一種三維仿生電極化梯度孔神經導管的構建及其製備的製作方法

2023-10-17 16:24:34

專利名稱：一種三維仿生電極化梯度孔神經導管的構建及其製備的製作方法
技術領域：
本發明屬於神經導管的構建及其製備領域，特別是涉及一種三維仿生電極化梯度孔神經導管的構建及其製備。
背景技術：
周圍神經缺損是臨床常見疾病，大約2. 8%的創傷患者導致周圍神經損傷，並且嚴重者將終身殘疾。我國每年有幾十萬病例需要神經修復，但修復效果不盡如人意，故周圍神經損傷後的再生和功能恢復一直是神經科學領域的熱門課題。目前，自體神經移植作為周圍神經損傷的金標準，是最為經典的橋接修復神經缺損的方法，但其並非最理想的方法。除供體來源有限，會造成供體部位部分功能喪失及永久性神經損傷，還受可修復長度、瘢痕形成等問題的限制。當前研究著重於發展能夠用物理性神經再生通過損傷區的神經導管。所 以設計具有良好的生物相容性、生物可降解性和力學性能的神經導管是臨床醫學的重大需求。理想的神經導管材料除應具有良好的生物相容性，良好的生物可降解吸收性，良好的可塑性和適宜的力學性能等外，還應具有良好的表面活性和組織誘導性。￠-磷酸三隹丐(^ -tricalci -umphosphate ( ^ -TCP))是一種生物降解和生物吸收型磷酸韓生物活性材料，具有良好的可生物降解性、生物相容性和生物無毒性。且其降解產物顯弱鹼性，能部分中和材料降解產生的酸性，並且有研究表明Ca2+在介導軸突生長和遷移方向中起關鍵作用。聚乳酸(PDLLA)是一種重要的生物可降解聚合物，以其優良的生物相容性和生物可吸收性以及良好的力學性能而被廣泛研究和應用於周圍神經的損傷與修復中。透明質酸(HA)帶有大量負電荷，對成纖維細胞有排斥作用，可形成化學屏障。同時高濃度、高分子量HA具有抑制淋巴細胞、單核細胞和成纖維細胞的遷移，減輕炎症反應，形成免疫屏障的作用。更為重要的是，HA能夠選擇性地刺激成纖維細胞合成膠原，促進膠原纖維以網狀排列方式沉積，從而減少瘢痕的形成。殼聚糖(CHS)是唯一的鹼性天然多糖高分子，具有良好的生物可降解性和生物相容性，與生物體的親和性能體現在細胞水平上，產生抗原的可能性很小，對受損傷的生物體能誘生特殊細胞，加快創傷癒合，特別是促進癒合張力的增長，還具有消炎、止血、鎮痛和抑菌等性能，能有效防止神經再生過程中瘢痕的產生，但其力學性能較差。神經生長因子(NGF)不僅能夠保護神經元、誘導神經軸突伸展、促進周圍神經再生，而且可以參與機體免疫、造血、炎症反應、生殖等系統功能的調節，作為從生物體中提取的一種生物製劑，極具發展潛力。自組裝是指構建基元在沒有人為介入的情況下自發地形成有序結構。目前，將聚合物的自組裝應用於製備精細表面及界面己成為十分活躍的研究方向。逐漸成為研究生物功能、理解生命現象、探索生命起源的一個極其重要的研究領域。其中，「靜電自組裝」已成為一種日益引起廣大生物材料工作者興趣的新方法。目前，國內外研究較多的是用生物可降解材料所構建的神經導管修復神經損傷。然而，任何單一的可降解材料都無法滿足上述要求，只有充分利用天然高分子的生物活性基元及合成高分子良好的力學加工性能、便於大批量生產以及成本低等特點，進行天然高分子和合成高分子結構雜化和優勢互補，才能使製備出的周圍神經再生導管賦予更多的性能。高滲透、梯度孔三維神經導管因可以負載生長因子和活體細胞並能引導神經纖維定向生長，故在周圍神經再生修複方面具有獨特的優勢。探索尋找更為適宜製備此類神經導管材料的研究始終在進行中。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種三維仿生電極化梯度孔神經導管及其製備方法，該導管具有「人工神經」 以及神經組織工程支架的雙重作用，有利於負載生長因子和活體細胞，並能引導神經纖維定向生長，且該神經導管具有良好的生物相容性和生物降解性能；其製備方法簡單，無汙染。本發明的一種三維仿生電極化梯度孔神經導管是基於細胞外基質材料的仿生分子來設計的，它是電極化P-磷酸三鈣/聚乳酸/透明質酸/殼聚糖/神經生長因子神經導管，是以聚乳酸(PDLLA)為基質材料，添加電極化￠-磷酸三鈣(P-TCP在外加電場的作用下，使其電極化)，製備均勻分散的電極化P -磷酸三鈣與聚乳酸(電極化P -TCP/PDLLA)芯材；再以靜電自組裝和偶合交聯技術將透明質酸和殼聚糖以及神經生長因子附於芯材表面製備的成分和孔結構雙重梯度的三維仿生電極化梯度孔神經導管(記作電極化3-TCP/PDLLA/HA/CHS/NGF 神經導管)。所述的神經導管長度為10 100mm,內徑為I 6mm,壁厚為0. 5 2mm。本發明的一種三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備方法，包括如下步驟
(1)將P-磷酸三鈣(P -TCP)粉末(IO-IOOnm)放置在一個直徑2 8cm，高0. 5 3cm氧化招環中，在2 IOkvcm-I直流電場作用下,於100 500°C空氣中電極化I 2小時，得電極化￠-磷酸三鈣，取出備用；
(2)在室溫下，以乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷為溶劑，加入聚乳酸(PDLLA)，再加入電極化3 -磷酸三鈣(電極化3-TCP)，製成混合溶液，混合溶液中聚乳酸質量濃度為5wt% 20wt%,電極化P -憐酸三I丐質量濃度為5wt% 10wt% ；
