基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選及其應用方法
2023-10-09 08:39:49 2
專利名稱：基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選及其應用方法
技術領域：
本發明涉及一種人類白細胞抗原類型的測試鑑別方法，特別涉及用於基因晶片檢測方面的分型探針篩選和應用的方法。
背景技術：
人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen，簡稱HLA)就是人類的主要組織相容性複合物(Major HistocompatibilityComplex簡稱MHC)，它在免疫系統中對T細胞發育階段中的篩選、效應階段中的活性介導以及對NK細胞的抑制等方面發揮非常重要的作用。
人類白細胞抗原具有非常豐富的多態性，即在一個人群當中，對於同一種白細胞抗原，不同的個體可能攜帶有不同的等位基因。以2003年4月份IMGT/HLA公布的資料為例，HLA-B有519個等位基因，由於人是雙倍染色體，理論上存在的HLA-B種抗原的數目為134,940種。HLA的多態性和其在免疫系統中發揮的重要作用，決定了不同個體的免疫系統可能因具有不同的HLA抗原分子而具有不同的免疫優勢和劣勢。HLA的多態性還會造成了器官移植和骨髓移植中的排斥反應，若供者和受者具有不同的HLA等位基因，在進行器官移植或骨髓移植後就會有比較強的免疫排斥反應發生，造成移植失敗，因此，在移植前，必須對供者和受者進行高精度的HLA分型。
自1958年發現第一個白細胞抗原，人們就開始對白細胞抗原進行分型，其方法也在不斷進步。微量淋巴細胞毒試驗70年代就發展成熟，並在以後成為實際上的白細胞抗原分型的技術標準，但由於這種方法分型只能對活細胞分型且錯誤率高，目前正逐漸被基於DNA技術的各種方法所取代。IHWG(International HistocompatabilityWorking Group，國際組織相容性工作組)目前推薦的分型方法主要有三種SSOP，SBT，SSP，其中以SSOP方法最受推崇。SSOP(SequenceSpecific Oligonucleotide Probe)即序列特異性寡核苷酸。這種方法靈敏度，特異性，穩定性都比較好，是目前幾種方法中較優的一種，但也存在不少缺點，如操作時間比較長，大概需3個工作日；需昂貴設備等等。NMDP(National Marrow Donor Program)是美國國家骨髓庫，其於1992-1993以及1997-1999年期間分別完成了對II白細胞抗原和I白細胞抗原分型方法由血清學技術(微量淋巴細胞毒試驗)到基於DNA技術(SSOP)的轉換。與血清學技術方法相比，各種基於DNA技術的各種方法確實有諸多優點，但這也帶來了分型標準的混亂，世界各國的骨髓庫和各地的分型實驗室在使用不同的分型試劑與分型方法來進行白細胞抗原分型，各種分型試劑的解析度穩定性都不相同，給數據的交流帶來很多麻煩。
基因晶片技術是最近於生物技術領域內出現的一種新方法，它能高通量平行性的獲得待測樣本的大量信息，這是傳統的生物學方法難以達到的。基因晶片由固相載體(一般為玻璃)和固定於其上的DNA探針組成，目前主要用於表達譜分析和突變檢測兩個領域。用於檢測鹼基突變的基因晶片的DNA探針的長度一般為十幾個到二十幾個鹼基，其序列與待檢測突變位點及突變位點兩側的序列互補，讓待檢測位點位於探針的中間位置(或接近中間)，根據待檢測位點出現的鹼基類型，設計幾條探針分別與之完全互補，這樣，在雜交時，待檢測樣品中的DNA會與序列與之完全匹配的探針結合，使該點有較強的螢光信號強度。