比色分析方法及其使用的試劑的製作方法

2023-10-17 15:13:39

專利名稱：比色分析方法及其使用的試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及比色分析方法及其使用的試劑。
背景技術：
在臨床檢查及生化檢查等領域中，進行葡萄糖、膽固醇等的成分分析，其中的一個方法為比色分析。例如，在葡萄糖的比色分析中，通常，首先使葡萄糖氧化酶作用於葡萄糖(底物)，產生葡萄酸內酯和過氧化氫，在過氧化酶存在下，通過Trinder試劑等顯色劑檢測過氧化氫。這種通過過氧化氫間接地測定底物濃度的方法，不只限於葡萄糖，也適用於膽固醇等其他的成分分析。
但是，原來的比色分析中，存在下述問題。首先，由於不是直接測定分析對象，而是通過過氧化氫間接地測定，所以測定費時間，例如，測定葡萄糖時需要30～60秒。其次，原來的比色分析法中，2種酶反應體系需要同時穩定化，條件設定困難。而且，由於需要氧，原來的比色分析法還存在這樣的問題如果氧不足，反應就不充分。

發明內容
鑑於上述問題，本發明的目的是提供反應體系為一步、分析時間短、分析值可靠的比色分析方法。
為達成上述目的，本發明的比色分析法，是使氧化還原酶作用於分析對象及通過電子授受而顏色變化的電子授受顏色變化物質，通過測定由於上述分析對象向上述電子授受顏色變化物質的電子傳遞而發生的上述電子授受顏色變化物質的顏色變化，對上述分析對象進行定性或定量的方法。
根據該方法，由於為一步反應，反應體系簡單，穩定性好，且測定時間也短(例如，以葡萄糖為底物時，約5秒以下便可測定)，另外由於不通過過氧化氫、且不需要氧，所以分析值的可靠性也高。
本發明的試劑為上述本發明的比色分析方法使用的試劑，為含有氧化還原酶及通過電子授受而顏色變化的電子授受顏色變化物質的試劑。本發明的試驗片為含有上述本發明的試劑的試驗片。該試驗片與原來通過過氧化氫進行比色分析的試驗片相比，可在極短的時間內進行分析，分析值的可靠性也高。
有將聯吡啶金屬絡合物作為發光物質使用的分析方法(特開平10-253633號公報等)，本發明是關於比色分析方法，所以上述分析方法與本發明技術領域完全不同。同樣，也有通過電極直接外加使聯吡啶金屬絡合物發生顯消色反應的技術(例如，特開昭57-192483號公報)，由於本發明是利用通過氧化還原酶的電子授受，所以上述技術也與本發明技術領域完全不同。


圖1為表示本發明一實施例中反射率的葡萄糖濃度依賴性的圖。
圖2為表示本發明其他實施例中反射率的葡萄糖濃度依賴性的圖。
圖3為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖4為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖5為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖6為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖7為表示本發明其他實施例中反射率的葡萄糖濃度依賴性的圖。
圖8A～圖8F為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖9A～圖9D為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖10A～圖10C為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖11為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖12為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖13A～圖13C為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖14為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖15為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖16A～圖16E為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖17A和圖17B為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
圖18A～圖18C為表示本發明其他實施例中顏色變化的圖。
具體實施例方式
在本發明的比色分析方法、試劑及試驗片中，上述電子授受顏色變化物質優選為過渡金屬絡合物。過渡金屬絡合物優選為銅絡合物、鐵絡合物、釕絡合物或鋨絡合物或它們2種以上的混合物。上述過渡金屬絡合物的配體的配位原子優選為氮、氧及硫中的至少一種。上述配體例如優選為氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。上述配體的配位位置以外的氫原子中的至少一個可以被取代基取代。上述取代基例如有烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基。上述過渡金屬絡合物也可以具有2種以上的配體。即上述絡合物也可以是混合配體絡合物。
在本發明的比色分析方法、試劑及試驗片中，氧化還原酶優選為脫氫酶或氧化酶。如果酶量多，反應變快，所以優選。分析對象例如有葡萄糖、膽固醇、尿酸、乳酸、丙酮酸、肌酸、肌酸酐等，這時的氧化還原酶為對應於上述各物質的脫氫酶或氧化酶。
在本發明的比色分析方法、試劑及試驗片中，除了電子授受顏色變化物質，還優選使用介質。上述電子授受顏色變化物質也是介質，它不只具有電子授受的功能，還兼具顏色變化的功能。因此，追加使用的介質是與上述電子授受顏色變化物質不同的介質。如果使用介質，電子授受速度提高，因此上述電子授受顏色變化物質的顏色變化的速度也提高。結果，可以減少氧化還原酶的用量，從成本上看有利。上述介質例如有鋨絡合物、釕絡合物等，具體例子如後文所述。作為電子授受顏色變化物質與介質的組合，優選電子授受顏色變化物質為銅絡合物、介質為鋨絡合物或釕絡合物的組合。
在本發明的試驗片中，除了上述試劑，還優選含有無機凝膠。上述顏色變化物質通過電子傳遞被還原，發生顏色變化，周圍有氧時，可能被再氧化而發生褪色，如果含有無機凝膠，可以防止這種褪色。
下面舉具體例子更詳細地說明本發明。
如上所述，在本發明中，電子授受顏色變化物質優選為過渡金屬絡合物，在過渡金屬絡合物中，優選銅絡合物、鐵絡合物、釕絡合物及鋨絡合物。
