骨疾病的預防或治療方法

2023-12-08 19:58:36 1

專利名稱：骨疾病的預防或治療方法
技術領域：
本發明涉及骨疾病的預防或治療方法以及這些方法中所用的化合物。更具體涉及以骨代謝改變為特徵的骨疾病的預防或治療方法，其中包括骨質疏鬆如絕經後骨質疏鬆、骨量減少、佩吉特病、癌症患者的溶骨性轉移、肝病的骨營養不良(osteodistrophy)以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術、衰老、懷孕和營養不良導致的骨代謝改變。
背景技術：
本說明書所引用的所有參考文獻，包括所有專利或專利申請，都已納入本文作為參考，以便於全面地理解本發明。但是，引用這些參考文獻不能被認為是承認這些參考文獻成為了本領域常識的一部分，無論是在澳大利亞還是在其他任何國家。參考文獻的討論部分陳述了文獻作者的意見，本發明的申請者有權質疑被引用文獻的準確性和適當性。
骨是不斷更新的活組織。骨包含細胞和特異性的膠原纖維，外包晶體礦物質。礦物質、細胞和纖維一起形成有機基質或「類骨質」。
骨不斷地經歷骨形成和骨吸收，前者由成骨細胞完成，後者由破骨細胞完成。如果血鈣水平降低，則骨吸收增加以滿足身體其他部位的鈣需求。
骨代謝改變的特徵是骨形成和骨吸收之間的平衡被打破。其發生可能與幾類疾病有關。這類疾病的例子有骨質疏鬆、骨量減少、佩吉特病、癌症患者的溶骨性轉移、肝病的骨營養不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術、衰老、懷孕和營養不良導致的骨代謝改變。
骨丟失隨衰老過程而加速。老年人群中的主要骨疾病是骨質疏鬆。這種疾病的特徵是廣泛的骨丟失，導致骨的脆性增加，骨折的風險增大。這種疾病導致了相當多的人出現疼痛、喪失勞動能力、損形和喪失獨立性，耗費巨大，是醫療衛生事業的沉重負擔。在全球範圍內，每年有超過150萬的人因骨質疏鬆而骨折。
現在已知有兩種類型的骨質疏鬆。第一類通常發生在50到75歲之間，女性(絕經後骨質疏鬆)的發病率是男性的6倍。第二類被稱為老年性骨質疏鬆，對75歲以上的男性和女性都有影響，與正常骨丟失加速無關。兩類骨質疏鬆的危險因素是高咖啡因攝入、喝酒、體重過低和鈣攝入少。
絕經後骨質疏鬆最主要的已知原因是雌激素缺乏。絕經以後，卵巢停止分泌這種激素，這與骨礦物質含量下降直接相關。大家所熟知的絕經後症狀，包括骨質疏鬆，的治療方法是激素替代療法(HRT)，這種雌激素替代療法可有效地預防骨質疏鬆。但是，HRT有嚴重的副作用，如，乳腺組織生長刺激，因此需要尋找其他的絕經後骨質疏鬆治療方法其他類型骨疾病的主要原因還有待確定，治療這類疾病的方法也是我們需要的。
本發明的一個優選實施方式的目的在於提供預防或治療骨疾病的方法，以及這類方法中所用的組合物。
發明概述本發明的第一個方面提供了預防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的肽，所述的肽能調節脂質代謝，對胰島素樣生長因子-1(IGF-1)卻沒有可評估的效應。
在Monash University的澳大利亞專利No.693478中，我們描述了使用肽控制肥胖症的方法，所述的肽來源於人生長激素的羧基端序列或其他哺乳動物生長激素的相應區域。生長激素的這個區域能夠調節脂質代謝。更特別的是，研究發現人生長激素胺基酸殘基177-191(在下文中稱之為hGH 177-191)相應的合成肽能夠抑制肥胖症模型系統C57B1/6J(Ob/Ob)小鼠的體重增加和脂肪組織增多。在在後申請，Metabolic Pharmaceuticals Ltd的PCT/AU98/00724中，公開了也有這種活性的hGH177-191肽的類似物。AU693478和PCT/AU98/00724的完整公開內容已納入本文作為參考。
我們的申請PCT/AU00/01362(WO01/33977)公開了這類肽令人驚奇的口服活性。
利用絕經後骨質疏鬆的老化大鼠模型研究了AOD9604(Tyr-hGH 177-191)對骨骼的效應。由於在我們較早的申請中所描述的人生長激素的C端片段相應的肽沒有正常全長生長激素的正常生長效應，對IGF-1(介導人生長激素的生長效應)也沒有效應，因此我們估計這個肽對骨代謝也沒有效應。但令人驚奇的是，我們在兩個試驗中發現AOD9604對骨生長有效應，並且其預防骨丟失的效應比雌激素還要高。
因此，本發明的發明者認識到人生長激素C端片段相應的肽(AOD9604)對骨代謝有效應。因而發明者提出，在以前的試驗中顯示有調節脂質代謝能力的人生長激素的所有C端片段可能都和AOD9604具有一樣的骨代謝影響效應。相應的，發明者認為在以前的試驗中顯示有調節脂質代謝能力但不影響IGF-1的所有肽都可用於治療或預防骨代謝。
本發明的第二方面提供了有調節脂質代謝的能力但對IGF-1沒有可評估的效應的肽在製造用於治療或預防骨疾病的藥物中的應用。
在第三方面，本發明提供了用於預防或治療骨疾病的藥物製劑，所述製劑包含有調節脂質代謝能力但對IGF-1沒有可評估的效應的肽以及藥用載體。
第三方面所述的製劑還包含一種或多種治療或預防骨疾病的藥物。
可用第一方面所述方法或第二方面所述藥物治療的骨疾病包括以骨代謝改變為特徵的那些疾病。
骨疾病可以包括骨質疏鬆如絕經後骨質疏鬆、骨量減少、佩吉特病、癌症患者的溶骨性轉移、肝病的骨營養不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術、衰老、懷孕和營養不良導致的骨代謝改變。
本發明特別適用於治療或預防絕經後骨質疏鬆。


圖1成骨細胞增殖試驗所得到的AOD9604濃度對原代成骨細胞培養物中胸苷摻入量的柱狀圖。
圖2實施例2的試驗設計概述和時間線。
圖3按照實施例2的描述進行治療12周後所有治療組的骨礦物質密度(BMD)，a)腰椎(L4+L5)，b)股骨。
圖4實驗性卵巢切除模型a)腰椎(L4+L5)和b)股骨的骨礦物質密度。(**顯著性設定在p＜0.05，***趨勢設定在p＜0.1)。
圖5比較OVX對照組和藥物治療組a)腰椎(L4+L5)(OVX到LAOD 0.075，0.05)和b)股骨(0.1，0.01)的BMD(*顯著性設定在p＜0.01，**顯著性設定在p＜0.05，***趨勢設定在p＜0.1)。
圖6比較各治療組所得到的右股骨三點彎曲試驗結果。A)極限應力，B)破壞應變(*表示顯著性在p＜0.01。**表示顯著性在p＜0.05)。
圖7比較各治療組所得到的右股骨三點彎曲試驗結果。A)標準化的破壞能量，B)彈性模量(*表示顯著性在p＜0.01。**表示顯著性在p＜0.05)。
圖8比較各治療組L5的脊椎壓縮試驗結果。A)標準化的破壞能量，B)彈性模量(**表示顯著性在p＜0.05)。
圖9股骨頸的機械特性。A)極限載荷(N)，B)破壞形變(mm)。*代表顯著性在p＜0.01，**代表顯著性在p＜0.05，***代表趨勢在p＜0.1。
圖10股骨頸的機械特性。A)破壞能量(mJ)，B)剛性(MPa)。*代表顯著性在p＜0.01，**代表顯著性在p＜0.05，***代表趨勢在p＜0.1。