根據各點螢光信號強度的不同，即可讀出待檢測樣品中的DNA序列。由於HLA各等位基因之間的差異本質上是在多態性位點上的核苷酸的差異，可以利用基因晶片技術來對其進行分型，而且利用基因晶片技術對HLA分型有許多傳統方法難以比擬的優勢，比如操作簡單，只需雜交掃描；效率高，雜交掃描能在兩個小時內完成，而且可以在同一張晶片上同時分型好幾份份樣品；自動化程度高，掃描以後的工作都可以由計算機來處理；成本低，合成一次寡核苷酸探針可以點數千張晶片，每張晶片都可以檢測幾份樣品。因此基於基因晶片技術的人類白細胞抗原分型方法很具有成為人類白細胞抗原分型技術標準的潛力。
目前世界上已有不少公司及實驗室在研究用基因晶片技術分型人類白細胞抗原的方法，但他們設計出的分型探針及由此生產的分型晶片都只達到中等解析度水平，而基因晶片用人類白細胞抗原高解析度分型探針的設計方法尚未有人描述，因為人類白細胞抗原高解析度分型探針比較難以設計，這主要有兩個原因第一，人類白細胞抗原的多態性非常豐富，在所有已發現的人類基因中其多態性最為豐富，如目前登錄的HLA-B抗原的等位基因已達519條，而且人是雙倍體，由HLA-B抗原的519條等位基因組成的合子與雜合子數目會達134940種之多，要對其設計高解析度分型探針，是一件很艱巨的工作，需要大量運算。
第二，人類白細胞抗原的多態性位點比較集中，I類白細胞抗原的多態性位點幾乎都集中在第二和第三外顯子的340bp內，II類白細胞抗原的多態性位點幾乎都集中在第二外顯子的260bp內。這些多態性位點，由於它們相互臨近，在對其中一個多態性位點設計探針時總會受到臨近多態性位點的幹擾，若按照對孤立多態性位點設計探針的方法來進行設計，很難獲得理想的探針，即便設計出了探針，也會對後面的探針調試，判定閥值確定帶來諸多麻煩。
發明內容
本專利公開了一種人類白細胞抗原高解析度、並且探針調試以及確定判定閥值容易的分型探針篩選及其應用方法，很好的解決了上述現有技術存在的問題。
本發明的技術方案如下首先設計一種基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，該方法包括如下步驟A.將人類白細胞抗原各等位基因的序列比對結果由網絡中下載到計算機的存儲器中，建立一個資料庫；B.讀取資料庫中所有白細胞抗原多態性位點的信息；C.檢測所有多態性位點，並將所有多態性位點按鹼基位置相互臨近的原則分為若干位點組；D.檢索同一多態性位點組內出現的所有組合，比較每兩種組合，找出鹼基類型不相同的鹼基位置形成新的數據組；E.根據數據組中每個多態性位點出現的情況確定分型探針的檢測位點；F.根據探針的檢測位點找出探針的序列；上述探針在基因晶片對人類白細胞抗原分型時的應用方法，包括以下步驟
①以上述方法確定探針檢測位點以及探針序列；②構建各等位基因對與各條探針匹配關係的判斷程序；③合成探針並將探針置於固相載體上；④PCR擴增樣品DNA，與晶片雜交並掃描；⑤由步驟②所建立的判斷程序判別步驟④掃描出來的結果，將完全匹配的判斷結果輸出，從而確定待測樣品的白細胞抗原型別。
依據本發明中設計的人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，提出了對多態性位點進行「分組」的解決方案，依此方法設計出來的分型探針，檢測位點定位準確並且包容性較強，解析度高。本發明的全部篩選過程全部由設計的一套計算機軟體來執行，所以，可以快速準確地篩選出理想的分型探針。而且本專利還描述了各種匹配關係表的構建方法及如何根據這些匹配關係表一步步由晶片雜交結果判斷出待測樣品的白細胞抗原類型，解決了該分型探針在實際工作中的應用問題。