(銅絡合物)銅絡合物通過酶的電子傳遞，例如顏色從藍色(Cu2+)變成紅褐色(Cu+)。作為銅絡合物的配體，例如有氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物等配體。上述配體也可以2種以上組合成混合配體。
在聯吡啶的情況下，配位數為4或6，但從穩定性的觀點看，聯吡啶優選配位2個。聯吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
聯吡啶銅絡合物的例子，例如有二聯吡啶合銅、二(4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(4，4』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(4，4』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(4，4』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(4，4』-二溴-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合銅、二(5，5』-二溴-2，2』-聯吡啶)合銅、三聯吡啶合銅、三(4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(4，4』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(4，4』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(4，4』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(4，4』-二溴-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合銅、三(5，5』-二溴-2，2』-聯吡啶)合銅等。
在咪唑的情況下，配位數為4。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑銅絡合物的例子，例如有四咪唑合銅、四(4-甲基-咪唑)合銅、四(4-苯基-咪唑)合銅、四(4-氨基-咪唑)合銅、四(4-羥基-咪唑)合銅、四(4-羧基-咪唑)合銅、四(4-溴-咪唑)合銅等。
胺基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸銅絡合物具有溶解性高的優點。作為混合配體，例如有聯吡啶與咪唑的組合、聯吡啶與胺基酸的組合。例如有[Cu(咪唑)2(聯吡啶)]、[Cu(L-Arg)2(聯吡啶)]。使用混合配體，可以付與銅絡合物各種性質，例如，使用精氨酸時，絡合物的溶解性提高。
(鐵絡合物)鐵絡合物通過酶的電子傳遞，例如顏色從黃色系(Fe3+)變成紅色系(Fe2+)。鐵絡合物的配體，例如有氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配體。上述配體也可以2種以上組合成混合配體。
在聯吡啶的情況下，配位數為6。聯吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
聯吡啶鐵絡合物的例子，例如有三聯吡啶合鐵、三(4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(4，4』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(4，4』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(4，4』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(4，4』-二溴-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合鐵、三(5，5』-二溴-2，2』-聯吡啶)合鐵等。
在咪唑的情況下，配位數為6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑鐵絡合物的例子，例如有六咪唑合鐵、六(4-甲基-咪唑)合鐵、六(4-苯基-咪唑)合鐵、六(4-氨基-咪唑)合鐵、六(4-羥基-咪唑)合鐵、六(4-羧基-咪唑)合鐵、六(4-溴-咪唑)合鐵等。
胺基酸例如有精氨酸(L-Arg)。通常精氨酸鐵絡合物具有溶解性高的優點。作為混合配體，例如有聯吡啶與咪唑的組合、聯吡啶與胺基酸的組合。例如有[Fe(咪唑)2(聯吡啶)2]、[Fe(L-Arg)2(聯吡啶)2]。使用混合配體時，可以賦予絡合物各種性質，例如，使用精氨酸時，絡合物的溶解性提高。
(釕絡合物)釕絡合物的配體，例如有氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配體。上述配體也可以2種以上組合成混合配體。
在聯吡啶的情況下，配位數為6。聯吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
聯吡啶釕絡合物的例子，例如有三聯吡啶合釕、三(4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(4，4』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(4，4』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(4，4』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(4，4』-二溴-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合釕、三(5，5』-二溴-2，2』-聯吡啶)合釕等。
在咪唑的情況下，配位數為6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑釕絡合物的例子，例如有六咪唑合釕、六(4-甲基-咪唑)合釕、六(4-苯基-咪唑)合釕、六(4-氨基-咪唑)合釕、六(4-羥基-咪唑)合釕、六(4-羧基-咪唑)合釕、六(4-溴-咪唑)合釕等。