(3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內，室溫下，採用溶劑揮發法揮發12 48小時，真空乾燥12 48小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化P -磷酸三鈣與聚乳酸(極化P -TCP /PDLLA)芯材；
(4)胺化將步驟(3)製得的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材，浸入濃度為I 10mg/ml的己二胺-異丙醇、己二胺-正丙醇、乙二胺-異丙醇或者乙二胺-正丙醇溶液中，反應I 2小時，用水充分漂洗去掉未反應的己二胺或乙二胺，真空乾燥至恆重；
(5)將上述胺化後的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材依次在濃度為I 10mg/ml的透明質酸、I 10mg/ml的殼聚糖溶液中自組裝，使其在室溫下攪拌，組裝完畢，置於I 10mg/ml的神經生長因子水溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)反應，其加入量為電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I I. 5倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，即得三維仿生電極化梯度孔神經導管。本發明所用的聚乳酸的分子量為I. OX IO5 3. OX IO5，P -磷酸三鈣粉末的粒徑為IO-IOOnm ;選的有機溶劑為乙酸乙酯、氯仿、丙酮或三氯甲烷。
本發明的製備方法步驟(3)中，製得的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材直徑為L 5 8mm o本發明的製備方法步驟(5)中，得到的神經導管外層管壁孔隙率為65%_75%的三維網絡狀結構。本發明的三維仿生電極化梯度孔神經導管應用於周圍神經系統的修復、誘導周圍神經再生以及組織工程中神經細胞的體外培養。電極化0 -TCP的引入可發揮電刺激誘導神經生長作用，PDLLA被廣泛用於神經導管的製備，HA屬酸性多糖，是細胞外基質的重要組成部分，CHS是自然界存在的唯一天然鹼性多糖，是類細胞外基質成分，NGF是典型的靶源性神經營養因子，^ _TCP、PDLLA、HA和CHS的綜合利用可獲得良好力學性能，故本發明用這幾種材料製備的神經導管具有仿細胞的微環境，可達到成分仿生的目的；利用熱致相分離技術和糖模板法可獲得定向高通透性、梯度 孔結構，達到結構仿生的目的。本發明的有益效果在於
I、本發明可以誘導再生神經定向生長。通過P-TCP組成梯度解決引導再生神經軸突定向生長和遷移方向的鈣離子、磷酸根離子適時、適量供給問題，同時解決電極化P -TCP的電荷儲存量和保證誘導神經再生的有效電流問題；通過偶聯技術解決NGF控制釋放問題。2、本發明構建的靜電自組裝多層膜與芯材的裝配以及多層膜內部具有良好的穩定性。3、本發明可以通過神經導管的定向、梯度孔、高通透性的結構的設計與構建技術，實現神經定向再生誘導因子的適時、適量釋放，解決細胞和生長因子定向趨附以及結締組織入侵等難題，為粗大、長段的神經缺損提供解決方案。4、本發明的製備方法簡單，成本低，對環境友好，經濟效益高，適於工業化生產。


圖I :神經導管示意圖
圖2 :神經導管芯材及其掃描電鏡示意圖
圖中1為0-TCP/PDLLA芯材，2為自組裝層，3為梯度孔層。由圖可見，梯度孔層由兩層不同孔徑的多孔層組成，內層為P -TCP/PDLLA多孔結構，外層為CHS/HA多孔結構。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種等價改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例I
三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備，製備步驟為
(I)將P -磷酸三鈣(P -TCP)粉末(IO-IOOnm)放置在一個直徑2釐米，高0. 5釐米氧化鋁環中，在2kvcm-l直流電場作用下，於100°C空氣中電極化I小時，即得電極化P -TCP,取出備用；
(2)在室溫下，以乙酸乙酯為溶劑，分別加入聚乳酸(PDLLA)和電極化P-TCP，製成質量濃度5%的聚乳酸和質量濃度5%的電極化3 -TCP混合溶液；
(3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內，室溫下，採用溶劑揮發法揮發12小時，真空乾燥12小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化3 -TCP /PDLLA 芯材；