圖1是各組合之間的空間位置關係圖。
圖2是各探針之間的空間位置關係圖。
具體實施例方式
本發明的具體實施方式
如下一種基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，該方法包括如下步驟A.將人類白細胞抗原各等位基因的序列比對結果由網絡中下載到計算機的存儲器中，建立一個資料庫；B.讀取資料庫中所有白細胞抗原多態性位點的信息；C.檢測所有多態性位點，並將所有多態性位點按鹼基位置相互臨近的原則分為若干位點組；D.檢索同一多態性位點組內出現的所有組合，比較每兩種組合，找出鹼基類型不相同的鹼基位置形成新的數據組；E.根據數據組中每個多態性位點出現的情況確定分型探針的檢測位點；F.根據探針的檢測位點找出探針的序列；所有人類白細胞抗原各等位基因的序列比對結果都可以從IMGT/HLA的網站上下載。對於I類白細胞抗原HLA-A，HLA-B，HLA-C等，只需下載第二和第三外顯子的比對結果，因為I類白細胞抗原的多態性位點幾乎都集中在第二和第三外顯子；對於II類白細胞抗原HLA-DRBI等，只需下載第二外顯子的比對結果，因為II類白細胞抗原的多態性位點幾乎都集中在第二外顯子。不管I類白細胞抗原還是II類白細胞抗原，在其各自的考察範圍內，即I類白細胞抗原的第二和第三外顯子與II類白細胞抗原的第二外顯子，都存在鹼基序列完全相同的等位基因，比如HLA-B抗原的等位基因B*0705和B*0706。在進行設計探針工作之前，要先合併具有相同鹼基序列的等位基因，得到具有唯一序列的等位基因比對結果。而且，不管I類白細胞抗原還是II類白細胞抗原都存在包含有序列插入或序列刪除變異的等位基因。所以，在步驟A中還設計有合併和刪除程序，可以先建立一個二維數組(比如alleleSeq)和一個TextStream變量(比如ts)，運用ts訪問磁碟上的數據，將每一個等位基因的序列讀入alleleSeq的每一行進行兩兩比較，合併序列完全相同的等位基因以及刪除包含有序列插入或序列刪除變異的等位基因，得到具有唯一序列的等位基因比對結果。
所述步驟B中的檢測過程是由計算機對步驟A所形成的資料庫中的單元位置進行掃描，忽略不具多態性的位點，顯示多態性位點的各相關信息，所述相關信息包括，在一致性序列中的鹼基類型、變異的鹼基類型以及變異鹼基出現的次數。多態性位點的各相關信息可以顯示在一Word表格內，例如表1所示內容表1(部分) 在表1中，第一列顯示的是各個多態性位點的位置，第二列顯示的是在該位置處佔優勢的鹼基類型，第三到第六列分別顯示A，G，C，T四種鹼基類型在各個多態性位點出現的次數。
在設計白細胞抗原分型探針時，經常碰到這樣的問題若干個多態性位點相距很近，連在一起或僅間隔兩三個鹼基，這時對其中任一點設計探針總會受到相鄰的多態性位點的幹擾，為解決這一問題，可將這些相互臨近的多態性位點作為一個整體來看待，即分為一組。步驟C的分組原則是將兩個多態性位點之間間隔的鹼基數目進行比較，根據實際需要可以將其差數小於3～6範圍內的分為一組，如果將其差數值確定為4或5，效果最佳。例如以變量pos1代表一個多態性位點的位置，以變量pos2代表另一個多態性位點的位置，如果(pos2-pos1)的絕對值小於其設定的差數值，則將它們歸入一組；表1中的第五列的多態性位點與第六列多態性位點之間間隔的鹼基數為1(32-30-1)，就應將它們劃為一組。根據以上的分組原則，可以將表(2)中的多態性位點分為7組，不同的字體表示不同的組。