胺基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸釕絡合物具有溶解性高的優點。作為混合配體，例如有聯吡啶與咪唑的組合、聯吡啶與胺基酸的組合。例如有[Ru(咪唑)2(聯吡啶)2]、[Ru(L-Arg)2(聯吡啶)2]。使用混合配體時，可以賦予絡合物各種性質，例如，使用精氨酸時，絡合物的溶解性提高。
(鋨絡合物)鋨絡合物通過酶的電子傳遞，例如顏色從橙色系(Os3+)變成茶褐色系(Os2+)。作為鋨絡合物的配體，例如有氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物配體。上述配體也可以2種以上組合成混合配體。
在聯吡啶的情況下，配位數為6。聯吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
聯吡啶鋨絡合物的例子，例如有三聯吡啶合鋨、三(4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(4，4』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(4，4』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(4，4』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(4，4』-二溴-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二甲基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二苯基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二羥基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二羧基-2，2』-聯吡啶)合鋨、三(5，5』-二溴-2，2』-聯吡啶)合鋨等。
在咪唑的情況下，配位數為6。咪唑可以未取代，也可以引入取代基。通過引入取代基，例如可以調節溶解度、氧化還原電位等。取代位置有2位、4位及5位。取代基例如有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基(例如溴、氯、碘等)。
咪唑鋨絡合物的例子，例如有六咪唑合鋨、六(4-甲基-咪唑)合鋨、六(4-苯基-咪唑)合鋨、六(4-氨基-咪唑)合鋨、六(4-羥基-咪唑)合鋨、六(4-羧基-咪唑)合鋨、六(4-溴-咪唑)合鋨等。
胺基酸例如有精氨酸(L-Arg)。精氨酸鋨絡合物具有溶解性高的優點。作為混合配體，例如有聯吡啶與咪唑的組合、聯吡啶與胺基酸的組合。例如有[Os(咪唑)2(聯吡啶)2]、[Os(L-Arg)2(聯吡啶)2]。使用混合配體時，可以賦予絡合物各種性質，例如，使用精氨酸時，絡合物的溶解性提高。
上述過渡金屬絡合物的說明是著眼於過渡金屬的種類舉的例子，本發明不只限於這些。下面著眼於配體來對過渡金屬絡合物進行說明。
具有N、O、S配位原子的配體，是指分子內例如具有＝N-OH、-COOH、-OH、-SH、＞C＝O等基的配體。具有這種配體的金屬絡合物，例如有NN螯合物、NO螯合物、NS螯合物、OO螯合物、OS螯合物、SS螯合物(二齒配位)、N螯合物(單齒)、NNN螯合(三齒)等，組合達多種。如果選擇有雙鍵的配體，銅、鐵、釕、鋨金屬就容易帶有電子傳遞/授受功能。作為配體，優選具有芳環的配體。如上所述，配體上可以引入各種取代基。例如，如果引入磺基等，金屬絡合物的溶解度就會上升。形成金屬絡合物時，可以二種以上配體混合，用作混合配體絡合物。例如，作為配體之一，如果混合胺基酸，有時與酶的親和性變好。中心金屬的一部分位置也可以帶有各種滷素(例如氯、氟、溴、碘)等。下面所示為按配位的類型分類的過渡金屬絡合物的一例。
(NN配位型)菲繞啉衍生物Cu+1，10-菲繞啉Fe+1，10-菲繞啉Cu+紅菲繞啉Fe+紅菲繞啉Cu+紅菲繞啉磺酸Fe+紅菲繞啉磺酸聯吡啶衍生物Cu+2，2』-聯吡啶Fe+2，2』-聯吡啶Fe+4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶Ru+4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶三嗪衍生物Cu+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)Fe+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)Fe+PDTS(3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)聯喹啉衍生物Cu+亞銅試劑(亞銅試劑＝2，2』-聯喹啉)吡啶基偶氮衍生物Fe+硝基-PAPS(2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)(NO配位型)Fe+亞硝基-PSAP(2-亞硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)Fe+亞硝基-ESAP(亞硝基-ESAP＝2-亞硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)Fe+1-亞硝基-2-萘酚(NS配位型)Fe+2-氨基-4-噻唑乙酸(OO配位型)Fe+1，2-萘醌-4-磺酸(混合配體型)Os+氯，咪唑，4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶Os+咪唑，4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶Cu+L-精氨酸，2，2』-聯吡啶Cu+乙二胺，2，2』-聯吡啶Cu+咪唑，2，2』-聯吡啶下面，舉例說明本發明的比色分析方法適用於試驗片的例子，使用銅絡合物作為電子授受顏色變化物質，以葡萄糖為分析對象。膽固醇等其他成分的分析，除隨之改變氧化還原酶外，基本相同。
