一株含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株的製作方法
2023-10-09 17:51:14 4
專利名稱：一株含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物動物細胞系領域，涉及肺炎克雷伯臨床耐藥菌株，具體涉 及一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌株攜帶有與細胞生長有關的新基因組島。
背景技術：
目前，臨床治療中。醫院獲得性感染病人的比例日益增高，肺炎克雷伯菌 (A7e/^ieWa p/7e"歷朋iae)是導致醫院感染的主要條件致病菌之一，常引起呼 吸道感染、尿路感染等，並常表現為對多種抗生素耐藥。治療實踐發現，不同的 肺炎克雷伯臨床感染菌株的感染類型、細菌耐藥種類存在著很大的不同。推測這 些臨床感染菌株在基因水平上可能存在著明顯不同，因而決定了其眾多特性不 同。
近年有人提出了基因組島的概念，認為除細菌基因組的保守骨架外，還存在 著一些可變基因池，這些基因可以作為一個整體在不同菌株之間水平轉移，這些
可移動基因被統稱為基因組島。研究顯示，基因組島存在著一些共同的特徵，包 括GC含量與保守骨架序列不同，常位於tRNA基因位點後，兩端通常帶有保守的 重複序列(Direct R印eats, DR)，常攜帶有編碼整合酶或轉座酶的基因(參與 基因組島的水平轉移，位點特異性重組過程)，攜帶的基因片段較大通常10 kb-10—0 kb以上等。基因組島攜帶的基因可以是某些與致病或耐藥相關的毒力因 子相關基因，也可以是與抗生素抗性、代謝等相關。基因組島的水平移動使得細 菌可以在短時間內獲得新基因產生新特性，對於細菌獲得致病性以及適應環境具 有重要意義。
研究顯示，基因組島也存在於肺炎克雷伯菌株中。有研究發現編碼氟甲碸黴 素(Florfenicol)耐藥的基因/7M位於一個43 kb的基因組島上，該基因組島 與肺炎克雷伯菌屬中結合性質粒R55有高度同源性。Bach S等發現耶爾森菌屬 一個與鐵轉運蛋白的合成、調節有關的致病島HPI同時也存在於肺炎克雷伯菌株 中。研究認為，基因組島的存在對於細菌致病或耐藥基因的獲得以及適應環境具有重要意義。同時基因組島的存在也被認為是微生物在短時間獲得進化的主要方 式之一。
由於基因組島插入宿主基因組時，常與tRNA相界。tRNA被認為是基因組島 的插入熱點。歐竑宇等人利用tRNA content and context URNAcc)分析的方 法確定了 ￡ co"'中基因組島插入熱點tRNA在基因組中的位置，並通過tRIP PCR (tRNA site interrogation for pathogenicity islands, prophages and other genomic islands PCR)方法證實了 tRNAcc分析結果。
發明內容
本發明的目的是通過篩選肺炎克雷伯臨床耐藥菌株，提供一株含有新的基因 組島KpGI-2的肺炎克雷伯臨床多重耐藥菌株。
本發明對51株血液、痰、尿液、傷口分泌物來源的肺炎克雷伯臨床耐藥菌 株採用引物phe55U和phe55D進行tRIP PCR擴增，得到了一個6. 4 kb的基因序 列，定義為基因組島KpGI-2，將該含有新的基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯臨床 多重耐藥菌株命名為HS04160。已於2008年6月25日保藏，保藏單位中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區大屯路，中國 科學院微生物研究所，100101，保藏編號CGMCCNo.2558,分類命名肺炎克雷 伯菌A7e6sie27a p/2e咖o/H'3e 。