所述步驟D是針對每個多態性位點組，從第一條等位基因開始逐個考察其組合的類型，記錄下來組合數以及所出現的新的組合類型，並自動形成比照表格，該表格行數為該組內組合數加一，列數為組合數加二；如表1中的多態性位點30，32，33所組成的一組所示，在多態性位點30出現了兩種鹼基類型，分為G和T；在多態性位點32出現了兩種鹼基類型，分為C和T；在多態性位點33出現了兩種鹼基類型，分為A和G，理論上講這三個多態性位點可以組成8種組合，分為GCA，GCG，GTA，GTG，TCA，TCG，TTA，TTG，我們只以已經發現的四種組合為例，分將其為TCG，GCA，GCG，GTA，列成比照表格，如表2所示表2
該表格的第一行以及第一列中分別填入各組合類型，進一步將上述組合類型進行兩兩比較，找出鹼基類型不相同的位置，填入該兩種組合類型相交的單元格內。
一個探針的檢測位點就是該條探針所要檢測的那個多態性位點，尋找探針檢測位點的步驟E是根據上面的比照表格，考察該表格的每一列中的多態性位點，如果存在一個多態性位點在該列的所有有效單元格內是否都出現，如果是則確定該多態性位點作為該探針的檢測位點，並填入該列的最下面一格；否則，就要確定多個多態性位點，使該列中的任一有效的單元格至少有選定的一個多態性位點出現，這些被選定的多態性位點就分別是每條探針的檢測位點，例如第二列中的多態性位點30在第三，四，五行中都出現，所以多態性位點30即可作為所要探針的檢測位點，將30寫在該列的最下單元格內。對於某一列，如果不存在一個多態性位點在所有的單元格都出現(處於左上到右下對角線上的那個單元格不在考慮範圍內)，就要確定2個或更多個多態性位點，使該列中的任一單元格至少有選定的一個多態性位點出現，例如第三列中的多態性位點32和33。統計該組中所設計探針的數量(即檢測位點的數目，因為一個檢測位點要設計一條探針)，並可以寫出返回探針數目的probe函數。
所述步驟E後還有優化分組程序，包括根據每組中多態性位點的數量多少進行優化組合和拆分程序，其中優化組合程序是對於組內多態性位點數量較少、兩個多態性位點之間間隔的鹼基數目大於3但小於10，暫分為一組，計算該組所需的探針數量，調用函數probe進行比較，如果前者多則放棄，如果後者多則將它們確定劃歸入同一組；對於組內大量多態性位點擁擠在一起，其中任意相鄰兩個多態性位點之間間隔的鹼基數都小於3～6，則將其拆分為多組，計算拆分後所需的探針數量，調用函數probe進行比較，如果前者多則放棄，如果後者多則按新組劃分，反覆比較，直至找到最佳分組方案後確定；並重新確定探針的檢測位點。例如，如果(pos2-pos1)的絕對值大於等於3但小於10，就要調用probe函數，若probe(pos1)加上probe(pos2)大於probe(pos1，pos2)，則將它們分入一組；否則將它們分為兩組。
輸出探針初步序列在本專利中，用如下的方式表示一條探針(組合類別，檢測位點位置)。如表2中的6條探針可以分別表示如下(TCG，30)，(GCA，32)，(GCA，33)，(GCC，30)，(GCC，33)，(GTA，32)。知道了探針的檢測位點後，找出探針的序列就是很簡單的事情了，所述步驟F是以確定的探針檢測位點為中心向左右各延伸6～13個鹼基，確定探針的序列，當然，向左右各延伸的鹼基數選擇8或9個，則更為理想。在多態性位點處的鹼基就是組合中顯示的鹼基類型，在非多態性位點處的鹼基就是一致序列中的鹼基類型。例如，表2中六條探針的初步序列顯示於表3中。
表3
在表3中，有下劃線的表示該位置是所在探針的檢測位點；小寫字母的表示該位點是多態性位點，但不是所在探針的檢測位點；大寫的字母表示該位點是非多態性位點。
本專利中對於計算機普通技術人員能夠輕易寫出的軟體程序不再贅述。
