啟動子；和(b)與第二個外顯子和第二個未配對的剪接供體位點可操作相連的第二個啟動子，其中所述第一個外顯子的核苷酸序列不同於所述第二個外顯子的核苷酸序列。
128.權利要求127的載體，其中所述第一和第二個外顯子各含有翻譯起始密碼子和不被終止密碼子終止的開放閱讀框。
129.權利要求127的載體，其中所述第一個外顯子，所述第二個外顯子，或所述第一個和第二個外顯子缺少翻譯起始密碼子。
130.一種載體構建體，其含有(a)與正選擇標記可操作相連的第一個啟動子；(b)與負選擇標記可操作相連的第二個啟動子；和(c)未配對的剪接供體位點，其中所述正和負選擇標記和所述剪接供體位點在所述載體構建體上的取向使得當所述載體構建體以所述基因組中的內源基因被轉錄活化的方式整合至真核宿主細胞基因組時，所述正選擇標記以活性形式被表達，所述負選擇標記或者不表達，或者以無活性的形式被表達。
131.權利要求130的載體構建體，其進一步含有與第二個未配對的剪接供體位點可操作相連的第三個啟動子。
132.權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體，所述載體進一步含有一個或多個轉座信號。
133.權利要求111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體，所述載體進一步含有一個或多個可擴增標記。
134.權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體，所述載體進一步含有一或多個病毒複製起點。
135.權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體，所述載體進一步含有一個或多個病毒複製因子基因。
136.權利要求133的載體，其中所述可擴增標記選自二氫葉酸還原酶、腺苷脫氨酶、天冬氨酸轉氨甲醯酶、二氫乳清酸酶和氨甲醯磷酸合成酶。
137.權利要求134的載體，其中所述病毒複製起點選自EB病毒oriP和SV40 ori。
138.權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體，所述載體進一步含有基因組DNA。
139.一種宿主細胞，其含有權利要求31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體。
140.含有權利要求132的載體的宿主細胞。
141.含有權利要求133的載體的宿主細胞。
142.含有權利要求134的載體的宿主細胞。
143.含有權利要求135的載體的宿主細胞。
144.含有權利要求138的載體的宿主細胞。
145.權利要求139的宿主細胞，其中所述宿主細胞是分離的細胞。
146.權利要求140-144中任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是分離的細胞。
147.一種細胞文庫，其含有權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體。
148.含有權利要求132的載體的細胞文庫。
149.含有權利要求133的載體的細胞文庫。
150.含有權利要求134的載體的細胞文庫。
151.含有權利要求135的載體的細胞文庫。
152.含有權利要求138的載體的細胞文庫。
153.活化細胞中的內源基因的方法，其包括(a)用權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體轉染含有基因組的細胞；和(b)在適於所述載體非同源整合至所述細胞基因組內的條件下培養所述細胞，其中所述整合導致所述細胞基因組中內源基因的活化。
154.鑑定基因的方法，其包括(a)用權利要求1，5-7，8，31，32，35，111，118，122，124，127，130和131中任一項的載體轉染多個含有基因組的細胞；(b)在適於所述載體非同源整合至宿主細胞基因組的條件下培養所述細胞；(c)選擇其中所述載體已整合至基因組的細胞；(d)從所選細胞中分離RNA；(e)從所分離的RNA產生cDNA；和(f)通過對含有一或多個來自所述載體的核苷酸序列的一或多個cDNA分子進行分離來鑑定所述cDNA中的基因。