發明詳述有調節脂質代謝能力但對IGF-1沒有可評估的效應的肽與生長激素的C端胺基酸序列尤其相似。這種肽被稱為「生長激素C端片段」。在本說明書中，術語「生長激素C端片段」應被理解為哺乳動物生長激素胺基酸序列的羧基端區域來源的肽片段，該片段能夠降低脂肪生成(lipogenic)活性；和/或刺激脂解作用。
本文所用的術語「肽」是指長度為2到50個胺基酸殘基的任何胺基酸鏈，優選的是長度為2到20個胺基酸殘基，更優選的是長度約為15個胺基酸殘基。因此，本文所用的術語「肽」也包括多肽，二者可交互使用。只有一個前提條件就是本發明所使用的所有肽都不包含全長序列的人生長激素或其來源於其他物種的類似物。全長的生長激素能夠調節脂質代謝，並且也能調節IGF-1。因此，全長生長激素不包括在本發明所使用的肽的範圍之內。
本發明所使用的肽優選能夠刺激激素敏感性脂肪酶的活性，該酶是脂解作用的關鍵酶，並且能夠抑制乙醯輔酶A羧化酶的活性，該酶是脂肪生成的關鍵酶。
本發明所使用的肽優選至少包含哺乳動物生長激素的二硫鍵環。
術語「生長激素片段」還包括哺乳動物生長激素天然羧基端序列的功能性類似物，其中所述的類似肽能夠調節脂質代謝但對IGF-1沒有可評估的效應。這種類似物可來源於天然來源、通過重組DNA技術製備、或者利用常規的肽合成方法合成。這些肽合成方法應當被理解為包括組合方法。優選的這種類似物包含二硫鍵，二硫鍵可使肽具有環狀構型。特別是AU 693478和PCT/AU98/00724所描述的肽都應當被理解為包含在本發明的範圍之內，例如參考編號 結構9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe SEQ ID NO19405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO29410 H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO39404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2 SEQ IDNO49407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO59408 Leu Arg Ile Val Gln CysLys Ser Val GluGly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO6(醯胺鍵)9604 Tyr Leu Arg Ile VAl Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO79605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO89618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ IDNO99607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO109606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO119608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO129403 Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO139609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO149610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO159612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO169613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO179615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe SEQ ID NO189616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe SEQ ID NO199602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe SEQ ID NO20950l Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe SEQ IDNO219601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala SEQ ID NO22其中的胺基酸殘基縮寫與標準的肽命名法一致Gly＝甘氨酸；Ile＝異亮氨酸；Glu＝穀氨酸；Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝穀氨醯胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝絲氨酸；Val＝纈氨酸；Lys＝賴氨酸；Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝組氨酸；
Orn＝鳥氨酸；Tyr＝酪氨酸；Pen＝青黴胺(p，p′-二甲基-半胱氨酸)。
除了甘氨酸以外，如果沒有說明是D-絕對構型，所有的胺基酸都是L-絕對構型。上述所有肽在Cys(182)和Cys(189)之間或Pen(182)和Pen(189)之間都有合適的環形二硫鍵。
優選的肽包含人生長激素的胺基酸182-189(hGH 182-189)，更優選的包含人生長激素的胺基酸177-191(hGH 177-191)。更優選的是人生長激素類似物AOD9604(Tyr-hGH 177-191)。但是，應當清醒地認識到本發明也適用於其他哺乳動物物種來源的生長激素的胺基酸序列相應的肽，其中包括而不限於家畜如牛、羊、豬和馬的生長激素，寵物如貓和狗的生長激素，以及動物園動物包括貓科動物、犬科動物和非人靈長類動物的生長激素。生長激素這個區的序列在不同物種之間高度保守，如PCT/AU98/00724及其所引用的參考文獻所描述的。
肽還可以連接到融合伴侶上使其更容易生物合成和/或轉運。還可以摻入到藥物組合物中，或者存在於基因修飾食品中，如WO 01/33997所描述。
肽可以和藥用載體混合形成藥物組合物來給藥。
肽可以通過任何合適的途徑給藥，本領域的技術人員根據所要治療的疾病可以很容易地確定最合適的給藥途徑和給藥劑量。肽可以包含常規的非毒性藥用載體、佐劑和載體的劑量單位製劑形式通過口服、舌下含服、口腔含服、鼻內、吸入、透皮、局部或胃腸外途徑給藥。本文所用的術語胃腸外途徑包括皮下、靜脈、肌內、鞘內、顱內注射或輸注技術。
給藥劑量可由巡診醫生或獸醫根據所治療疾病的性質和狀況、患者的年齡及健康狀況、給藥途徑及以前採取的治療措施來判斷。給藥間隔時間可以是每周一次、每天一次或連續給藥。