首先，準備聯吡啶銅絡合物。其可以使用市售品，也可以自己配製。例如，將CuCl2和2，2』-聯吡啶(bpy)在約60-90℃的溫浴中混合，合成[Cu(bpy)2]Cl2。CuCl2和2，2』-聯吡啶(bpy)的摩爾比例如為1∶2。聯吡啶銅絡合物水溶液的濃度例如為1-10質量％。在該聯吡啶銅絡合物水溶液中溶解粘合劑，再在該粘合劑溶液中溶解葡萄糖脫氫酶(GDH)，作為試劑溶液。粘合劑例如有羥丙基纖維素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯醯胺、牛血清白蛋白(BSA)等，其中，優選HPC。粘合劑的濃度例如為0.5-5質量％的範圍。GDH的濃度例如為1000～50000U/ml。使上述試劑溶液浸漬在濾紙等多孔質薄片中，然後通過乾燥，可以作成葡萄糖分析用試驗片。在浸漬上述試劑溶液前，優選將無機凝膠溶液浸漬在上述多孔質薄片中，乾燥。無機凝膠例如有蒙脫石等。上述無機凝膠溶液的無機凝膠濃度例如為1～5質量％，優選為1～3質量％，更優選為1.5～2質量％。上述無機凝膠溶液中可以含有CHAPS等兩性表面活性劑。相對於上述無機凝膠溶液總量，上述兩性表面活性劑的濃度例如為0.1～2質量％，優選為0.1～1質量％，更優選為0.2～0.4質量％。相對於上述多孔質薄片，按多孔質薄片空隙體積基準，上述無機凝膠的浸漬量例如為1～50mg/cm3，優選為10～30mg/cm3，更優選為15～20mg/cm3。上述多孔質薄片，可以是孔徑隨著厚度方向或薄片面方向變化的非對稱多孔質膜。該試驗片，開始為藍色，如果點上血液等含有葡萄糖的試樣，根據其濃度，變成紅褐色。通過該顏色變化，可以進行葡萄糖的定性或定量分析。分析所需要的時間為點上試樣後約2～3秒。如果該試驗片中浸漬有無機凝膠，可以防止顏色變化後的再氧化引起的褪色，得到更多供測定的時間。
上述無機凝膠，例如優選使用膨潤性粘土礦物。膨潤性粘土礦物中，更優選膨潤土、蒙脫石、蛭石或合成氟雲母，特別優選合成鋰蒙脫石或合成皂石等合成蒙脫石，或以合成氟雲母為代表的膨潤性合成雲母(或Na型雲母)等合成雲母(天然雲母通常為非膨潤性粘土礦物)。
下面舉例說明本發明的比色分析方法適用於液系分析的例子，使用銅絡合物作為電子授受顏色變化物質，以葡萄糖為分析對象。膽固醇等其他成分的分析，除隨之改變氧化還原酶外，基本相同。
即，如上所述，合成銅絡合物[Cu(bpy)2]Cl2。將該銅絡合物和GDH在緩衝液中溶解，配製試劑溶液。也可以在水中溶解，但優選在緩衝液中溶解。緩衝液的pH例如為pH6～8的範圍，優選為pH6.5～7的範圍。銅絡合物的濃度例如為0.1～60mM，優選為0.2～10mM，更優選為0.3～0.6mM。GDH的濃度例如為10～1000U/ml，優選為50～500U/ml，特別優選為100～200U/ml。該試劑溶液中如果添加血液等含葡萄糖的檢體，例如，在5秒以內的短時間內，上述試劑溶液的顏色根據檢體的葡萄糖濃度由藍色變成紅褐色。該變化可以用目測確認，也可以使用分光光度計等光學測定裝置測定。上述檢體的添加量，相對於上述試劑溶液1ml，例如為1～100μl的範圍，優選為3～10μl的範圍，更優選為5～10μl的範圍。
如上所述，在本發明的比色分析方法中，除使用電子授受顏色變化物質，還優選使用鋨絡合物、釕絡合物等介質。在試驗片的情況下，相對於上述試劑溶液總量，該介質的用量例如為0.1～50mM，優選為0.5～10mM，更優選為1～3mM，在液系分析的情況下，相對於上述試劑溶液總量，該介質的用量例如為0.1～10mM，優選為0.1～1mM，更優選為0.1～0.3mM。它們的最適濃度根據使用的介質的種類而變化。
實施例下面對本發明的實施例進行說明。下述中PQQ表示吡咯並喹啉醌，其他試劑的詳細說明如下。

(實施例1)將CuCl2和2，2』-聯吡啶按摩爾比1∶2在約80℃的溫浴中混合，配製[Cu(bpy)2]Cl2·6H2O水溶液(濃度80mM)。另外，將HPC-M在聯吡啶銅絡合物水溶液中溶解(濃度2質量％)，一次加熱至50℃後，冷卻至25℃。再在該水溶液中按50000U/ml的濃度溶解GDH，配製試劑溶液。然後，準備孔徑隨著厚度方向變化的非對稱性多孔質膜(製品編號BTS-25、US Filter公司生產)，預先從上述多孔質膜的孔小的一面浸漬無機凝膠(製品編號Laponite XLG、ROOKWOOD Additives公司生產)的水溶液(2質量％)後，乾燥。然後從上述多孔質膜的孔大的一面點上2μl試劑溶液，通風乾燥，形成圓形的斑點(淺藍色)。剪下該斑點部分，用帶孔的PET膜夾住，製作成目的物葡萄糖分析用試驗片。
在該試驗片上點上4種葡萄糖濃度的血清(0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)，點上5秒後，用反射率測定裝置測定顏色變化(波長470nm)。結果如圖1所示。如圖所示，在該試驗片中，點上5秒以內，根據葡萄糖濃度而顯色。這種根據葡萄糖濃度的顯色(紅褐色)，通過目測也能夠觀察。顯色所需要的時間為2～3秒。上述葡萄糖添加血清，是將糖酵解完畢的人全血血漿凍結熔化，得到的血清中，按上述各種濃度添加葡萄糖而配製的。
(實施例2)將0.01mol氯化銅(II)在30ml熱水中溶解，向其中加入0.02mol2，2』-聯吡啶，攪拌。然後，冷卻，析出六水合物結晶，得到[Cu(bpy)2]Cl2·6H2O。將含有該銅絡合物的下述反應試劑1ml放入光程長10mm的微量吸收池中，用分光光度計(日本分光公司生產的V-550型)測定波長300nm～900nm的吸收光譜，將此作為空白(氧化型)。在該吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，攪拌，立即測定光譜。結果如圖2所示。如圖所示，通過酶反應，銅絡合物被還原，確認在短波長側有顯色。
(反應試劑組成)[Cu(bpy)2]Cl20.4mMPIPES(pH7.0)50mMPQQGDH 200U/ml(實施例3)將0.01mol氯化銅(II)及0.033mol 2，2』-聯吡啶加到少量水中，加熱至完全溶解後，冷卻時，析出[Cu(bpy)3]Cl2·6H2O結晶。將含有該銅絡合物的下述反應試劑1ml放入光程長10mm的微量吸收池中，用分光光度計(日本分光公司生產的V-550型)測定波長300nm～900nm的吸收光譜，將此作為空白(氧化型)。在該吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，攪拌，立即測定光譜。結果如圖3所示。如圖所示，通過酶反應，銅絡合物被還原，確認在短波長側有顯色。
(反應試劑組成)[Cu(bpy)3]Cl20.4mMPIPES(pH7.0) 50mMPQQGDH200U/ml
(實施例4)分別將0.01mol氯化銅(II)在10ml熱水中溶解，將0.01mol乙二胺(en)在10ml熱水中溶解，將0.01mol 2，2』-聯吡啶在10ml熱乙醇中溶解，混合這3種溶液，得藍色溶液。將該溶液冷卻濃縮，得[Cu(en)(bpy)]Cl2針狀結晶。將含有該銅絡合物的下述反應試劑1ml放入光程長10mm的微量吸收池中，用分光光度計(日本分光公司生產的V-550型)測定波長300nm～900nm的吸收光譜，將此作為空白(氧化型)。在該吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，攪拌，立即測定光譜。結果如圖4所示。如圖所示，通過酶反應，銅絡合物被還原，確認在短波長側有顯色。