一種基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的應用方法，包括以下步驟①以上述方法確定探針檢測位點以及探針序列；②構建各等位基因對與各條探針匹配關係的判斷程序；③合成探針並將探針置於固相載體上；④PCR擴增樣品DNA，與晶片雜交並掃描；
表三比較單抗E11C與兩種試劑檢測G145R HBsAg的靈敏度
注結果以比色後的OD值表示實施例三B肝表面抗原檢測試劑盒的製備以本發明製備的抗突變HBsAg單抗代替常規B肝表面抗原檢測試劑盒中的HBsAb，其餘試劑和材料與常規B肝表面抗原檢測試劑盒中的一樣。檢測方法也與常規的B肝表面抗原檢測試劑盒一樣。
b.進一步建立雙倍體組合探針匹配關係表，建立雙倍體組合探針匹配關係表的方法是將任兩個組合類型配在一起並將它們與探針的匹配關係疊加在一起，疊加時遵循如下原則若一種組合在某一探針處顯示匹配的信號(P)，不管另一種組合在該探針處顯示的信號是否匹配(P、N或V)，則這兩種組合配對後與該探針相匹配(P)。若一種組合在某一探針處顯示不確定信號(V)，則不管另一種組合在該探針處顯示不確定信號還是不匹配信號(N或V)，這兩種組合配對後都會使該探針顯示不確定信號(V)；若兩種組合在某一探針處均顯示不匹配信號(N)，則這兩種組合配對後會使該探針顯示不匹配的信號(N)，如此可由表4派生出表5。
表5-30，32，33這一組內的雙倍體組合探針匹配表
按照以上原則，對所有的多態性位點組都可以建立起組合與探針的雙倍體匹配關係表，這一步的程序實現就是將各組合與各探針依次比較即可。
C.構建等位基因與組合的匹配關係表。比較每一條等位基因與每一組合的序列，判斷各條等位基因與各組合的匹配關係，若某一條等位基因的鹼基類型與某一組合的鹼基類型都一致，則該等位基因與該組合相匹配，用「+」號表示；若某一條等位基因與某一組合在一處或多處鹼基類型不相同，則該等位基因與該組合不相匹配。例如HLA-B抗原包含495條等位基因，224種組合，則HLA-B抗原的各等位基因與各組合的匹配關係表就是495條等位基因與224種組合之間的匹配關係表。在程序實現時，應先將各等位基因的序列讀入一個二維數組，然後將各組合依次與每條等位基因序列比較，將其結果輸出Excel表格。例如表6所示的為部分HLA-B抗原等位基因與組合的匹配關係表，C表示組合(Combination)之意表6
D.構建等位基因對與組合的匹配關係表。等位基因對就是所有的等位基因任意兩兩組合所形成的配對。本步驟只要在步驟C的基礎上，將組成該等位基因對的兩種等位基因與該組合的匹配關係疊加起來，即可得到該等位基因對與該組合的匹配關係。在程序實現時，可以用一個二維數組代表整張等位基因與組合的匹配關係表，然後依次將每兩條等位基因組成的等位基因對與各組合的匹配關係疊加輸出Excel表格。例如考察表6中等位基因B*0721與B*0722組成的等位基因對與組合C14和C15的匹配關係，發現B*0721與組合C14匹配，與組合C15不匹配；B*0722與組合C15匹配，與組合C14不匹配。由它們組成的等位基因對則既與C14匹配又與C15匹配。
E.合併處理。對各等位基因對與各組合的匹配關係做兩兩比較，合併具有相同組合匹配關係的等位基因對，構建出最終的各等位基因對與各組合的匹配關係表。對於這些等位基因對，由於具有相同的組合匹配關係，根據以上設計的探針將無法把它們區分開，例如HLA-B抗原的等位基因對B*070201+B*0801與等位基因對B*0705+B*0807具有相同的組合匹配關係，因此無法相互區分。
F.由晶片雜交結果判斷出各條探針的正負，根據雙倍體組合探針匹配關係表由各條探針的正負判斷出各組合的正負，根據最終的各等位基因對與各組合的匹配關係表由各組合的正負判斷出待測樣品的等位基因對，即待測樣品的白細胞抗原型別。