優選的治療對象是患有以骨代謝改變為特徵的骨疾病的哺乳動物，如骨質疏鬆如絕經後骨質疏鬆、骨量減少、佩吉特病、癌症患者的溶骨性轉移、肝病的骨營養不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術、衰老、懷孕和營養不良導致的骨代謝改變。哺乳動物也可以是生長激素缺乏的哺乳動物。
哺乳動物可以是人，也可以是家畜或寵物。雖然本發明特別適於治療人，但是也可用於獸疾治療，其中包括寵物如狗和貓的治療，家畜如馬、牛和羊的治療，或者動物園動物如非人靈長類動物、貓科動物、犬科動物、牛科動物和有蹄動物的治療。
優選的哺乳動物是人。人可以是兒童，也可以是成人。
用於製備藥物組合物的方法和藥用載體是本領域所熟知的，如教科書所描述，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明頓藥物科學)，第20版，Williams andWilliams，Pennsylvania，USA(2000)。
本文所用的術語「藥用載體」是指用於將生長激素片段和/或藥物活性劑轉移到患者體內的藥用溶劑、懸浮劑或載體。選擇何種載體或稀釋劑要根據給藥途徑而定，另外，本領域的技術人員可以很容易地確定每個特定病例最適合的製劑。
本文所描述的肽類似物包括在本發明的範圍之內，如果它們有功能活性的話。本文所用的術語「有功能活性的」和「功能活性」用於指類似物時表示類似物能夠(或者有能力)調節脂質代謝但對IGF-1沒有可評估的效應。
本發明所使用的肽或類似肽預防或治療骨疾病的能力表現在實施例所描述的成骨細胞形成活性。
本文所用的類似肽包括所提供的肽胺基酸序列的胺基酸序列變體。序列變體包括上述生長激素片段的胺基酸序列內胺基酸殘基的缺失、插入或替代。缺失、插入和替代的任意組合也可以形成生長激素片段的胺基酸序列變體，只要該變體具有本文所描述的我們所期望的功能特性；即，能夠調節脂質代謝但對IGF-1沒有可評估的效應。
更具體地說，確定變體是否具有功能活性的一個試驗是檢測變體刺激胸腺嘧啶摻入到原代大鼠胚胎成骨細胞內是否能達到有統計學意義的水平(參見實施例l的進一步描述)。
如果這種替代不會導致功能活性的變化，那麼就可以引入更多的實質改變，如表l所列的典型替代或者參照胺基酸分類在下文進一步描述的，然後分析所得到的生長激素片段變體的功能活性。
本領域的技術人員利用常用的方法就可以確定一個肽是否能夠調節脂質代謝但對IGF-1沒有可評估的效應。
本文所用的術語「沒有可評估的效應」是指對IGF-1的效應在統計學上不顯著，以及即使在試驗中記錄了肽的效應，但是這種效應被認為可以忽略不計。
本領域的技術人員確定肽是否能夠調節脂質代謝的一種方式是實施例A所描述的脂解試驗。簡言之，大鼠在治療後處死，取治療大鼠和對照大鼠的脂肪組織，置於小瓶內，加入間羥叔丁腎上腺素。小瓶在37℃孵育1小時，通以碳合氣(carbon)，然後利用標準的甘油試驗進行測定，例如，利用測定試劑盒，如Sigma GPO-337。
實施例B所描述的脂肪生成試驗是本領域的技術人員確定肽是否能夠調節脂質代謝的另一種方法。
為了確定肽對IGF-1是否有可評估的效應，本領域的技術人員可以用血液樣品(例如小鼠的血液樣品)進行IGF-1試驗。RD Systems，Inc.有一種適於做此試驗的試劑盒，產品編號為DY791。這是一種夾心ELISA方法，以倉鼠抗小鼠IGF-A抗體作為捕獲抗體，以羊抗鼠IGF-A抗體作為檢測抗體。有關該試驗的完整細節見實施例C。
表1

本文所用的術語「治療有效量」和「治療量」是同義詞，是指本發明的肽的量能夠有效地產生所期望的治療反應。
顯然，特定的治療有效量隨某些因素的變化而變化，如所治療的特定疾病、所治療的哺乳動物的種類、哺乳動物的物理狀況和臨床治療史、治療持續時間、合併治療措施(如果有的話)、以及所使用的特定製劑及肽的結構。
一般來說，「處理」、「治療」等術語用於本文中是指影響患者、組織或細胞來獲得所期望的藥理和/或生理效應。效應可以是預防性的，其形式為完全或部分防止骨丟失，和/或是治療性的，其形式為增加骨形成和/或骨沉積。
「治療」用於本文中可涵蓋治療或預防哺乳動物，特別是人，的疾病的任何方法，其中包括預防易患但經診斷還未患上某疾病的患者患上該疾病；抑制疾病，即阻止疾病的發展；或者減輕或改善疾病的影響，即使疾病的影響減退。
本發明的第三方面包括用於改善骨疾病的各種藥物組合物。本發明的一個實施方式所述的藥物組合物是利用載體、賦形劑和添加劑或輔助劑將生長激素C端片段、其類似物、變體或鹽相應的肽與一種或多種抗骨疾病的活性劑混合在一起形成適於給予患者的形式而製備的。
抗骨疾病的其他活性劑包括鈣、骨礦物質如鎂和硼、γ亞麻酸、維生素如維生素D和維生素K、雌激素或用於雌激素替代療法的一種或多種雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
添加鈣可增加骨的鈣沉積。鈣可來源於任何適宜的含鈣有機或無機化合物。無機鈣鹽的例子包括，例如，氯化鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、氧化鈣、氫氧化鈣或碳酸鈣。有機鈣化合物的例子有奶粉或酪朊酸鈣、檸檬酸鈣、蘋果酸鈣、檸檬酸蘋果酸鈣或乳酸鈣。鈣的量優選每日劑量200-1500mg。
添加骨礦物質可增加骨的強度。優選的製劑為每日劑量含100-500mg鎂和2-6mg硼。
γ亞麻酸用於調節鈣代謝，優選的量為每日劑量25-100mg。
添加的維生素可作為輔助因子優化骨代謝。優選的維生素K每日劑量為25pg到5mg。維生素D可提高鈣從腸道內的攝取。優選的製劑所含的每日劑量為200IU到800IU。
雌激素或模擬雌激素替代療法中所用化合物的一種或多種雌激素也可以包含在製劑中。雌激素模擬化合物的例子有植物性雌激素如染料木黃酮、木脂體或香豆滿(coumerans)，或藥物製劑如17p-雌二醇、酯化的雌激素、硫酸雌酮、結合馬雌激素和乙炔雌二醇。對於植物性雌激素來說，這些化合物的量為每日劑量5-100mg。對於藥物製劑來說，活性組分的含量由廠家的說明書定義。
一種或多種磷酸氫鹽可用於抑制噬骨性骨吸收。這些化合物的例子有阿侖膦酸鹽和利塞膦酸鹽。這些化合物的優選量為每日劑量5-50mg。
異黃酮可從大豆或黑升麻中獲得(分離)，也可以人工合成。異黃酮的添加量為每日劑量10-75mg。
本發明的第三方面所述的製劑還可以包含其他的能量來源如脂肪和碳水化合物、蛋白質、維生素、礦物質、纖維、澱粉、防腐劑、著色劑、甜味劑等。
藥用活性劑的任何化學相容性組合都包含在本發明的範圍之內，只要這種組合不會降低本發明的生長激素片段的活性。
藥物組合物優選以劑量單位的形式製備和給藥。固體劑量單位包括片劑、膠囊和栓劑。用於治療患者時，根據化合物的活性、給藥方式、疾病的性質和嚴重程度、患者的年齡和體重不同可選擇不同的每日劑量。然而，在某些情況下，較高或較低的每日劑量是合適的。每日劑量的藥物可以通過單個劑量單位的形式或幾個較小劑量單位的形式一次給予，也可以通過亞劑量單位的形式以一定的時間間隔多次給予。
藥物組合物可以治療有效劑量的形式局部給藥或系統給藥。當然，用於此目的的有效量要根據疾病的嚴重程度和患者的體重及一般狀況而定。一般來說，體外使用劑型可為確定藥物組合物的原位給藥量提供指導，動物模型也可用於確定處理細胞毒性副作用的有效劑量。