(4)胺化，將電極化P-TCP /PDLLA芯材浸入lmg/ml的己二胺-異丙醇溶液中，反應I小時，用水充分漂洗去掉未反應的己二胺，真空乾燥至恆重；(5)將上述胺化後的電極化P-TCP /PDLLA芯材依次在濃度為lmg/ml的HA、lmg/ml的CHS溶液中自組裝，使其在室溫下緩慢攪拌，組裝完畢，置於濃度為lmg/ml的NGF水溶液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)反應，其加入量為電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，得三維仿生電極化梯度孔神經導管。實施例2
三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備，製備步驟為
(1)將P-磷酸三鈣(P -TCP)粉末(IO-IOOnm)放置在一個直徑4釐米，高I. 5釐米氧化鋁環中，在5kvcm-l直流電場作用下，於200°C空氣中電極化2小時，即得電極化P -TCP,取出備用；
(2)在室溫下，以氯仿為溶劑，分別加入聚乳酸(PDLLA)和電極化P-TCP，製成質量濃度10%的聚乳酸和質量濃度6%的電極化P -TCP混合溶液；
(3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內，室溫下，採用溶劑揮發法揮發24小時，真空乾燥24小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化3 -TCP /PDLLA 芯材；
(4)胺化，將電極化P-TCP /PDLLA芯材浸入4mg/ml的己二胺-正丙醇溶液中，反應2小時，用水充分漂洗去掉未反應的乙二胺，真空乾燥至恆重；
(5)將上述胺化後的P-TCP /PDLLA芯材依次在濃度為4mg/ml的HA、4mg/ml的CHS溶液中自組裝，使其在室溫下緩慢攪拌，組裝完畢，置於4mg/ml的NGF水溶液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)反應，其加入量為電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I. 5倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，得三維仿生電極化梯度孔神經導管。實施例3
三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備，製備步驟為
(1)將P-磷酸三鈣(P -TCP)粉末(IO-IOOnm)放置在一個直徑6釐米，高2釐米氧化鋁環中，在8kvcm-l直流電場作用下，於300°C空氣中電極化I小時，即得電極化P -TCP，取出備用；
(2)在室溫下，以丙酮為溶劑，分別加入聚乳酸(PDLLA)和電極化P-TCP，製成質量濃度15%的聚乳酸和質量濃度8%的電極化P -TCP混合溶液；
(3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內，室溫下，採用溶劑揮發法揮發36小時，真空乾燥36小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化3 -TCP /PDLLA 芯材；
(4)胺化，將電極化P-TCP /PDLLA芯材浸入7mg/ml的乙二胺-異丙醇溶液中，反應I小時，用水充分漂洗去掉未反應的乙二胺，真空乾燥至恆重；
(5)將上述胺化後的電極化P-TCP /PDLLA芯材依次在濃度為7mg/ml的HA、7mg/ml的CHS溶液中自組裝，使其在室溫下緩慢攪拌，組裝完畢，置於7mg/ml的NGF水溶液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)反應，其加入量為電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I. 15倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，得三維仿生電極化梯度孔神經導管。實施例4 三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備，製備步驟為
(1)將P-磷酸三鈣(P -TCP)粉末(IO-IOOnm)放置在一個直徑8釐米，高3釐米氧化鋁環中，在IOkvcm-I直流電場作用下，於500°C空氣中電極化2小時，即得電極化P-TCP，取出備用；
(2)在室溫下，以三氯甲烷為溶劑，分別加入聚乳酸(PDLLA)和電極化P-TCP，製成質量濃度20%的聚乳酸和質量濃度10%的電極化3 -TCP混合溶液；
(3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內。室溫下，採用溶劑揮發法揮發48小時，真空乾燥48小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化3 -TCP /PDLLA 芯材；
(4)胺化，將電極化P-TCP /PDLLA芯材浸入10mg/ml的乙二胺-正丙醇溶液中，反應2小時，用水充分漂洗去掉未反應的乙二胺，真空乾燥至恆重；