本發明的攜帶有基因組島的肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160分離於一位 臨床尿路感染病人同時伴有白色假絲單胞菌感染，通過細菌活細胞計數試驗證明 KpGI-2含有的基因與細菌的生長相關。本發明實驗顯示，KpGI-2與肺炎克雷伯 臨床菌株適應新的寄生環境並進一步導致感染具有重要意義。所述的含有基因組 島KpGI-2的菌株對於肺炎克雷伯菌株的致病與耐藥有著重要影響。
本發明細胞株與肺炎克雷伯MGH78578 (GenBank accession number: CP000647)基因組DNA 3.72 Mb處相對應地tRNA位點攜帶有一個新的與細 胞分裂、增殖有關的基因組島，具有序列1的結構。
所述的基因組島KpGI-2長度為6.4 kb,攜帶的基因與細胞生長相關。
本發明所述的含有KpGI-2肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160，通過下述方 法識別鑑定得到
1)採用tRIPPCR擴增肺炎克雷伯臨床耐藥菌株基因組島；2) 將得到的6.4kb的PCR產物進行酶切、克隆，測序；
3) 根據測序結果設計引物PCR擴增6.4 kb基因片段上下遊的未知序列；
4) 將得到的序列結果拼接，進行序列分析確認，命名為KpGI-2;
5) 將KpGI-2及其攜帶的基因分別克隆後進行細菌活細胞計數試驗，確定 其功能與細菌生長有關。
本發明採用tRNAcc分析確定肺炎克雷伯基因組島插入熱點-eMtRNA上下 遊的保守序列，設計了特異性的引物，採用tRIP PCR擴增，在一株肺炎克雷伯 臨床多重耐藥菌株HS04160中得到了一個長為6. 4 kb的基因片段。
經分析確定該6. 4 kb的序列的GC含量為38. 03%，與肺炎克雷伯菌屬基因 組GC含量(57.5%)存在著明顯不同，因此確定該序列是外源性序列，該所述序 列上存在著一個與沙門氏菌屬(&^70/je^a e"en'ca)同源的不完整的整合酶 序列，位於p力e5^tRNA之後。所述整合酶序列可能是由於基因組島在不同菌株 間水平移動發生同源重組過程中發生了改變，所以表現為不完整的整合酶序列； 同時在這個序列上還存在著一個長為163 bp的DR序列，所述DR與肺炎克雷伯 MGH78578 tRNA位點上12. 6 kb的基因組島中的DR序列完全一致。通過分 析表明，所述的6.4 kb的序列符合基因組島的典型特徵，故，定義其為新的基 因組島，命名為KpGI-2。
本發明採用Glimmer 3.02, GeneMark等生物信息學分析方法對上述基因組 島攜帶的基因進行了分析，結果顯示，該基因組島中存在著5個0rf:其中0rf 1 是部分與沙門氏菌屬同源的不完整整合酶基因，0rf 4與ATP依賴的RNA解旋酶 具有同源性，在0rf 4中存在著兩個蛋白保守結構域，分別為DEXDc和HELICc; DEXDc結構域中含有與ATP結合的位點;HELICc屬於超螺旋蛋白家族C端結構域， 該蛋白家族主要是參與利用三磷酸核苷酸提供能量解開DNA螺旋；0rf 5中包含 了一個保守結構域，屬於與細胞有絲分裂相關的Fic(Filamentation induced by cAMP， Fic)蛋白家族，該Fic蛋白家族可以通過葉酸代謝來調節細胞的分裂、 增殖。
表l是KpGI-2基因注釋表，其中列出了 0rf在KpGI-2中的坐標位置，片段 長度以及該0rf的同源性分析。0屍/大小具有同源性的蛋白名稱同源性蛋白胺基酸BlastPAccession No.