由圖1和圖2中可知，為了更加直觀清晰地顯示出各組合與各探針在空間位置上的相互關係，對每一種HLA抗原，最好繪製兩張圖，一張顯示各組合之間的空間位置關係，一張顯示各探針之間的空間位置關係。在做這兩張圖時，遵循如下原則對每一組合(或探針)，由上到下搜索各條等位基因，直到遇到第一條與該組合(或探針)匹配的等位基因，則在該處顯示該組合(或探針)的名字。圖1顯示的HLA-B抗原各組合空間位置圖表的一部分，圖2顯示的是HLA-B抗原各探針空間位置圖表的一部分。圖1中對組合的命名有一些本專利的約定，以Combi3-2-8為例，Combi表示Combination，即組合之意；3表示第三個多態性位點組，HLA-B抗原共152個多態性位點，被分為40組；2表示該組合是第三個多態性位點組中的第二種組合，第三個多態性位點組共有4種組合；8表示該組合在HLA-B抗原的所有組合中排在第八位，HLA-B抗原共有224種組合。被一個組合覆蓋的各鹼基用圓圈，小寫字母或方框顯示，圓圈或小寫字母表示該位點是多態性位點，方框表示該位點是非多態性位點。圖2中對探針的命名也有一些本專利的約定，以Probe4-1-13為例，Probe表示探針之意；4表示該探針是第四個多態性位點組所規定的探針；1表示該探針是第四多態性位點組規定的所有探針中的第一條，第四多態性位點組規定的探針共6條；13表示在HLA-B抗原的所有探針中該探針排在第13位，HLA-B抗原共有301條探針。被一個探針覆蓋的各鹼基用圓圈，小寫字母，X字或方框顯示，圓圈或小寫字母表示該位點是所在探針的檢測位點；X字表示該位點是多態性位點，但不是所在探針檢測位點；方框表示該位點是非多態性位點。
結果判定分為三步第一步、由各探針位點螢光信號的強弱來判斷各探針信號是正還是負，若某一探針位點的螢光信號值大於判定閥值，則該探針位點信號為正；若某一探針位點的螢光信號值小於判定閥值，則該探針位點信號為負。判定閥值應該由試驗來確定。第二步、在本專利中，每條探針都是隸屬於某一多態性位點組的，要先將隸屬於每一組的各探針都找出，根據同一多態性位點組內各組合與各探針的雙倍體匹配表，由各條探針信號的正負判定各組合的正負，即該組合在待測樣品中的DNA中是否出現。由晶片雜交結果判斷出的探針的信號有正負兩種狀態，在各組合與各探針的雙倍體匹配表中各組合與各探針的匹配關係有P，N和V三種情況，它們的對應關係如下「P」與「正」對應；」N」與「負」對應；「V」即可與「正」對應也可與「負」對應。比如在表5中，從Probe1到Probe6都是多態性位點30，32，33這一組所規定的探針，假如在一次雜交結果中它們的信號依次為+，-，-，+，+，-，從第二行到第十一行依次檢索表5，發現只有第七行(P，V，N，P，P，N)與此相匹配，所以該檢測樣品在這個多態性位點組的組合必為TCG+GCG，即這一多態性位點組的四種組合TCG，GCA，GCG，GTA的信號依次為+，-，+，-。按照以上原則，可依次判斷出每一種組合的正負信號。第三步、根據最終的經合併處理的各等位基因對與各組合的匹配關係表，由各組合的正負判斷出到底哪一對等位基因在待測樣品中出現，即白細胞抗原的最終分型結果。知道各個組合的正負信號後，可以從第一行開始依次檢索各等位基因對與各組合的匹配關係表，若在各等位基因對與各組合的匹配關係表發現一等位基因對，其與各組合的匹配關係與基因晶片檢測出的各組合的正負信號完全一致，則待測樣品的白細胞抗原即為該等位基因對的表達產物；若在各等位基因對與各組合的匹配關係表沒有發現一等位基因對，其與各組合的匹配關係與基因晶片檢測出的各組合的正負信號完全一致，則待測樣品的白細胞抗原可能為新的尚未被登記入人類白細胞抗原等位基因庫的抗原。