(反應試劑)[Cu(en)(bpy)]Cl20.4mMPIPES(pH7.0) 50mMPQQGDH 200U/ml(實施例5)將511mg(3.0mmol，1.0eq.)氯化銅(II)二水合物CuCl2·2H2O在10ml熱水中溶解，配製氯化銅水溶液。另外，將408mg(6.0mmol，2.0eq.)咪唑在10ml水中溶解，將69mg(3.0mmol，1.0eq.)2，2』-聯吡啶在10ml乙醇中溶解，配製這2種溶液的混合溶液。將該混合溶液加到氯化銅水溶液中，配製[Cu(Him)2(bpy)]Cl2的深藍色溶液。將含有該銅絡合物的下述反應試劑1ml放入光程長10mm的微量吸收池中，用分光光度計(日本分光公司生產的V-550型)測定波長300nm～900nm的吸收光譜，將此作為空白(氧化型)。在該吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，攪拌，立即測定光譜。結果如圖5所示。如圖所示，通過酶反應，銅絡合物被還原，確認在短波長側有顯色。
(反應試劑)[Cu(Him)2(bpy)]Cl21mMPIPES(pH7.0)50mMPQQGDH 1000U/ml(實施例6)分別將0.01mol氯化銅(II)在10ml熱水中溶解，將0.01mol L-精氨酸在10ml熱水中溶解，將0.01mol 2，2』-聯吡啶在10ml熱乙醇中溶解，混合這3種溶液，得深藍色溶液。將該溶液冷卻濃縮，得[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl2針狀結晶。將含有該銅絡合物的下述反應試劑1ml放入光程長10mm的微量吸收池中，用分光光度計(日本分光公司生產的V-550型)測定波長300nm～900nm的吸收光譜，將此作為空白(氧化型)。在該吸收池中添加500mM葡萄糖水溶液10μl，攪拌，立即測定光譜。結果如圖6所示。如圖所示，通過酶反應，銅絡合物被還原，確認在短波長側有顯色。
(反應試劑)[Cu(L-Arg)(bpy)]Cl21mMPIPES(pH7.0) 50mMPQQGDH 1000U/ml(實施例7)準備孔徑隨著厚度方向變化的非對稱性多孔質膜(製品編號BTS-25、US Filter公司生產)，預先從上述多孔質膜的孔小的一面浸漬下述組成的無機凝膠水溶液(2質量％)後，乾燥。然後從上述多孔質膜的孔大的一面點上2μl下述組成的試劑溶液，通風乾燥，形成圓形的斑點(淺藍色)。剪下該斑點部分，用帶孔的PET膜夾住，製作成目的物葡萄糖分析用試驗片。
(無機凝膠水溶液組成)蒙脫石(與實施例1同一製品) 1.8質量％CHAPS(表面活性劑) 0.4質量％(試劑溶液)[Cu(bpy)2]Cl280mM[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl33mMPQQ-GDH1000U/mlBSA5％CHAPS 0.4％在該試驗片上點上4種葡萄糖濃度的血清(0mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml)，點上5秒後，用反射率測定裝置測定顏色變化(波長470nm)。結果如圖7所示。如圖所示，該試驗片中，點上後立即根據葡萄糖濃度顯色。這種根據葡萄糖濃度的顯色(紅褐色)，通過目測也能夠觀察。顯色瞬時發生。上述葡萄糖添加血清，是將糖酵解完畢的人全血血漿凍結熔化，得到的血清中，按上述各種濃度添加葡萄糖而配製的。
(實施例8)相對於下述組成的試劑溶液100μl，添加500 mM葡萄糖水溶液10μl。於是，1分鐘以內，上述試劑溶液由開始的顏色綠色變成紅褐色，目測便可確認。上述試劑溶液開始的顏色為綠色，是因為GOD中含有的輔酶FAD為黃色、銅為藍色，兩者混合變成綠色。
(試劑溶液組成)GOD(Sigma公司生產，比活性209U/mg) 50mg/ml[Cu(bpy)2]Cl240mMPIPES(pH7) 50mMCHAPS 0.1質量％
(實施例9)相對於下述組成的試劑溶液100μl，添加500mM葡萄糖水溶液10μl。於是，5秒鐘以內，上述試劑溶液由開始的顏色綠色變成紅褐色，目測便可確認。上述試劑溶液開始的顏色為綠色，是因為GOD中含有的輔酶FAD為黃色、銅為藍色，兩者混合變成綠色。
(試劑溶液組成)GOD(Sigma公司生產，比活性209U/mg)50mg/ml[Cu(bpy)2]Cl240mM[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl20.3mMPIPES(pH7) 50mMCHAPS0.1質量％(實施例10)製備具有各種配體的銅絡合物。即，氯化銅(II)與以下配體按摩爾比1∶2混合，用精製水溶解，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘，使之配位，得絡合物溶液。

(實施例11)使用下面所示配體和聯吡啶作為配體，製備銅的混合配體絡合物。即，銅∶以下配體∶聯吡啶按摩爾比1∶2∶1混合，用精製水溶解，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘，使之配位，得以下配體。

(實施例12)使用各種配體製備鐵絡合物。將氯化鐵(III)與以下配體按摩爾比1∶3混合，用精製水溶解，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘，使之配位，得絡合物溶液。

(實施例13)如下所述，製備2種釕絡合物。
首先，將市售的釕絡合物(Aldrich公司，Hexaammineruthenium(III)chloride(氯化六氨釕))在水中溶解，得[Ru(NH3)6]的絡合物溶液。三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合釕配體將11.8g(63.0mmol)2，2』-聯吡啶-N，N』-二氧化物(Aldrich公司生產)在用冰浴冷卻過的濃硫酸120ml中緩慢溶解，將反應液加熱到100℃。然後緩慢滴加64.0g(630mmol)硝酸鉀的100ml濃硫酸溶液，之後加熱攪拌1小時。反應後，將溶液放冷至室溫，倒入碎冰中，過濾得4，4』-二硝基-2，2』-聯吡啶-N，N』-氧化物固體。在氬氣流下，將4，4』-二硝基-2，2』-聯吡啶-N，N』-氧化物7.0g(25mM)、10％鈀碳6.0g混懸於23ml乙醇中。向該溶液中滴加肼一水合物6.3g(126mmol)的47ml乙醇溶液，回流8小時。將反應液放冷後，過濾，濃縮濾液。用矽膠柱進行精製，得4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶。