155.權利要求154的方法，其中(f)所述鑑定通過使所述cDNA與所述載體雜交而實現。
156.權利要求154的方法，其中(f)所述鑑定通過測序所述cDNA並將該cDNA的核苷酸序列與所述載體的核苷酸序列進行比較而實現。
157.權利要求124的載體，其中所述未配對的剪接供體緯度位於所述第一選擇標記的上遊或內部，從而當所述載體整合至真核宿主細胞的基因組中時，可將所述未配對的剪接供體位點剪接至基因組編碼的剪接受體位點處，然後使所述第一選擇標記以無活性形式表達或根本不表達。
158.分離細胞的方法，該細胞中一個單外顯子基因已活化，該方法包括(a)用權利要求157的載體轉染多個含有基因組的真核細胞；(b)在適於所述載體非同源整合至宿主細胞基因組的條件下培養所述細胞；(c)選擇其中第一和第二選擇標記均以非活性形式表達的細胞；
159.權利要求158的方法，進一步包括(d)從所選細胞中分離RNA；(e)從所分離的RNA產生cDNA；和(f)從所述cDNA分離一個單外顯子基因。
160.分離基因的外顯子I的方法，其包括(a)用權利要求111，112，114，122，124，和127中任一項的載體轉染一或多個含有基因組的真核細胞；(b)在適於所述載體非同源整合至所述細胞基因組的條件下培養所述細胞；(c)選擇其中所述載體已使含有一或多個外顯子的內源基因轉錄活化了的細胞；(d)從所選細胞中分離RNA；(e)從所分離的RNA產生cDNA；(f)回收含有所述載體的第一外顯子並已將該外顯子剪接至所述內源基因之第二外顯子處的cDNA分子，從而獲得一或多個被載體外顯子標記的cDNA分子；和(g)用所述被載體外顯子標記的cDNA分子回收含有外顯子I的活化的內源基因。
161.表達含基因外顯子I的轉錄物的方法，該方法包括(a)用權利要求111，112，114，122，124，和127中任一項的載體轉染一或多個含有基因組的真核細胞；(b)在適於所述載體非同源整合至所述細胞基因組的條件下培養所述細胞；(c)在適於含內源基因外顯子I的轉錄物表達的條件下培養所述細胞。
162.產生基因產物的方法，其包括(a)從真核細胞分離含有至少一個基因的基因組DNA；(b)通過體外轉座將所述分離的基因組DNA插入一種載體，從而形成一種基因組DNA-載體複合物，其中所述載體含有一或多個轉座信號、一或多個啟動子、一或多個外顯子、以及一或多個未配對的剪接供體位點；(c)將所述基因組DNA-載體複合物導入真核宿主細胞；和(d)在適於所述基因表達的條件下培養所述宿主細胞。
163.權利要求162的方法，進一步包括分離所述基因的表達產物。
164.產生由內源性細胞基因組的基因編碼的基因產物的方法，其包括(a)從真核細胞分離含有至少一個基因的基因組DNA；(b)將所述分離的基因組DNA插入權利要求111，112，114，122，124，和127任一項的載體中或與之組合，從而形成一種基因組DNA-載體複合物；(c)將所述基因組DNA-載體複合物轉染至適當的真核宿主細胞；和(d)在適於導致由所述基因組DNA-載體複合物中所述載體編碼的一或多個基因轉錄的條件下培養所述宿主細胞。
165.權利要求164的方法，進一步包括(e)分離由所述宿主細胞的轉錄產生的RNA；(f)從所述分離的RNA產生一或多種cDNA分子；和(g)回收在所述cDNA分子的5｀端含有載體序列的一或多種cDNA分子，從而分離所述基因。
166.權利要求164的方法，其中所述載體進一步包含一或多個轉座信號，且其中所述載體已通過體外轉座而插入所述分離的基因組DNA中。
167.權利要求164的方法，其中所述分離的基因組DNA出現在克隆載體中。
168.產生蛋白質的方法，其包括(a)從一或多種細胞分離基因組DNA；(b)將所述分離的基因組DNA插入權利要求111，112，114，122，124，和127任一項的載體中或與之組合，從而形成一種基因組DNA-載體複合物；(c)將所述基因組DNA-載體複合物轉染至適當的宿主細胞；和(d)在適於導致由所述基因組DNA-載體複合物中所述基因組DNA編碼的蛋白質表達的條件下培養所述細胞。
169.產生蛋白質的方法，其包括(a)從一或多種細胞分離基因組DNA；(b)將含有一或多個轉座信號以及與外顯子-未配對的剪接供體複合物可操作相連的轉錄調控序列的載體通過轉座而整合至所述分離的基因組DNA中，從而形成一種基因組DNA-載體複合物；(c)將所述基因組DNA-載體複合物轉染至適當的宿主細胞；和(d)在適於導致由所述基因組DNA-載體複合物中所述基因組DNA編碼的蛋白質表達的條件下培養所述細胞。