權利要求
1.一種基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於該方法包括如下步驟A.將人類白細胞抗原各等位基因的序列比對結果由網絡中下載到計算機的存儲器中，建立一個資料庫；B.讀取資料庫中所有白細胞抗原多態性位點的信息；C.檢測所有多態性位點，並將所有多態性位點按鹼基位置相互臨近的原則分為若干位點組；D.檢索同一多態性位點組內出現的所有組合，比較每兩種組合，找出鹼基類型不相同的鹼基位置形成新的數據組；E.根據數據組中每個多態性位點出現的情況確定分型探針的檢測位點；F.根據探針的檢測位點找出探針的序列。
2.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟A中還包括有合併和刪除程序，由資料庫中的每個單元數據進行兩兩比較，刪除序列完全相同的等位基因以及包含有序列插入或序列刪除變異的等位基因，得到具有唯一序列的等位基因比對結果。
3.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟B中的檢測過程是由計算機對步驟A所形成的資料庫中的單元位置進行掃描，忽略不具多態性的位點，顯示多態性位點的各相關信息，所述相關信息包括，在一致性序列中的鹼基類型、變異的鹼基類型以及變異鹼基出現的次數；所述步驟C包括預分組程序是將兩個多態性位點之間間隔的鹼基數目進行比較，其差數小於3～6的分為一組。
4.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟D是針對每個多態性位點組，從第一條等位基因開始逐個考察其組合的類型，記錄下來所出現的新的組合類型，並自動形成比照表格，該表格行數為該組內組合數加一，列數為組合數加二；該表格的第一行以及第一列中分別填入各組合類型，進一步將上述組合類型進行兩兩比較，找出鹼基類型不相同的位置，填入該兩種組合類型相交的單元格內。
5.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟E是根據上面的比照表格，考察該表格的每一列中的多態性位點，判定一個多態性位點在該列的所有有效單元格內是否都出現，如果是則確定該多態性位點作為該探針的檢測位點，並填入該列的最下面一格；否則，就要確定多個多態性位點，使該列中的任一有效的單元格至少有選定的一個多態性位點出現，這些被選定的多態性位點就分別是每條探針的檢測位點，統計該組中所需探針的數量，並形成函數probe。
6.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟E後還有優化分組程序，包括根據每組中多態性位點的數量多少進行優化組合和拆分程序，其中優化組合程序是對於組內多態性位點數量較少、兩個多態性位點之間間隔的鹼基數目大於3但小於10，暫分為一組，計算該組所需的探針數量，調用函數probe進行比較，如果前者多則放棄，如果後者多則將它們確定劃歸入同一組；對於組內大量多態性位點擁擠在一起，其中任意相鄰兩個多態性位點之間間隔的鹼基數都小於3～6，則將其拆分為多組，計算拆分後所需的探針數量，調用函數probe進行比較，如果前者多則放棄，如果後者多則按新組劃分，反覆比較，直至找到最佳分組方案後確定；並重新確定探針的檢測位點。
7.根據權利要求1所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的篩選方法，其特徵在於所述步驟F是以確定的探針檢測位點為中心向左右各延伸6～13個鹼基，確定探針的序列。
