酵母菌利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法

2023-10-09 18:17:39 2

專利名稱：酵母菌利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法
技術領域：
本發明涉及酵母菌的應用，特別是涉及三株酵母菌種嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)ATCC 34887之一利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法。
背景技術：
酒精又稱乙醇，通常由釀酒酵母以六碳糖為底物發酵生產。以生物質(農作物秸稈、木材加工廢物等)為原料生產燃料乙醇是國家能源戰略和國家能源安全的重要組成部分，也是防止和減少汽車燃燒尾氣所造成空氣汙染的重要途徑，是國家經濟和社會可持續發展的重要保證。在生物質中，纖維素和半纖維素是主要化學成分，半纖維素包括各種聚戊糖與聚己糖，最常見的半纖維素是木聚糖，它約佔草本植物乾重的一半，也存在於木本植物中。木質纖維素經預處理後，可得到主要含葡萄糖和木糖的水解糖液。在研究以生物質為原料進行酒精發酵的方法中，關鍵是要確定能同時高效代謝木糖和葡萄糖成酒精的菌株，進而在此基礎上完善酒精發酵工藝。現在能同時代謝木糖和葡萄糖成酒精的酵母菌有嗜鞣管囊酵母，休哈塔假絲酵母，畢赤酵母(Pichia stipitis)，馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和假絲酵母(Candida sp XF217)等，但它們利用木糖和葡萄糖發酵生產酒精的實際產量只有理論產量的70％左右，而且發酵周期長，在80小時左右。

發明內容
本發明的目的是提供一種酵母菌利用木糖和葡萄糖發酵生產酒精的方法，該方法以現有的酵母菌株為基礎，通過採用馴化、液體培養、固定化等技術手段，可以使酒精發酵周期縮短，底物利用率提高。
為實現本發明的目的，採用了如下的技術方案，該方法包括以下步驟1)將嗜鞣管囊酵母2.1662或者嗜鞣管囊酵母ATCC 32691或者休哈塔假絲酵母ATCC 34887，接種於馴化培養基進行馴化；2)將馴化後的酵母菌，接種於液體培養基中進行液體培養；3)將液體培養獲得的酵母菌進行固定化；4)將固定化的酵母菌進行增殖培養；
5)增殖後的酵母菌進行酒精發酵；在上述生產酒精的方法中所用的酵母菌為嗜鞣管囊酵母2.1662(可以在中國普通微生物菌種保藏管理中心買到)、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691(美國典型菌種保藏中心保藏)和休哈塔假絲酵母ATCC 34887(美國典型菌種保藏中心保藏)三株中的一株；對菌株進行馴化時，馴化培養基的配方為木糖10-50g/L，蛋白腖4-6g/L，酵母汁2-4g/L，馴化條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，每個批次馴化時間為48-96小時，接種量為1％-5％，優選的方案是接種量為2％，馴化5個批次以上。
對馴化後的酵母菌進行液體培養時，液體培養基的配方為木糖10-50g/L，蛋白腖4-6g/L，酵母汁2-4g/L，接種量為1-5％，培養條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，培養時間為24-48小時，培養結束後濃縮處理，收集培養液備用。
將液體培養獲得的酵母菌進行固定化時，每次取定量的濃縮液體培養物與含有1.2％Al2O3的3-6％海藻酸鈉溶液在常溫下混合，在無菌條件下充分攪拌均勻後，滴加到2％的CaCl2水溶液中，於4℃下靜置10-20小時後得到凝膠粒子。
對固定化酵母細胞進行增殖培養時，增殖培養基配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白腖3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，增殖培養條件為28-35℃，pH5.0-5.5，60-120rpm，培養時間為24-48小時，每隔12小時更換一次新鮮培養液。
最後利用木糖和葡萄糖進行酒精發酵，發酵培養基的配方是木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白腖3g/L，尿素0.24g/L，發酵條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rmp，發酵時間為24-36小時。
實驗室中用高壓液相色譜儀測定木糖利用率嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假絲酵母ATCC 34887三株菌株馴化後的固定化細胞對木糖的利用率分別為87.90％，76.62％和74.68％，嗜鞣管囊酵母2.1622明顯優於其他兩個菌株。