合成在50mL二頸燒瓶中放入乙二醇(10ml)，依次攪拌溶解DA-bpy(0.2g)、RuCl3(0.1g)，在N2氣流下強烈攪拌的同時用加熱套加熱，回流約4小時。
精製在N2氣流下攪拌·放冷後，移到100ml茄形燒瓶中，將反應液用丙酮(5ml)+乙醚(20ml)洗滌。將反應液用丙酮(5ml)+乙醚(20ml)反覆洗滌，直到溶劑乙二醇完全除去。將充分洗滌過的目的物用乙醇溶解，通過加入乙醚使目的物沉澱。用乙醚洗滌的同時過濾，減壓乾燥，得三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶)合釕固體。將其水溶，得絡合物溶液。
(實施例14)如下所述，製備2種鋨絡合物。
合成在氮氣流下，將(NH4)2[OsCl6]2.00g(4.56mmol、Aldrich公司)和1.68g(9.11mmol)4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶(dmbpy，和光純藥公司)在60ml乙二醇中回流1小時。冷卻至室溫後，用30分鐘加入120ml 1M連二亞硫酸鈉水溶液，在冰浴中冷卻30分鐘。將得到的沉澱減壓過濾，用水充分洗滌(使用500～1000ml)。再用乙醚洗滌2次後，減壓乾燥，得[OsCl2(dmbpy)2]1.5～1.7g。在氮氣流下，將1.56g(2.60mmol)得到的[OsCl2(dmbpy)2]與0.36g(5.2mmol)咪唑(Him)在50ml水/甲醇混合溶劑中回流2小時。冷卻至室溫後，加入300ml飽和NaCl水溶液。將得到的沉澱減壓過濾，用飽和NaCl水溶液洗滌後，減壓乾燥，得[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
精製將[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2用儘量少量的乙腈/甲醇(1∶1v/v)溶解，用柱色譜(吸附劑活性氧化鋁，展開溶劑乙腈/甲醇)精製。溶劑蒸發後，在少量的丙酮中溶解，用乙醚再沉澱。將得到的沉澱減壓過濾後，減壓乾燥。將其水溶，得絡合物溶液。
合成在氮氣流下，將2.00g(4.56mmol)(NH4)2[OsCl6]和1.68g(9.11mmol)dmbpy在60ml 乙二醇中回流1小時。冷卻至室溫後，用30分鐘加入120ml 1M連二亞硫酸鈉水溶液，在冰浴中冷卻30分鐘。將得到的沉澱減壓過濾，用水充分洗滌(使用500～1000ml)。再用乙醚洗滌2次後，減壓乾燥。這樣，得[OsCl2(dmbpy)2]1.5～1.7g。在氮氣流下，將1.56g(2.60mmol)得到的[OsCl2(dmbpy)2]與0.36g(5.2mmol)Him在50ml 1，2-乙二醇溶劑中回流2小時。冷卻至室溫後，加入300ml飽和NaCl水溶液。將得到的沉澱減壓過濾，用飽和NaCl水溶液洗滌後，減壓乾燥，得[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2。
精製將[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2用儘量少量的乙腈/甲醇(1∶1v/v)溶解，用柱色譜(吸附劑活性氧化鋁，展開溶劑乙腈/甲醇)精製。溶劑蒸發後，在少量的丙酮中溶解，用乙醚再沉澱。將得到的沉澱減壓過濾後，減壓乾燥。將其水溶，得絡合物溶液。
(實施例15)按下面的試劑溶液組成1～6，混合NN配位型菲繞啉配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖8A～圖8F所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖8A)PQQ-GDH 50U/ml二(1，10-菲繞啉)合銅 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(試劑溶液組成2圖8B)PQQ-GDH 50U/ml三(1，10-菲繞啉)合鐵 0.1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(試劑溶液組成3圖8C)PQQ-GDH 50U/ml[Cu(紅菲繞啉)2] 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(紅菲繞啉＝4，7-二苯基菲繞啉)(試劑溶液組成4圖8D)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(紅菲繞啉)3] 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(紅菲繞啉＝4，7-二苯基菲繞啉)(試劑溶液組成5圖8E)PQQ-GDH 50U/ml[Cu(紅菲繞啉磺酸)2] 1mMPIPES pH750mM
Triton X-1000.5％(試劑溶液組成6圖8F)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(紅菲繞啉磺酸)3]0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(實施例16)按下面的試劑溶液組成1～4，混合NN配位型聯吡啶配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖9A～圖9D所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖9A)PQQ-GDH 50U/ml二(2，2』-聯吡啶)合銅 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(試劑溶液組成2圖9B)PQQ-GDH 50U/ml三(2，2』-聯吡啶合鐵1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(試劑溶液組成3圖9C)PQQ-GDH 50U/ml三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶合銅 0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％