(bp)的種屬匹配百分比 (匹配數/總 數)E-value(Best match)
223Truncated phage integraseTyphi CT18194/225 [86%]4e-58CAD06800
峭900Hypothetical protein, BcerH—11817H3081.97106/296 [35%J6e-42ZP—02596029
峭393Helicase domain proteinHAW-EB426/91 [28%]2e-04YP—001673642
2076ATP-dependent RNA helicase,DEAD box family proteinH3081.97242/676 [35%]3e-91ZP—02596030
1143Hypothetical protein, Salentericaenterica—10663HI N05-537370/380 [97%]0.0ZP_02831840
己有研究發現含有刀c基因的E.coli在cAMP作用後，細菌分裂受到抑制， 細菌菌體由於不能正常分裂而有絲化現象，最終細胞生長受到抑制。另有研究證 明毒素(Doc) /抗毒素(PhD)系統由*基因進化而來。Doc/PhD是沉溺系統 的一種，兩個分子分別對細胞的增長起抑制/促進作用。通過二者的協同作用， 使得細胞的生長處於一個平衡的狀態。我們將含有KpGI-2基因組島的基因 (0/^-3， or/《o//5)以及KpGI-2基因組島本身分別與載體pUC19相連後克隆入 宿主菌DH5a中，按照文獻報導的方法進行細菌活細胞計數試驗，觀察這些克隆 子對細菌生長的影響。結果發現KpGI-2基因組島中的和o;^基因聯合對細 菌的生長具有抑制作用，or戶和o;/5則對細菌的生長具有促進作用。因此我們推 測KpGI-2可能攜帶有一個與Doc/PhD類似的毒素/抗毒素分子調節系統。本發 明基於現有研究發現細菌在不利的環境中會通過減慢生長速度等來減少自身的 消耗維持菌體的生存，有利於細菌適應新的環境，推測含有與細菌生長相關基因 的上述基因組島參與了肺炎克雷伯臨床菌株HS04160在尿路定居感染的過程。 本發明受國家863項目資助，項目編號2006AA02Z328。
圖1是KpGI-2凝膠電泳圖。
圖2是KpGI-2基因序列(序列1 )
KpGI-2全長6360 bp，下劃線部分序列為/^e tRNA序列，陰影部分序列為 163 bp的DR序列，該序列與MGH 78578基因組3. 72 Mb處的p力e tRNA位點基 因組島的DR序列完全一致。
圖3 KpGI-2基因注釋圖
圖中按照比例標出了Orf的位置，Orf中的保守結構域用紫紅色斜方格標出。
圖4細菌生長圖
含有KpGI-2及其攜帶的基因分別進行克隆。KpGI-2連入pUC19後構成克 隆體pUCKp， or/2-3連入pUC19中後構成克隆體pUC2-3， or/4連入pUC19中 後構成克隆體pUC4， w/5連入pUC19後構成克隆體pUC5。將這些克隆子分別 轉化入DH5a中。這些含有不同克隆子的菌株在含有5 mM cAMP或者不含有 cAMP的條件下進行培養，按照文獻報導方法進行活細胞計數試驗。最後計算不 同時間點細菌的總數與0 h的比值(結果取lg值)得到細菌在不同時間點的增長 率。A沒有cAMP作用下，在指定的時間點含有不同克隆體的細菌生長情況。B 在5mMcAMP作用下，在指定時間點含有不同克隆體的細菌生長情況。從圖中 可以看到，含有o^/2-3的克隆子在5mMcAMP作用下，細胞生長受到了明顯抑 帝U。而含有或者or/5的克隆子在5 mM cAMP作用6 h後，明顯促進了細胞 的生長。
具體實施例方式
實施例1基因組島KpGI-2的發現與分析過程
1) tRIP PCR篩選肺炎克雷伯臨床耐藥菌株中的基因組島根據tRNAcc分 析確定了在肺炎克雷伯菌屬中基因組島的插入熱點為p力e5^ tRNA位點，同時分 析確定了在這個位點的上下遊存在的保守序列。根據保守序列設計引物phe55U: 5' -CGTGCTTTTAGCGCAATGT-3' ; phe55D: 5' -GACATAACCATTTACCCACTCGT-3'。 tRIP—PCR擴增條件為94° C 30 s, 55° C 1 min, 72° C 5 min，共30個循環。 比較基因組學方法分析表明，採用此對引物擴增基因組島，在沒有基因組島插入的情況下，tRIP PCR擴增將得到一個0. 5 kb的片段。我們的tRIP PCR結果發 現在一株肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160中擴增得到一個6. 4 kb的基因片段，
懷疑為基因組島插入。
2) 6. 4 kb基因序列分段測序將6. 4 kb的PCR產物回收純化後，採用EcoR I和Bgl II酶切，得到了大小不等的片段，將這些片段與經過EcoR I和BamH I 雙酶切的pUC19載體用T4連接酶連接。將連接產物採用鈣轉法轉化入DH5a感受 態細菌中。於含有IPTG和氨苄抗生素的平板上培養過夜。挑選白色菌落進行酶 切鑑定後測序。根據測序結果再次設計引物，EGxiao-l: 5' -AGGTATATTTG CCGCAGATA-3' ; EGxiao-2: 5' -TATCTGCGGCAAATATACCT-3'。採用引物phe55U 和EGxiao-2， EGxiao-1和phe55D分別擴增6. 4 kb基因序列的上下遊未知片段， 再次測序。將三次測序結果進行拼接，得到了一個6.4 kb的基因片段。