葡萄糖利用率上述三菌株馴化後的固定化細胞對葡萄糖的利用能力也得到了明顯提高。馴化前，固定化細胞發酵36h，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假絲酵母ATCC 34887三株菌株的葡萄糖利用率分別為99.21％、96.91％、92.01％。馴化後，固定化細胞發酵24h，上述三菌株對葡萄糖的利用率均達到了85％以上。發酵36h，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假絲酵母ATCC 34887三株菌株的葡萄糖利用率分別為99.99％、98.21％、97.46％。48h，上述三株菌的葡萄糖利用率均達到了99.99％，接近100％。對於固定化細胞嗜鞣管囊酵母2.1662而言，發酵24h，葡萄糖利用率即達到了99.99％，發酵時間縮短了三分之一。
總糖利用率馴化前，嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假絲酵母ATCC 34887三株菌株固定化細胞的總糖利用率分別為85.08％、79.85％、77.81％。馴化後，上述三菌株固定化細胞的總糖利用率依次分別為93.95％、88.31％、87.34％。
馴化後三菌株的乙醇產率馴化後三菌株的乙醇產率得到了大幅度的提高。總體而言，在三個菌株中，菌株嗜鞣管囊酵母2.1662優於其他兩個菌株。
本發明酵母菌利用木糖和葡萄糖進行酒精發酵具有周期短、底物轉化率高、酒精產量高的特點。
下面通過具體實施例對本發明作進一步說明。
具體實施例方式
實施例1嗜鞣管囊酵母2.1662利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法。
在250ml的三角瓶中裝有100ml的馴化培養基，馴化培養基的配方為木糖20g/L，蛋白腖5g/L，酵母汁3g/L。將斜面保存的酵母菌嗜鞣管囊酵母2.1662，接種於馴化培養基中，接種量為2％。在pH5.0，30℃，60rpm的條件下進行培養48小時，總共進行7個批次的馴化培養。用顯微鏡直接計數法對培養液中的含菌量進行計數，含菌量隨馴化批次的增多而明顯增加，嗜鞣管囊酵母2.1662在經過7個批次的馴化培養後，含菌量達到3.3×108/ml，而此菌株在第1次馴化後的含菌量只有5.0×107/ml，含菌量在第一次馴化後的基礎上又增加了1個數量級。含菌量的增加說明其代謝木糖和葡萄糖的能力提高。
對馴化後的酵母菌嗜鞣管囊酵母2.1662進行液體培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的液體培養基，液體培養基的配方為木糖20g/L，蛋白腖5g/L，酵母汁3g/L。將馴化後的嗜鞣管囊酵母2.1662接種於液體培養基中，接種量為2％。在pH5.0，30℃，60rpm的條件下培養24小時，培養結束後濃縮處理，收集培養液備用。
然後用該培養物作為接種物，對嗜鞣管囊酵母2.1662細胞進行固定化。每次取上步得到的培養菌液2ml與68ml含有1.2％Al2O3的3％海藻酸鈉溶液在常溫下混合，在無菌條件下充分攪拌均勻後，滴加到2％的CaCl2水溶液中，於4℃下靜置10小時。嗜鞣管囊酵母2.1662細胞經過固定化後製成凝膠粒子，其直徑D為3mm左右。固定化凝膠粒子用無菌水清洗三遍後，轉入增殖培養基中。
對固定化的嗜鞣管囊酵母2.1662進行增殖培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的增殖培養基，增殖培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白腖3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L。將凝膠粒子接入100ml的增殖培養基中，在30℃，pH5.0，80rpm的條件下培養24小時，12小時後要更換一次新鮮培養液。
最後用增殖培養後的嗜鞣管囊酵母2.1662進行酒精發酵。在250ml的三角瓶中裝有100ml的發酵培養基，發酵培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白腖3g/L，尿素0.24g/L。將增殖培養後的嗜鞣管囊酵母2.1662接入100ml的發酵培養基中，在60rpm，30℃，pH值5.0的條件下進行發酵反應24小時。
經高壓液相色譜儀進行測定木糖利用率為87.90％，葡萄糖利用率達到了99.99％，總糖利用率為93.95％。用氣相色譜分析發酵液中的酒精含量，結果說明乙醇產率達到97％。
實施例2嗜鞣管囊酵母ATCC 32691利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法。