(試劑溶液組成4圖9D)PQQ-GDH50U/ml三(4，4』-二氨基-2，2』-聯吡啶合釕 10mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(實施例17)按下面的試劑溶液組成1～3，混合NN配位型三嗪配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖10A～圖10C所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖10A)PQQ-GDH50U/ml[Cu(TPTZ)2] 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)(試劑溶液組成2圖10B)PQQ-GDH50U/ml[Fe(TPTZ)3] 0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)(試劑溶液組成3圖10C)PQQ-GDH50U/ml[Fe(PDTS)3] 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％
(PDTS＝3-(2-吡啶基)-5，6-二(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)(實施例18)按下面的試劑溶液組成，混合NN配位型聯喹啉配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖11所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成)PQQ-GDH 50U/ml[Cu(亞銅試劑)2]1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(亞銅試劑＝2，2』-聯喹啉)(實施例19)按下面的試劑溶液組成，混合NN配位型吡啶基偶氮配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖12所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(硝基-PAPS)3] 0.02mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(硝基-PAPS＝2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)
(實施例20)按下面的試劑溶液組成1～3，混合NO配位型配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖13A～圖13C所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖13A)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(亞硝基-PSAP)3] 0.05mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(亞硝基-PSAP＝2-亞硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)(試劑溶液組成2圖13B)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(亞硝基-ESAP)3] 0.1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(亞硝基-ESAP＝2-亞硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)(試劑溶液組成3圖13C)PQQ-GDH 50U/ml[Fe(1-亞硝基-2-萘酚)3] 0.1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(實施例21)按下面的試劑溶液組成，混合NS配位型配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖14所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成)PQQ-GDH 50U/ml三(2-氨基-4-噻唑乙酸)合鐵 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(實施例22)按下面的試劑溶液組成，混合OO配位型配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖15所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成)PQQ-GDH 50U/ml三(1，2-萘醌-4-磺酸)合鐵1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(實施例23)按下面的試劑溶液組成1～5，混合混合配體的絡合物、酶、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖，測定顏色變化後的光譜。結果如圖16A～圖16E所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖16A)PQQ-GDH 50U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2]0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％
(Him＝咪唑)(dmbpy＝4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)(試劑溶液組成2圖16B)PQQ-GDH50U/ml[Os(Him)2(dmbpy)2] 0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(試劑溶液組成3圖16C)PQQ-GDH50U/ml[Cu(L-Arg)2(bpy)] 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(L-Arg＝L-精氨酸)(bpy＝2，2』-聯吡啶)(試劑溶液組成4圖16D)PQQ-GDH50U/ml[Cu(en)2(bpy)]1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(en＝乙二胺)(bpy＝2，2』-聯吡啶)(試劑溶液組成5圖16E)PQQ-GDH50U/ml[Cu(Him)2(bpy)] 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％