(5)將上述胺化後的P-TCP/PDLLA芯材依次在濃度為10mg/ml的HA、10mg/ml的CHS溶液中自組裝，使其在室溫下緩慢攪拌，組裝完畢，置於10mg/ml的NGF水溶液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)反應，其加入量為電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I. 3倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，得三維仿生電極化梯度孔神經導管。
權利要求
1.ー種三維仿生電極化梯度孔神經導管，其特徵在幹它是電極化￠-磷酸三鈣/聚乳酸/透明質酸/殼聚糖/神經生長因子神經導管，是以聚乳酸為基質材料，添加電極化 磷酸三鈣，製備均勻分散的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材；再以靜電自組裝和偶合交聯技術將透明質酸和殼聚糖以及神經生長因子附於芯材表面製備的成分和孔結構雙重梯度的三維仿生電極化梯度孔神經導管。
2.根據權利要求I所述的ー種三維仿生電極化梯度孔神經導管，其特徵在於所述的神經導管長度為10 100mm,內徑為I 6mm,壁厚為0. 5 2mm。
3.—種三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟 (1)將P-磷酸三I丐納米粒子放置在ー個直徑2 8cm,高0. 5 3cm氧化招環中，在2 IOkvcm-I直流電場作用下,於100 500°C空氣中電極化I 2小時,得電極化P -磷酸三鈣，取出備用； (2)在室溫下，以こ酸こ酷、氯仿、丙酮或三氯甲烷為溶劑，加入聚乳酸，再加入電極化^ -磷酸三鈣，製成混合溶液，混合溶液中聚乳酸質量濃度為5wt% 20wt%，電極化P -磷酸三鈣質量濃度為5wt% 10wt% ； (3)用磁力攪拌使上述混合液完全分散，再將混合溶液徐徐傾倒入玻璃模具內，室溫下，採用溶劑揮發法揮發12 48小時，真空乾燥12 48小時，再從模具上剝離芯材，製成電極化P-磷酸三鈣與聚乳酸芯材； (4)胺化將步驟(3)製得的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材，浸入濃度為I 10mg/ml的己ニ胺-異丙醇、己ニ胺-正丙醇、こニ胺-異丙醇或者こニ胺-正丙醇溶液中，反應I 2小時，用水充分漂洗去掉未反應的己ニ胺或こニ胺，真空乾燥至恆重； (5)將上述胺化後的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材依次在濃度為I 10mg/ml的透明質酸、I 10mg/ml的殼聚糖溶液中自組裝，使其在室溫下攪拌，組裝完畢，置於I 10mg/ml的神經生長因子水溶液中，加入I-(3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽反應，其加入量為電極化P -磷酸三鈣與聚乳酸芯材總當量的I I. 5倍，反應完畢後真空冷凍乾燥，消毒，即得三維仿生電極化梯度孔神經導管。
4.根據權利要求3所述的三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備方法，其特徵在於所用的聚乳酸的分子量為I. OX IO5 3. OX IO5，@ -磷酸三鈣粉末的粒徑為IO-IOOnm ;選的有機溶劑為こ酸こ酷、氯仿、丙酮或三氯甲烷。
5.根據權利要求3所述的三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備方法，其特徵在於步驟(3)製得的電極化￠-磷酸三鈣與聚乳酸芯材直徑為1.5 8mm。
6.根據權利要求5所述的三維仿生電極化梯度孔神經導管的製備方法，其特徵在於得到的神經導管外層管壁孔隙率為65%-75%的三維網絡狀結構。
7.如權利要求I所述的ー種三維仿生電極化梯度孔神經導管的應用，其特徵在於應用於周圍神經系統的修復、誘導周圍神經再生以及組織工程中神經細胞的體外培養。
全文摘要
一種三維仿生電極化梯度孔神經導管的構建及其製備。該神經導管是電極化β-磷酸三鈣/聚乳酸/透明質酸/殼聚糖/神經生長因子神經導管，是以聚乳酸為基質材料，添加電極化β-磷酸三鈣，製備均勻分散的電極化β-磷酸三鈣與聚乳酸芯材；再以靜電自組裝和偶合交聯將透明質酸和殼聚糖及神經生長因子附於芯材表面製備的成分和孔結構雙重梯度的三維仿生電極化梯度孔神經導管，長度10～100mm，內徑1～6mm，壁厚0.5～2mm，外層管壁為三維網絡狀結構。本發明的神經導管應用於周圍神經系統的修復、誘導周圍神經再生以及組織工程中神經細胞的體外培養。本發明的製備方法簡單，成本低，對環境友好，經濟效益高，適於工業化生產。
文檔編號A61L27/20GK102727931SQ20121023187
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者劉慧 , 張喻, 徐海星, 李映萱, 王玉, 王玲, 許沛虎, 陳慧, 黃志軍, 龍倩 申請人:武漢理工大學