3) 基因序列分析採用Blastn， Blastp， Blastx， tBlastn， tBlastx等方 法對其進行基因分析。通過NCBI確定了其0rfs，並釆用Glimmer 3. 02， GeneMark 對其0rf序列進行分析。確定了其中的0rf以及其中的保守結構域。
4) KpGI-2克隆將6. 4 kb的KpGI-2的PCR產物兩端聯入限制性內切酶位 點Sph I和Sacl克隆到pUC19中，轉化入DH5a中。挑選單克隆進行測序驗證連 接正確。
5) 細菌活細胞生長試驗按照文章報導的方法進行活細胞生長試驗。將含 有KpGI-2及其基因分別進行克隆後轉入宿主菌DH5a中。30。C培養過夜後，取 20 nl菌液用新鮮培養基(含有或者不含有5 mM cAMP)稀釋100倍後於37°C 培養。在指定的時間點，分別取50pl菌液用LB稀釋後鋪板，於37。C孵育培養 過夜後計算平板上的菌落數，計算細菌總數。計算指定時間點得到的細菌總數與 Oh的細菌總數的比值，將比值取lg值，得到細菌的生長圖。序列表-華山交大
SEQUENCE LISTING <110〉復旦大學附屬華山醫院,上海交通大學 —株含有基因組島KpG卜2的肺炎克雷伯菌株 12 <160〉 1
Patentln version 3.5
<210〉 1 <211〉 6360 DNA
Klebsiella pneumoniae 1
cccagct33c 3tctgateigt gcgtctgctg C3tscg3t33 atttcgttgs cgaggcgcgg 60
cgattacggt ttaatgggcc ccgttgcccg gatagctcag tcggtagagc aggggattga 120
aaatccccgt gtccttggtt cgattccgag tccgggcacc actatttaaa gaacccgccc 180
aaaaggcggg證gcttt tctgtagccg gactctccat cgaactgcgt tcgattattc 240
gccgcscsgc ggctc3cccc ttcggggccs gcgcgscscg cgcgctgttc 33cgcctgcg 300
gcgttagtcc gagtccgggc accacttttc tg細atg cttctctatg caccccatcg 360
t歸taaat tcaataggtt agattaaaaa tctttccaga tacgtttcta tttatctcta 420
tgtattcgga aaatttgggg tcaaattgcg ggtcattcag ttcgatgaat gaagagaccc 480
tcatgtgsct ctg犯tg3c3 gt犯33tccg cgctgcaasg cccctcgcas 33t8ctac33 540
gctcsccgsc 3cac33ggtc tgtacctgsc g3tattt3tc sccgsctcts sgctstggts 600
tttccgctac cgttttgaag gtgaggaaat cctctggcct ttggccctat ccatagatta 660
cgctggcggs 3gccc3cg33鄉cgcgatg cggcgcgtsa gctgctgat3 tccgtsatta 720
tttgttttat aggtagttta acttatttga catattaaaa atcgcattag taaaaaacat 780 tcatttcatt aataaattct tgtccaaatg gcttaccgtg gttctagggt acagcgaatt 840 taattgaaaa ttactcttga ctgtgttttt atacagtata tatactgtga gtataaaatc 900
9序列表-華山交大
gacaaaacga ggcacacatg ataaatttca tccatgataa caacaaggta ttatggatat 960
gctgctgccc atacgagtca acaagcggtt cttgaattta tttagaacac ttacattaga 1020
caaagcacca cggcaatcta ccgtaaactt acatgttcta aacattgaga gtaacagttt 1080
tgtttataac aaattggttg aggaattaag agacttaata gtctgttacg tacattcgaa1140
tagaagaata gctgagtttg aaaaaaatca tccatc加agtcccaaac catatttaga1200
ggcastacag aaatttcgts cctstscatc 3aatg33ggt gagttsggtg sactsctstt 1260
3t3cgc3ttc cttgsatcag gtctcsacgc acctaaatta ct3tccaa33 tgg3gct333 1320
gactgatgca aatgattata tcaaaggttc cgatggtata catttattag agatcgacaa 1380
taattatcaa ctaatctttg gcgagtccaa aatgtactcg gacttactgg agggggctcg 1440
tgaagcgttt gactctattg ctgactttaa agccaacgga ttaggatttg aacgaggtct 1500