170.表達基因的方法，其包括(a)從一或多種真核細胞中分離含一或多個基因的基因組DNA；(b)使所述分離的基因組DNA與含有以下元件的載體組合(i)選擇標記，(ii)與翻譯起始密碼子可操作相連的轉錄調控序列，(iii)分泌信號序列，(iv)表位標記，和(v)未配對的剪接供體位點，從而形成一種載體-基因組DNA複合物；(c)將所述載體-基因組DNA複合物導入細胞；(d)選擇含所述載體-基因組DNA複合物的細胞；和(e)在適於所述載體-基因組DNA複合物所含基因表達的條件下培養所述細胞。
171.權利要求168的方法，其中選出的所述宿主細胞是在適於蛋白質表達的條件下培養之前、期間、或之後含有所述轉染的載體-基因組DNA複合物的細胞。
172.權利要求169的方法，其中所述載體進一步包含選擇標記，且其中選出的所述宿主細胞是在適於蛋白質或基因表達的條件下培養之前含有所述轉染的載體-基因組DNA複合物的細胞。
173.權利要求167的方法，其中所述克隆載體選自BAC、YAC、PAC、粘粒、噬菌體、和質粒。
174.權利要求164的方法，進一步包括分離所述蛋白。
175.由權利要求168的方法產生的蛋白質。
176.由權利要求170-172中任一項的方法產生的蛋白質。
177.由權利要求174的方法產生的蛋白質。
178.蛋白表達的方法，其包括(a)用含有與以下元件可操作相連的異源啟動子的載體轉染宿主細胞(i)異源外顯子，(ii)異源剪接供體位點，(iii)編碼基因或其一部分的基因組DNA片段，和(iv)一或多個選擇標記，其中所述異源外顯子缺乏翻譯起始密碼子或編碼翻譯起始密碼子及未被終止密碼子終止的開放閱讀框；(b)選擇含所述轉染的載體的細胞；和(c)在適於所述載體表達蛋白的條件下培養所選擇的轉染的宿主細胞。
179.權利要求178的方法，其中所述載體進一步包含病毒複製起點。
180.權利要求179的方法，其中所述病毒複製起點是EB病毒oriP。
181.一種載體，其包含(a)異源啟動子；(b)異源外顯子；(c)異源剪接供體位點；(d)編碼基因或其一部分的基因組片段；(e)一或多個選擇標記；和(f)一或多個病毒複製起點，其中所述異源外顯子缺乏翻譯起始密碼子或編碼翻譯起始密碼子及未被終止密碼子終止的開放閱讀框，且其中所述基因組片段的取向為所述異源啟動子、所述外顯子及所述剪接供體位點的下遊，以便通過將所述載體導入宿主細胞，可由所述基因組片段所編碼的基因或其一部分來表達蛋白。
182.權利要求181的載體，其中所述選擇標記缺乏聚腺苷酸化信號。
183.權利要求181的載體，進一步包括編碼一或多種病毒複製蛋白的一或多個基因。
184.權利要求181的載體，進一步包括可擴增標記。
185.含有權利要求181-184中任一項的載體的細胞。
186.權利要求185的細胞，其中所述細胞為分離的細胞。
187.權利要求8的載體構建體，其中所述第一個轉錄調控序列在所述載體構建體中與所述第二個轉錄調控序列的取向相同。
188.權利要求118或130的載體構建體，其中所述正選擇標記選自新黴素基因、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、嘌呤黴素基因、二氫乳清酸酶基因、穀氨醯胺合成酶基因、組氨酸D基因、氨甲醯磷酸合成酶基因、二氫葉酸還原酶基因、多抗藥性1基因、天冬氨酸轉氨甲醯酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、和腺苷脫氨酶基因。
189.權利要求118或130的載體構建體，其中所述負選擇標記選自次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因、胸苷激酶基因、和白喉毒素基因。
190.權利要求130的載體，其中所述負選擇標記位於所述正選擇標記的上遊。
191.一種穩定表達蛋白的宿主細胞，其中所述宿主細胞包含一種載體，該載體含有啟動子、外顯子/剪接供體複合物、和編碼所述蛋白或其部分的基因組片段，其中所述啟動子和外顯子/剪接供體複合物相對於所述基因組片段為異源性的。