在250ml的三角瓶中裝有100ml的馴化培養基，馴化培養基的配方為木糖10g/L，蛋白腖4g/L，酵母汁2g/L。將斜面保存的酵母菌嗜鞣管囊酵母ATCC32691，接種於馴化培養基中，接種量為3％。在pH為5.5，35℃，80rpm的條件下進行培養60小時，總共進行6個批次的馴化培養。用顯微鏡直接計數法對培養液中的含菌量進行計數，含菌量隨馴化批次的增多而明顯增加。含菌量的增加說明其代謝木糖和葡萄糖的能力提高。
對馴化後的酵母菌嗜鞣管囊酵母ATCC 32691進行液體培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的液體培養基，液體培養基的配方為木糖10g/L，蛋白腖4g/L，酵母汁2g/L。將馴化後的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691接種於液體培養基中，接種量為3％。在pH5.5，35℃，80rpm的條件下培養36小時，培養結束後濃縮處理，收集培養液備用。
然後用該培養物作為接種物，對嗜鞣管囊酵母ATCC 32691細胞進行固定化。每次取上步得到的培養菌液2ml與68ml含有1.2％Al2O3的5％海藻酸鈉溶液在常溫下混合，在無菌條件下充分攪拌均勻後，滴加到2％的CaCl2水溶液中，於4℃下靜置15小時。嗜鞣管囊酵母ATCC 32691細胞經過固定化後製成凝膠粒子，其直徑D為3mm左右。固定化凝膠粒子用無菌水清洗三遍後，轉入增殖培養基中。
對固定化的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691進行增殖培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的增殖培養基，增殖培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白腖3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L。將凝膠粒子接入100ml增殖培養基中，在35℃，pH5.5，70rpm的條件下培養36小時，每隔12小時更換一次新鮮培養液。
最後用增殖培養後的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691進行酒精發酵。在250ml的三角瓶中裝有100ml的發酵培養基，發酵培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白腖3g/L，尿素0.24g/L。將增殖培養後的嗜鞣管囊酵母ATCC 32691接入100ml的發酵培養基中，在80rpm，35℃，pH5.5的條件下進行發酵反應30小時。
經高壓液相色譜儀進行測定木糖利用率為76.62％，葡萄糖利用率達到了98.08％，總糖利用率為88.31％。用氣相色譜分析發酵液中的酒精含量，結果說明乙醇產率達到了96％。
實施例3休哈塔假絲酵母ATCC 34887利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法。
在250ml的三角瓶中裝有100ml的馴化培養基，馴化培養基的配方為木糖50g/L，蛋白腖6g/L，酵母汁4g/L。將斜面保存的酵母菌休哈塔假絲酵母ATCC34887，接種於馴化培養基中，接種量為5％。在pH5.5，28℃，120rpm的條件下進行培養96小時，總共進行5個批次的馴化培養。用顯微鏡直接計數法對培養液中的含菌量進行計數，含菌量隨馴化批次的增多而明顯增加。含菌量的增加說明其代謝木糖和葡萄糖的能力提高。
對馴化後的酵母菌休哈塔假絲酵母ATCC 34887進行液體培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的液體培養基，液體培養基的配方為木糖50g/L，蛋白腖6g/L，酵母汁4g/L。將馴化後的嗜鞣管囊酵母ATCC 34887接種於液體培養基中，接種量為5％。在pH5.5，28℃，120rpm的條件下培養48小時，培養結束後濃縮處理，收集培養液備用。
然後用該培養物作為接種物，對休哈塔假絲酵母ATCC 34887細胞進行固定化。每次取上步得到的培養菌液2ml與68ml含有1.2％Al2O3的6％海藻酸鈉溶液在常溫下混合，在無菌條件下充分攪拌均勻後，滴加到2％的CaCl2水溶液中，於4℃下靜置20小時。休哈塔假絲酵母ATCC 34887細胞經過固定化後製成凝膠粒子，其直徑D為3mm左右。固定化凝膠粒子用無菌水清洗三遍後，轉入增殖培養基中。