33t3g3t3Ct C3tgtC3t38 3tg333tggt t3Ctg33g33 gg3t3tgsg3 C33t3333tC
1560
tatactatta ccttcaggaa ataatgggcc aaaccttgat ctagcttttg gcgttttcct 1620
aggatttgag ttacctgtta gtgatacaca attgtctatg agaaacaacg aattccgaga 1680
ttggacatat tcattagtaa aaaataatgc ttctcgtgta attgatacga tagaaaaaag 1740 aattataaag cataaactct ttggtcacga ctttcatata tacattgtcc ctttcacaga1800
C8t3g3t3tC 3Ctcgt3338 33tt犯tCC3 3g3犯tgct3 3C33ttgg3t 33333tt3tg
1860
aacgaaaaag atgtagcaag aaaaatccca ttagcacaac gtctttcgat ggacgcttat 1920
acaagtagct actttaaaga gatctataaa tatatatcaa ttttatacga taattgtttg1980
tttaataata acggcactca taatctgcta tttgttgaca caacaaaaat agagaaagct 2040
ttacgttttg ctgatattct atctcattca catgttgaag ctcatcgaac aaaatcattt 2100
gaaatcataa gtaaaatagc tgcatttcat tcagatgatc cttattttaa aatgataggt 2160
tcagcggtca taaatcgttt aggtatattt gccgcagata atttaatctc gcaaggagta 2220
catttaccgt t3gaccgag3 aatagaataa tccataaaaa 3atc3ttcc3 ssgaactact 2280序列表-華山交大
atagatggat tattttttac agacaaacaa tatgaacttt atcaatccct aattacctca 2340
aacactttaa gctttgccgg ccctacgtca atggggaaat cgtttgtcat aaatgaatat 2400
ataaaacata ttgtttttgg taatgctaaa aaaaatatag tgctcatagt cccaactaga 2460
gcattaatta gccaaagtac attaaaatta aaaaatgaac taagagatga aattgatggc 2520
33tcsgt3ta 3g3tsgt33C 33C3tcttac 8tgctcagsg gsggtsttgs tcstsgtsas 2580
gggtatgttt tcgtattgac tccagagaga ttagttagtt taattagtac atgtcctgat 2640
ataattattg attatatttt tgtcgatgaa gcacaaaaac ttactattaa aaatgataca 2700
cgaagtctcg taacctattc cgcgatcgaa caaacattaa atttaaatcc aaacgcaaaa 2760
cta腦ct catcaccaaa tttatccaac cctgaagtat ttaatgattt atttaatcgg 2820
gaccatgcta aagtttatcg cagcatagaa ggcgctacag ctcagaactt atactttatt 2880
gatttattaa acaacaagtt tagttatgtt gataaaaaca aattaattga tatagataat 2940
gttaatcaga cttatacatc tgttaatgat cttatcttcc agattaacaa agggaaaagt 3000
aagattattt acactggagg tatcgataat acattatctc gaacaaggga tttcctacgt 3060
tacataaaga aattacsaag taacaagaaa cctcaaaatt ttgatctagc atctcaggtc 3120
cgagaatttg tgcataccgg ctacgaactt gctgaagcta tagagtatgg agtagcattt 3180
catttcggaa acctgccaca agcaataaga gatcttattg aatacaactt taaaataggt 3240
aatattgatt acctgttttg cacatcaact cttcttgagg gggtaaattt acccgcacgt 3300
tcagtattta ttttgacatc aaaaaagggt actagatatt ttgaacctgt gga腿gg 3360
aatctcgcag gcagagctgg aagactagcc atagagttag ctggtgatat attttgcgta 3420
333g3tg333 gtgggscctg gsstgstsss gcggt33383 3ttt33ttct 3tcc33t3犯 3480
aatgaaattg aactaactcc cagcttttat cttaacgatt ctaaaaggat taaagagcta 3540