例如，生長激素片段用於治療時的有效量要依據治療的目的、給藥途徑和患者的病情而定。相應的，臨床醫學家需要確定給藥劑量及調整給藥途徑以獲得最佳的治療效果。根據給藥模式的不同，每日劑量可以從約1μg/kg到100mg/kg或更高。
生長激素片段的劑量水平一般為約0.5-20mg/公斤體重的次序，優選的劑量範圍是約0.5-10mg/公斤體重/天(約0.5-3g/人/天)。與載體材料混合製成單次劑量的活性組分量因所治療的宿主和特定給藥模式的不同而不同。例如，人用口服製劑可以包含約5mg到lg的活性化合物加上適當量的載體材料，後者可佔組合物總量的約5-95％。一個劑量單位的製劑一般包含約5-500mg的活性組分。
但是，應當理解的是，對於任何一個特定患者來說，其特定的劑量水平要根據多種因素來確定，其中包括所使用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般狀況、性別、飲食情況、給藥時間、給藥途徑、排洩速度、合併用藥及正在治療的特定疾病的嚴重程度。
在本說明書中，應當清楚地了解名詞「包括」是指「包括但不需局限於」，名詞「包含」也有同樣的意思。
本領域的技術人員很容易理解，雖然為了澄清和便於理解本發明，在某些細節上對本發明作了描述，但是，只要不偏離本說明書所描述的概念的範圍，可以對本文所描述的實施方式和方法作出各種修改和改變。
現在僅僅是以參考下列非限定性實施例的方式對本發明進行描述。
實施例大鼠處理方案大鼠16隻雄性Wistar大鼠。
給瘦的Wistar大鼠餵29天的高脂飼料。每周稱一次大鼠體重(包括開始給藥時的第0天)。在給藥或給鹽水期間繼續以高脂飼料餵養大鼠。
以有效的給藥途徑用藥物(溶於鹽水中)處理8隻雄性Wistar大鼠(瘦的，成年的)。用鹽水(等體積的)處理另外8隻雄性Wistar大鼠(瘦的，成年的)29天。
在第0天稱體重，然後每周稱一次。動物必須在每天的相同時間(8:30-9:30am)給藥。
28天時，採集所有大鼠的血樣並以適當方式保存。
給藥後的29天，在處死前不給動物禁食並讓動物自由進食和飲水。
在最後一次給藥後讓動物休息2小時(自由進食和飲水)。在此期間，配製緩衝液、藥物儲存液(來自於Sigma的鹽酸間羥叔丁腎上腺素)並準備解剖設備和工作區。
在每個小瓶(每隻大鼠的每個稀釋度準備6個小瓶)中加入1.8ml KRB(見附件3)緩衝液(含2％BSA和1mM葡萄糖)，蓋上蓋子放置，直到組織剝離。間羥叔丁腎上腺素儲存液是10×濃縮的，在將組織放入小瓶後、開始孵育前加入到小瓶內，每瓶200μl。間羥叔丁腎上腺素的終濃度為0μmol/L、0.1μmol/L和0.5μmol/L。蓋上蓋子並將間羥叔丁腎上腺素置於冰箱內直到孵育開始(光敏感的！！)。
最後一次給藥後2小時通過立即斷頭處死大鼠。立刻取下附睪脂肪組織，用鹽水徹底衝洗(室溫)。
實施例A-測定肽調節脂質代謝能力的脂解試驗將一塊脂肪墊剪成均勻的18塊(每個間羥叔丁腎上腺處理鼠有8份)，立即放置到1.8ml KRB緩衝液中。記錄重量，通過先剪切所有的塊然後將其放入小瓶內使各瓶的孵育時間差異減到最小。
在每個盛有組織的小瓶內加入200μl間羥叔丁腎上腺素溶液，立即放入保溫箱內。
在37℃、通碳合氣(carbogen，氧和5％二氧化碳的混合氣)的情況下孵育60分鐘。
孵育完以後，取出100μl孵育液加入到eppendorf管內。取其中的10μl用標準甘油分析試劑盒(Sigma GPO-337)分析。將剩餘的90μl混合物於-80℃保存。
實施例B-測定肽調節脂質代謝能力的脂肪生成試驗取每隻大鼠的第二塊脂肪墊。將組織剪切成相同重量的塊(200mg)。每隻大鼠取6塊組織。
將每塊組織放置到10ml三角瓶中，瓶中盛有2ml KRB緩衝液/2％BSA，其中含有[12C]-葡萄糖和[14C]-葡萄糖(最終的特異性活性為0.05μCi/μmol)以及人胰島素(100μU/ml)。在37℃水浴中孵育60分鐘，以100rpm的速度持續搖動，同時通以95％O2/5％CO2。
取出組織，用0.9％NaCl洗滌三次，吸乾水分，放置到含5ml氯仿∶甲醇(2∶1v/v)的玻璃螺旋帽試管(或falcon)中，放入4℃冰箱過夜。
取出組織(留下溶液)，放入含2ml氯仿∶甲醇溶液(2∶1v/v)的10ml離心管中，振蕩，冷卻30分鐘。該步驟得到的提取溶液與步驟4得到的提取溶液混合。用玻璃棒碾壓組織提取其中剩餘的脂質。
然後使組織與2ml甲醇∶0.1％MgCl2溶液(1∶1v/v)在4℃混合15分鐘。
混合步驟5和6的提取物，在10℃以6000×g離心10分鐘。
吸出上層丟掉。將5ml下層溶液轉移到帶刻度的小瓶內，在溫暖空氣流中蒸發過夜。
將已乾燥的材料重懸於1ml氯仿，其中加入了l0ml閃爍液。
測定放射活性60秒，所得數據表示為dpm/mg組織。
實施例C-檢測對IGF-1的效應RD Research Systems，Inc.的DuoSet ELISA發育試劑盒(產品編號為DY791)用於分析對IGF-1的效應。每個試劑盒內都包含檢測細胞培養上清和血清中IGF-1的夾心ELISA所需要的基本組分。IGF-1試劑盒DY791的使用說明書複製在附件1中。
實施例1材料所用的肽AOD 9604，純度95％生產廠家Metabolic Pharmaceutical Ltd儲存條件-20℃可溶性建議以1mg/ml的濃度溶於鹽水中；但是，這可能會形成混濁的溶液-離心取上清用於蛋白質分析。如果溶液所含的藥物還低於1mg/ml，則認為沉澱不是蛋白質。
方法原代成骨細胞增殖試驗按照如下步驟用原代大鼠胚胎成骨細胞培養系統分析AOD 9604肽。
原代大鼠成骨細胞來源於膠原酶連續消化的21-天大鼠胚胎顱蓋骨。收集消化物3-4並在T-75培養瓶內用含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)培養。細胞生長到匯合以後用胰酶消化，接種到24孔培養板內，用含5％FBS的極限必需培養基(MEM)培養24小時。然後細胞用不含血清的MEM/0.1％BSA培養24小時。換掉培養基，加入生長介質後再孵育24小時。在孵育結束前4小時加入3H-胸苷。洗滌細胞，孔內加入10％TCA，培養板在4℃過夜。然後測定培養板內的胸苷摻入量。
結果AOD對原代成骨細胞合成代謝的影響濃度為10-10M和10-9M AOD能夠明顯地刺激胸苷摻入到原代大鼠胚胎成骨細胞內(圖1a)。用斯氏t檢驗評估顯著性。
結論AOD對原代成骨細胞培養物有明顯的促有絲分裂作用。因此，AOD對骨的合成代謝有影響，可能成為骨領域的潛在治療性化合物。
實施例2本試驗觀察AOD9604對絕經後骨質疏鬆老化大鼠模型骨骼的效應。預計AOD不能阻止大鼠因卵巢切除而發生的骨變化。
材料和方法(a)動物的飼養和安置本試驗總共包括96隻老化的雌性Sprague-Dawley大鼠(Rattus Norvegicus)，約9周齡，購自Harlan(Harlan Farms，Indiana)。大鼠隨機分成8組。在12周的試驗期間，大鼠被安置在多倫多大學比較醫學中心(Division of Comparative Medicine at theUniversity of Toronto)的動物實驗室內。大鼠成對安置在乾淨塑料籠子內，以玉米片為床，以塑料管為房子。所有大鼠都可以隨意地從水龍頭飲水，隨意進食實驗室食物。每日監測其居室，保持20.5℃的恆定溫度和60％的溼度。