對固定化的休哈塔假絲酵母ATCC 34887進行增殖培養。在250ml的三角瓶中裝有100ml的增殖培養基，增殖培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白腖3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L。將凝膠粒子接入100ml增殖培養基中，在28℃，pH5.5，120rpm的條件下培養48小時，每隔12小時更換一次新鮮培養液。
最後用增殖培養後的休哈塔假絲酵母ATCC 34887進行酒精發酵。在250ml的三角瓶中裝有100ml的發酵培養基，發酵培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白腖3g/L，尿素0.24g/L。將增殖培養後的休哈塔假絲酵母ATCC 34887接入100ml的發酵培養基中，在120rpm，28℃，pH值5.5的條件下進行發酵反應36小時。
經高壓液相色譜儀進行測定木糖利用率為74.68％，葡萄糖利用率達到了97.46％，總糖利用率為87.34％。用氣相色譜分析發酵液中的酒精含量，結果說明乙醇產率達到了95％。
權利要求
1.一種酵母菌利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法，其特徵是該方法包括以下步驟1)嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)2.1662或者嗜鞣管囊酵母ATCC 32691或者休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)ATCC 34887，接種於馴化培養基進行馴化；2)將馴化後的酵母菌，接種於液體培養基中進行液體培養；3)將液體培養獲得的酵母菌進行固定化；4)將固定化的酵母菌進行增殖培養；5)增殖後的酵母菌進行酒精發酵；在上述生產酒精的方法中所用的酵母菌為嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691和休哈塔假絲酵母ATCC 34887三株中的一株；對菌株進行馴化時，馴化培養基的配方為木糖10-50g/L，蛋白腖4-6g/L，酵母汁2-4g/L，馴化條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，每個批次馴化時間為48-96小時。
2.一種如權利要求1所述的生產酒精的方法，其特徵是對菌株進行馴化時，接種量為1％-5％，優選的方案是接種量為2％，馴化5個批次以上。
3.一種如權利要求2所述的生產酒精的方法，其特徵是將馴化後的酵母菌進行液體培養時，培養基的配方為木糖10-50g/L，蛋白腖4-6g/L，酵母汁2-4g/L，接種量為1-5％，培養條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rpm，培養時間為24-48小時，培養結束後濃縮處理，收集培養液備用。
4.一種如權利要求3所述的生產酒精的方法，其特徵是將液體培養獲得的酵母菌進行固定化時，每次取定量的濃縮液體培養物與含有1.2％Al2O3的3-6％海藻酸鈉溶液在常溫下混合，在無菌條件下充分攪拌均勻後，滴加到2％的CaCl2水溶液中，於4℃下靜置10-20小時後製成凝膠粒子。
5.一種如權利要求4所述的生產酒精的方法，其特徵是對固定化酵母細胞進行增殖培養時，增殖培養基的配方為木糖20g/L，葡萄糖50g/L，蛋白腖3g/L，酵母汁2.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，增殖培養條件為28-35℃，pH5.0-5.5，60-120rpm，培養時間為24-48小時，每隔12小時更換一次新鮮培養液。
6.一種如權利要求5所述的生產酒精的方法，其特徵是增殖培養後的酵母菌進行酒精發酵時，發酵培養基的配方是木糖20g/L，葡萄糖50g/L，CaCl22.5g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO42.5g/L，酵母汁2.5g/L，蛋白腖3g/L，尿素0.24g/L，發酵條件為pH5.0-5.5，28-35℃，60-120rmp，發酵時間為24-36小時。
全文摘要
酵母菌利用木糖和葡萄糖生產酒精的方法涉及酵母菌的應用，特別是利用嗜鞣管囊酵母2.1662、嗜鞣管囊酵母ATCC 32691、休哈塔假絲酵母ATCC 34887之一以木糖和葡萄糖為底物生產酒精的方法。本發明以現有的酵母菌株為基礎，通過採用馴化、液體培養、固定化、增殖培養等技術手段，可以使酵母菌利用木糖和葡萄糖發酵生產酒精的周期縮短，底物利用率提高。該方法主要用在以生物質為原料發酵生產酒精方面。
文檔編號C12P7/06GK1629298SQ200310121829
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優先權日2003年12月19日
發明者楊秀山, 田沈 申請人:首都師範大學