192.權利要求191的宿主細胞，其中所述載體已整合至所述細胞的基因組中。
193.權利要求191的宿主細胞，其中所述載體進一步包含病毒的複製起點，且該載體已作為附加體維持在所述宿主細胞中。
194.權利要求190或192的細胞，其中所述載體進一步包含一或多個選擇標記。
195.權利要求192的細胞，其中所述病毒複製起點是EB病毒oriP。
196.一種激活內源基因的表達的方法，其包括(a)將適於激活內源基因的載體導入含有染色體的宿主細胞；(b)在導入所述載體之前或之後，用能誘導所述宿主細胞染色體中DNA斷裂的試劑處理所述細胞；和(c)將所述載體整合至所述DNA斷裂處，以便在所述載體和所述內源基因之間形成一種可操作的連接，從而所述內源基因可由載體編碼的一或多個核苷酸序列激活。
197.權利要求196的方法，其中(d)所述激活通過分離所述宿主細胞並在適於所述內源基因激活的條件下培養所述宿主細胞而實現。
198.一種載體，其包含(a)與基因可操作相連的轉錄調控序列；(b)病毒複製起點；和(c)可擴增標記。
199.一種增加基因表達的方法，其包括(a)將權利要求198的載體導入宿主細胞，其中所述載體作為附加體形式維持在所述宿主細胞內；和(b)選擇所述可擴增標記和所述基因增加的表達。
200.一種使來自未剪接的細胞轉錄分子的cDNA分子裂解的方法，其包括(a)將權利要求5或7的載體整合至一或多種真核宿主細胞的基因組中；(b)在適於從所述轉錄調控序列表達的條件下培養所述宿主細胞；(c)從所述宿主細胞分離RNA；(d)從所述分離的RNA產生cDNA；和(e)用在所述罕見的切割限制性位點裂解的酶消化所述cDNA。
201.一種藥物運送方法，其包括(a)將一種載體整合至真核宿主細胞的基因組中，其中所述載體整合激活了所述宿主細胞中內源基因的表達；(b)在有利於所述激活的基因表達的條件下培養所述細胞，從而產生所述激活的基因的基因產物；(c)用一或多種將被篩選其藥物活性的待檢化合物處理所述細胞；和(d)測定所述一或多種待檢化合物與所述基因產物的相互作用，或對所述基因產物所誘導的細胞表型的影響。
202.一種藥物運送方法，其包括(a)將一種載體整合至真核宿主細胞的基因組中，其中所述載體整合激活了所述宿主細胞中內源基因的表達；(b)在有利於所述激活的基因產生基因產物的條件下在減少血清的培養基中培養所述細胞，從而產生含有所述基因產物的細胞-條件培養基；(c)通過測定一或多種待檢化合物與所述基因產物在所述細胞-條件培養基中的相互作用而篩選所述待檢化合物的藥物活性。
203.權利要求202的方法，進一步在(c)所述篩選之前使所述細胞-條件培養基濃縮。
204.權利要求202的方法，進一步在(c)所述篩選之前使所述細胞-條件培養基濃縮。
全文摘要
本發明一般性地涉及通過原位重組法來活化基因表達或導致基因過表達。本發明還一般性地涉及使內源基因在細胞中以高於正常細胞中所見的水平進行表達的方法。在本發明的一個實施方案中,在整合到細胞中後,通過能活化內源基因表達的調控序列的非同源或非法重組,來活化或提高該內源基因的表達。在另一個實施方案中,通過共整合一或多個可擴增標記並針對整合載體上該一或多個可擴增標記的拷貝數增加來進行選擇,從而進一步提高所述內源基因的表達。在另一個實施方案中,本發明涉及通過將本發明提供的特化活化載體非靶向整合至宿主細胞基因組來活化內源基因。本發明還提供了鑑定,活化,分離和/或表達那些用目前技術無法發現的基因的方法,因為整合不需要靶序列。本發明還提供了分離編碼多種蛋白質,包括跨膜蛋白質的核酸分子(特別是cDNA分子)的方法,以及分離能表達這種可能是相對於細胞異源性的跨膜蛋白質的細胞的方法。本發明還涉及分離的基因、基因產物、核酸分子和含有這些基因、基因產物及核酸分子的組合物,還涉及含有這些基因及核酸分子的載體和宿主細胞,所述載體和宿主細胞可用於多種治療和診斷用途。因此,利用本發明,可以活化和分離內源基因,包括那些與人類疾病和發育相關的基因,而不需要預先知道這些基因的序列、結構、功能或表達特性。
文檔編號G01N33/15GK1384881SQ00806377
公開日2002年12月11日 申請日期2000年2月22日 優先權日1999年2月19日
發明者約翰·J·哈林頓, 布魯斯·舍夫, 史蒂芬·朗德萊特 申請人:阿瑟西斯公司