gaacaaataa taaaaactgg ttctactgag gggattcaaa atagcgaatt tctc3g3aca 3600
ctaagtgata tggtaaggat tgatacccta cgaactgaca aagccaataa tttaccactt 3660序列表-華山交大
atcaat-tatt tcagaaataa tggaaataac gatatattac attatgcctt gaaaagcata 3720
aataacatts scatscctac 3C3tstttta ttagcaast3 gcc3tattgc t3tt33ctc3 3780
caacataatg catttaattg catcagaaat tattcaattg acgaactaaa gttatcatgg 3840
a3tcctacsa 3tg33g3aat aassgaasaa ttggccctcs t3ttC33t3t ttatc33ata 3900
gataaatata gtaaaggatt aaaccgtctt aattttaatt caattccata ttacgcagtc 3960
attttaacta agtggatgca tggtaataca ttaagtgaaa ttatctctga cgcgattgtt 4020
tattacatat cgaatagaaa gaatatctat ctttcagata agactcaaga gccatttgat 4080
caaaataatt ctattcatat aacaaaatta gtaaatgata caattaaaga tatagaatta 4140
aaaataggtt atcaactaca aaattatatt tcacattatt gccaacttct ttcacttgtt 4200
tttgaaaata acccgggagc aaattggtca caattcatag agtttggctc gaatgatccg 4260
attgtatggc aactgcaatt tatgggattt tccagacatt gtgcaatatt tttaaagaaa 4320
aacttcccta aacaccttaa atatgatcaa gaaaacaatc agttatacat attaaacaga 4380
gctgaaatca agtcaaaggt taaacagaac aaattatatt ggcttgaaat tcaggccctg 4440
ctttaacata accccccatc tgaattacag atggggggtt atcacaagtc aggaataaac 4500
ccctcgtccc gcagaacctt aatcacccca cgaatcagat acgagttaga aaacttcgcc 4560
gtataggtac gagccccctg ttctaccggc tgaagcagtc cccgctcaat cagcttacca 4620
3gctg3t卿tcscctgcgt cggtttcsgs tcgggc3333 csgcgcggsg 3tcgcccgct 4680
tttatcgtcc ccagttcaac agaacgtttc aaaacctttg attccagcgg atttatcact 4740
cctctctccg 3cg犯333tc gstggccggs tacaggatct tttc3ctc3g gs卿cgtgg 4800
tttgtcagtt gatcgacttt cttcagctca gagg3g3tcc ccgaaagcsc atataagcac 4860
cattcttcca gcccctgctc tgttccctta tcggctaacg aaagcatggc gtaatagcgt 4920
tcacgatcgt tacaaaatac cgcagtcgga ttgagtaccc ggccacctgc ctgaacatta 4980序列表-華山交大
aaaccatact tgataagtaa cgcataggtc agcagcctga ccgttcggcc attacc咖 5040
ccasaggggt gtstccsgcc犯3gcggtg3 tgcaccsgtg ca3tcttC3t csgatcgtsc 5100
tttggcttat cggcacggtt aataaaggcg gtcagttccg ccatataatc agcaacgcgg 5160
atgtggtccg gtggcagatg gtcagactga gcgatgctga cattatgttg tcgatatgcg 5220
ccgggcgttc tgtcgccttc ctgttgcagc ccgacgacag ccagsctatg caactcgcgg 5280
ataaaatatt ccgttatctc atcgccgttg ctcagatatt cgtcgatat3 ctccatcgcg 5340
gcttcaatat tattgatttc tttgagctgg tccgtcgaac tctgcgtccc ttcaactttg 5400
ctttcaacat agtcggcaag cgtggtgtga tttccctcaa tccttgcaga gccaagactc 5460
tccagcatgt ggaaaaccgc cttcaactgc gcaaacagga tagggtgaac atcggtttcc 5520