(實施例24)按下面的試劑溶液組成1、2，混合絡合物、酶(葡萄糖氧化酶(GOD)、丙酮酸氧化酶)、緩衝液，配製試劑溶液。測定其光譜，作為空白，再相對於絡合物添加當量的葡萄糖或丙酮酸，測定顏色變化後的光譜。結果如圖17A、圖17B所示。絡合物使用根據上述實施例配製的。
(試劑溶液組成1圖17A)GOD 100U/ml二(2，2』-聯吡啶)合銅 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(試劑溶液組成2圖17B)丙酮酸氧化酶100U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2]0.1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(Him＝咪唑)(dmbpy＝4，4』-二甲基-2，2』-聯吡啶)(實施例25)按下面的試劑溶液組成，混合緩衝液，配製試劑溶液。另外，配製下述酶溶液1、2、3。在10mm長的處理池中添加0、10、20、30mM葡萄糖水溶液10μl(終濃度0、0.1、0.2、0.3mM)，然後添加上述試劑溶液500μl，最後，添加酶溶液500μl，開始反應，用分光光度計(波長600nm)觀察50秒間的吸光度變化。結果如圖18A、圖18B、圖18C所示。如圖所示，酶量越增加，反應速度越快，酶活性1000U/ml時，5秒左右就達反應終點。對反應達到終點的5秒鐘附近的信號取樣，可以進行葡萄糖的定量。另外，根據反應到達終點的時間進程的趨勢也可以進行葡萄糖的定量。
(試劑組成)Cu(PDTS)21mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(酶溶液1圖18A)PQQ-GDH 111U/ml(酶溶液2圖18B)PQQ-GDH 333U/ml(酶溶液3圖18C)PQQ-GDH 1000U/ml產業利用性如上所述，根據本發明的比色分析方法，可以短時間且簡單地進行可靠的分析。
權利要求
1.使氧化還原酶作用於分析對象及通過電子授受而顏色變化的電子授受顏色變化物質，通過測定由於上述分析對象向上述電子授受顏色變化物質的電子傳遞而發生的上述電子授受顏色變化物質的顏色變化，對上述分析對象進行定性或定量的比色分析方法。
2.根據權利要求1所述的比色分析方法，其中電子授受顏色變化物質為過渡金屬絡合物。
3.根據權利要求2所述的比色分析方法，其中過渡金屬絡合物為選自銅絡合物、鐵絡合物、釕絡合物和鋨絡合物的至少一種絡合物。
4.根據權利要求3所述的比色分析方法，其中過渡金屬絡合物的配體中的配位原子為選自氮、氧及硫的至少一種。
5.根據權利要求4所述的比色分析方法，其中過渡金屬絡合物的配體為氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。
6.根據權利要求5所述的比色分析方法，其中配體的配位位置以外的氫原子的至少一個被取代基取代。
7.根據權利要求6所述的比色分析方法，其中取代基為選自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基的至少一種。
8.根據權利要求2所述的比色分析方法，其中過渡金屬絡合物具有2種以上的配體。
9.根據權利要求1所述的比色分析方法，其中氧化還原酶為脫氫酶或氧化酶。
10.根據權利要求1所述的比色分析方法，其中分析對象為葡萄糖、膽固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，氧化還原酶為對應於上述各物質的脫氫酶或氧化酶。
11.在權利要求1所述的比色分析方法中使用的試劑，其為含有氧化還原酶及通過電子授受而顏色變化的電子授受顏色變化物質的試劑。
12.根據權利要求11所述的試劑，其中電子授受顏色變化物質為過渡金屬絡合物。
13.根據權利要求12所述的試劑，其中過渡金屬絡合物為選自銅絡合物、鐵絡合物、釕絡合物和鋨絡合物的至少一種絡合物。
14.根據權利要求12所述的試劑，其中過渡金屬絡合物的配體中的配位原子為選自氮、氧及硫的至少一種。
15.根據權利要求14所述的試劑，其中過渡金屬絡合物的配體為氨、聯吡啶化合物、咪唑化合物、菲繞啉化合物、乙二胺化合物、胺基酸、三嗪化合物、聯喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯並噻唑化合物、乙醯丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。
16.根據權利要求15所述的試劑，其中配體的配位位置以外的氫原子的至少一個被取代基取代。
17.根據權利要求16所述的試劑，其中取代基為選自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺醯基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、醯基、醯胺基及滷素基的至少一種。
18.根據權利要求12所述的試劑，其中過渡金屬絡合物具有2種以上的配體。
19.根據權利要求11所述的試劑，其中氧化還原酶為脫氫酶或氧化酶。
20.根據權利要求11所述的試劑，其中分析對象為葡萄糖、膽固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，氧化還原酶為對應於上述各物質的脫氫酶或氧化酶。
21.含有權利要求11所述的試劑的試驗片。
22.根據權利要求21所述的試驗片，其還含有無機凝膠。
全文摘要
本發明提供可以短時間且簡單地實施可靠的分析的比色分析方法。在濾紙中浸漬含有聯吡啶銅絡合物及葡萄糖脫氫酶的水溶液，乾燥。向其中點上血液等試樣，根據葡萄糖濃度，聯吡啶銅絡合物顯紅褐色，測定之。由於該反應為一步反應，在5秒以下的短時間內便發生。而且，由於該反應不需要過氧化氫和氧，測定值的可靠性也高。
文檔編號G01N33/52GK1610753SQ0380185
公開日2005年4月27日 申請日期2003年1月6日 優先權日2001年12月28日
發明者永川健兒, 辻本朋吾, 西野進, 寺元正明, 川瀨喜幸 申請人:愛科來株式會社