(b)藥物製備和給藥GH和AOD治療組大鼠每周注射5天，共12周。所有治療都是通過皮下注射。GH治療組注射人GH(rhGH)(BresaGen，Adelaide，Australia)。按照廠家的說明書重新溶解配製好，每目劑量分裝一管，冷凍到-70℃，可儲存4周。AOD治療組用AOD9406(Formatech Inc.，Andover MA，U.S.A)處理，AOD冷凍乾燥後保存在4℃。按照藥廠的說明書配製。每天配製，在配製完後的4小時內使用。在4、8和10周後根據所稱的大鼠體重重新計算藥物濃度以確保整個試驗過程中的給藥劑量恆定。
試驗設計96天齡的Sprague-Dawley大鼠隨機分到8個組內。前兩組做假處理。組1作為假處理(Sham)對照，組2用2.5mg/kg/天的重組人GH(rhGH)(BresaGen)處理。其餘6組購自Harlan，是做過卵巢切除術(OVX)的。這種手術在治療前約8天進行。組3作為OVX模型的對照。組4用2.5mg/kg/天的rhGH處理。組5用0.75mg/kg/天的低劑量AOD肽(LAOD)處理，組6用2.0mg/kg/天的高劑量AOD肽(GAOD)處理。最後兩組給予緩釋的17B-雌激素片(0.01mg/天，17B-雌二醇，Innovative Research ofAmerica，Sarasota FL，U.S.A)，該藥物被皮下植入到頸背部。組7作為雌激素對照，組8給予2.0mg/kg/天的高劑量AOD肽(HAOD，Formatech Inc)。分組情況及各組的處理總結如下。
組 大鼠數量 模型 處理給藥劑量(mg/kg)112 假處理--------212 假處理RhGH2.5312 OVX ---412 OVX RhGH2.5512 OVX 低劑量AOD 0.75612 OVX 高劑量AOD 2.0712 OVX 雌激素(E) 0.01mg/天
812 OVX E+ 0.01mg/天HAOD2.0在開始處理前，稱重大鼠並採集1mL血液樣品。在4、8和12周後再採集血液樣品。血液樣品在血清分離管中以100×g離心10分鐘。吸出血清，分成4份進行下一步的分析。血清保存在-20℃。在處死前的13和3天，所有大鼠都腹腔注射30mg/mL的土黴素(Tetraject LP，Bimeda-MTC Pharmaceuticals，Cambridge，ON，Canada)。所有的稀釋都使用無菌鹽水。
在12周的治療期結束時，麻醉大鼠並稱重。在麻醉狀態下通過放血處死大鼠。取出股骨、脛骨和脊柱，放到預先標記的管內。將骨立刻放置到乾冰上，然後置於-70℃保存。圖2顯示的是試驗設計概要和時間線。
雙能X射線吸收測定法(DEXA)雙能X射線吸收測定法(DEXA)用於測定骨礦物質含量(BMC)和計算骨礦物質密度(BMD)。DEXA用PIXImus Densitometer(Lunar GE Corp.，Madison，WI，U.S.A)進行，該儀器是為測定小動物而專門設計的。通過將樣品暴露在高、低能量X射線的圓錐形射線下進行測定。低能量射線可透過軟組織但不能透過骨，而高能量射線可透過所有材料。根據骨從高、低能量射線中所吸收的能量計算骨密度。在每次使用前都用放置在PIXImus掃描區後1cm的鋁/有機玻璃假人校正機器。
掃描切下並清洗乾淨的股骨及腰椎4和5。樣品分別以半冷凍狀態放置到用聚苯乙烯製成的特殊板上，使骨上的軟組織厚度相同。在每次測量時樣品都以同一個方向放置。腰椎L4和L5的BMD合在一起作總體測量。
利用廠家提供的軟體根據BMC和面積計算BMD[BMD(g/cm2)＝BMC(g)/面積(cm2)]。通過在樣品上圍一個框來手工測量面積，術語稱之為目的區(ROI)。
統計學分析所有數據都表示為平均值+/-平均值的標準差(SEM)。利用統計學軟體SPSS(10.0版本)進行統計學分析。
包括兩組的比較用獨立t檢驗進行分析。對於多重比較來說，先進行方差齊性的Levene檢驗以判斷方差是否相等。如果數據的方差相等，則利用配對比較ProtectedFisher’s最小顯著差(LSD)事後檢驗(pairwise comparison Protected Fisher’s LeastSignificant Difference(LSD)post hoc test)通過單向方差分析進行多重比較。顯著性設定在p＜0.05，趨勢設定在p＜0.1。
雙能X射線吸收測定法(DEXA)DEXA用於計算骨礦物質密度(BMD)。脊椎的BMD主要用於確定骨小梁骨量的變化，而切下的股骨主要用於確定骨皮質骨量的變化。
卵巢切除術的效應測定卵巢切除術對骨礦物質密度的影響以確定雌激素缺乏模型是否可作為絕經後骨質疏鬆的模型。T檢驗的分析結果表明OVX組與對照假處理組相比其脊椎的BMD明顯下降(p＝0.02)，如圖4a所示。這種效應也發生在圖4b所示的股骨上，其中OVX組與假處理組相比BMD明顯下降(p＝0.046)。這些結果證實了OVX模型可用於本試驗。
AOD治療的效應AOD導致BMD的變化在脊椎和股骨之間是不同的。在脊椎中，方差分析結果表明，與OVX對照組相比，AOD的高(p＝0.05)、低劑量組(p＝0.076)都能使BMD顯著增加，如圖5a所示。BMD回到假處理對照組的水平。
低劑量的AOD處理後股骨BMD有增加的趨勢(p＝0.107)，但是高劑量的AOD卻沒有這種效應，如圖5b所示。高劑量的AOD不會導致BMD的增加，其BMD與OVX對照組相似。高劑量AOD組的BMD明顯低於低劑量組的BMD(p＝0.013)。
總之，用AOD治療後脊椎和股骨的BMD都有增加，但是脊椎的BMD增加更明顯。
實施例3機械檢測方法我們完成了3個試驗以確定骨皮質和骨小梁的機械特性。三點彎曲試驗和扭轉試驗用於檢驗骨皮質的機械特性和材料特性。脊椎壓縮試驗用於分析骨小梁的機械特性和材料特性。
統計學分析所有數據都表示為平均值+/-平均值的標準差(SEM)。利用統計學軟體SPSS(11.0版本)進行統計學分析。包括兩組的比較用獨立的斯氏t檢驗分析。利用配對比較Protected Fisher’s最小顯著差異(LSD)事後檢驗通過單向方差分析進行多重比較。顯著性設定在p＜0.05，趨勢設定在p＜0.1。
三點彎曲試驗右股骨用於三點彎曲試驗。在試驗前2天將待測骨從-70℃冰箱轉移到-20℃冰箱。在試驗前一夜，將樣品從-20℃冰箱中取出，分別用鹽水浸過的紗布包裹。然後將這些樣品放到約4℃過夜以確保樣品完全解凍。在試驗開始前，測量骨以確定如何在夾具上放置骨。首先，用數字測徑器測量骨的長度。從股骨的遠端開始，在佔骨全長25％的地方放置一個標記。在距第一點15.6mm處放置第二個標記，設定標距長度，在標距長度的中間放置最後一個標記。
試驗在機械檢測儀(Instron 4465，Instron Canada Inc.，Toronto，ON，Canada)上進行，使用的是1000牛頓的測力計。三點彎曲夾具安裝好以後校正和平衡測力計。用於檢測的不鏽鋼夾具由帶兩個支架和一個鋸條的基座組成，連接到Instron的十字頭上。所有的樣品都以同一個方向放置，其前面朝上，以其最穩定的位置放置到支架上。標距長度標記與夾具的兩個支架對齊，鋸條與標距長度的中點對齊。在骨上預先加載約1.0N的力。試驗以1mm/min的速度運行直到骨折。通過LabView數據採集軟體(National Instruments Corp.；Austin，TX)從Instron採集載荷對時間的數據。採集股骨斷裂點截面的數字圖象(ImageJ 1.28u，National Institute of Health)用於確定骨的尺寸並計算慣性距。測定中-側向(M/L)和前/後向(A/P)上的直徑以及厚度。