agccgcaggt gtcggagtsa ctccagttcc gtcagcgcat cgaccaasgg ggagtcaaag 5580
ctggggttca gaagcgagag ttcaaagtga ttaaattgag ccatgatgtt tagttatctc 5640
sactggtgca tgscgststc tc3333gt3t 3cc3aa33t3 ctsstsgsst ct3t犯3tt3 5700
gaaaaaacat cgtttctgat tatctcaaaa accgttgttc caacatatca aatataagtt 5760
tgaaagatgt tcaacactaa agggaatggg gctttgattg cataatgtag gaggggttgt 5820
ttggcgctgc tatgtatgga gttccagcca ctatatgtgg acctcagacc gttatgtgtg 5880
gacttgactc cacacataac gaaaccccat tcgctaaata acga腦t tatggggcct 5940
tcgtggggcg ctgtttscss gaastaccas csacaccast 33c33acagc acgttaatcg 6000
tggatatgat tccgagtccg ccacttattc agagaaccca gcctatggct ggtgtttgct 6060
tttctgcgcc ctatatcttt gggtttctac cacgccgtat cctctgtgcc attaagacct 6120
attccccata gaatc加c gaaaatacat tttcagatat cagataacac gctgattaaa 6180
atcgccattt tctcgccaaa agcggctaaa aacgcccttt tctggcaatc gatccgccca 6240序列表-華山交大
ggtggctacc ctgctttccc tccagatggc caaatagcat cttatattac attttacgct 6300 aaatgacaga gaaatattct ttaaataacc gtttaacagt ctagtagcaa aaaaatattc 6360
權利要求
1、一株含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株，其特徵是與肺炎克雷伯MGH78578基因組DNA 3.72Mb處相對應地phe tRNA位點攜帶有基因組島KpGI-2，所述菌株命名為HS04160，保藏編號CGMCC No.2558，分類命名肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae。
2、 按權利要求1所述的含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株，其特徵是 所述的基因組島KpGI-2，具有序列1的結構。
3、 按權利要求1所述的含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株，其特徵是 所述的基因組島KpGI-2攜帶有與細胞生長有關的基因。
4、 按權利要求3所述的含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株，其特徵是 攜帶有與生長相關的基因爿C/""7./、 ^G/7153&7、 XG/71539J和爿G/73W0J。
5、 按權利要求1所述的含有基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯菌株，其特徵是 通過下述方法製得1) 採用tRIPPCR擴增肺炎克雷伯臨床耐藥菌株基因組島；2) 將得到的6.4 kb的PCR產物進行酶切、克隆，測序；3) 根據測序結果設計引物PCR擴增6.4 kb基因片段上下遊的未知序列；4) 將得到的序列結果拼接，進行序列分析確認，命名為KpGI-2;5) KpGI-2及其攜帶的基因進行分別克隆後進行細菌活細胞計數試驗，確 定其功能與細菌生長有關。
全文摘要
本發明屬於微生物動物細胞系領域，涉及一株攜帶有與細菌生長有關的新基因組島KpGI-2的肺炎克雷伯臨床耐藥菌株HS04160。已於2008年6月25日保藏，保藏單位CGMCC，北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No.2558，分類命名肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae。本發明通過對肺炎克雷伯臨床耐藥菌株的篩選，得到6.4kb的基因序列並證明其屬新的基因組島，細菌活細胞計數試驗證明KpGI-2中攜帶的基因對細菌的生長分別具有促進/抑制作用，提示該基因組島與細菌生長相關。本發明實驗顯示，KpGI-2參與了肺炎克雷伯臨床菌株感染的致病過程。所述的含有基因組島KpGI-2的菌株對於肺炎克雷伯菌株的致病與耐藥有著重要影響。
文檔編號C12R1/22GK101560480SQ20091000660
公開日2009年10月21日 申請日期2009年1月24日 優先權日2008年11月20日
發明者元 呂, 剛 李, 敏 李, 楊澤華, 歐竑宇, 蔣曉飛, 賀新義, 鄧子新, 楠 陳, 陳曉耘, 魏取好 申請人:復旦大學附屬華山醫院;上海交通大學