8.一種基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的應用方法，其特徵在於包括以下步驟①以上述方法確定探針檢測位點以及探針序列；②構建各等位基因對與各條探針匹配關係的判斷程序；③合成探針並將探針置於固相載體上；④PCR擴增樣品DNA，與晶片雜交並掃描；⑤由步驟②所建立的判斷程序判別步驟④掃描出來的結果，將完全匹配的判斷結果輸出，從而確定待測樣品的白細胞抗原型別。
9.根據權利要求8所述的基因晶片用人類白細胞抗原分型探針的應用方法，其特徵在於將步驟④進一步詳細分成以下步驟a.首先建立各種組合與各條探針的單倍體匹配關係表，即當某一組合的序列與某一探針的序列相同，則雜交時該組合能使該探針位點亮，確定了該組合與該探針匹配；當某一組合與某一探針存在不相同的鹼基且該鹼基正好是該探針的檢測位點，則雜交時擁有該組合的序列不會使該探針亮，則表示該組合與該探針不相匹配；當某一組合與某一探針存在不相同的鹼基且該鹼基不是該探針的檢測位點，這時分兩種情況如果這個不相同的鹼基與該探針的檢測位點之間的間隔小於該組分組時確定的標準間隔鹼基數，那麼雜交時擁有該組合的序列會使該探針擁有不確定的信號，即可能使探針亮，也可能使探針不亮；如果這個不相同的鹼基與該探針的檢測位點之間的間隔大於或等於該組分組時確定的標準間隔鹼基數，那麼雜交時擁有該組合的序列會使該探針亮；b.進一步建立雙倍體組合探針匹配關係表，建立雙倍體組合探針匹配關係表的方法是將任兩個組合類型配在一起並將它們與探針的匹配關係疊加在一起，疊加時遵循如下原則若一種組合在某一探針處顯示匹配的信號，不管另一種組合在該探針處顯示的信號是否匹配，則這兩種組合配對後與該探針相匹配；若一種組合在某一探針處顯示不確定信號，則不管另一種組合在該探針處顯示不確定信號還是不匹配信號，這兩種組合配對後都會使該探針顯示不確定信號；若兩種組合在某一探針處的信息均顯示不匹配信號，則這兩種組合配對後會使該探針顯示不匹配的信號；c.比較每一條等位基因與每一組合的序列，判斷各條等位基因與各組合的匹配關係，若某一條等位基因的鹼基類型與某一組合的鹼基類型都一致，則該等位基因與該組合相匹配；若某一條等位基因與某一組合在一處或多處鹼基類型不相同，則該等位基因與該組合不相匹配；d.比較每兩種等位基因組成的等位基因對與各組合的匹配關係，本步驟只要在步驟C的基礎上，將組成該等位基因對的兩種等位基因與該組合的匹配關係疊加起來，即可得到該等位基因對與該組合的匹配關係；e.對各等位基因對與各組合的匹配關係做兩兩比較，合併具有相同組合匹配關係的等位基因對，構建出最終的各等位基因對與各組合的匹配關係表；f.由晶片雜交結果判斷出各條探針的正負，根據雙倍體組合探針匹配關係表，由各條探針的正負判斷出各組合的正負，根據最終的各等位基因對與各組合的匹配關係表，由各組合的正負判斷出待測樣品的等位基因對，即待測樣品的白細胞抗原型別。
全文摘要
本發明公開了一種人類白細胞抗原高解析度、並且探針調試以及確定判定閥值容易的分型探針篩選及其應用方法，提出了對多態性位點進行「分組」的解決方案，依此方法設計出來的分型探針，檢測位點定位準確並且包容性較強，解析度高。本發明的全部篩選過程全部由設計的一套計算機軟體來執行，所以，可以快速準確地篩選出理想的分型探針。而且本專利還描述了各種匹配關係表的構建方法及如何根據這些匹配關係表一步步由晶片雜交結果判斷出待測樣品的白細胞抗原類型，解決了該分型探針在實際工作中的應用問題。
文檔編號C12Q1/68GK1680589SQ0312680
公開日2005年10月12日 申請日期2003年6月6日 優先權日2003年6月6日
發明者李志廣 申請人:李志廣