將時間數據轉換成形變數據，利用電子表格軟體(Excel 2000，Microsoft)作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標準化機械特性；其中包括極限載荷、形變破壞點、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區斜率)。
利用直徑和慣性距將載荷-形變曲線轉換成應力-應變曲線。從應力/應變曲線中計算標準化的機械特性，其中包括極限應力、破壞應變、破壞彈性模量所需的標準化能量。
脊椎壓縮第五脊椎(L5)用於壓縮試驗。修剪脊椎只留下椎體用於試驗。在試驗前至少1天將待測骨從-70℃冰箱轉移到-20℃冰箱。在試驗前2小時，將樣品從-20℃冰箱中取出以確保骨完全除霜。在除霜期間用鹽水浸過的紗布包裹脊椎。
採集數字圖象，利用圖象分析軟體(ImageJ 1.28u，NIH)確定椎體的高度和截面面積。壓縮試驗在機械檢測儀(Instron 4465，Instron Canada)上進行，使用的是1000牛頓的測力計。將椎體放置到夾具的淺凹處，尾端或平端朝下。樣品用3個螺絲固定，然後用PMMA包裹。脊椎覆蓋以鹽水浸過的紗布，同時使PMMA凝固至少10分鐘。少量的PMMA用於抹平脊椎的載荷面。預先在樣品上加載1.0N的力，保持約3分鐘使PMMA凝固。在樣品上預載荷時，用卡規測定兩個壓盤之間的距離。然後用夾具的高度減去壓盤之間的距離就得到了標距長度。在骨上以1.0mm/min的速度加載載荷直到骨被破壞。脊椎壓縮失敗定義為力明顯減小，或者定義為例如力減小10％。
通過LabView數據採集軟體從Instron採集載荷對時間的數據。利用圖象分析軟體(ImageJ，NIH)採集數字圖象以確定高度和截面面積。
將時間數據轉換成形變數據作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標準化機械特性，其中包括極限載荷、形變破壞點、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區斜率)。從數字圖象採集的截面面積和標距長度用於將載荷-形變曲線轉換成應力-應變曲線。從應力/應變曲線中計算標準化的機械特性，其中包括極限應力、破壞應變、標準化的破壞能量(曲線下面積)和彈性模量(斜率)。
股骨頸骨折右股骨近端用於股骨頸骨折試驗。在試驗開始前，利用X射線透視近端股骨以確保股骨頭平對著屏幕。將待測骨從-20℃冰箱中取出，分別包裹上用鹽水浸過的紗布。然後將樣品置於約21℃的室溫中放置2小時以確保樣品完全解凍。在試驗開始前將股骨頸周圍的結締組織完全去除。
試驗在Instron 4464上完成。用4個平頭螺絲將樣品固定到夾具上。根據目測放置樣品使其長軸與夾具淺凹垂直並且有約11mm的標距長度(從骨的末端到夾具淺凹的頂部)。在夾具淺凹內填滿PMMA並使其凝固10分鐘。在PMMA凝固時用鹽水浸過的紗布覆蓋樣品。在試驗開始前，用數字卡規測量準確的標距長度和股骨頸在中-側向和前-後向的直徑。安置好樣品並且測量完以後，將樣品放到Instron儀上，股骨頸與底盤上的鑽孔邊對齊。預先加載約1.0N的力。試驗以2.5mm/min的速度運行直到股骨頸被破壞。
將時間數據轉換成形變數據作載荷-形變曲線。從該曲線中確定非標準化機械特性，其中包括極限載荷、形變破壞點、破壞能量(曲線下面積)和剛性(線性區斜率)。這些機械特性不進行任何標準化直接比較，因為股骨頸的幾何形狀複雜且加載到樣品上的是不同載荷的組合(壓縮力、切割力和彎曲力)。
機械試驗結果非標準化的機械特性採集於三點彎曲試驗、扭轉試驗和脊椎壓縮試驗所得到的載荷移位(load displacement)曲線。利用幾何參數將這些數據標準化。比較標準化參數的顯著性差異。如果在測定骨時發生了問題，則在分析時將這些試驗排除。HAOD組的一個樣品在右股骨上有一個異常硬結，因此沒有測定。經統計學檢驗後認為是遠離中心的數據也被排除在下面的分析之外。
三點彎曲試驗三點彎曲試驗用的是股骨，代表了骨皮質的機械特性。圖6和圖7用圖的方式描述了各組的極限應力、破壞應變、破壞能量和彈性模量數據。
AOD治療的效應低劑量AOD(LAOD)和高劑量AOD(HAOD)治療的結果表明在極限應力上無顯著差異，雖然有趨勢表明，與OVX對照組相比，LAOD和HAOD組具有更高的極限應力(p＝0.062，p＝0.076)。HAOD組和OVX組有相似的應變和彈性模量，但是LAOD組具有更高的彈性模量(p＝0.014)和更低的破壞應變(p＝0.005)。見圖6和圖7。
總結試驗證明OVX模型是有功能的，因為與假處理相比其骨皮質強度和剛性都降低。高、低劑量的AOD藥物治療出現了不同的效應。與OVX相比，兩個劑量都可以使強度增加，但是低劑量更有效，並且可使剛性增加。
脊椎壓縮脊椎壓縮試驗用的是第5脊椎椎體，代表了骨小梁的機械特性。有幾個脊椎在修剪時因太靠近椎體而損壞了皮質外殼，因此被排除在分析之外。
AOD治療的效應LAOD組所具有的彈性模量比OVX對照組高(p＝0.05)。見圖8。
總結低劑量的AOD治療結果表明，與OVX相比，其剛性有增加的趨勢，其表現為彈性模量升高。雌激素治療並不能防止由OVX引起的強度和剛性下降，儘管應力和彈性模量值較高。總之，與骨皮質相比，AOD對骨小梁的影響很小。這說明AOD對骨骼的效應與完整的GH相似。已知GH可在骨膜表面增加骨皮質的合成。
股骨頸骨折AOD的效應AOD可影響股骨頸的形變和剛性。OVX大鼠股骨頸的形變明顯高於高、低劑量AOD組大鼠股骨頸的形變(0.017，0.009)。兩個AOD組的剛性都高於OVX(p＝0.092，p＝0.023)，但是只有HAOD組有顯著性差異。OVX組的破壞能量明顯升高，這是因為它們有更高的韌性(p＝0.013，p＝0.008)。AOD治療組的剛性增加，說明OVX大鼠所發生的骨質量下降被遏制。見圖9和圖10。
總結卵巢切除術可導致股骨頸的強度和剛性下降。這主要是由於股骨頸的骨小梁丟失造成的。這也再次證明了OVX模型是有功能的。與OVX相比，用高、低劑量的AOD治療使剛性有增加的趨勢，但是其強度沒有差異。這可能是由材料變化如礦物質或膠原的變化引起的。
討論我們猜測AOD不能預防因卵巢切除術而引起的骨骼變化，從而對骨代謝沒有影響。本研究的結果證明了我們的猜測是不正確的，AOD確實對骨骼有效應。這一點可以從整個試驗中看出，因卵巢切除術而引起的許多骨骼變化被阻止。我們認為AOD9604肽可能只包含一個能刺激脂解作用但不能刺激骨代謝的區域。我們相信，由於完整的GH在體內有幾種不同的靶細胞，因此，AOD與骨細胞相互作用似乎是合理的。
AOD對骨小梁和骨皮質都有影響，但是主要影響骨皮質。我們認為，AOD對骨骼的效應與完整GH分子是一樣的。AOD還可以防止骨皮質BMD的下降，機械試驗結果表明低劑量的AOD可防止骨皮質軟化。而AOD對骨小梁的影響不大。
附件1小鼠IGF-I產品編號DY791這種DuoSet ELISA Development試劑盒包含進行夾心ELISA以檢測細胞培養物上清和血清中重組鼠胰島素樣生長因子(IGF-I)所需的基本組分1。每個試劑盒所包含的材料足夠約15個96孔板完成ELISA檢測，如果能夠滿足下列條件2●按照通用ELISA操作方法所總結的進行試驗。
●使用推薦的微孔板、緩衝液、稀釋液、底物和溶液。
在使用本產品前必須完整閱讀本試劑盒的包裝說明書。
所提供的材料在使用前將所有試劑置於室溫下。
捕獲抗體(Part 841413，1瓶)-用1.0mL PBS重新溶解後倉鼠抗小鼠IGF-I抗體的濃度為720μg/mL。重新溶解後，在2-8℃下儲存可達60天，或者分裝後儲存在-20℃到-70℃的人工除霜冰箱內可保存6個月3。用PBS稀釋到工作濃度4.0μg/mL，無載體蛋白。
檢測抗體(Part 841414，1瓶)-用1.0mL試劑稀釋液(見所需溶液部分)重新溶解後生物素化的羊抗小鼠IGF-I抗體的濃度為36μg/mL。重新溶解後，在2-8℃下儲存可達60天，或者分裝後儲存在-20℃到-70℃的人工除霜冰箱內可保存6個月3。用試劑稀釋液稀釋到工作濃度200ng/mL4。
標準品(Part 841415，1瓶)-用0.5mL試劑稀釋液(見所需溶液部分)重新溶解後重組小鼠IGF-I的濃度為100ng/mL。在稀釋前放置標準品至少15分鐘，同時溫和攪拌。重新溶解的標準品在2-8℃下儲存可達60天，或者分裝後儲存在-70℃可保存6個月3。用試劑稀釋液進行2倍稀釋，作7點標準曲線，推薦的標準品最高濃度為2000pg/mL。
鏈親和素-HRP(Part 890803，1瓶)-1.0mL連接到辣根過氧化物酶上的鏈親和素。第一次使用以後，在2-8℃下儲存可達60天3。不要冷凍。利用試劑稀釋液(見所需溶液部分)按照小瓶標籤的說明將其稀釋到工作濃度。)
所需溶液PBS-137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH7.2-7.4，0.2μm濾膜過濾。
洗滌緩衝液-0.05％Tween20，溶於PBS中，pH 7.2-7.4(RD System產品編號#WA126)。
封閉緩衝液-5％Tween 20，溶於PBS中，含0.05％NaN3。
試劑稀釋液1-5％Tween 20，溶於PBS中，pH 7.2-7.4，0.2μm濾膜過濾。
底物溶液-顯色劑A(H2O2)和顯色劑B(四甲基聯苯胺)(RD System產品編號#DY999)的1∶1混合物。
終止液-2N H2SO4(RD System產品編號#DY994)。
通用ELISA操作規程微孔板的準備1.用無載體蛋白的PBS將捕獲抗體稀釋到工作濃度。馬上將稀釋的捕獲抗體加入到96孔微孔板5內以包被微孔板，每孔加100μl。封上微孔板，在室溫下孵育過夜。
2.吸去孔內的溶液，用洗滌緩衝液洗滌，共洗滌3次。用噴水瓶、多道加樣器或自動洗滌儀在每個孔中都加滿洗滌緩衝液(400μl)進行洗滌。在每一步中將液體完全去掉是試驗成功所必須的。在最後一次洗滌結束後，抽吸掉所有剩餘的洗滌液，或者通過將微孔板倒扣在-疊乾淨的紙上去掉所有剩餘的洗滌液。
3.在每孔中加入300μl封閉緩衝液來封閉微孔板。在室溫下至少孵育1小時。
4.按照步驟2的方法重複抽吸/洗滌微孔板。現在微孔板已準備好，可以加樣了。
試驗過程1.每孔中加入100μl試劑稀釋液溶解的樣品或標準品，或者合適的稀釋液。用膠帶覆蓋微孔板，在室溫下孵育2小時。
2.按照微孔板準備中步驟2的方法重複抽吸/洗滌微孔板。
3.每孔中加入100μl試劑稀釋液溶解的檢測抗體。用膠帶覆蓋微孔板，在室溫下孵育2小時。
4.按照微孔板準備中步驟2的方法重複抽吸/洗滌微孔板。
5.每孔中加入100μl鏈親和素-HRP的工作稀釋液。覆蓋微孔板，在室溫下孵育20分鐘。微孔板避免直接光照。
6.按照步驟2的方法重複抽吸/洗滌微孔板。
7.每孔中加入100μl底物溶液。在室溫下孵育20分鐘。微孔板避免直接光照。
8.每孔中加入50μl終止液。溫和扣打微孔板使溶液充分混合。
9.立刻利用微孔板讀數儀在450nm處測定每孔的光密度。如果可以校正波長，則設定到540nm或570nm。如果不能校正波長，則450nm處的讀數減去540nm或570nm處的讀數。減去這個讀數的目的在於校正微孔板的光學缺陷。在450nm處直接測定而不校正可能會導致數值偏高，準確性下降。
技術提示和限制●本DuoSet試劑盒在超過標籤上標註的有效期時不應該再使用。
●用於重新溶解試劑和稀釋標準品的稀釋液能夠反映待測樣品的環境是很重要的。本規程所推薦的稀釋液適用於大多數細胞培養物的上清樣品。在使用前應當確認稀釋液是否適用於特定的樣品類型。
●本試驗所使用的酶和底物的種類以及捕獲/檢測抗體的濃度可以改變以獲得具有不同敏感性和動力學範圍的免疫分析。要在免疫分析中成功地使用這些試劑需要對免疫分析方法有基本的理解。
●完全而均勻地洗滌技術是獲得正確試驗結果所必須的。洗滌緩衝液應當分配均勻，並且應當通過抽吸或傾倒從孔中徹底去除。將微孔板倒扣在一疊乾淨的紙上可去掉所有剩餘的洗滌緩衝液。
●在每一步都要更換新的試劑容器和加樣頭。
●推薦所分析的所有樣品和標準品都設雙復孔。
●避免試劑和緩衝液被微生物汙染。微生物汙染可影響試驗的敏感性。含大量蛋白質的緩衝液應當在無菌條件下配製，並儲存在2-8℃，或者每天配製新鮮的緩衝液。
警告本試劑盒推薦使用的終止液是酸溶液。在使用這個溶液時要穿戴眼睛、手、面部和衣服的保護裝置。
結果的計算計算每個標準品、對照和樣品的雙復孔讀數的平均值，減去0標準品光密度的平均值。
利用能作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合的計算機軟體繪製標準曲線。另外，也可以手工繪製標準曲線，在y軸上點每個標準品的平均吸光度值，在x軸上點濃度，通過圖上的點畫一條最擬合的曲線。以IGF-I濃度的對數對O.D.的對數作圖則數據可能是線性的，通過回歸分析確定最擬合的曲線。這種方法可產生一條充分但精確度低的數據擬合曲線。如果樣品經過稀釋，那麼從曲線上讀出的濃度必須要乘以稀釋倍數。
典型數據本標準曲線只是為了證明的目的。
每一組分析的樣品都會產生一個標準曲線。
下圖代表使用這種鼠IGF-I DuoSet試劑盒所得到的典型數據。利用能進行4-PL曲線擬合的計算機繪製標準曲線。
鼠IGF-I DuoSet 特異性分析了含50ng/mL重組鼠IGF-II的樣品，結果顯示無交叉反應或幹擾。
含25ng/mL重組人IGF-I的樣品測定結果為63pg/mL(0.2％的交叉反應)。
校正
DuoSet試劑盒可用RD Systems生產的大腸桿菌表達的高純度重組鼠IGF-I校正。
1用於分析血清樣品時，每個實驗室應當設定和確證自己的血清稀釋度。血清稀釋液不能用於稀釋檢測抗體或鏈親和素-HRP。
2由於技術方法、塑料器具及水源的不同每個結果可能會有變化。
3假設在試劑盒的有效期內。
4重新溶解後所有組分最少放置15分鐘，同時溫和攪拌。工作稀釋液應臨時配製和使用。
5推薦使用Costar EIA Plate(產品編號#2592)。
RD System Inc. RD System Europe，Ltd.
15614Mckinley Place NE 19 Barton LaneMinneapolis，MN 55413 Abingdon Science ParkUSAAbingdon.OX 143NB1-800-343-7475United KingdomTel(612)379-2956Tel+44(0)1235 529449Fax(612)656-4400Fax+44(0)1235 533420
序列表110新陳代謝製藥有限公司(Metabolic Pharmaceuticals Limited)120骨疾病的預防或治療方法130FP2164715020049023881512004-05-0416022170Patentln version 3.3210121115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在182和189上是青黴胺；環肽220
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221Xaa222(13)..(13)223青黴胺4001Leu Arg Ile Val Gln Xaa Arg Ser Val Glu Gly Ser Xaa Gly Phe1 5 10 15210221115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，用CH3CO代替NH2；環肽220
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222(1)..(1)223CH3CO代替NH2220
221DISULFID222(6)..(13)4002Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210321115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，用H代替NH2；環肽220
221MOD_RES222(1)..(1)223H代替NH2220
221DISULFID222(6)..(13)4003Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phel 5 10 15210421l15212PRT213人工的220
223hGH 177-191，用CONH2代替COOH；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)220
221MOD_RES222(15)..(15)223CONH2代替COOH
4004Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210521115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在183上是賴氨酸；環肽220
221DISULFID222(6..(13
4005Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210621115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在183上是賴氨酸，且183和186之間有醯胺鍵；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)220
221MISC_FEATURE222(7)..(10)223醯胺鍵4006Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210721116212PRT213人工的220
223酪氨酸-hGH 177-191；環肽220
221DISULFID222(7)..(14)4007Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210821116212PRT213人工的220
223賴氨酸-hGH 177-191；環肽220
221DISULFID222(7)..(14)4008Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210921117212PRT213人工的220
223賴氨酸-賴氨酸-hGH 177-191；環肽220
221DISULFID222(8)..(15)4009Lys Lys Leu Arg lle Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly1 510 15Phe21010
21115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在177上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40010Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101121115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在178上是賴氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40011Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101221115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在179上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40012Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15
2101321115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在179上是賴氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40013Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101421115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在180上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40014Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101521115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在18l上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40015Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1 5 10 152101621115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在184上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40016Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101721115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在185上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40017Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe1 5 10 15210182ll15212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在187上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40018
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe1 5 10 152101921115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在188上是丙氨酸環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40019Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe1 5 10 152102021115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在190上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40020Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe1 5 10 152102121115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在187和190上是D-丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)
220
221Xaa222(11)..(11)223D-丙氨酸220
221Xaa222(14)..(14)223D-丙氨酸40021Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Xaa Ser Cys Xaa Phe1 5 10 152102221115212PRT213人工的220
223hGH 177-191，在191上是丙氨酸；環肽220
221DISULFID222(6)..(13)40022Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala1 5 10 1權利要求
1.一種預防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的能調節脂質代謝但對IGF-1沒有可評估的效應的肽。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述肽是人生長激素序列或其功能類似物或變體的胺基酸殘基177-191。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述肽能降低脂肪生成活性；和/或能夠刺激脂解作用。
4.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽至少包含哺乳動物生長激素的二硫鍵環。
5.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽選自以下序列參考編號 結構9502 Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe9405 CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9410 H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9404 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH29407 Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9408 Leu Arg Ile Val Gln CysLys Ser Val GluGly Ser Cys Gly Phe(醯胺鍵)9604 Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9605 Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9618 Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9607 Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9606 Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9608 Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9403 Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9609 Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9610 Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9612 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe9613 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe9615 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe9616 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe9602 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe9501 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe9601 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述肽包含人生長激素的胺基酸182-189(hGH 182-189)。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述肽包含人生長激素的胺基酸177-191(hGH 177-191)。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述肽是Tyr-hGH 177-191，並且含有序列Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe。
8.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽連接到融合伴侶上。
9.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽以藥物組合物的形式給藥。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述藥物組合物包含藥用載體。
11.如權利要求9或10所述的方法，其特徵在於，所述藥物組合物還包含治療骨疾病的其他活性劑。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述其他活性劑選自以下一種或多種鈣、骨礦物質、γ亞麻酸、維生素D、維生素K、雌激素、雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特徵在於，所述藥物組合物還包含能源。
14.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽通過口服、舌下含服、口腔含服、鼻內、吸入、透皮、局部或胃腸外途徑，通過皮下、靜脈、肌內、鞘內、顱內注射或輸注技術給藥。
15.如上述權利要求1到13中任一項所述的方法，其特徵在於，所述肽以基因改造食品的形式口服給予。
16.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述骨疾病以骨代謝改變為特徵。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述骨疾病選自骨質疏鬆如絕經後骨質疏鬆、骨量減少、佩吉特病、癌症患者的溶骨性轉移、肝病的骨營養不良以及由腎衰竭或血液透析、骨折、骨手術、衰老、懷孕和營養不良導致的骨代謝改變。
18.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物也是生長激素缺乏的。
19.如上述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物是人。
20.生長激素C端片段在製造用於治療或預防哺乳動物骨疾病的藥物中的應用。
21.如權利要求20所述的應用，其特徵在於，所述藥物還包含治療骨疾病的其他活性劑。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述其他活性劑是選自以下一種或多種鈣、骨礦物質、γ亞麻酸、維生素D、維生素K、雌激素、雌激素模擬化合物、磷酸氫鹽和異黃酮。
23.如權利要求11或12所述的方法，其特徵在於，所述組合物還包含能源。
全文摘要
本發明涉及預防或治療哺乳動物骨疾病的方法，該方法包括給予哺乳動物治療有效量的肽，所述的肽能調節脂質代謝，但對胰島素樣生長因子－1(IGF－1)卻沒有可評估的效應。
文檔編號A61P19/08GK1950103SQ200580014411
公開日2007年4月18日 申請日期2005年5月4日 優先權日2004年5月4日
發明者E·沃斯 申請人:新陳代謝製藥有限公司